Summary
Aquí, se presenta un flujo de trabajo experimental que permite la detección del procesamiento de caspasa-8 directamente en el complejo de señalización inductor de muerte (DISC) y determina la composición de este complejo. Esta metodología tiene amplias aplicaciones, desde desentrañar los mecanismos moleculares de las vías de muerte celular hasta el modelado dinámico de las redes de apoptosis.
Abstract
La apoptosis extrínseca está mediada por la activación de receptores de muerte (DR) como CD95 / Fas / APO-1 o ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) receptor 1 / receptor 2 (TRAIL-R1 / R2). La estimulación de estos receptores con sus ligandos cognados conduce al ensamblaje del complejo de señalización inductor de muerte (DISC). DISC comprende DR, la proteína adaptadora asociada a Fas con dominio de la muerte (FADD), procaspasas-8/-10 y proteínas inhibidoras de enzimas convertidoras de interleucina (IL)-1β similares a FADD celulares (c-FLP). El DISC sirve como plataforma para el procesamiento y la activación de la procaspasa-8. Este último ocurre a través de su dimerización/oligomerización en los filamentos del dominio efector de la muerte (DED) ensamblados en el DISC.
La activación de la procaspasa-8 es seguida por su procesamiento, que ocurre en varios pasos. En este trabajo se describe un flujo de trabajo experimental establecido que permite la medición de la formación de DISC y el procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo. El flujo de trabajo se basa en técnicas de inmunoprecipitación apoyadas por el análisis de western blot. Este flujo de trabajo permite un seguimiento cuidadoso de los diferentes pasos del reclutamiento de la procaspasa-8 para el DISC y su procesamiento y es muy relevante para investigar los mecanismos moleculares de la apoptosis extrínseca.
Introduction
Uno de los receptores de muerte (DR) mejor estudiados es CD95 (Fas, APO-1). La vía apoptótica extrínseca comienza con la interacción de la DR con su ligando cognado, es decir, CD95L interactúa con CD95 o TRAIL se une a TRAIL-Rs. Esto da como resultado la formación del DISC en el DR. DISC correspondiente consiste en cd95, FADD, procaspasa-8/-10 y proteínas c-FLIP1,2. Además, el DISC se ensambla mediante interacciones entre proteínas que contienen dominio de muerte (DD), como CD95 y FADD, y proteínas que contienen DED como FADD, procaspasa-8/-10 y c-FLIP(Figura 1). La procaspasa-8 sufre oligomerización a través de la asociación de sus DED, lo que resulta en la formación de filamentos DED, seguidos de la activación y el procesamiento de la procaspasa-8. Esto desencadena una cascada de caspasa, que conduce a la muerte celular(Figura 1)3,4. Así, la procaspasa-8 es una caspasa iniciadora central de la vía de apoptosis extrínseca mediada por CD95 o el TRAIL-R, activada en la plataforma macromolecular correspondiente, DISC.
Se sabe que dos isoformas de la procaspasa-8, a saber, la procaspasa-8a (p55) y la -8b (p53), se reclutan para el DISC5. Ambas isoformas comprenden dos DED. DED1 y DED2 se encuentran en la parte N-terminal de la procaspasa-8a/b seguida de los dominios catalítico p18 y p10. El análisis detallado de microscopía crioelectrónica (crio-EM) de los DED de procaspasa-8 reveló el ensamblaje de proteínas de procaspasa-8 en estructuras filamentosas llamadas filamentos DED4,6. Sorprendentemente, inicialmente se sugirió que las cadenas lineales de procaspasa-8 participaran en la dimerización seguida de la activación de la procaspasa-8 en el DISC. Ahora bien, se sabe que esas cadenas son sólo una subestructura del filamento DED procaspasa-8, este último compuesto por tres cadenas ensambladas en una triple hélice3,4,6,7.
