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Biochemistry

CD95 मौत उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की संरचना को मापना और इस परिसर में Procaspase-8 का प्रसंस्करण

Published: August 2, 2021 doi: 10.3791/62842
Automatic Translation
1, 1
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

Summary

यहां, एक प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है जो सीधे मृत्यु-उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स (डिस्क) पर सीधे -8 प्रसंस्करण का पता लगाने में सक्षम बनाता है और इस परिसर की संरचना को निर्धारित करता है। इस पद्धति में व्यापक अनुप्रयोग हैं, एपोप्टोसिस नेटवर्क के गतिशील मॉडलिंग के लिए सेल मृत्यु मार्गों के आणविक तंत्र को उजागर करने से।

Abstract

बाह्य एपोप्टोसिस को मृत्यु रिसेप्टर्स (डीआर) जैसे कि सीडी 95 / फास / एपीओ -1 या ट्यूमर नेक्रोसिस कारक से संबंधित एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण लिगैंड (ट्रेल) - रिसेप्टर 1 / रिसेप्टर 2 (ट्रेल-आर 1 / आर 2) के सक्रियण द्वारा मध्यस्थता की जाती है। उनके संज्ञानात्मक लिगेंड के साथ इन रिसेप्टर्स की उत्तेजना मृत्यु-उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स (डिस्क) की असेंबली की ओर ले जाती है। DISC में DR, adaptor protein Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspases-8/-10, और cellular FADD-like interleukin (IL)-1π-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs) शामिल हैं। DISC procaspase-8 प्रसंस्करण और सक्रियण के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है। उत्तरार्द्ध डिस्क पर इकट्ठे हुए मृत्यु प्रभावक डोमेन (डीईडी) फिलामेंट्स में इसके डिमराइजेशन / ओलिगोमेराइजेशन के माध्यम से होता है।

प्रोकैस्पेज़ -8 के सक्रियण के बाद इसकी प्रसंस्करण होती है, जो कई चरणों में होती है। इस काम में, एक स्थापित प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है जो DISC गठन के माप और इस परिसर में procaspase-8 के प्रसंस्करण की अनुमति देता है। वर्कफ़्लो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा समर्थित immunoprecipitation तकनीकों पर आधारित है। यह वर्कफ़्लो डिस्क और इसके प्रसंस्करण के लिए procaspase-8 भर्ती के विभिन्न चरणों की सावधानीपूर्वक निगरानी की अनुमति देता है और बाहरी एपोप्टोसिस के आणविक तंत्र की जांच के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है।

Introduction

सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए मृत्यु रिसेप्टर्स (डीआर) में से एक सीडी 95 (फास, एपीओ -1) है। बाह्य एपोप्टोटिक मार्ग अपने संज्ञेय लिगैंड के साथ डीआर की बातचीत के साथ शुरू होता है, यानी, सीडी 9 5 एल सीडी 9 5 के साथ बातचीत करता है या ट्रेल ट्रेल-रुपये से बांधता है। इसके परिणामस्वरूप संबंधित DR पर DISC का निर्माण होता है। DISC में CD95, FADD, procaspase-8/-10, और c-FLIP प्रोटीन1,2होते हैं। इसके अलावा, डिस्क को मृत्यु डोमेन (डीडी) के बीच बातचीत द्वारा इकट्ठा किया जाता है - प्रोटीन युक्त प्रोटीन, जैसे कि सीडी 9 5 और एफएडीडी, और डीईडी-युक्त प्रोटीन जैसे एफएडीडी, प्रोकैस्पेज -8 / -10, और सी-फ्लिप(चित्रा 1)। Procaspase-8 अपने DEDs के संघ के माध्यम से oligomerization से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप DED फिलामेंट्स का गठन होता है, जिसके बाद procaspase-8 सक्रियण और प्रसंस्करण होता है। यह एक कैस्केड को ट्रिगर करता है, जो सेल की मृत्यु की ओर जाता है(चित्रा 1)3,4। इस प्रकार, procaspase-8 CD95 या TRAIL-Rs द्वारा मध्यस्थता किए गए बाह्य एपोप्टोसिस मार्ग का एक केंद्रीय प्रारंभकर्ता है, जो संबंधित मैक्रोमोलेक्यूलर प्लेटफ़ॉर्म, डिस्क पर सक्रिय है।

procaspase-8 के दो आइसोफॉर्म, अर्थात् procaspase-8a (p55) और -8b (p53), DISC5में भर्ती होने के लिए जाने जाते हैं। दोनों आइसोफॉर्म में दो डीईडी शामिल हैं। DED1 और DED2 procaspase-8a/b के N-टर्मिनल भाग पर स्थित हैं, जिसके बाद उत्प्रेरक p18 और p10 डोमेन हैं। प्रोकैस्पेज़-8 डीईडी के विस्तृत क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) विश्लेषण से पता चला कि डीईडी फिलामेंट्स4,6नामक फिलामेंटस संरचनाओं में प्रोकैस्पेज़-8प्रोटीन की असेंबली का पता चला है। उल्लेखनीय रूप से, रैखिक procaspase-8 श्रृंखलाओं को शुरू में DISC पर procaspase-8 सक्रियण के बाद dimerization में लगे होने का सुझाव दिया गया था। अब, यह ज्ञात है कि वे श्रृंखलाएं केवल प्रोकैस्पेज़ -8 डीईडी फिलामेंट की एक उप-संरचना हैं, उत्तरार्द्ध में तीन श्रृंखलाएं शामिल हैं जो ट्रिपल हेलिक्स3,4,6,7में इकट्ठी होती हैं।

