Summary
Hier wordt een experimentele workflow gepresenteerd die de detectie van caspase-8-verwerking direct bij het death-inducerende signaleringscomplex (DISC) mogelijk maakt en de samenstelling van dit complex bepaalt. Deze methodologie heeft brede toepassingen, van het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van celdoodroutes tot de dynamische modellering van apoptosenetwerken.
Abstract
Extrinsieke apoptose wordt gemedieerd door de activering van doodsreceptoren (DRs) zoals CD95 / Fas / APO-1 of tumornecrosefactor-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL) - receptor 1 / receptor 2 (TRAIL-R1 / R2). Stimulatie van deze receptoren met hun verwante liganden leidt tot de assemblage van het dood-inducerende signaleringscomplex (DISC). DISC bestaat uit DR, het adaptoreiwit Fas-geassocieerd eiwit met death domain (FADD), procaspases-8/-10 en cellulaire FADD-achtige interleukine (IL)-1β-converterende enzym-remmende eiwitten (c-FLIPs). De DISC dient als platform voor procaspase-8 verwerking en activering. Dit laatste gebeurt via zijn dimerisatie/oligomerisatie in de death effector domain (DED) filamenten geassembleerd op de DISC.
Activering van procaspase-8 wordt gevolgd door de verwerking ervan, die in verschillende stappen plaatsvindt. In dit werk wordt een gevestigde experimentele workflow beschreven die de meting van DISC-vorming en de verwerking van procaspase-8 in dit complex mogelijk maakt. De workflow is gebaseerd op immunoprecipitatietechnieken die worden ondersteund door western blot-analyse. Deze workflow maakt zorgvuldige monitoring van verschillende stappen van procaspase-8-rekrutering voor de DISC en de verwerking ervan mogelijk en is zeer relevant voor het onderzoeken van moleculaire mechanismen van extrinsieke apoptose.
Introduction
Een van de best bestudeerde doodsreceptoren (DRs) is CD95 (Fas, APO-1). De extrinsieke apoptotische route begint met de interactie van de DR met zijn verwante ligand, d.w.z. CD95L interageert met CD95 of TRAIL bindt aan TRAIL-R's. Dit resulteert in de vorming van de DISC bij de overeenkomstige DR. DISC bestaat uit CD95, FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP eiwitten1,2. Bovendien wordt de DISC geassembleerd door interacties tussen death domain (DD)-bevattende eiwitten, zoals CD95 en FADD, en DED-bevattende eiwitten zoals FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP(Figuur 1). Procaspase-8 ondergaat oligomerisatie via associatie van zijn DED's, wat resulteert in de vorming van DED-filamenten, gevolgd door procaspase-8 activering en verwerking. Dit veroorzaakt een caspase cascade, wat leidt tot celdood (Figuur 1)3,4. Procaspase-8 is dus een centrale initiator caspase van de extrinsieke apoptoseroute gemedieerd door CD95 of de TRAIL-R's, geactiveerd op het overeenkomstige macromoleculaire platform, DISC.
Van twee isovormen van procaspase-8, namelijk procaspase-8a (p55) en -8b (p53), is bekend dat ze worden gerekruteerd voor de DISC5. Beide isovormen bestaan uit twee DED's. DED1 en DED2 bevinden zich op het N-terminale deel van procaspase-8a/b gevolgd door de katalytische p18- en p10-domeinen. Gedetailleerde cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) analyse van procaspase-8 DEDs onthulde de assemblage van procaspase-8-eiwitten in filamenteuze structuren genaamd DED-filamenten4,6. Opmerkelijk genoeg werd aanvankelijk gesuggereerd dat de lineaire procaspase-8-ketens betrokken waren bij de dimerisatie gevolgd door procaspase-8-activering op de DISC. Nu is bekend dat die ketens slechts een onderbouw zijn van het procaspase-8 DED-filament, waarbij de laatste bestaat uit drie ketens geassembleerd tot een drievoudige helix3,4,6,7.