Tras la dimerización en el filamento DED, los cambios conformacionales en la procaspasa-8a/b conducen a la formación del centro activo de la procaspasa-8 y su activación3,8. Esto es seguido por el procesamiento de la procaspasa-8, que está mediado por dos vías: la primera va a través de la generación de un producto de escisión p43 / p41 y la segunda a través de la generación inicial de un producto de escisión p30. La vía p43/p41 se inicia por la escisión de la procaspasa-8a/b en Asp374, dando como resultado productos de escisión p43/p41 y p12 (Figura 2). Además, estos fragmentos se escindieron autocatalíticamente en Asp384 y Asp210/216, dando lugar a la formación del heterotetrámero activo caspasa-8, p102/ p1829,10,11. Además, se demostró que en paralelo a la vía de procesamiento p43/p41, la procaspasa-8a/b también se escinde en Asp216, lo que conduce a la formación del producto de escisión C-terminal p30, seguido de su proteólisis a p10 y p1810 (Figura 2).
La activación de la procaspasa-8a/b en el filamento DED está estrictamente regulada por proteínas llamadas c-FLIPs12. Las proteínas c-FLIP se encuentran en tres isoformas: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)y c-FLIPRaji (c-FLIPR). Las tres isoformas contienen dos DED en su región N-terminal. c-FLIPL también tiene un dominio similar a la caspasa catalíticamente inactivo C-terminal12,13. Ambas isoformas cortas de c-FLIP-c-FLIPS y c-FLIPR-actúande manera antiapoptótica al interrumpir la formación de filamentos DED en el DISC6,14,15. Además, c-FLIPL puede regular la activación de la caspasa-8 de una manera dependiente de la concentración. Esto puede resultar en efectos pro- y anti-apoptóticos16,17,18. Al formar el heterodímero de procaspasa-8/c-FLIPL catalíticamente activo, c-FLIPL conduce a la estabilización del centro activo de la procaspasa-8 y su activación. La función pro- o anti-apoptótica de c-FLIPL depende directamente de su cantidad en los filamentos DED y la cantidad posterior de heterodímeros de procaspasa-8/c-FLIPL ensamblados19. Las concentraciones bajas o intermedias de c-FLIPL en el DISC dan como resultado cantidades suficientes de heterodímeros de procaspasa-8/c-FLIPL en el filamento DED, que apoya la activación de la caspasa-8. En contraste, el aumento de las cantidades de c-FLIPL conduce directamente a sus efectos antiapoptóticos en el DISC20.
En conjunto, la activación y el procesamiento de la procaspasa-8a / b en el DISC es un proceso altamente regulado que implica varios pasos. Este artículo discute la medición del procesamiento de la procaspasa-8 directamente en el DISC, así como el análisis de la composición de este complejo. Esto se presentará utilizando CD95 DISC como el complejo de DR ejemplar.
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Protocol
Los experimentos con células T se realizaron de acuerdo con el acuerdo ético 42502-2-1273 Uni MD.
1. Preparación de células para el experimento
NOTA: El número promedio de células para esta inmunoprecipitación es de 1 × 107. Las células adherentes tienen que ser sembradas un día antes del experimento para que haya 1 × 107 células el día del experimento.
- Preparación de células adherentes para el experimento
- Sembra 5-8 × 106 células adherentes en 20 mL de medio (ver la Tabla de Materiales para la composición) para cada condición en platos de 14,5 cm un día antes de que comience el experimento.
- El día del experimento, asegúrese de que las células sean 80-90% confluentes y adherentes al plato. Deseche el medio y agregue medio fresco a las células adherentes.
- Preparación de células de suspensión para el experimento
- Coloque cuidadosamente 1 × 107 celdas de suspensión en 10 ml de medio de cultivo (consulte la Tabla de materiales para la composición) por condición en platos de 14,5 cm inmediatamente antes de que comience el experimento.
- Si utiliza células primarias, aísle las células T primarias de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente21. Tratar las células T primarias con 1 μg/ml de fitohemaglutinina durante 24 h, seguido de 25 U/ml de IL2 durante 6 días.
- Coloque cuidadosamente 1 × 108 células T primarias en 10 ml de medio de cultivo (consulte la Tabla de materiales para la composición) por condición en platos de 14,5 cm inmediatamente antes de que comience el experimento.
NOTA: Se recomienda este mayor número de células T primarias, ya que estas células son más pequeñas.
2. Estimulación CD95L
- Estimular las células con CD95L (producido como se describió anteriormente20 o disponible comercialmente (ver la Tabla de Materiales)).