डीईडी फिलामेंट पर dimerization पर, procaspase-8a / b में संरचनात्मक परिवर्तन procaspase-8 के सक्रिय केंद्र के गठन और इसके सक्रियण3,8के गठन के लिए नेतृत्व करते हैं। इसके बाद प्रोकैस्पेज़ -8 प्रसंस्करण होता है, जिसे दो मार्गों के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है: पहला एक p43 / p41 दरार उत्पाद की पीढ़ी के माध्यम से जाता है और दूसरा एक p30 दरार उत्पाद की प्रारंभिक पीढ़ी के माध्यम से जाता है। P43/p41 मार्ग Asp374 पर procaspase-8a/b की दरार द्वारा शुरू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप p43/p41 और p12 दरार उत्पाद(चित्रा 2)। इसके अलावा, इन टुकड़ों को Asp384 और Asp210/216 पर ऑटो-उत्प्रेरक रूप से क्लीव किया जाता है, जिससे सक्रिय-8 हेटरोटेट्रेमर, p10 2 /p1829,10,11के गठन को जन्म मिलता है। इसके अलावा, यह दिखाया गया था कि प्रसंस्करण के p43 / p41 मार्ग के समानांतर, procaspase-8a / b को Asp216 पर भी क्लीव किया जाता है, जो सी-टर्मिनल क्लीवेज उत्पाद p30 के गठन की ओर जाता है, इसके बाद p10 और p1810 (चित्रा 2)के लिए इसके proteolysis द्वारा पीछा किया जाता है।

DED फिलामेंट पर Procaspase-8a/b सक्रियण को c-FLIPs12नामक प्रोटीन द्वारा सख्ती से विनियमित किया जाता है। C-FLIP प्रोटीन तीन isoforms में होते हैं: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS),और c-FLIPRaji (c-FLIPR)। सभी तीन आइसोफॉर्मों में उनके एन-टर्मिनल क्षेत्र में दो डीईडी होते हैं। c-FLIPL में एक C-terminal catalytically inactive-like domain12,13भी होता है। C-FLIP-c-FLIPS और c-FLIPRके दोनों छोटे आइसोफॉर्म्स डिस्क6,14, 15पर DED फिलामेंट गठन को बाधित करके एंटी-एपोप्टोटिक तरीके से कार्य करतेहैं। इसके अलावा, सी-फ्लिपएल एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से सक्रियण को विनियमित कर सकता है। इसके परिणामस्वरूप प्रो- और एंटी-एपोप्टोटिक प्रभाव16 , 17,18दोनों हो सकतेहैं। उत्प्रेरक रूप से सक्रिय procaspase-8/c-FLIPL heterodimer बनाने से, c-FLIPL procaspase-8 के सक्रिय केंद्र के स्थिरीकरण और इसके सक्रियण की ओर जाता है। C-FLIPL का प्रो- या एंटी-एपोप्टोटिक फ़ंक्शन सीधे DED फिलामेंट्स पर इसकी मात्रा पर निर्भर करता है और इकट्ठे हुए procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19की बाद की मात्रा पर निर्भर करता है। डिस्क पर सी-फ्लिपएल की कम या मध्यवर्ती सांद्रता के परिणामस्वरूप डीईडी फिलामेंट पर प्रोकैस्पेज़ -8 / सी-फ्लिपएल हेटरोडिमर्स की पर्याप्त मात्रा होती है, जो कि 8 के सक्रियण का समर्थन करता है। इसके विपरीत, सी-फ्लिपएल की बढ़ी हुई मात्रा सीधे डिस्क20पर इसके एंटी-एपोप्टोटिक प्रभावों का कारण बनती है।

एक साथ लिया गया, DISC पर procaspase-8a/b का सक्रियण और प्रसंस्करण एक अत्यधिक विनियमित प्रक्रिया है जिसमें कई चरण शामिल हैं। यह पेपर डिस्क पर सीधे प्रोकैस्पेज़ -8 प्रसंस्करण के माप के साथ-साथ इस परिसर की संरचना के विश्लेषण पर चर्चा करता है। यह अनुकरणीय DR परिसर के रूप में CD95 DISC का उपयोग कर प्रस्तुत किया जाएगा।

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Protocol

टी सेल प्रयोगों को नैतिक समझौते 42502-2-1273 यूनि एमडी के अनुसार किया गया था।

1. प्रयोग के लिए कोशिकाओं की तैयारी

नोट: इस immunoprecipitation के लिए कोशिकाओं की औसत संख्या 1 × 107है। अनुयायी कोशिकाओं को प्रयोग से एक दिन पहले बीज दिया जाना चाहिए ताकि प्रयोग के दिन 1 ×10 7 कोशिकाएं हों।