Bij dimerisatie bij het DED-filament leiden conformationele veranderingen in procaspase-8a/b tot de vorming van het actieve centrum van procaspase-8 en de activering ervan3,8. Dit wordt gevolgd door procaspase-8-verwerking, die via twee paden wordt gemedieerd: de eerste gaat via de generatie van een p43 / p41-splitsingsproduct en de tweede via de eerste generatie van een p30-splitsingsproduct. De p43/p41-route wordt geïnitieerd door de splitsing van procaspase-8a/b bij Asp374, wat resulteert in p43/p41- en p12-splitsingsproducten(figuur 2). Verder worden deze fragmenten autokatalytisch gesplitst bij Asp384 en Asp210/216, wat aanleiding geeft tot de vorming van het actieve caspase-8 heterotetrameer, p102/ p1829,10,11. Bovendien werd aangetoond dat parallel aan de p43/p41-verwerkingsroute procaspase-8a/b ook wordt gesplitst bij Asp216, wat leidt tot de vorming van het C-terminale splitsingsproduct p30, gevolgd door de proteolyse tot p10 en p1810 (figuur 2).
Procaspase-8a/b activering bij het DED filament wordt strikt gereguleerd door eiwitten genaamd c-FLIPs12. De c-FLIP-eiwitten komen voor in drie isovormen: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)en c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle drie de isovormen bevatten twee DED's in hun N-terminale regio. c-FLIPL heeft ook een C-terminal katalytisch inactief caspase-achtig domein12,13. Beide korte isovormen van c-FLIP-c-FLIPS en c-FLIPRwerken op een anti-apoptotische manier door de vorming van DED-filamenten op de DISC6,14,15te verstoren. Bovendien kan c-FLIPL de activering van caspase-8 op een concentratieafhankelijke manier regelen. Dit kan resulteren in zowel pro- als anti-apoptotische effecten16,17,18. Door het katalytisch actieve procaspase-8/c-FLIPL heterodimeer te vormen, leidt c-FLIPL tot de stabilisatie van het actieve centrum van procaspase-8 en de activering ervan. De pro- of anti-apoptotische functie van c-FLIPL is direct afhankelijk van de hoeveelheid bij de DED-filamenten en de daaropvolgende hoeveelheid geassembleerde procaspase-8/c-FLIPL heterodimeren19. Lage of intermediaire concentraties c-FLIPL bij de DISC resulteren in voldoende hoeveelheden procaspase-8/c-FLIPL heterodimeren bij het DED-filament, wat de activering van caspase-8 ondersteunt. Daarentegen leiden verhoogde hoeveelheden c-FLIPL direct tot de anti-apoptotische effecten op de DISC20.
Alles bij elkaar genomen is de activering en verwerking van procaspase-8a/b bij de DISC een sterk gereguleerd proces dat verschillende stappen omvat. Dit artikel bespreekt de meting van procaspase-8-verwerking direct op de DISC en de analyse van de samenstelling van dit complex. Dit zal worden gepresenteerd met behulp van CD95 DISC als het voorbeeldige DR-complex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
T-cel experimenten werden uitgevoerd volgens de ethische overeenkomst 42502-2-1273 Uni MD.
1. Cellen voorbereiden voor het experiment
OPMERKING: Het gemiddelde aantal cellen voor deze immunoprecipitatie is 1 × 107. Adherente cellen moeten een dag voor het experiment worden gezaaid, zodat er op de dag van het experiment 1 ×10 7 cellen zijn.
- Hechte cellen voorbereiden voor het experiment
- Zaad 5-8 × 106 aanhangende cellen in 20 ml medium (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) voor elke voorwaarde in schalen van 14,5 cm een dag voordat het experiment begint.
- Zorg er op de dag van het experiment voor dat de cellen voor 80-90% confluent zijn en zich hechten aan het gerecht. Gooi het medium weg en voeg vers medium toe aan de aanhangende cellen.