NOTA: La concentración de la CD95L y el tiempo de estimulación son de tipo celulardependientes 13,15,22,23,24,25. Prepare una condición de estimulación dos veces para generar una muestra de "control de cuentas" en paralelo.- Estimular las células adherentes con la concentración seleccionada de CD95L. Sostenga la placa en ángulo y pipetee el ligando en el medio sin tocar las células adherentes.
- Estimular las células de suspensión con CD95L pipeteando la solución de ligando en la suspensión celular.
3. Cosecha celular y lisis
- Coloque los platos celulares sobre hielo.
NOTA: No descarte el medio. Las células moribundas flotan en el medio y son importantes para el análisis. - Agregue 10 ml de solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) a la suspensión celular y raspe las células adheridas de la placa. Recoger la suspensión celular en un tubo de 50 ml.
- Lave el plato celular con 10 ml de PBS frío dos veces y coloque la solución de lavado en el mismo tubo de 50 ml. Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 ml de PBS frío. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 ml de PBS frío.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular con 1 ml de tampón de lisis (que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa al 4%). Incubarlo durante 30 min sobre hielo.
- Centrifugar el lisado a velocidad máxima (~17.000 × g)durante 15 min, 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante (lisado) a un tubo limpio. Deseche el pellet. Tome 50 μL del lisado en otro tubo. Analizar la concentración de proteínas mediante ensayo de Bradford y tomar la cantidad de lisado correspondiente a 25 μg de proteína en un vial. Agregue un tampón de carga (consulte la Tabla de materiales para la composición) al vial. Guárdelo a -20 °C como control de lisado.
4. Inmunoprecipitación (IP)
- Añadir 2 μL de anticuerpos anti-APO-1 y 10 μL de perlas de sefarosa de proteína A (preparadas según lo recomendado por el fabricante) al lisado. Agregue solo 10 μL de las perlas a un tubo separado que contenga lisado (muestra estimulada) para generar un "control de cuentas".
NOTA: Use puntas de pipeta con orificios anchos, ya sea cortando las puntas o comprando puntas especiales para IP mientras manipula las cuentas de sefalrosa de proteína A. - Incubar la mezcla de lisado con anticuerpos/perlas de sefalrosa de proteína A con una mezcla suave durante la noche a 4 °C. Centrifugar los lisados con anticuerpos/perlas de sefalrosa de proteína A a 500 × g durante 4 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml de PBS frío a las perlas y repita este paso al menos tres veces.
- Deseche el sobrenadante. Aspire las perlas preferiblemente con una jeringa Hamilton de 50 μL.
5. Western blot
- Agregue 20 μL de tampón de carga 4x (consulte la Tabla de materiales para la composición) a las perlas y caliente a 95 ° C durante 10 min. Calentar los controles de lisado a 95 °C durante 5 min.
- Cargue los lisados, las IP y un estándar de proteínas en un gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 12.5% (consulte la Tabla de materiales para la preparación del gel) y funcione con un voltaje constante de 80 V.
- Transfiera las proteínas del gel SDS a una membrana de nitrocelulosa.
NOTA: Aquí, se utilizó la técnica semiseca, optimizada para las proteínas de interés, para la transferencia durante 12 min (25 V; 2.5 A = constante). Remoje la membrana de nitrocelulosa y dos pilas de transferencia de tamaño mini en tampón de electroforesis (consulte la Tabla de materiales para la composición, prepárese de acuerdo con las instrucciones del fabricante) durante unos minutos antes de la eliminación de manchas occidentales. - Coloque la membrana separada en una caja y bloquéela durante 1 h en solución de bloqueo (0.1% Tween-20 en PBS (PBST) + 5% leche). Incubar la membrana con la solución de bloqueo bajo agitación suave.
- Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos cada lavado.
6. Detección de Western blot
- Añadir el primer anticuerpo primario en la dilución indicada (ver la Tabla de Materiales)a la membrana e incubarlo durante la noche a 4 °C con agitación suave.
- Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos cada lavado.
- Incubar la membrana con 20 ml de anticuerpo secundario (diluido 1:10.000 en PBST + 5% de leche) con agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos cada lavado.
- Deseche pbST y agregue aproximadamente 1 ml de sustrato de peroxidasa de rábano picante a la membrana.