  1. प्रयोग के लिए अनुयायी कोशिकाओं को तैयार करना
    1. बीज 5-8 ×10 6 मध्यम के 20 मिलीलीटर में अनुयायी कोशिकाएं (संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें) प्रयोग शुरू होने से एक दिन पहले 14.5 सेमी व्यंजनों में प्रत्येक स्थिति के लिए।
    2. प्रयोग के दिन, सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं 80-90% confluent और पकवान के अनुयायी हैं। माध्यम को छोड़ दें और अनुयायी कोशिकाओं में ताजा माध्यम जोड़ें।
  2. प्रयोग के लिए निलंबन कक्षों को तैयार करना
    1. प्रयोग शुरू होने से ठीक पहले 14.5 सेमी व्यंजनों में प्रति शर्त संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर में 1 × 107 निलंबन कोशिकाओं को ध्यान से रखें (संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    2. प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, तो पहले से वर्णित प्रक्रिया21के अनुसार प्राथमिक टी कोशिकाओं को अलग करें। 24 घंटे के लिए 1 μg / mL phytohemagglutinin के साथ प्राथमिक टी कोशिकाओं का इलाज करें, इसके बाद 6 दिनों के लिए 25 U / mL IL2 उपचार किया जाता है।
    3. प्रयोग शुरू होने से ठीक पहले 14.5 सेमी व्यंजनों में 14.5 सेमी व्यंजनों में संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर में 1 × 108 प्राथमिक टी कोशिकाओं को ध्यान से रखें (संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट:: प्राथमिक T कक्षों की यह उच्च संख्या अनुशंसित है, क्योंकि ये कक्ष छोटे हैं।

2. CD95L उत्तेजना

  1. CD95L के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें (जैसा कि पहले20 या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वर्णित है (सामग्री की तालिकादेखें))।
    नोट: CD95L की सांद्रता और उत्तेजना का समय सेल-प्रकार निर्भर13,15,22, 23,24,25हैं। समानांतर में एक 'मनका नियंत्रण' नमूना उत्पन्न करने के लिए दो बार एक उत्तेजना की स्थिति तैयार करें।
    1. CD95L की चयनित एकाग्रता के साथ अनुयायी कोशिकाओं को उत्तेजित करें। प्लेट को एक कोण पर पकड़ो और अनुयायी कोशिकाओं को छूने के बिना लिगैंड को माध्यम में पाइप करें।
    2. सेल निलंबन में लिगैंड समाधान pipetting द्वारा CD95L के साथ निलंबन कोशिकाओं को उत्तेजित.

3. सेल फसल और lysis

  1. सेल डिश को बर्फ पर रखें।
    नोट:: माध्यम को न छोड़ें। मरने वाली कोशिकाएं माध्यम में तैरती हैं और विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं।
  2. सेल निलंबन के लिए ठंडे फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के 10 मिलीलीटर जोड़ें और प्लेट से संलग्न कोशिकाओं को स्क्रैप करें। एक 50 mL ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए.
  3. 10 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस के साथ सेल डिश को दो बार धोएं और धोने के समाधान को उसी 50 एमएल ट्यूब में रखें। 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 500 × जी पर सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. supernatant त्यागें और ठंडे PBS के 1 mL के साथ सेल गोली resuspend. सेल निलंबन को 1.5 मिली ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 500 × जी पर सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant त्यागें और ठंडे PBS के 1 mL के साथ सेल गोली resuspend.
  6. 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 500 × जी पर सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को त्यागें और lysis बफर के 1 mL के साथ सेल गोली resuspend (4% प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल युक्त). इसे बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अधिकतम गति (~ 17,000 × जी)पर लिसेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. supernatant (lysate) एक साफ ट्यूब के लिए स्थानांतरण. गोली को छोड़ दें। एक और ट्यूब में lysate के 50 μL ले लो. ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का विश्लेषण करें और एक शीशी में प्रोटीन के 25 μg करने के लिए इसी lysate की मात्रा ले लो। शीशी में लोडिंग बफर जोड़ें (संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें)। इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर लिसेट नियंत्रण के रूप में स्टोर करें।

4. Immunoprecipitation (आईपी)

  1. लाइसेट में एंटी-एपीओ -1 एंटीबॉडी के 2 μL और प्रोटीन ए सेफ्रोज मोतियों के 10 μL (निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में तैयार) जोड़ें। एक 'मनका नियंत्रण' उत्पन्न करने के लिए लिसेट (उत्तेजित नमूना) युक्त एक अलग ट्यूब में मोतियों के केवल 10 μL जोड़ें।
    नोट: व्यापक छिद्रों के साथ पिपेट युक्तियों का उपयोग करें या तो युक्तियों को काटकर या आईपी के लिए विशेष सुझाव खरीदकर प्रोटीन ए सेफ्रोज मोतियों को संभालते समय।
  2. एंटीबॉडी / प्रोटीन के साथ लिसेट के मिश्रण को इनक्यूबेट करें एक सेफ्रोज मोतियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोमल मिश्रण के साथ। एंटीबॉडी / प्रोटीन के साथ लिसेट को सेंट्रीफ्यूज करें 500 × ग्राम पर 4 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक सेफ्रोज मोतियों। supernatant त्यागें, मोतियों के लिए ठंडा PBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और कम से कम तीन बार इस कदम को दोहराने।
  3. supernatant को छोड़ दें। एक 50 μL हैमिल्टन सिरिंज के साथ अधिमानतः मोतियों aspirate.

