Summary
כאן, מוצגת זרימת עבודה ניסיונית המאפשרת זיהוי של עיבוד caspase-8 ישירות בקומפלקס האיתות מעורר המוות (DISC) וקובעת את ההרכב של קומפלקס זה. למתודולוגיה זו יש יישומים רחבים, החל מחשיפת המנגנונים המולקולריים של נתיבי מוות תאים ועד למודל הדינמי של רשתות אפופטוזיס.
Abstract
אפופטוזיס Extrinsic הוא בתיווך על ידי ההפעלה של קולטני מוות (DRs) כגון CD95 /Fas/APO-1 או גידול נמק הקשורים אפופטוזיס-גרימת ליגנד (TRAIL)-קולטן 1/קולטן 2 (TRAIL-R1/R2). גירוי של קולטנים אלה עם ליגנדים מודעים שלהם מוביל להרכבה של תסביך איתות גרימת מוות (DISC). ה-DISC כולל את DR, חלבון המתאם Fas הקשור לתחום המוות (FADD), פרוקספסות-8/-10, ואינטרלוקין דמוי FADD תאי (IL)-1β הממיר חלבונים מעכבי אנזימים (c-FLIPs). הדיסק משמש כפלטפורמה לעיבוד והפעלה של פרוקספאז-8. זה האחרון מתרחש באמצעות דימרציה שלה / אוליגומריזציה בתחום אפקט המוות (DED) חוטים שהורכבו בדיסק.
הפעלה של procaspase-8 מלווה בעיבוד שלה, אשר מתרחשת במספר שלבים. בעבודה זו, מתוארת זרימת עבודה ניסיונית מבוססת המאפשרת מדידה של היווצרות דיסק ועיבוד של פרוקספאז-8 במתחם זה. זרימת העבודה מבוססת על טכניקות אימונופרציפיטציה הנתמכות על-ידי ניתוח כתם מערבי. זרימת עבודה זו מאפשרת ניטור זהיר של שלבים שונים של גיוס procaspase-8 ל- DISC ועיבודו והיא רלוונטית מאוד לחקירת מנגנונים מולקולריים של אפופטוזיס קיצוני.
Introduction
אחד קולטני המוות הנחקרים ביותר (DRs) הוא CD95 (פאס, APO-1). המסלול האפופטוטי הקיצוני מתחיל באינטראקציה של ה- DR עם ליגנד הקוגנייט שלו, כלומר, CD95L מקיים אינטראקציה עם CD95 או TRAIL נקשר ל- TRAIL-Rs. התוצאה היא היווצרות הדיסק ב- DR. DISC המתאים מורכב CD95, FADD, פרוקספאז-8/-10, וחלבוני C-FLIP1,2. יתר על כן, הדיסק מורכב על ידי אינטראקציות בין חלבונים המכילים תחום מוות (DD), כגון CD95 ו- FADD, וחלבונים המכילים DED כגון FADD, פרוקספסאז-8/-10 ו- c-FLIP (איור 1). Procaspase-8 עובר אוליגומריזציה באמצעות שיוך של DDs שלה, וכתוצאה מכך היווצרות של חוטי DED, ואחריו הפעלה ועיבוד פרוקספאז-8. הדבר מעורר מפל מפל, מה שמוביל למוות תאי (איור 1)3,4. לכן, procaspase-8 הוא יזם מרכזי caspase של מסלול אפופטוזיס extrinsic בתיווך CD95 או TRAIL-Rs, מופעל בפלטפורמה המקרומולקולרית המתאימה, דיסק.
שני איזופורמים של פרוקספאז-8, כלומר פרוקספאז-8a (p55) ו -8b (p53), ידועים שגויסו ל- DISC5. שני האיזופורמים מורכבים משני מקרים של נזיפה. DED1 ו- DED2 ממוקמים בחלק N-terminal של procaspase-8a/b ואחריו הדומיינים הקטליטיים p18 ו- p10. ניתוח מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית מפורטת (cryo-EM) של ממסמכים מזהים פרוקספצאז-8 גילה את ההרכבה של חלבוני פרוקספאז-8 למבנים חוטיים הנקראים חוטי DED4,6. למרבה הפלא, רשתות הפרוקספסאז-8 הליניאריות הוצעו בתחילה לעסוק בדימרציה ואחריה הפעלת פרוקספסאז-8 בדיסק. עכשיו, זה ידוע כי רשתות אלה הם רק תת מבנה של חוט DED procaspase-8, האחרון מורכב שלוש שרשראות התאספו סליל משולש3,4,6,7.