- Suspensiecellen voorbereiden voor het experiment
- Plaats zorgvuldig 1 × 107 suspensiecellen in 10 ml kweekmedium (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) per conditie in schalen van 14,5 cm vlak voordat het experiment begint.
- Als u primaire cellen gebruikt, isoleer dan primaire T-cellen volgens de eerder beschreven procedure21. Behandel primaire T-cellen met 1 μg / ml fytohemagglutinine gedurende 24 uur, gevolgd door 25 U / ml IL2-behandeling gedurende 6 dagen.
- Plaats zorgvuldig 1 × 108 primaire T-cellen in 10 ml kweekmedium (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) per voorwaarde in schalen van 14,5 cm vlak voordat het experiment begint.
OPMERKING: Dit hogere aantal primaire T-cellen wordt aanbevolen, omdat deze cellen kleiner zijn.
2. CD95L stimulatie
- Stimuleer de cellen met CD95L (geproduceerd zoals eerder beschreven20 of in de handel verkrijgbaar (zie de tabel met materialen)).
OPMERKING: De concentratie van de CD95L en de tijd van stimulatie zijn celtype afhankelijkvan 13,15,22,23,24,25. Bereid twee keer één stimulatieconditie voor om parallel een 'bead control'-monster te genereren.- Stimuleer aanhangende cellen met de geselecteerde concentratie CD95L. Houd de plaat onder een hoek en pipetteer het ligand in het medium zonder de aanhangende cellen aan te raken.
- Stimuleer suspensiecellen met CD95L door de ligandoplossing in de celsuspensie te pipetteren.
3. Celoogst en lysis
- Zet de celschalen op ijs.
OPMERKING: Gooi het medium niet weg. Stervende cellen drijven in het medium en zijn belangrijk voor de analyse. - Voeg 10 ml koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de celsuspensie en schraap de aangesloten cellen van de plaat. Verzamel de celsuspensie in een buis van 50 ml.
- Was de celschaal tweemaal met 10 ml koude PBS en plaats de wasoplossing in dezelfde buis van 50 ml. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met 1 ml koude PBS. Breng de celsuspensie over in een buis van 1,5 ml.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met 1 ml koude PBS.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met 1 ml lysisbuffer (met 4% proteaseremmercocktail). Incubeer het gedurende 30 minuten op ijs.
- Centrifugeer het lysaat met maximale snelheid (~17.000 × g) gedurende 15 min, 4 °C.
- Breng het supernatant (lysaat) over in een schone buis. Gooi de pellet weg. Neem 50 μL van het lysaat in een andere buis. Analyseer de eiwitconcentratie door Bradford-test en neem de hoeveelheid lysaat die overeenkomt met 25 μg eiwit in een injectieflacon. Voeg de laadbuffer (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) toe aan de injectieflacon. Bewaren bij -20 °C als lysaatcontrole.
4. Immunoprecipitatie (IP)
- Voeg 2 μL anti-APO-1-antilichamen en 10 μL eiwit A sepharose-kralen (bereid zoals aanbevolen door de fabrikant) toe aan het lysaat. Voeg slechts 10 μL van de kralen toe aan een aparte buis met lysaat (gestimuleerd monster) om een 'kraalcontrole' te genereren.
OPMERKING: Gebruik pipetpunten met brede openingen door de uiteinden te snijden of speciale tips voor IP te kopen tijdens het hanteren van het eiwit A sepharose kralen. - Incubeer het mengsel van lysaat met antilichamen/eiwit A sepharose kralen met zachte menging gedurende de nacht bij 4 °C. Centrifugeer de lysaten met antilichamen/eiwit A sepharose kralen bij 500 × g gedurende 4 min, 4 °C. Gooi het supernatant weg, voeg 1 ml koude PBS toe aan de kralen en herhaal deze stap minstens drie keer.
- Gooi het supernatant weg. Zuig de kralen bij voorkeur op met een Hamilton spuit van 50 μL.