5. पश्चिमी धब्बा

  1. 4x लोडिंग बफर के 20 μL जोड़ें (संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें) मोतियों और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के लिए। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर lysate नियंत्रण गर्म करें।
  2. 12.5% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) जेल पर लिसेट, आईपी और एक प्रोटीन मानक लोड करें (जेल की तैयारी के लिए सामग्री की तालिका देखें) और 80 वी के निरंतर वोल्टेज के साथ चलाएं।
  3. एसडीएस जेल से प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करें।
    नोट: यहां, अर्ध-शुष्क तकनीक, ब्याज के प्रोटीन के लिए अनुकूलित, 12 मिनट (25 वी; 2.5 ए = स्थिरांक) से अधिक हस्तांतरण के लिए उपयोग किया गया था। नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली और वैद्युतकणसंचलन बफर में दो मिनी आकार के हस्तांतरण ढेर को भिगोएं (संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें, निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार करें) पश्चिमी ब्लोटिंग से कुछ मिनटों के लिए।
  4. एक बॉक्स में धब्बेदार झिल्ली रखें और इसे ब्लॉकिंग समाधान में 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें (पीबीएस (पीबीएसटी) + 5% दूध में 0.1% ट्वीन -20)। कोमल आंदोलन के तहत अवरुद्ध समाधान के साथ झिल्ली incubate.
  5. प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं।

6. पश्चिमी धब्बा का पता लगाने

  1. झिल्ली के लिए संकेतित कमजोर पड़ने पर पहला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) और कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमल मिलाते हुए माध्यमिक एंटीबॉडी के 20 मिलीलीटर (पीबीएसटी + 5% दूध में पतला 1: 10,000) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  4. प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं।
  5. PBST को त्यागें और झिल्ली में हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट के लगभग 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. Chemoluminescent संकेत का पता लगाएं (सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट:: एक्सपोज़र समय और कैप्चर की गई छवियों की संख्या सेल में प्रोटीन की मात्रा और उपयोग किए गए एंटीबॉडी की विशिष्टता पर निर्भर करती है। यह पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अनुभवजन्य रूप से स्थापित किया जाना चाहिए।

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Representative Results

CD95 DISC पर DISC और इसके प्रसंस्करण के लिए-8 भर्ती का विश्लेषण करने के लिए, यह पेपर एक शास्त्रीय वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, जो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के साथ CD95 DISC के IP को जोड़ता है। यह डिस्क पर सक्रियण की कई प्रमुख विशेषताओं का पता लगाने की अनुमति देता है: मैक्रोमोलेक्यूलर प्लेटफ़ॉर्म को सक्रिय करने वाले मैक्रोमोलेक्यूलर प्लेटफ़ॉर्म की असेंबली, डिस्क के लिए प्रोकैस्पेज़ -8 की भर्ती, और इस सर्जक के प्रसंस्करण(चित्रा 1 और चित्रा 2)। इस वर्कफ़्लो में CD95L के साथ संवेदनशील कोशिकाओं का उपचार समय-निर्भर तरीके से शामिल है, इसके बाद उनके लाइसिस, एंटी-CD95 (एंटी-एपीओ -1) एंटीबॉडी का उपयोग करके immunoprecipitation, और बाद में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण(चित्रा 3)।

सर्वाइकल कैंसर हेला-सीडी 95 कोशिकाओं का उपयोग डिस्क गठन26का विश्लेषण करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया गया था। CD95L के साथ इन कोशिकाओं की उत्तेजना के परिणामस्वरूप CD95 DISC गठन का एक उच्च स्तर हुआ, CD95-immunoprecipitation(चित्रा 4) के माध्यम से निगरानी की गई। CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10, और c-FLIPs इन CD95-immunoprecipitations में देखे गए थे, जो कुशल DISC गठन का संकेत देते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, procaspase-8a /b: p43/p41, p30, और p18 के दरार उत्पादों को DISC पर पाया गया था, जो procaspase-8 और इसके बाद के प्रसंस्करण के सक्रियण को इंगित करता है। विशेष रूप से, procaspase-8 p43/p41 और p18 के दरार उत्पादों का पता लगाया गया था, जो p43 प्रसंस्करण मार्ग के दो उपर्युक्त चरणों को दर्शाता है। इसके अलावा, p30 उत्पाद का पता लगाया गया था, जो कि -8 प्रसंस्करण के वैकल्पिक मार्ग को दर्शाता है। इसके अलावा, डिस्क पर प्रोकैस्पेज़ -8 के सक्रियण के बाद सी-फ्लिप प्रोटीन जैसे इसके सब्सट्रेट्स की दरार होती है।

दरअसल, c-FLIP-p43-FLIP और p22-FLIP के दरार उत्पादों को immunoprecipitations में पाया गया था, जो कि -8 सक्रियण(चित्रा 4)को इंगित करता है। महत्वपूर्ण रूप से, न तो FADD, procaspase-8, procaspase-10, और c-FLIPs, और न ही उनके दरार उत्पादों को अनुपचारित कोशिकाओं से immunoprecipitation नमूनों में पाया गया था, जो DISC-immunoprecipitation की विशिष्टता को रेखांकित करता है(चित्रा 4)। इन प्रयोगों से महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त की जा सकती है, जो प्रोकैस्पेज़ -8(चित्रा 4)के विभिन्न दरार उत्पादों के अनुरूप बैंडों को परिमाणित करके प्राप्त की जा सकती है। इस जानकारी का उपयोग एपोप्टोसिस नेटवर्क के गणितीय मॉडलिंग में किया जा सकता है और मार्ग विनियमन में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