עם עמעום בסימת DED, שינויים קונפורמציה procaspase-8a/b להוביל להיווצרות של המרכז הפעיל של procaspase-8 והפעלתו3,8. לאחר מכן עיבוד procaspase-8, אשר מתווך באמצעות שני מסלולים: הראשון עובר דרך הדור של מוצר מחשוף p43/p41 והשני באמצעות הדור הראשוני של מוצר מחשוף p30. מסלול p43/p41 הוא ביוזמת מחשוף של פרוקספז-8a/b ב Asp374, וכתוצאה מכך p43/p41 ו p12 מחשוף מוצרים(איור 2). יתר על כן, שברים אלה הם אוטומטית קטליטית בקע ב Asp384 ו Asp210/216, מה שמוליד היווצרות של הטרוטרמר קפסטה פעיל-8, p102/p1829,10,11. בנוסף, הוכח כי במקביל למסלול העיבוד p43/p41, פרוקספז-8a/b מבקע גם ב-Asp216, מה שמוביל להיווצרותו של מוצר המחשוף C-terminal p30, ואחריו הפרוטאוליזה שלו ל-p10 ו-p1810 (איור 2).
הפעלה של פרוקספאז-8a/b בסיבי DED מוסדרת בקפדנות על ידי חלבונים הנקראים c-FLIPs12. חלבוני C-FLIP מופיעים בשלושה איזופורמים: C-FLIPלונג (c-FLIPL),C-FLIPShort (c-FLIPS)ו-C-FLIPRaji (c-FLIPR). כל שלושת האיזופורמים מכילים שני מקרים של פענוחים באזור N-terminal שלהם. c-FLIPL כולל גם תחום דמוי קפטאז12,13. שני האיזופורמים הקצרים של C-FLIP-C-FLIPS ו- c-FLIPR- פועלים באופן אנטי-אפופטוטי על ידי שיבוש היווצרות חוט DED בדיסק6,14,15. בנוסף, c-FLIPL יכול לווסת את הפעלת caspase-8 באופן תלוי ריכוז. זה יכול לגרום הן אפקטים פרו-אנטיאפופטוטיים 16,17,18. על ידי יצירת פרוקספאז פעיל קטליטית-8/c-FLIPL הטרודימר, c-FLIPL מוביל לייצוב של המרכז הפעיל של פרוקספז-8 והפעלתו. הפונקציה pro- או אנטי אפופטוטי של c-FLIPL תלויה ישירות בכמות שלה בסיבי DED ואת הכמות הבאה של procaspase-8/c-FLIPL הטרודימרים19. ריכוזים נמוכים או בינוניים של C-FLIPL בדיסק גורמים לכמויות מספיקות של הטרודימרים פרוקספאז-8/c-FLIPL בסיעת DED, התומכת בהפעלה של caspase-8. לעומת זאת, כמויות מוגברות של c-FLIPL מובילות ישירות להשפעות האנטי-אפופטוטיות שלה בדיסק20.
יחד, ההפעלה ועיבוד של procaspase-8a/b בדיסק הוא תהליך מוסדר מאוד הכולל מספר שלבים. מאמר זה דן במדידת עיבוד procaspase-8 ישירות בדיסק, כמו גם בניתוח הרכב של קומפלקס זה. פעולה זו תוצג באמצעות תקליטור CD95 כמתחם DR למופת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בתאי T בוצעו על פי ההסכם האתי 42502-2-1273 Uni MD.
1. הכנת תאים לניסוי
הערה: המספר הממוצע של תאים עבור אימונופרציפיטציה זו הוא 1 × 107. תאים דבקים צריכים להיות זרע יום אחד לפני הניסוי, כך שיש 1 × 107 תאים ביום הניסוי.