5. Western blot
- Voeg 20 μL van 4x belastingsbuffer (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) toe aan de kralen en verwarm gedurende 10 minuten bij 95 °C. Verwarm de lysaatregelaars gedurende 5 minuten op 95 °C.
- Laad de lysaten, IP's en een eiwitstandaard op een 12,5% natriumdodecylsulfaat (SDS) gel (zie de tabel met materialen voor het gelpreparaat) en voer uit met een constante spanning van 80 V.
- Breng de eiwitten van de SDS-gel over naar een nitrocellulosemembraan.
OPMERKING: Hier werd de halfdroge techniek, geoptimaliseerd voor de eiwitten van belang, gebruikt voor de overdracht gedurende 12 minuten (25 V; 2,5 A = constant). Week het nitrocellulosemembraan en twee mini-formaat transfer stacks in elektroforesebuffer (zie de tabel met materialen voor de samenstelling, bereid volgens de instructies van de fabrikant) gedurende een paar minuten voor western blotting. - Plaats het afgeveegde membraan in een doos en blokkeer het gedurende 1 uur in de blokkerende oplossing (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% melk). Incubeer het membraan met de blokkerende oplossing onder zachte agitatie.
- Was het membraan drie keer met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
6. Western blot detectie
- Voeg het eerste primaire antilichaam bij de aangegeven verdunning (zie de tabel met materialen) toe aan het membraan en incubeer het gedurende een nacht bij 4 °C met zachte agitatie.
- Was het membraan drie keer met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Incubeer het membraan met 20 ml secundair antilichaam (verdund 1:10.000 in PBST + 5% melk) met zacht schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was het membraan drie keer met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Gooi PBST weg en voeg ongeveer 1 ml mierikswortelperoxidasesubstraat toe aan het membraan.
- Detecteer het chemoluminescente signaal (zie de tabel met materialen).
OPMERKING: De belichtingstijd en het aantal vastgelegde beelden zijn afhankelijk van de hoeveelheid eiwit in de cel en de specificiteit van de gebruikte antilichamen. Het moet empirisch worden vastgesteld voor elk antilichaam dat voor de detectie wordt gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om caspase-8-rekrutering voor de DISC en de verwerking ervan op de CD95 DISC te analyseren, beschrijft dit artikel een klassieke workflow, die IP van de CD95 DISC combineert met western blot-analyse. Dit maakt de detectie van verschillende belangrijke kenmerken van caspase-8 activering op de DISC mogelijk: de assemblage van het caspase-8-activerende macromoleculaire platform, rekrutering van procaspase-8 voor de DISC en de verwerking van deze initiator caspase (Figuur 1 en Figuur 2). Deze workflow omvat de behandeling van gevoelige cellen met CD95L op een tijdsafhankelijke manier, gevolgd door hun lysis, immunoprecipitatie met behulp van anti-CD95 (anti-APO-1) antilichamen en daaropvolgende western blot-analyse (figuur 3).
Baarmoederhalskanker HeLa-CD95-cellen werden als voorbeeld gebruikt om de DISC-formatie te analyseren26. Stimulatie van deze cellen met CD95L resulteerde in een hoge mate van CD95 DISC-vorming, gecontroleerd via CD95-immunoprecipitatie(figuur 4). CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 en c-FLIPs werden waargenomen in deze CD95-immunoprecipitaties, wat wijst op efficiënte DISC-vorming. Belangrijk is dat de splitsingsproducten van procaspase-8a /b: p43 / p41, p30 en p18 werden gedetecteerd op de DISC, wat duidt op activering van procaspase-8 en de daaropvolgende verwerking ervan. In het bijzonder werden de splitsingsproducten van procaspase-8 p43/p41 en p18 gedetecteerd, wat de twee bovengenoemde stappen van de p43-verwerkingsroute aangeeft. Bovendien werd het p30-product gedetecteerd, wat de alternatieve route van caspase-8-verwerking aangeeft. Bovendien wordt activering van procaspase-8 op de DISC gevolgd door de splitsing van zijn substraten zoals c-FLIP-eiwitten.