डिस्क पर सक्रियण का स्तर c-FLIPs द्वारा संशोधित किया जाता है। इसलिए, HeLa-CD95 कोशिकाएं जो c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 को ओवरएक्सप्रेस करती हैं, उन्हें दूसरे उदाहरण(चित्रा 5)के रूप में चुना गया था। इन प्रयोगों में सी-फ्लिपएल आइसोफोर्म के प्रभावों को देखा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप डिस्क पर p43/p41 के लिए प्रोकैस्पेज़-8a / b प्रसंस्करण की एक अलग दर माता-पिता के हेला-सीडी 95 कोशिकाओं में डिस्क पर प्रोकैस्पेज़ -8 के इसी प्रोटियोलिसिस की तुलना में, जैसा कि हिलर्ट एट अल द्वारा वर्णित है। 15. चित्रा 4में टिप्पणियों के समान, FADD की कोई भर्ती नहीं, procaspase-8, procaspase-10, c-FLIP प्रोटीन, और उनके दरार उत्पादों को CD95L उपचार के बिना HeLa-CD95-FL कोशिकाओं से immunoprecipitations में पाया गया था, जो इन immunoprecipitations की विशिष्टता का समर्थन करता है। immunoprecipitations की विशिष्टता के लिए अधिक सबूत procaspase-3 और poly (ADP-ribose) पोलीमरेज़ 1 (PARP1) की भर्ती की अनुपस्थिति है DISC, जो CD95L-उपचारित immunoprecipitations(चित्रा 5)में देखा गया था। ये प्रोटीन जटिल का हिस्सा नहीं हैं, और immunoprecipitation संकेतों में उनकी अनुपस्थिति प्रचुर मात्रा में सेलुलर प्रोटीन के गैर-विशिष्ट बंधन की अनुपस्थिति के लिए सबूत के रूप में काम कर सकती है।