- הכנת תאים חסידיים לניסוי
- זרע 5-8 × 106 תאים דבקים ב 20 מ"ל של בינוני (ראה טבלת החומרים עבור הרכב) עבור כל תנאי ב 14.5 ס"מ מנות יום אחד לפני תחילת הניסוי.
- ביום הניסוי, ודא כי התאים הם 80-90% משוחחים ודבקים במנה. יש להשליך את המדיום ולהוסיף מדיום טרי לתאים החסידים.
- הכנת תאי השעיה לניסוי
- בזהירות למקם 1 × 107 תאי השעיה ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (ראה את שולחן החומרים עבור הרכב) לכל תנאי 14.5 ס"מ מנות מיד לפני תחילת הניסוי.
- אם אתה משתמש בתאים ראשיים, בודד תאי T ראשיים בהתאם להליך המתואר קודם לכן21. לטפל בתאי T ראשוניים עם 1 מיקרוגרם / מ"ל פיטוהמגלוטינין עבור 24 שעות, ואחריו 25 U / mL IL2 טיפול במשך 6 ימים.
- יש למקם בזהירות 1 × 108 תאי T ראשוניים ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (ראה את טבלת החומרים עבור הרכב) לכל תנאי 14.5 ס"מ מנות מיד לפני תחילת הניסוי.
הערה: מומלץ מספר גבוה יותר זה של תאי T ראשיים, מכיוון שתאים אלה קטנים יותר.
2. גירוי CD95L
- לעורר את התאים עם CD95L (מיוצר כמתואר בעבר20 או זמין מסחרית (ראה טבלת החומרים)).
הערה: הריכוז של CD95L וזמן הגירוי הם תלויים בסוג התא13,15,22,23,24,25. הכן מצב גירוי אחד פעמיים כדי ליצור מדגם 'בקרת חרוזים' במקביל.- לעורר תאים חסידים עם הריכוז הנבחר של CD95L. החזק את הצלחת בזווית והזרימו את הליגנד למדיום מבלי לגעת בתאים החסידים.
- לעורר תאי השעיה עם CD95L על ידי צנרת פתרון ליגנד לתוך ההשעיה של התא.
3. קציר תאים ותסיסה
- מניחים את הכלים הסלולריים על קרח.
הערה: אל תמחק את המדיום. תאים גוססים צפים במדיום וחשובים לניתוח. - הוסף 10 מ"ל של תמיסת מלח קר פוספט חוצץ (PBS) להשעיית התא ולגרד את התאים המצורפים מהצלחת. לאסוף את ההשעיה התא בצינור 50 מ"ל.
- לשטוף את צלחת התא עם 10 מ"ל של PBS קר פעמיים ומניחים את פתרון לשטוף לתוך אותו צינור 50 מ"ל. צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F).
- להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של PBS קר. העבר את ההשעיה התאית לתוך צינור 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של PBS קר.
- צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של חוצץ תמיסת (המכיל 4% קוקטייל מעכב פרוטאז). לדגור אותו במשך 30 דקות על קרח.
- צנטריפוגות ליסאט במהירות מקסימלית (~ 17,000 × גרם)במשך 15 דקות, 4 °C (4 °F).
- מעבירים את הסופר-נט (ליסאט) לצינור נקי. להשליך את הכדור. קח 50 μL של ליסאט בצינור אחר. לנתח את ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay ולקחת את כמות ליסאט המקביל 25 מיקרוגרם של חלבון בלוויון. הוסף מאגר טעינה (עיין בטבלת החומרים עבור הרכב) ל- Vial. לאחסן אותו ב -20 °C (70 °F) כמו בקרת ליסייט.
4. אימונופרציפיטציה (IP)
- הוסף 2 μL של נוגדנים נגד APO-1 ו 10 μL של חלבון חרוזי ספרוז (מוכן כפי שהומלץ על ידי היצרן) ליסאט. הוסף רק 10 μL של החרוזים לצינור נפרד המכיל ליסאט (מדגם מגורה) כדי ליצור 'בקרת חרוזים'.