Inderdaad, de splitsingsproducten van c-FLIP-p43-FLIP en p22-FLIP-werden gedetecteerd in de immunoprecipitaties, wat wijst op caspase-8-activering (figuur 4). Belangrijk is dat noch FADD, procaspase-8, procaspase-10 en c-FLIPs, noch hun splitsingsproducten werden gedetecteerd in de immunoprecipitatiemonsters van onbehandelde cellen, wat de specificiteit van DISC-immunoprecipitatie onderstreept (figuur 4). Uit deze experimenten kan belangrijke informatie worden verkregen door de banden te kwantificeren die overeenkomen met de verschillende splitsingsproducten van procaspase-8 (figuur 4). Deze informatie kan worden gebruikt in de wiskundige modellering van apoptosenetwerken en biedt kwantitatieve inzichten in routeregulatie.
Het niveau van caspase-8 activering op de DISC wordt gemoduleerd door c-FLIPs. Vandaar dat HeLa-CD95-cellen die c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 overexpressie geven, als tweede voorbeeld werden geselecteerd (Figuur 5). De effecten van de c-FLIP L-isovorm in deze experimenten konden worden waargenomen, wat resulteerde in een andere snelheid van procaspase-8a / b-verwerking dan p43 / p41 op de DISC in vergelijking met de overeenkomstige proteolyse van procaspase-8 op de DISC in ouderlijke HeLa-CD95-cellen, zoals beschreven door Hillert et al. 15. Vergelijkbaar met de waarnemingen in figuur 4, werd geen rekrutering van FADD, procaspase-8, procaspase-10, c-FLIP-eiwitten en hun splitsingsproducten gedetecteerd in de immunoprecipitaties van HeLa-CD95-FL-cellen zonder CD95L-behandeling, wat de specificiteit van deze immunoprecipitaties ondersteunt. Meer bewijs voor de specificiteit van immunoprecipitaties is de afwezigheid van de rekrutering van procaspase-3 en poly(ADP-ribose)polymerase 1 (PARP1) voor de DISC, die werd waargenomen in de met CD95L behandelde immunoprecipitaties(figuur 5). Deze eiwitten maken geen deel uit van het complex en hun afwezigheid in de immunoprecipitatiesignalen kan dienen als bewijs voor de afwezigheid van niet-specifieke binding van overvloedige cellulaire eiwitten.
Ten slotte werden immunoprecipitaties van CD95 DISC uit suspensiecellen uitgevoerd als een derde voorbeeld, bijvoorbeeld geactiveerde primaire T-cellen (figuur 6). Deze cellen worden ook gekenmerkt door hoge niveaus van CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 en c-FLIPs die werden waargenomen in anti-CD95-immunoprecipitaties samen met hun splitsingsproducten (Figuur 6). De detectie van procaspase-8 splitsingsproducten in de immunoprecipitaties duidt op de activering en verwerking van dit initiator caspase in de DISC-immunoprecipitatie van primaire T-cellen. Deze experimenten geven aan dat de DISC immunoprecipitatie kan worden verkregen uit vele adherente en suspensiecellen en dat caspase-8 verwerking en activering kan worden gevalideerd door western blot-analyse.