अंत में, निलंबन कोशिकाओं से CD95 DISC के immunoprecipitations को तीसरे उदाहरण के रूप में किया गया था, उदाहरण के लिए, सक्रिय प्राथमिक टी कोशिकाएं(चित्रा 6)। इन कोशिकाओं को CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10, और c-FLIPs के उच्च स्तर की भी विशेषता है जो एंटी-CD95-immunoprecipitations में उनके दरार उत्पादों(चित्रा 6)के साथ देखे गए थे। immunoprecipitations में procaspase-8 दरार उत्पादों का पता लगाने सक्रियण और प्राथमिक टी कोशिकाओं से DISC-immunoprecipitation में इस प्रारंभकर्ता के प्रसंस्करण को इंगित करता है। इन प्रयोगों से संकेत मिलता है कि डिस्क को कई अनुयायी और निलंबन कोशिकाओं से immunoprecipitated किया जा सकता है और यह कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा सत्यापित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:CD95 सिग्नलिंग मार्ग की योजनाबद्ध प्रस्तुति। CD95L डिस्क असेंबली ट्रिगर करता है। DISC में CD95, FADD, procaspase-8/-10 और c-FLIP शामिल हैं। FADD अपने DD के माध्यम से CD95 को बांधता है, जबकि procaspase-8, procaspase-10, और c-FLIPs अपने DEDs के माध्यम से बातचीत करते हैं, जिससे DED फिलामेंट्स बनते हैं। डीईडी फिलामेंट्स का गठन प्रोकैस्पेज़ -8 डिमराइजेशन, प्रसंस्करण और बाद के सक्रियण के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है। सक्रिय -8 हेटरोटेट्रेमर, पी18 2/ पी10 2,क्लीवेज द्वारा -3 को सक्रिय करता है, जो एपोप्टोसिस की ओर जाता है। संक्षेप: CD = विभेदन का समूह; CD95L = CD95 लिगैंड; DISC = मौत उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स; डीडी = मृत्यु डोमेन; FADD = Fas-संबद्ध मृत्यु डोमेन; c-FLIP = सेलुलर FADD-जैसे इंटरल्यूकिन (IL)-1π-परिवर्तित एंजाइम-निरोधात्मक प्रोटीन; DED = मृत्यु effector डोमेन; c-FLIPL = c-FLIPLong| कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2:डिस्क पर Procaspase-8 प्रसंस्करण. DISC पर procaspase-8a/b प्रसंस्करण के दो तरीके दिखाए गए हैं। पहले तरीके में p43/p41 पीढ़ी शामिल है जिसके बाद p18 का गठन होता है। दूसरे तरीके में पी 30 पीढ़ी शामिल है, जिसके बाद पी 18 और पी 10 के लिए इसका प्रसंस्करण होता है। अवशेषों को प्रोकैस्पेज़ -8ए के अनुक्रम के अनुसार गिना जाता है। संक्षिप्त रूप: DED = मृत्यु effector डोमेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3:डिस्क-आईपी के प्रयोगात्मक सेटअप की योजनाबद्ध प्रस्तुति। कोशिकाओं को CD95L के साथ उत्तेजित किया जाता है। उत्तेजना के बाद, कोशिकाओं को काटा जाता है और एकत्र किया जाता है, इसके बाद विभिन्न धोने के चरणों का पालन किया जाता है। कोशिकाओं को फिर झूठ बोला जाता है, और लिसेट एकत्र किए जाते हैं। इसके बाद, प्रोटीन ए-सेफ्रोज मोतियों और एंटी-एपीओ -1 (एंटी-सीडी 9 5) एंटीबॉडी को लिसेट में जोड़ा गया और रात भर इनक्यूबेट किया गया। कई धोने के चरणों के बाद, पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा immunoprecipitations का विश्लेषण किया गया था। संक्षेप: डिस्क = मृत्यु-उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स; आईपी = immunoprecipitation; CD95L = CD95 लिगैंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4:HELa-CD95 कोशिकाओं में CD95 डिस्क गठन. HeLa-CD95 कोशिकाओं को 30 मिनट या 1 घंटे के लिए 125 ng / mL CD95L के साथ उत्तेजित किया गया था। आईपी की संरचना की जांच पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा संकेतित प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके की गई थी। एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता था। इनपुट दिखाए गए हैं। DISC पर procaspase-8 दरार उत्पादों का परिमाणीकरण दिखाया गया है और CD95 सिग्नल के लिए सामान्यीकृत है। संक्षेप: l.e. = लंबे समय तक जोखिम; s.e. = कम जोखिम; BC = नियंत्रण आईपी के साथ 'मोती-केवल', एंटीबॉडी के अलावा के बिना; CD95L = CD95 लिगैंड; DISC = मौत उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स; आईपी = immunoprecipitation; FADD = Fas-संबद्ध मृत्यु डोमेन; c-FLIP = सेलुलर FADD-जैसे इंटरल्यूकिन (IL)-1π-परिवर्तित एंजाइम-निरोधात्मक प्रोटीन; c-FLIPL = c-FLIPLong; c-FLIPS = c-FLIPShort; M = किलोदल्टन (kDA) में आणविक भार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5:CD95 डिस्क गठन में c-FLIPL-overexpressing HeLa-CD95 कोशिकाओं. HeLa-CD95-FL कोशिकाओं को संकेतित समय बिंदुओं (1-3 ज) के लिए 250 ng / mL CD95L के साथ उत्तेजित किया गया था। CD95 DISC-IPs एंटी-APO-1 (एंटी-CD95) एंटीबॉडी का उपयोग करके किए गए थे। आईपी की संरचना की जांच पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा की गई थी और संकेतित प्रोटीन के लिए विश्लेषण किया गया था। एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता था। इनपुट दिखाए गए हैं। डिस्क पर प्रोकैस्पेज़ -8 दरार उत्पादों का परिमाणीकरण दिखाया गया है और CD95 सिग्नल के लिए सामान्यीकृत किया गया है। दो में से एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है। संक्षेप: l.e. = लंबे समय तक जोखिम; s.e. = कम जोखिम; BC = नियंत्रण आईपी के साथ 'मोती-केवल', एंटीबॉडी के अलावा के बिना; CD95L = CD95 लिगैंड; DISC = मौत उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स; आईपी = immunoprecipitation; FADD = Fas-संबद्ध मृत्यु डोमेन; c-FLIP = सेलुलर FADD-जैसे इंटरल्यूकिन (IL)-1π-परिवर्तित एंजाइम-निरोधात्मक प्रोटीन; c-FLIPL = c-FLIPLong; PARP1 = पॉली (ADP-ribose)पोलीमरेज़ 1; M = किलोदल्टन (kDA) में आणविक भार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6:प्राथमिक टी कोशिकाओं में CD95 डिस्क गठन. प्राथमिक सक्रिय टी कोशिकाओं को 15 मिनट और 30 मिनट के लिए 500 एनजी / एमएल सीडी 9 5 एल के साथ उत्तेजित किया गया था। सीडी 95 डिस्क-आईपी एंटी-एपीओ -1 (एंटी-सीडी 9 5) एंटीबॉडी का उपयोग करके किए गए थे। आईपी की संरचना की जांच पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा की गई थी और संकेतित प्रोटीन के लिए विश्लेषण किया गया था। एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता था। डिस्क पर प्रोकैस्पेज़ -8 दरार उत्पादों का परिमाणीकरण दिखाया गया है और CD95 सिग्नल के लिए सामान्यीकृत किया गया है। इनपुट दिखाए गए हैं। संक्षेप: l.e. = लंबे समय तक जोखिम; s.e. = लघु जोखिम; ; CD95L = CD95 लिगैंड; DISC = मौत उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स; आईपी = immunoprecipitation; FADD = Fas-संबद्ध मृत्यु डोमेन; c-FLIP = सेलुलर FADD-जैसे इंटरल्यूकिन (IL)-1π-परिवर्तित एंजाइम-निरोधात्मक प्रोटीन; c-FLIPL = c-FLIPLong; M = किलोदल्टन (kDA) में आणविक भार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस दृष्टिकोण को पहली बार Kischkel et al.27 द्वारा वर्णित किया गया था और तब से कई समूहों द्वारा सफलतापूर्वक विकसित किया गया है। इस परिसर में कुशल DISC-immunoprecipitation और निगरानी के लिए कई महत्वपूर्ण मुद्दों पर विचार किया जाना चाहिए।