הערה: השתמש טיפים pipet עם פתחים רחבים או על ידי חיתוך הטיפים או קניית טיפים מיוחדים עבור IP תוך טיפול חלבון חרוזים ספרוז. - לדגור על התערובת של ליסאט עם נוגדנים / חלבון חרוזי ספרוז עם ערבוב עדין לילה ב 4 °C (70 °F). צנטריפוגה ליסאטים עם נוגדנים / חלבון חרוזי ספרוז ב 500 × גרם במשך 4 דקות, 4 °C (4 °F). להשליך את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של PBS קר חרוזים, ולחזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים.
- זרוק את סופר-טבעי. שאפו את החרוזים עדיף עם מזרק 50 μL המילטון.
5. כתם מערבי
- הוסף 20 μL של 4x חוצץ טעינה (ראה את טבלת החומרים עבור הרכב) לחרוזים וחום ב 95 °C (10 דקות). מחממים את פקדי הלסייט ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- העמיסו את ה-lysates, IPs ותקן החלבון על ג'ל נתרן דודסיל סולפט (SDS) ב-12.5% (ראו טבלת החומרים להכנת הג'ל) והפעלו במתח קבוע של 80 וולט.
- מעבירים את החלבונים מג'ל SDS לקרום ניטרוצלולוז.
הערה: כאן, הטכניקה היבשה למחצה, ממוטבת לחלבונים מעניינים, שימשה להעברה מעל 12 דקות (25 V; 2.5 A = קבוע). השרו את קרום הניטרוצלולוז ושתי ערימות העברה מיני-גודל במאגר אלקטרופורזה (ראו טבלת החומרים להרכב, היכונו בהתאם להוראות היצרן) במשך כמה דקות לפני הכתם המערבי. - מניחים את הממברנה הכתומה בקופסה וחוסמים אותה למשך שעה אחת בתמיסת חסימה (0.1% Tween-20 ב- PBS (PBST) + 5% חלב). לדגור על הממברנה עם פתרון חסימה תחת תסיסה עדינה.
- לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.
6. זיהוי כתם מערבי
- הוסף את הנוגדן העיקרי הראשון בדילול המצוין (ראה טבלת החומרים) לממברנה ודגר אותו למשך הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.
- לדגור את הממברנה עם 20 מ"ל של נוגדן משני (מדולל 1:10,000 PBST + 5% חלב) עם רועד עדין במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.
- להשליך PBST ולהוסיף כ 1 מ"ל של מצע peroxidase חזרת לממברנה.
- זהה את האות chemoluminescent (ראה טבלת החומרים).
הערה: זמן החשיפה ומספר התמונות שנתפסו תלויים בכמות החלבון בתא ודעת הספציפיות של הנוגדנים המשמשים. זה חייב להיות הוקם אמפירית עבור כל נוגדן המשמש לגילוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לנתח גיוס caspase-8 לדיסק ועיבודו בדיסק CD95, מאמר זה מתאר זרימת עבודה קלאסית, המשלבת IP של דיסק CD95 עם ניתוח כתם מערבי. הדבר מאפשר זיהוי של מספר תכונות מרכזיות של הפעלת caspase-8 בדיסק: ההרכבה של הפלטפורמה המקרומולקולרית המפעילה caspase-8, גיוס פרוקספז-8 ל- DISC ועיבוד של קספאז יוזם זה (איור 1 ואיור 2). זרימת עבודה זו כוללת טיפול בתאים רגישים עם CD95L באופן תלוי זמן, ואחריו תמוגה שלהם, immunoprecipitation באמצעות נוגדנים נגד CD95 (אנטי APO-1), וניתוח כתם מערבי לאחר מכן (איור 3).
סרטן צוואר הרחם HeLa-CD95 תאים שימשו כדוגמה לנתח את היווצרות הדיסק26. גירוי של תאים אלה עם CD95L הביא לרמה גבוהה של היווצרות CD95 DISC, מנוטר באמצעות CD95-immunoprecipitation (איור 4). CD95, FADD, procaspase-8, פרוקספז-10 ו- c-FLIPs נצפו ב- CD95-immunoprecipitations אלה, דבר המצביע על היווצרות דיסק יעילה. חשוב לציין, מוצרי המחשוף של פרוקספסאז-8a/b: p43/p41, p30 ו- p18 זוהו בדיסק, מה שמצביע על הפעלה של פרוקספסאז-8 ועיבודו לאחר מכן. בפרט, מוצרי המחשוף של procaspase-8 p43/p41 ו p18 זוהו, המציין את שני השלבים הנ"ל של מסלול העיבוד p43. בנוסף, מוצר p30 זוהה, המציין את המסלול החלופי של עיבוד caspase-8. יתר על כן, הפעלה של פרוקספסאז-8 בדיסק מלווה במחשוף של המצעים שלה כגון חלבוני C-FLIP.