Figuur 1: Schematische weergave van de CD95 signaleringsroute. CD95L activeert de DISC-assembly. De DISC bestaat uit CD95, FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP. FADD bindt zich aan CD95 via zijn DD, terwijl procaspase-8, procaspase-10 en c-FLIPs interageren via hun DED's en DED-filamenten vormen. Vorming van de DED-filamenten dient als een platform voor procaspase-8 dimerisatie, verwerking en daaropvolgende activering. Het actieve caspase-8 heterotetrameer, p182/p102, activeert caspase-3 door splitsing, wat leidt tot apoptose. Afkortingen: CD = cluster van differentiatie; CD95L = CD95 ligand; DISC = doodsopwekkend signaleringscomplex; DD = overlijdensdomein; FADD= Fas-geassocieerd overlijdensdomein; c-FLIP = cellulair FADD-achtig interleukine (IL)-1β-converterend enzym-remmend eiwit; DED = death effector domein; c-FLIPL = c-FLIPLang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Procaspase-8 verwerking op de DISC. Twee manieren van procaspase-8a/b verwerking op de DISC worden getoond. De eerste manier omvat p43 / p41-generatie gevolgd door p18-vorming. De tweede manier omvat p30-generatie gevolgd door de verwerking ervan naar p18 en p10. De residuen zijn genummerd volgens de volgorde van procaspase-8a. Afkortingen: DED = death effector domain. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematische presentatie van de experimentele opstelling van de DISC-IP. Cellen worden gestimuleerd met CD95L. Na stimulatie worden de cellen geoogst en verzameld, gevolgd door verschillende wasstappen. De cellen worden vervolgens gelyseerd en de lysaten worden verzameld. Vervolgens werden eiwit A-sepharose kralen en anti-APO-1 (anti-CD95) antilichamen toegevoegd aan het lysaat en 's nachts geïncubeerd. Na verschillende wasstappen werden de immunoprecipitaties geanalyseerd door western blotting. Afkortingen: DISC = death-inducing signaling complex; IP = immunoprecipitatie; CD95L = CD95 ligand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: CD95 DISC-formatie in HeLa-CD95 cellen. HeLa-CD95 cellen werden gestimuleerd met 125 ng/ml CD95L gedurende 30 min of 1 h. CD95 DISC-IP's werden uitgevoerd met behulp van anti-APO-1 (anti-CD95) antilichamen. De samenstelling van de IP's werd onderzocht door western blot-analyse met behulp van de antilichamen voor de geïndiceerde eiwitten. Actine werd gebruikt als een belastingscontrole. Ingangen worden weergegeven. Kwantificering van procaspase-8 splitsingsproducten op de DISC wordt getoond en genormaliseerd naar CD95-signaal. Afkortingen: l.e. = lange belichtingstijd; s.e. = korte blootstelling; BC = controle-IP met 'beads-only', zonder toevoeging van antilichamen; CD95L = CD95 ligand; DISC = doodsopwekkend signaleringscomplex; IP = immunoprecipitatie; FADD = Fas-geassocieerd overlijdensdomein; c-FLIP = cellulair FADD-achtig interleukine (IL)-1β-converterend enzym-remmend eiwit; c-FLIPL = c-FLIPLang; c-FLIPS = c-FLIPKort; M = molecuulgewicht in kiloDalton (kDa). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: CD95 DISC-vorming in c-FLIPL-overexpressie HeLa-CD95 cellen. HeLa-CD95-FL cellen werden gestimuleerd met 250 ng/ml CD95L voor de aangegeven tijdspunten (1-3 uur). CD95 DISC-IP's werden uitgevoerd met behulp van anti-APO-1 (anti-CD95) antilichamen. De samenstelling van de IP's werd onderzocht door western blot-analyse en geanalyseerd op de geïndiceerde eiwitten. Actine werd gebruikt als een belastingscontrole. Ingangen worden weergegeven. Kwantificering van procaspase-8 splitsingsproducten op de DISC wordt getoond en genormaliseerd naar het CD95-signaal. Eén representatief experiment op twee wordt getoond. Afkortingen: l.e. = lange belichtingstijd; s.e. = korte blootstelling; BC = controle-IP met 'beads-only', zonder toevoeging van antilichamen; CD95L = CD95 ligand; DISC = doodsopwekkend signaleringscomplex; IP = immunoprecipitatie; FADD = Fas-geassocieerd overlijdensdomein; c-FLIP = cellulair FADD-achtig interleukine (IL)-1β-converterend enzym-remmend eiwit; c-FLIPL = c-FLIPLang; PARP1 = poly(ADP-ribose)polymerase 1; M = molecuulgewicht in kiloDalton (kDa). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: CD95 DISC-vorming in primaire T-cellen. Primair geactiveerde T-cellen werden gestimuleerd met 500 ng/ml CD95L gedurende 15 min en 30 min. CD95 DISC-IP's werden uitgevoerd met anti-APO-1 (anti-CD95) antilichamen. De samenstelling van de IP's werd onderzocht door western blot-analyse en geanalyseerd op de geïndiceerde eiwitten. Actine werd gebruikt als een belastingscontrole. Kwantificering van procaspase-8 splitsingsproducten op de DISC wordt getoond en genormaliseerd naar het CD95-signaal. Ingangen worden weergegeven. Afkortingen: l.e. = lange belichtingstijd; s.e. = korte blootstelling; ; CD95L = CD95 ligand; DISC = doodsopwekkend signaleringscomplex; IP = immunoprecipitatie; FADD = Fas-geassocieerd overlijdensdomein; c-FLIP = cellulair FADD-achtig interleukine (IL)-1β-converterend enzym-remmend eiwit; c-FLIPL = c-FLIPLang; M = molecuulgewicht in kiloDalton (kDa). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze benadering werd voor het eerst beschreven door Kischkel et al.27 en is sindsdien met succes ontwikkeld door verschillende groepen. Verschillende belangrijke kwesties moeten worden overwogen voor efficiënte DISC-immunoprecipitatie en monitoring caspase-8-verwerking in dit complex.
Ten eerste is het essentieel om alle wasstappen tijdens immunoprecipitatie te volgen. Vooral belangrijk zijn de laatste wasstappen van de sepharose kralen en het drogen van de sepharose kralen. Dit moet correct gebeuren om de signaal/ruisverhouding van immunoprecipitatie te verhogen, waardoor caspase-8-rekrutering en -verwerking op de DISC kunnen worden gedetecteerd. Belangrijk is dat voor zeer gevoelige analytische technieken, zoals massaspectrometrie, een "preclearing-stap", die de incubatie van de lysaten met alleen de sepharose-kralen of isotypecontrole-antilichamen omvat, ook belangrijk kan zijn bij het verminderen van de ruis. Verschillende studies hebben echter aangetoond dat deze preclearing stap niet essentieel is voor de detectie van caspase-8 rekrutering voor de DISC door western blotting7,23. Zoals vermeld, is het wassen van de kralen aan het einde van immunoprecipitatie echter essentieel voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. Niet-specifieke binding van overvloedige cellulaire eiwitten aan de sepharose-kralen kan in wezen de specifieke signalen van de kern-DISC-componenten verminderen. Als een belangrijke controle voor de afwezigheid van de niet-specifieke binding, kan western blot-analyse van de eiwitten, waarvan wordt gemeld dat ze niet aanwezig zijn op de DISC, worden uitgevoerd. Een voorbeeld van deze analyse wordt gegeven in figuur 5, waarin de rekrutering van PARP1 en caspase-3 voor de DISC-immunoprecipitatie niet werd waargenomen. Dit duidt op de specificiteit van de specifieke immunoprecipitatie en voldoende wassen van de sepharose kralen tijdens het experiment.
Ten tweede is het cruciaal om negatieve controles uit te voeren, zoals een controle met alleen kralen of een immunoprecipitatiecontrole met een antilichaam met hetzelfde isotype als het antilichaam dat wordt gebruikt voor de immunoprecipitatie. Voor anti-APO-1-antilichamen kunnen anti-muis IgG3-antilichamen worden gebruikt als isotypecontrole. Ten derde is het belangrijk om de resultaten van de immunoprecipitatie van onbehandelde monsters te controleren, waarbij alleen CD95 moet worden waargenomen. De detectie van FADD, c-FLIP of procaspase-8 in deze monsters duidt meestal op de aanwezigheid van enkele tekortkomingen in het immunoprecipitatieprotocol of wasstappen. Dit zou aanleiding kunnen geven tot aannames over de stimulatie-onafhankelijke associatie van FADD of c-FLIP met CD95, die mogelijk niet helemaal correct zijn en in plaats daarvan wijzen op gebreken in immunoprecipitatie. Ten vierde moeten voor elke immunoprecipitatie de inputs of lysaten zorgvuldig parallel worden geanalyseerd om de expressie en posttranslationele modificaties van de kerneiwitten geanalyseerd door immunoprecipitatie te meten.