सबसे पहले, immunoprecipitation के दौरान सभी धोने के चरणों का पालन करना आवश्यक है। विशेष रूप से महत्वपूर्ण सेफ्रोज मोतियों के अंतिम धोने के चरण और सेफ्रोज मोतियों के सूखने हैं। यह सही ढंग से immunoprecipitation के संकेत / शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए किया जाना चाहिए, जिससे DISC पर भर्ती और प्रसंस्करण का पता लगाया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, बहुत संवेदनशील विश्लेषणात्मक तकनीकों के लिए, जैसे कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एक "प्रीक्लियरिंग चरण", जिसमें केवल सेफ्रोज मोतियों या आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ लीसेट की इनक्यूबेशन शामिल है, शोर को कम करने में भी महत्वपूर्ण हो सकती है। हालांकि, कई अध्ययनों से पता चला है कि यह preclearing कदम पश्चिमी blotting7,23द्वारा DISC के लिए भर्ती का पता लगाने के लिए आवश्यक नहीं है। हालांकि, जैसा कि उल्लेख किया गया है, इम्यूनोप्रिसिपेशन के अंत में मोतियों की धुलाई विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। सेफ्रोज मोतियों के लिए प्रचुर मात्रा में सेलुलर प्रोटीन का गैर-विशिष्ट बंधन अनिवार्य रूप से कोर डिस्क घटकों के विशिष्ट संकेतों को कम कर सकता है। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी की अनुपस्थिति के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण के रूप में, प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, डिस्क पर मौजूद नहीं होने की सूचना दी गई है, प्रदर्शन किया जा सकता है। इस विश्लेषण का एक उदाहरण चित्र 5में दिया गया है, जिसमें DISC-immunoprecipitation के लिए PARP1 और एपोप्टोस -3 की भर्ती नहीं देखी गई थी। यह प्रयोग के दौरान विशेष immunoprecipitation और sepharose मोतियों की पर्याप्त धुलाई की विशिष्टता को इंगित करता है।

दूसरा, नकारात्मक नियंत्रण जैसे कि मोतियों-केवल नियंत्रण या एक एंटीबॉडी के साथ एक इम्यूनोप्रिसिपिटेशन नियंत्रण करना महत्वपूर्ण है, जो कि एक ही आइसोटाइप के साथ होता है जैसा कि इम्यूनोप्रिसिपेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के रूप में होता है। एंटी-एपीओ -1 एंटीबॉडी के लिए, एंटी-माउस आईजीजी 3 एंटीबॉडी का उपयोग आइसोटाइप नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है। तीसरा, अनुपचारित नमूनों से इम्यूनोप्रिसिपिटेशन के परिणामों की निगरानी करना महत्वपूर्ण है, जिसमें केवल सीडी 95 का पालन किया जाना चाहिए। इन नमूनों में FADD, c-FLIP, या procaspase-8 का पता लगाना आमतौर पर immunoprecipitation प्रोटोकॉल या धोने के चरणों में कुछ कमियों की उपस्थिति को इंगित करता है। यह सीडी 95 के साथ एफएडीडी या सी-फ्लिप के उत्तेजना-स्वतंत्र संघ पर मान्यताओं को जन्म दे सकता है, जो पूरी तरह से सही नहीं हो सकता है, और इसके बजाय इम्युनोप्रिसिपेशन में खामियों का संकेत देता है। चौथा, प्रत्येक immunoprecipitation के लिए, इनपुट या lysates ध्यान से समानांतर में विश्लेषण किया जाना चाहिए अभिव्यक्ति और immunoprecipitation द्वारा विश्लेषण किए गए कोर प्रोटीन के posttranslational संशोधनों को मापने के लिए।

पांचवां, समय-निर्भर विश्लेषण समय के साथ परिसर में परिवर्तन ों का पालन करने की अनुमति देता है और परिसर में भर्ती किए गए प्रोटीन की विशिष्टता पर एक और महत्वपूर्ण पुष्टि प्रदान करता है। इस संबंध में, एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि प्रत्येक सेल लाइन में CD95 अभिव्यक्ति का एक अलग स्तर होता है और इस परिसर के इंट्रासेल्युलर घटकों का होता है। तदनुसार, CD95 डिस्क गठन का सटीक समय प्रत्येक विशेष सेल प्रकार के लिए सावधानीपूर्वक स्थापित किया जाना है। अंत में, डिस्क गतिशीलता के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण मुद्दा प्रत्येक immunoprecipitation में प्रोटीन की मात्रा की तुलना है। CD95 DISC-immunoprecipitations के लिए एंटी-APO-1 एंटीबॉडी का उपयोग करके किया जाता है, CD95 की मात्रा तुलना किए जा रहे परिसरों की समान मात्रा का एक महत्वपूर्ण उपाय है। यह मुश्किल हो सकता है क्योंकि immunoprecipitations में CD95 संकेत की तीव्रता अपेक्षाकृत अधिक है। हालांकि, किसी को संबंधित पश्चिमी धब्बा संकेत को मापने के लिए इष्टतम समय अंतराल ढूंढना होगा। एक और बाधा यह है कि सीडी 95 एक अत्यधिक ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन है, जो कई 'धुंधले' बैंड28के एक विशेष पैटर्न की उपस्थिति के कारण इम्यूनोप्रिसिपेशन में इसका पता लगाने में कठिनाइयों में भी योगदान देता है।