ואכן, מוצרי המחשוף של c-FLIP-p43-FLIP ו-p22-FLIP-התגלו באימונופרנציות, מה שמצביע על הפעלת caspase-8(איור 4). חשוב לציין, לא FADD, procaspase-8, procaspase-10, ו c-FLIPs, ולא מוצרי המחשוף שלהם זוהו בדגימות אימונופרציפיטציה מתאים לא מטופלים, אשר מדגיש את הספציפיות של דיסק-immunoprecipitation (איור 4). ניתן לקבל מידע חשוב מניסויים אלה על ידי כימות הרצועות המתאימות למוצרי המחשוף השונים של פרוקספסאז-8 (איור 4). מידע זה יכול לשמש במודלים מתמטיים של רשתות אפופטוזיס ומספק תובנות כמותיות על ויסות מסלולים.
רמת הפעלת caspase-8 בדיסק מווסתתת על-ידי c-FLIPs. לפיכך, תאי HeLa-CD95 המפרסים יתר על המידה C-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 נבחרו כדוגמה השנייה(איור 5). ניתן היה לראות את ההשפעות של איזופורם C-FLIPL בניסויים אלה, וכתוצאה מכך שיעור שונה של עיבוד פרוקספאז-8a/b ל- p43/p41 בדיסק בהשוואה לפרוטוליזה המתאימה של פרוקספז-8 בדיסק בתאי HeLa-CD95 ההורים, כפי שתואר על ידי הילרט ואח '. 15.בדומה לתצפיות באיור 4,לא זוהה גיוס של FADD, פרוקספז-8, פרוקספסאז-10, חלבוני C-FLIP ומוצרי המחשוף שלהם התגלו בחלבונים אימונו-CD95-FL ללא טיפול CD95L, התומך בפרטים של חיסונים אלה. עדות נוספת לייחודיות של אימונופרציפיטציות היא היעדר גיוס של פרוקספז-3 ופולי (ADP-ריבוז)פולימראז 1 (PARP1) לדיסק, אשר נצפתה בחיסון שטופלו ב- CD95L (איור 5). חלבונים אלה אינם חלק מהתסביך, והיעדרם באותות האימונופרנציה יכול לשמש כהוכחה להיעדר כריכה לא-מינית של חלבונים תאיים שופעים.
לבסוף, חיסונים של CD95 DISC מתאי השעיה בוצעו כדוגמה שלישית, למשל, תאי T ראשיים שהופעלו(איור 6). תאים אלה מאופיינים גם ברמות גבוהות של CD95, FADD, פרוקספז-8, פרוקספאז-10 ו- c-FLIPs שנצפו ב- anti-CD95-immunoprecipitations יחד עם מוצרי המחשוף שלהם (איור 6). זיהוי של מוצרי מחשוף procaspase-8 ב immunoprecipitations מציין את ההפעלה ועיבוד של קספז יוזם זה ב- DISC-immunoprecipitation מתאי T ראשיים. ניסויים אלה מצביעים על כך שניתן לאמת את הדיסק מתאי חסידות והשעיה רבים וכי עיבוד והפעלה של caspase-8 יכולים להיות מאומתים על ידי ניתוח כתם מערבי.