- Detectar la señal quimioluminiscente (ver la Tabla de Materiales).
NOTA: El tiempo de exposición y el número de imágenes capturadas dependen de la cantidad de proteína en la célula y la especificidad de los anticuerpos utilizados. Debe establecerse empíricamente para cada anticuerpo utilizado para la detección.
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Representative Results
Para analizar el reclutamiento de caspasa-8 para el DISC y su procesamiento en el DISC CD95, este documento describe un flujo de trabajo clásico, que combina IP del DISC CD95 con análisis de western blot. Esto permite la detección de varias características clave de la activación de la caspasa-8 en el DISC: el ensamblaje de la plataforma macromolecular activadora de la caspasa-8, el reclutamiento de procaspasa-8 en el DISC y el procesamiento de esta caspasa iniciadora(Figura 1 y Figura 2). Este flujo de trabajo implica el tratamiento de células sensibles con CD95L de manera dependiente del tiempo, seguido de su lisis, inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-CD95 (anti-APO-1) y posterior análisis de western blot(Figura 3).
Se utilizaron células HeLa-CD95 de cáncer de cuello uterino como ejemplo para analizar la formación de DISC26. La estimulación de estas células con CD95L resultó en un alto nivel de formación de CD95 DISC, monitoreado a través de la inmunoprecipitación CD95(Figura 4). Se observaron CD95, FADD, procaspasa-8, procaspasa-10 y c-FLP en estas inmunoprecipitaciones cd95, lo que indica una formación eficiente de DISC. Es importante destacar que los productos de escisión de la procaspasa-8a / b: p43 / p41, p30 y p18 se detectaron en el DISC, lo que indica la activación de la procaspasa-8 y su procesamiento posterior. En particular, se detectaron los productos de escisión de la procaspasa-8 p43/p41 y p18, lo que indica los dos pasos antes mencionados de la vía de procesamiento de p43. Además, se detectó el producto p30, lo que indica la vía alternativa de procesamiento de la caspasa-8. Además, la activación de la procaspasa-8 en el DISC es seguida por la escisión de sus sustratos, como las proteínas c-FLIP.
De hecho, los productos de escisión de c-FLIP-p43-FLIP y p22-FLIP- se detectaron en las inmunoprecipitaciones, lo que indica la activación de la caspasa-8(Figura 4). Es importante destacar que ni FADD, procaspasa-8, procaspasa-10 y c-FLP, ni sus productos de escisión se detectaron en las muestras de inmunoprecipitación de células no tratadas, lo que subraya la especificidad de la inmunoprecipitación DISC(Figura 4). Se puede obtener información importante de estos experimentos cuantificando las bandas correspondientes a los diferentes productos de escisión de la procaspasa-8 (Figura 4). Esta información se puede utilizar en el modelado matemático de redes de apoptosis y proporciona información cuantitativa sobre la regulación de la vía.
El nivel de activación de la caspasa-8 en el DISC es modulado por c-FLP. Por lo tanto, las células HeLa-CD95 que sobreexpresan c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 fueron seleccionadas como el segundo ejemplo (Figura 5). Se pudieron observar los efectos de la isoforma c-FLIPL en estos experimentos, lo que resultó en una tasa diferente de procesamiento de procaspasa-8a / b a p43 / p41 en el DISC en comparación con la proteólisis correspondiente de la procaspasa-8 en el DISC en células heLa-CD95 parentales, según lo descrito por Hillert et al. 15. De manera similar a las observaciones de la Figura 4,no se detectó reclutamiento de FADD, procaspasa-8, procaspasa-10, proteínas c-FLIP y sus productos de escisión en las inmunoprecipitaciones de células HeLa-CD95-FL sin tratamiento con CD95L, lo que respalda la especificidad de estas inmunoprecipitaciones. Más evidencia de la especificidad de las inmunoprecipitaciones es la ausencia del reclutamiento de procaspasa-3 y poli(ADP-ribosa)polimerasa 1 (PARP1) al DISC, que se observó en las inmunoprecipitaciones tratadas con CD95L (Figura 5). Estas proteínas no forman parte del complejo, y su ausencia en las señales de inmunoprecipitación puede servir como prueba de la ausencia de unión inespecífica de abundantes proteínas celulares.