DISC-immunoprecipitation विश्लेषण सक्रियण और प्रसंस्करण का पता लगाने के लिए एक इष्टतम आधार प्रदान करता है। दरअसल, पश्चिमी ब्लोटिंग के साथ संयुक्त immunoprecipitation procaspase-8a / b के दरार उत्पादों की मात्रात्मक पहचान के लिए अनुमति देता है: p43 / p41, p30, और p18, जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है(चित्रा 4, चित्रा 5,और चित्रा 6)। यह, बदले में, प्रयोगकर्ताओं को समय के साथ प्रोकैस्पेज़ -8 ए / बी प्रसंस्करण में परिवर्तनों का पालन करने और प्रोकैस्पेज़ -8 के विभिन्न दरार चरणों को अलग करने में सक्षम बनाता है। इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग गणितीय मॉडल में सक्रियण का वर्णन करने और DISC 7,20, 29पर अंतर- और इंट्रामोलेक्यूलर प्रोकैस्पेस-8प्रसंस्करण के बीच अंतर करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा -8 दरार उत्पादों को मापने के पास आईईटीडी सब्सट्रेट के आधार पर पारंपरिक गतिविधि एसेस की तुलना में स्पष्ट लाभ हैं। उत्तरार्द्ध मामले में, यह अच्छी तरह से स्थापित है कि आईईटीडी अन्य लोगों के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में भी कार्य करता है। इसलिए, इस बात के बढ़ते सबूत हैं कि आईईटीडी गतिविधि का पता लगाना सेल में गतिविधि की सामान्य वृद्धि को इंगित करता है। इसके विपरीत, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करने से विशेष रूप से पश्चिमी धब्बा में संबंधित बैंड को -8 में असाइन करने में मदद मिल सकती है, जिससे शोधकर्ता को विश्वास हो सकता है कि इस परिसर में सक्रिय है। इसके अलावा, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, डिस्क पर प्रसंस्करण को मापने के लिए गणितीय मॉडलिंग और सिस्टम जीव विज्ञान अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रस्तुत करता है। एक साथ लिया गया, एक शास्त्रीय वर्कफ़्लो को प्रोकैस्पेज़ -8 सक्रियण और प्रसंस्करण के विभिन्न चरणों की निगरानी की अनुमति देने के लिए प्रस्तुत किया जाता है, जो सेल मृत्यु के आणविक तंत्र को उजागर करने के लिए आवश्यक है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम विल्हेम सैंडर-फाउंडेशन (2017.008.02), सेंटर ऑफ डायनेमिक सिस्टम्स (सीडीएस) को स्वीकार करते हैं, जो यूरोपीय संघ-कार्यक्रम ईआरडीएफ (यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष) और डीएफजी (एलए 2386) द्वारा हमारे काम का समर्थन करने के लिए वित्त पोषित है। हम हमारे प्रयोगों का समर्थन करने के लिए करीना गुटटेक को धन्यवाद देते हैं। हम प्रोफेसर डिर्क रेनहोल्ड (OvGU, Magdeburg) को हमें प्राथमिक टी कोशिकाएं प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12.5% SDS gel self made for two separating gels:
3.28 mL distilled H2O
2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M
4.06 mL acrylamide
100 µL 10% SDS
100 µL 10% APS
7.5 µL TEMED

for two collecting gels:
3.1 mL distilled H2O
1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 mL acrylamide
50 µL 10% SDS
25 µL 10% APS
7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes Greiner 639160
acrylamide Carl Roth A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice VWR 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab Sigma Aldrich A2103 dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo ALX-805-038-C100 used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab Biozol MBL-M059-3 dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab cell signaling 9662 S dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15 provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-804-242-C100 dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab Santa Cruz sc-715 dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-804-961-0100 dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ADI-AAM-212-E dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab cell signaling 9542 dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS Carl Roth 9592.3
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml		 Bio Rad 500-0006 used according to manufacturer's instructions
CD95L provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector
Chem Doc XRS+		 Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) Sigma Aldrich 11 836 145 001 prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg PAN Biotech P04-53500 dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer self made 10x electrophoresis buffer:
60.6 g Tris
288 g glycine
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 dilution before usage
glycine Carl Roth 3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP SouthernBiotech 1070-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP SouthernBiotech 1090-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP SouthernBiotech 4030-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2) Merckgroup/ Roche 11011456001 for activation of T cells
KCl Carl Roth 6781.2
KH2PO4 Carl Roth 3904.1
loading buffer
4x Laemmli Sample Buffer,10 mL		 Bio Rad 161-0747 prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUFO500
lysis buffer self made 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L PAN Biotech P04-41154 adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells gibco by Life Technologie 21875034 adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder Carl Roth T145.4
Na2HPO4 Carl Roth P030.3
NaCl Carl Roth 3957.2
PBST self made 20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk self made 50 g milk powder + 1 L PBST
PHA Thermo Fisher Scientific R30852801 for activation of T Cells
Power Pac HC Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue Bio Rad 161-0373 use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads Novodirect/ Th.Geyer GE 17-0780-01 affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper VWR 734-2602
SDS Carl Roth 4360.2
shaker Heidolph
sodium azide Carl Roth K305.1
TEMED Carl Roth 2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks Bio Rad 170-4270 used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer Bio Rad 10026938 prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane Bio Rad 170-4270 used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo Bio Rad
Tris Chem Solute 8,08,51,000
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Tween-20 Pan Reac Appli Chem A4974,1000

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References

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जैव रसायन अंक 174 CD95 डिस्क गठन immunoprecipitation -8
CD95 मौत उत्प्रेरण सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की संरचना को मापना और इस परिसर में Procaspase-8 का प्रसंस्करण
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Hillert-Richter, L. K., Lavrik, I. N. Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. Vis. Exp. (174), e62842, doi:10.3791/62842 (2021).

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