איור 1: הצגה סכמטית של מסלול האיתות CD95. CD95L מפעיל את הרכבת הדיסק. הדיסק כולל CD95, FADD, פרוקספאז-8/-10 ו- c-FLIP. FADD נקשר ל- CD95 באמצעות ה- DD שלו, בעוד ש- procaspase-8, procaspase-10 ו- c-FLIPs מקיימים אינטראקציה באמצעות ה- DDs שלהם ויוצרים חוטי DED. היווצרות חוטי DED משמשת פלטפורמה לדמעום, עיבוד והפעלה לאחר מכן של פרוקספאז-8. ההטרוטרמר הפעיל caspase-8, עמ'18 2/p102,מפעיל את קספאז-3 על ידי מחשוף, מה שמוביל לאפופטוזיס. קיצורים: CD = אשכול של בידול; CD95L = ליגנד CD95; דיסק = תסביך איתות מעורר מוות; DD = תחום מוות; FADD= תחום המוות הקשור לפא; c-FLIP = אינטרלוקין תאי דמוי FADD (IL)-1β ממיר חלבון מעכב אנזימים; DED = תחום משפיע מוות; c-FLIPL = C-FLIPארוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עיבוד פרוקספאז-8 בדיסק. מוצגות שתי דרכים לעיבוד פרוקספאז-8a/b בדיסק. הדרך הראשונה כוללת דור p43/p41 ואחריו היווצרות p18. הדרך השנייה כוללת דור p30 ואחריו עיבוד ל p18 ו p10. השאריות ממוספרות לפי רצף הפרוקספסאז-8a. קיצורים: DED = תחום משפיע מוות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הצגה סכמטית של ההתקנה הניסיונית של ה-DISC-IP. תאים מגורה עם CD95L. לאחר גירוי, התאים נקצרים ונאספים, ואחריו צעדי כביסה שונים. לאחר מכן, התאים נשענים, והליסאטים נאספים. לאחר מכן, חרוזי חלבון A-ספרוז ונוגדנים נגד APO-1 (אנטי CD95) נוספו ליסאט ודגרה בן לילה. לאחר מספר צעדי כביסה, האימונופרנציות נותחו על ידי סופג מערבי. קיצורים: דיסק = תסביך איתות הגורמים למוות; IP = immunoprecipitation; CD95L = ליגנד CD95. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: היווצרות דיסק CD95 בתאי HeLa-CD95. תאי HeLa-CD95 היו מגורה עם 125 ng/mL CD95L במשך 30 דקות או 1 שעה CD95 DISC-IPs בוצעו באמצעות נוגדנים נגד APO-1 (אנטי CD95). הרכב ה-IPs נבדק על ידי ניתוח כתם מערבי באמצעות הנוגדנים לחלבונים המצוינים. Actin שימש כפקד טעינה. תשומות מוצגות. כימות של מוצרי מחשוף procaspase-8 בדיסק מוצג ומנורמל לאות CD95. קיצורים: כלומר = חשיפה ארוכה; s.e. = חשיפה קצרה; BC = שליטה IP עם 'חרוזים בלבד', ללא תוספת של נוגדנים; CD95L = ליגנד CD95; דיסק = תסביך איתות מעורר מוות; IP = immunoprecipitation; FADD = תחום מוות הקשור לפא; c-FLIP = אינטרלוקין תאי דמוי FADD (IL)-1β ממיר חלבון מעכב אנזימים; c-FLIPL = C-FLIPארוך; c-FLIPS = C-FLIPקצר; M = משקל מולקולרי בקילו דלטון (kDa). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: היווצרות דיסק CD95 בתאי HeLa-CD95 הממחישים יתר על המידה. תאי HeLa-CD95-FL היו מגורה עם 250 ng/ mL CD95L עבור נקודות הזמן שצוינו (1-3 שעות). CD95 DISC-IPs בוצעו באמצעות נוגדנים נגד APO-1 (אנטי CD95). הרכב שב"ס נבדק על ידי ניתוח כתם מערבי ונותח עבור החלבונים המצוינים. Actin שימש כפקד טעינה. תשומות מוצגות. כימות של מוצרי מחשוף procaspase-8 בדיסק מוצג ומנורמל לאות CD95. ניסוי מייצג אחד מתוך שניים מוצג. קיצורים: כלומר = חשיפה ארוכה; s.e. = חשיפה קצרה; BC = שליטה IP עם 'חרוזים בלבד', ללא תוספת של נוגדנים; CD95L = ליגנד CD95; דיסק = תסביך איתות מעורר מוות; IP = immunoprecipitation; FADD = תחום מוות הקשור לפא; c-FLIP = אינטרלוקין תאי דמוי FADD (IL)-1β ממיר חלבון מעכב אנזימים; c-FLIPL = C-FLIPארוך; PARP1 = פולי (ADP-ריבוז)פולימראז 1; M = משקל מולקולרי בקילו דלטון (kDa). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: היווצרות תקליטור CD95 בתאי T ראשיים. תאי T המופעלים העיקריים היו מגורה עם 500 ng/ mL CD95L במשך 15 דקות ו 30 דקות. CD95 DISC-IPs בוצעו באמצעות נוגדנים נגד APO-1 (אנטי CD95). הרכב שב"ס נבדק על ידי ניתוח כתם מערבי ונותח עבור החלבונים המצוינים. Actin שימש כפקד טעינה. כימות של מוצרי מחשוף procaspase-8 בדיסק מוצג ומנורמל לאות CD95. תשומות מוצגות. קיצורים: כלומר = חשיפה ארוכה; s.e. = חשיפה קצרה; ; CD95L = ליגנד CD95; דיסק = תסביך איתות מעורר מוות; IP = immunoprecipitation; FADD = תחום מוות הקשור לפא; c-FLIP = אינטרלוקין תאי דמוי FADD (IL)-1β ממיר חלבון מעכב אנזימים; c-FLIPL = C-FLIPארוך; M = משקל מולקולרי בקילו דלטון (kDa). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גישה זו תוארה לראשונה על ידי Kischkel ואח'27 ופותחה בהצלחה מאז על ידי מספר קבוצות. מספר נושאים חשובים יש לשקול עבור יעיל דיסק-immunoprecipitation וניטור בעיבוד caspase-8 במתחם זה.
ראשית, זה חיוני כדי לעקוב אחר כל שלבי הכביסה במהלך immunoprecipitation. חשוב במיוחד הם צעדי הכביסה הסופיים של חרוזי ספרוז וייבוש של חרוזי ספרוז. זה חייב להיעשות כראוי כדי להגדיל את יחס האות / רעש של immunoprecipitation, המאפשר זיהוי של גיוס ועיבוד caspase-8 ב- DISC. חשוב, עבור טכניקות אנליטיות רגישות מאוד, כגון ספקטרומטריית מסה, "צעד preclearing", הכולל את הדגירה של ליסאטים עם רק חרוזי ספרוז או נוגדנים בקרת איזוטיפ, יכול להיות חשוב גם בהפחתת הרעש. עם זאת, מספר מחקרים הראו כי צעד קדם-הפעלה זה אינו חיוני לאיתור גיוס caspase-8 לדיסק על ידי מערב סופג7,23. עם זאת, כאמור, שטיפת החרוזים בסוף אימונופרציפיטציה חיונית להשגת תוצאות אמינות. כריכה לא ספציפית של חלבונים תאיים שופעים לחרוזי הספרדים יכולה למעשה להקטין את האותות הספציפיים של רכיבי הליבה של הדיסק. כבקרה חשובה להיעדר הכריכה הלא-מדעית, ניתוח כתם מערבי של החלבונים, שדווח כי אינו נוכח בדיסק, עשוי להתבצע. דוגמה לניתוח זה ניתנת באיור 5, שבו לא נצפתה גיוס של PARP1 ו-caspase-3 ל-DISC-immunoprecipitation. זה מציין את הספציפיות של אימונופרציפיטציה מסוימת ושטיפה מספקת של חרוזי ספרוז במהלך הניסוי.
שנית, חשוב לבצע בקרות שליליות כגון שליטה חרוזים בלבד או בקרת אימונופרציפיטציה עם נוגדן עם איזוטיפ זהה לזה של הנוגדן המשמש עבור immunoprecipitation. עבור נוגדנים נגד APO-1, נוגדנים נגד עכבר IgG3 יכולים לשמש כבקרת איזוטיפ. שלישית, חשוב לעקוב אחר התוצאות של אימונופריציה מדגימות לא מטופלות, שבהן רק CD95 צריך להיות נצפה. זיהוי של FADD, c-FLIP או procaspase-8 בדגימות אלה בדרך כלל מצביע על נוכחות של כמה חסרונות בפרוטוקול immunoprecipitation או צעדי כביסה. זה יכול להוליד הנחות על שיוך בלתי תלוי גירוי של FADD או c-FLIP עם CD95, אשר עשוי להיות לא לגמרי נכון, ובמקום זאת להצביע על פגמים immunoprecipitation. רביעית, עבור כל אימונופרציפיטציה, יש לנתח בקפידה את התשומות או ה- lysates במקביל כדי למדוד את הביטוי ואת השינויים הפוסט-לאומיים של חלבוני הליבה המנותחים על ידי אימונופרציפיטציה.