Finalmente, se realizaron inmunoprecipitaciones de CD95 DISC de células de suspensión como tercer ejemplo, por ejemplo, células T primarias activadas(Figura 6). Estas células también se caracterizan por altos niveles de CD95, FADD, procaspasa-8, procaspasa-10 y c-FLP que se observaron en inmunoprecipitaciones anti-CD95 junto con sus productos de escisión(Figura 6). La detección de productos de escisión de procaspasa-8 en las inmunoprecipitaciones indica la activación y el procesamiento de esta caspasa iniciadora en la inmunoprecipitación DISC de las células T primarias. Estos experimentos indican que el DISC puede ser inmunoprecipitado a partir de muchas células adherentes y de suspensión y que el procesamiento y la activación de la caspasa-8 pueden ser validados por el análisis de western blot.
Figura 1: Presentación esquemática de la vía de señalización CD95. CD95L activa el ensamblado DISC. El DISC comprende CD95, FADD, procaspasa-8/-10 y c-FLIP. FADD se une a CD95 a través de su DD, mientras que la procaspasa-8, la procaspasa-10 y los c-FLP interactúan a través de sus DED, formando filamentos DED. La formación de los filamentos DED sirve como plataforma para la dimerización, el procesamiento y la posterior activación de la procaspasa-8. El heterotetrámero activo caspasa-8, p182/p102,activa la caspasa-3 por escisión, lo que conduce a la apoptosis. Abreviaturas: CD = grupo de diferenciación; CD95L = ligando CD95; DISC = complejo de señalización inductor de muerte; DD = dominio de la muerte; FADD= Dominio de muerte asociado a Fas; c-FLIP = proteína inhibidora de la enzima convertidora de interleucina (IL)-1β similar a la FADD celular; DED = dominio efector de la muerte; c-FLIPL = c-FLIPLargo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procesamiento de la procaspasa-8 en el DISC. Se muestran dos formas de procesamiento de la procaspasa-8a/b en el DISC. La primera forma implica la generación p43 / p41 seguida de la formación p18. La segunda forma implica la generación de p30 seguida de su procesamiento a p18 y p10. Los residuos se numeran de acuerdo con la secuencia de procaspasa-8a. Abreviaturas: DED = dominio efector de la muerte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Presentación esquemática de la configuración experimental del DISC-IP. Las células se estimulan con CD95L. Después de la estimulación, las células se cosechan y recolectan, seguidas de diferentes pasos de lavado. Luego se lisan las células y se recogen los lisados. Posteriormente, las perlas de proteína A-sefarosa y los anticuerpos anti-APO-1 (anti-CD95) se agregaron al lisado y se incubaron durante la noche. Después de varios pasos de lavado, las inmunoprecipitaciones fueron analizadas por western blotting. Abreviaturas: DISC = complejo de señalización inductor de muerte; IP = inmunoprecipitación; CD95L = ligando CD95. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Formación de CD95 DISC en células HeLa-CD95. Las células HeLa-CD95 fueron estimuladas con 125 ng/mL CD95L durante 30 min o 1 h. Cd95 DISC-IPs se llevaron a cabo utilizando anticuerpos anti-APO-1 (anti-CD95). La composición de las IP se examinó mediante análisis de western blot utilizando los anticuerpos para las proteínas indicadas. La actina se utilizó como control de carga. Se muestran las entradas. La cuantificación de los productos de escisión de la procaspasa-8 en el DISC se muestra y normaliza a la señal CD95. Abreviaturas: l.e. = exposición prolongada; s.e. = exposición corta; BC = IP de control con 'solo perlas', sin la adición de anticuerpos; CD95L = ligando CD95; DISC = complejo de señalización inductor de muerte; IP = inmunoprecipitación; FADD = dominio de muerte asociado a Fas; c-FLIP = proteína inhibidora de la enzima convertidora de interleucina (IL)-1β similar a la FADD celular; c-FLIPL = c-FLIPLargo; c-FLIPS = c-FLIPCorto; M = peso molecular en kiloDalton (kDa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Formación de CD95 DISC en células c-FLIPL-sobreexpresando