Ten vijfde maakt tijdsafhankelijke analyse het mogelijk om veranderingen in het complex in de loop van de tijd te volgen en geeft nog een andere belangrijke bevestiging van de specificiteit van de eiwitten die in het complex worden gerekruteerd. In dit opzicht is een belangrijke kwestie dat elke cellijn een ander niveau van CD95-expressie en van intracellulaire componenten van dit complex heeft. Dienovereenkomstig moet de exacte timing van de CD95 DISC-formatie zorgvuldig worden vastgesteld voor elk specifiek celtype. Ten slotte is de cruciale kwestie voor de analyse van de DISC-dynamiek de vergelijking van de hoeveelheid eiwit in elke immunoprecipitatie. Voor CD95 DISC-immunoprecipitaties uitgevoerd met behulp van anti-APO-1 antilichamen, is de hoeveelheid CD95 een belangrijke maat voor de gelijke hoeveelheid van de complexen die worden vergeleken. Dit kan moeilijk zijn omdat de intensiteit van het CD95-signaal in de immunoprecipitaties relatief hoog is. Men moet echter het optimale tijdsinterval vinden voor het meten van het overeenkomstige western blot-signaal. Een ander obstakel is dat CD95 een sterk geglycosyleerd eiwit is, dat ook bijdraagt aan de problemen bij de detectie ervan bij immunoprecipitatie als gevolg van de aanwezigheid van een bepaald patroon van verschillende 'wazige' banden28.
DISC-immunoprecipitatieanalyse biedt een optimale basis voor het detecteren van caspase-activering en -verwerking. Immunoprecipitatie in combinatie met western blotting maakt inderdaad kwantitatieve detectie mogelijk van splitsingsproducten van procaspase-8a/b: p43/p41, p30 en p18, zoals weergegeven in deze studie(figuur 4, figuur 5en figuur 6). Dit stelt op zijn beurt experimentatoren in staat om veranderingen in procaspase-8a / b-verwerking in de loop van de tijd te volgen en verschillende splitsingsstappen van procaspase-8 te onderscheiden. Deze benadering is met succes gebruikt om caspase-8 activering in wiskundige modellen te beschrijven en onderscheid te maken tussen inter- en intramoleculaire procaspase-8 verwerking op de DISC7,20,29. Bovendien heeft het meten van caspase-8 splitsingsproducten door western blotting duidelijke voordelen ten opzichte van de conventionele caspase-8 activiteitstests op basis van IETD-substraat. In het laatste geval staat vast dat IETD ook dient als substraat voor de andere caspasen. Daarom is er steeds meer bewijs dat de detectie van IETD-activiteit wijst op een algemene toename van caspase-activiteit in de cel. Daarentegen kan het gebruik van western blot-analyse helpen om specifiek de overeenkomstige banden in de western blot toe te wijzen aan caspase-8, waardoor de onderzoeker erop kan vertrouwen dat caspase-8 in dit complex wordt geactiveerd. Bovendien, zoals hierboven vermeld, biedt het meten van caspase-8-verwerking op de DISC een uitstekend hulpmiddel voor wiskundige modellering en systeembiologische studies. Alles bij elkaar wordt een klassieke workflow gepresenteerd om de monitoring van verschillende stappen van procaspase-8 activering en verwerking mogelijk te maken, wat essentieel is voor het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van celdood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen de Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), het Center of Dynamic Systems (CDS), gefinancierd door het EU-programma EFRO (European Regional Development Fund) en de DFG (LA 2386) voor het ondersteunen van ons werk. We bedanken Karina Guttek voor het ondersteunen van onze experimenten. We erkennen Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) voor het leveren van primaire T-cellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