חמישית, ניתוח תלוי זמן מאפשר לעקוב אחר שינויים במתחם לאורך זמן ומספק אישור חשוב נוסף על הספציפיות של החלבונים שגויסו למתחם. בהקשר זה, בעיה חשובה היא שלכל קו תא יש רמה שונה של ביטוי CD95 ושל רכיבים תאיים של קומפלקס זה. בהתאם, יש לקבוע בקפידה את התזמון המדויק של היווצרות הדיסק CD95 עבור כל סוג תא מסוים. לבסוף, הנושא המכריע לניתוח הדינמיקה של הדיסק הוא השוואת כמות החלבון בכל אימונופרציפיטציה. עבור CD95 DISC-immunoprecipitations המבוצעים באמצעות נוגדנים נגד APO-1, כמות CD95 היא מדד מרכזי של הכמות השווה של המתחמים המושווים. זה עלול להיות קשה מכיוון שעוצמת אות CD95 ב- immunoprecipitations גבוהה יחסית. עם זאת, יש למצוא את מרווח הזמן האופטימלי למדידת אות הכתם המערבי המתאים. מכשול נוסף הוא כי CD95 הוא חלבון גליקוסילציה מאוד, אשר גם תורם לקשיים בזיהויו immunoprecipitation בשל נוכחות של דפוס מסוים של כמה להקות "מטושטשות"28.
ניתוח אימונופרציפיטציה של DISC מספק בסיס אופטימלי לזיהוי הפעלה ועיבוד של סף. ואכן, אימונופרציפיטציה בשילוב עם סופג מערבי מאפשרת זיהוי כמותי של מוצרי מחשוף של פרוקספז-8a/b: p43/p41, p30 ו-p18, כפי שמוצג במחקר זה (איור 4, איור 5 ואיור 6). זה, בתורו, מאפשר לנסיינים לעקוב אחר שינויים בעיבוד procaspase-8a/b לאורך זמן ולהבחין בשלבי מחשוף שונים של פרוקספסאז-8. גישה זו שימשה בהצלחה לתיאור הפעלת caspase-8 במודלים מתמטיים ולהבחנה בין עיבוד פרוקספז-8 בין-עיני ב- DISC7,20,29. יתר על כן, למדידת מוצרי מחשוף caspase-8 על ידי סופג מערבי יש יתרונות ברורים בהשוואה לבדיקות הפעילות הקונבנציונליות caspase-8 המבוססות על מצע IETD. במקרה האחרון, נקבע היטב כי IETD משמש גם כמצע עבור הקספסים האחרים. לפיכך, יש ראיות הולכות וגדלות כי זיהוי פעילות IETD מצביע על עלייה כללית בפעילות caspase בתא. לעומת זאת, באמצעות ניתוח כתם מערבי יכול לעזור במיוחד להקצות את הרצועות המתאימות בכתם המערבי ל caspase-8, ומאפשר לחוקר להיות בטוח כי caspase-8 מופעל במתחם זה. יתר על כן, כאמור, מדידת עיבוד caspase-8 בדיסק מהווה כלי מצוין ללימודי ביולוגיה של מידול מתמטי ומערכות. יחד, זרימת עבודה קלאסית מוצגת כדי לאפשר ניטור של שלבים שונים של הפעלה ועיבוד procaspase-8, אשר חיוני כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים של מוות תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים בקרן וילהלם סנדר (2017.008.02), המרכז למערכות דינמיות (CDS), הממומן על ידי תוכנית האיחוד האירופי ERDF (הקרן האירופית לפיתוח אזורי) ו- DFG (LA 2386) לתמיכה בעבודתנו. אנו מודים לקרינה גוטק על תמיכתה בניסויים שלנו. אנו מודים לפרופ' דירק ריינהולד (OvGU, מגדבורג) על כך שסיפק לנו תאי T ראשוניים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