Células HeLa-CD95. Las células HeLa-CD95-FL fueron estimuladas con 250 ng/mL CD95L para los puntos de tiempo indicados (1-3 h). Las CD95 DISC-IP se llevaron a cabo utilizando anticuerpos anti-APO-1 (anti-CD95). La composición de las IP fue examinada por análisis de western blot y analizada para las proteínas indicadas. La actina se utilizó como control de carga. Se muestran las entradas. La cuantificación de los productos de escisión de la procaspasa-8 en el DISC se muestra y normaliza a la señal CD95. Se muestra un experimento representativo de cada dos. Abreviaturas: l.e. = exposición prolongada; s.e. = exposición corta; BC = IP de control con 'solo perlas', sin la adición de anticuerpos; CD95L = ligando CD95; DISC = complejo de señalización inductor de muerte; IP = inmunoprecipitación; FADD = dominio de muerte asociado a Fas; c-FLIP = proteína inhibidora de la enzima convertidora de interleucina (IL)-1β similar a la FADD celular; c-FLIPL = c-FLIPLargo; PARP1 = poli(ADP-ribosa)polimerasa 1; M = peso molecular en kiloDalton (kDa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Formación de CD95 DISC en células T primarias. Las células T activadas primarias se estimularon con 500 ng/mL CD95L durante 15 min y 30 min. Cd95 DISC-IP se llevaron a cabo utilizando anticuerpos anti-APO-1 (anti-CD95). La composición de las IP fue examinada por análisis de western blot y analizada para las proteínas indicadas. La actina se utilizó como control de carga. La cuantificación de los productos de escisión de la procaspasa-8 en el DISC se muestra y normaliza a la señal CD95. Se muestran las entradas. Abreviaturas: l.e. = exposición prolongada; s.e. = exposición corta; ; CD95L = ligando CD95; DISC = complejo de señalización inductor de muerte; IP = inmunoprecipitación; FADD = dominio de muerte asociado a Fas; c-FLIP = proteína inhibidora de la enzima convertidora de interleucina (IL)-1β similar a la FADD celular; c-FLIPL = c-FLIPLargo; M = peso molecular en kiloDalton (kDa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este enfoque fue descrito por primera vez por Kischkel et al.27 y ha sido desarrollado con éxito desde entonces por varios grupos. Se deben considerar varias cuestiones importantes para la eficiencia de la inmunoprecipitación DISC y el monitoreo del procesamiento de la caspasa-8 en este complejo.
En primer lugar, es esencial seguir todos los pasos de lavado durante la inmunoprecipitación. Especialmente importantes son los pasos finales de lavado de las cuentas de sefalrosa y el secado de las cuentas de sefalrosa. Esto debe hacerse correctamente para aumentar la relación señal/ruido de la inmunoprecipitación, lo que permite la detección del reclutamiento y procesamiento de la caspasa-8 en el DISC. Es importante destacar que, para técnicas analíticas muy sensibles, como la espectrometría de masas, un "paso de preclarecimiento", que incluye la incubación de los lisados con solo las perlas de sefarosa o los anticuerpos de control de isotipo, también puede ser importante para reducir el ruido. Sin embargo, varios estudios han demostrado que este paso de predesclaración no es esencial para la detección del reclutamiento de caspasa-8 al DISC por western blotting7,23. Sin embargo, como se mencionó, el lavado de las cuentas al final de la inmunoprecipitación es esencial para obtener resultados confiables. La unión inespecífica de abundantes proteínas celulares a las perlas de sefarosa puede disminuir esencialmente las señales específicas de los componentes centrales de DISC. Como control importante para la ausencia de la unión inespecífica, se podría realizar un análisis de western blot de las proteínas, que se informó que no estaban presentes en el DISC. Un ejemplo de este análisis se da en la Figura 5,en la que no se observó el reclutamiento de PARP1 y caspasa-3 a la inmunoprecipitación DISC. Esto indica la especificidad de la inmunoprecipitación particular y el lavado suficiente de las cuentas de sefalrosa durante el experimento.
En segundo lugar, es crucial realizar controles negativos como un control de solo perlas o un control de inmunoprecipitación con un anticuerpo con el mismo isotipo que el anticuerpo utilizado para la inmunoprecipitación. Para los anticuerpos anti-APO-1, los anticuerpos IgG3 anti-ratón se pueden utilizar como un control de isotipo. En tercer lugar, es importante controlar los resultados de la inmunoprecipitación de muestras no tratadas, en las que solo se debe observar CD95. La detección de FADD, c-FLIP o procaspasa-8 en estas muestras generalmente indica la presencia de algunas deficiencias en el protocolo de inmunoprecipitación o en los pasos de lavado. Esto podría dar lugar a suposiciones sobre la asociación independiente de la estimulación de FADD o c-FLIP con CD95, que podrían no ser del todo correctas, y en su lugar indicar fallas en la inmunoprecipitación. En cuarto lugar, para cada inmunoprecipitación, las entradas o lisados deben analizarse cuidadosamente en paralelo para medir la expresión y las modificaciones posttraduccionales de las proteínas centrales analizadas por inmunoprecipitación.
Quinto, el análisis dependiente del tiempo permite que los cambios en el complejo se sigan a lo largo del tiempo y proporciona otra confirmación importante sobre la especificidad de las proteínas reclutadas para el complejo. En este sentido, una cuestión importante es que cada línea celular tiene un nivel diferente de expresión de CD95 y de componentes intracelulares de este complejo. En consecuencia, el momento exacto de la formación de CD95 DISC debe establecerse cuidadosamente para cada tipo de célula en particular. Finalmente, el tema crucial para el análisis de la dinámica disc es la comparación de la cantidad de proteína en cada inmunoprecipitación. Para las inmunoprecipitaciones DISC CD95 realizadas con anticuerpos anti-APO-1, la cantidad de CD95 es una medida clave de la cantidad igual de los complejos que se comparan. Esto podría ser difícil porque la intensidad de la señal CD95 en las inmunoprecipitaciones es relativamente alta. Sin embargo, uno debe encontrar el intervalo de tiempo óptimo para medir la señal de western blot correspondiente. Otro obstáculo es que CD95 es una proteína altamente glicosilada, lo que también contribuye a las dificultades en su detección en inmunoprecipitación debido a la presencia de un patrón particular de varias bandas 'borrosas'28.
El análisis de inmunoprecipitación DISC proporciona una base óptima para detectar la activación y el procesamiento de la caspasa. De hecho, la inmunoprecipitación combinada con western blotting permite la detección cuantitativa de productos de escisión de procaspasa-8a / b: p43 / p41, p30 y p18, como se muestra en este estudio(Figura 4, Figura 5y Figura 6). Esto, a su vez, permite a los experimentadores seguir los cambios en el procesamiento de la procaspasa-8a / b a lo largo del tiempo y distinguir los diferentes pasos de escisión de la procaspasa-8. Este enfoque se ha utilizado con éxito para describir la activación de la caspasa-8 en modelos matemáticos y distinguir entre el procesamiento inter e intramolecular de la procaspasa-8 en el DISC7,20,29. Además, la medición de los productos de escisión de caspasa-8 por western blotting tiene claras ventajas en comparación con los ensayos de actividad convencionales de caspasa-8 basados en sustrato IETD. En este último caso, está bien establecido que IETD también sirve como sustrato para las otras caspasas. Por lo tanto, hay cada vez más evidencia de que la detección de la actividad de IETD indica un aumento general de la actividad de la caspasa en la célula. Por el contrario, el uso del análisis de western blot puede ayudar a asignar específicamente las bandas correspondientes en el western blot a caspasa-8, lo que permite al investigador estar seguro de que caspasa-8 se activa en este complejo. Además, como se mencionó anteriormente, la medición del procesamiento de la caspasa-8 en el DISC presenta una excelente herramienta para el modelado matemático y los estudios de biología de sistemas. En conjunto, se presenta un flujo de trabajo clásico para permitir el monitoreo de diferentes pasos de activación y procesamiento de la procaspasa-8, que es esencial para desentrañar los mecanismos moleculares de la muerte celular.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos a la Fundación Wilhelm Sander (2017.008.02), al Centro de Sistemas Dinámicos (CDS), financiado por el programa de la UE FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional) y al DFG (LA 2386) por apoyar nuestro trabajo. Agradecemos a Karina Guttek por apoyar nuestros experimentos. Reconocemos al Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburgo) por proporcionarnos células T primarias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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