Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

قياس تكوين CD95 الموت المسببة للإشارات المعقدة ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع

Published: August 2, 2021 doi: 10.3791/62842
Automatic Translation
1, 1
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

Summary

هنا، يتم تقديم سير عمل تجريبي يمكن من الكشف عن معالجة caspase-8 مباشرة في مجمع الإشارات المسببة للوفاة (DISC) ويحدد تكوين هذا المجمع. هذه المنهجية لها تطبيقات واسعة النطاق، من كشف الآليات الجزيئية لمسارات موت الخلايا إلى النمذجة الديناميكية لشبكات موت الخلايا المبرمج.

Abstract

يتم التوسط في موت الخلايا المبرمج ال extrinsic عن طريق تنشيط مستقبلات الموت (DRs) مثل CD95/Fas/APO-1 أو الليغاند المسبب لداء موت الخلايا المبرمج المرتبط بعامل الورم (TRAIL) - مستقبلات 1/مستقبلات 2 (TRAIL-R1/R2). تحفيز هذه المستقبلات مع ليغاندس cognate يؤدي إلى تجميع مجمع الإشارات المسببة للموت (DISC). القرص يتكون DR، البروتين المحول Fas المرتبطة مع مجال الموت (FADD)، procaspases-8/-10، والخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتينات المثبطة للإنزيم (c-FLIPs). القرص بمثابة منصة لمعالجة procaspase -8 والتنشيط. يحدث هذا الأخير عن طريق التعتيم / oligomerization في مجال تأثير الموت (DED) خيوط تجميعها في القرص.

ويتبع تنشيط procaspase-8 معالجتها، والذي يحدث في عدة خطوات. في هذا العمل ، يتم وصف سير عمل تجريبي ثابت يسمح بقياس تكوين DISC ومعالجة procaspase-8 في هذا المجمع. ويستند سير العمل على تقنيات التكفير المناعي المدعومة بتحليل البقع الغربية. هذا سير العمل يسمح رصد دقيق لخطوات مختلفة من procaspase-8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها، وهي ذات صلة عالية للتحقيق في الآليات الجزيئية للخلايا المبرمج extrinsic.

Introduction

واحدة من مستقبلات الموت الأكثر دراسة (DRs) هو CD95 (Fas, APO-1). يبدأ المسار الأبوبتوتيكي extrinsic مع تفاعل DR مع ليغند cognate لها، أي CD95L يتفاعل مع CD95 أو تريل يربط تريل-Rs. وهذا يؤدي إلى تشكيل القرص في القرص DR. المقابلة يتكون من CD95، FADD، procaspase-8/-10، وC-FLIP البروتينات1،2. وعلاوة على ذلك، يتم تجميع القرص عن طريق التفاعلات بين مجال الموت (DD) التي تحتوي على البروتينات، مثل CD95 و FADD، والبروتينات المحتوية على DED مثل FADD، procaspase-8/-10، وc-FLIP (الشكل 1). Procaspase-8 يخضع لoligomerization عن طريق جمعية من DEDs لها، مما أدى إلى تشكيل خيوط DED، تليها تنشيط procaspase-8 وتجهيزها. وهذا يؤدي إلى سلسلة كاسباس، مما يؤدي إلى موت الخلية (الشكل 1)3،4. وهكذا، procaspase-8 هو caspase البادئ المركزي للمسار الخلايا المبرمج extrinsic بوساطة CD95 أو تريل-Rs، تفعيلها في منصة الجزيئية الكلية المقابلة، القرص.

اثنين من isoforms من procaspase -8 ، وهي procaspase - 8a (p55) و -8b (p53) ، ومن المعروف أن يتم تجنيدهم في القرص5. كلا isoforms تتألف من اثنين من DEDs. يقع DED1 و DED2 في الجزء N-terminal من procaspase-8a/b متبوعا بنطاقي p18 و p10 الحفازين. كشف التحليل التفصيلي المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ل procaspase-8 DEDs عن تجميع بروتينات procaspase-8 في هياكل خيوط تسمى خيوط DED4،6. ومن اللافت للنظر أن سلاسل procaspase-8 الخطية اقترحت في البداية للمشاركة في التعتيم يليه تنشيط procaspase-8 في DISC. الآن، ومن المعروف أن تلك السلاسل ليست سوى بنية فرعية من خيوط بروكاسباس-8 DED، وهذا الأخير يتألف من ثلاث سلاسل تجميعها في الحلزون الثلاثي3،4،6،7.

عند التعتيم في خيوط DED ، تؤدي التغييرات التشكيلية في procaspase-8a /b إلى تشكيل المركز النشط للبروكاسباس -8 وتفعيله3،8. ويتبع ذلك معالجة procaspase-8 ، والتي يتم التوسط فيها عبر مسارين: الأول يمر عبر توليد منتج شق p43/p41 والثاني عبر الجيل الأولي من منتج الانقسام p30. يبدأ مسار p43/p41 من خلال انشقاق procaspase-8a/b في Asp374 ، مما أدى إلى منتجات الانقسام p43/p41 و p12 (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يتم قطع هذه الشظايا تلقائيا بشكل تحفيزي في Asp384 و Asp210/216، مما أدى إلى تشكيل التروتروترمر caspase-8 النشط، p102/p1829،10،11. وبالإضافة إلى ذلك، تبين أنه بالتوازي مع مسار p43/p41 للمعالجة، procaspase-8a/b هو أيضا مشقوق في Asp216، مما يؤدي إلى تشكيل المنتج C-محطة الانقسام p30، تليها بروتيوليسيس إلى p10 و P1810 (الشكل 2).

Procaspase-8a/b التنشيط في خيوط DED ينظم بدقة من قبل البروتينات المسماة c-FLIPs12. تحدث بروتينات c-FLIP في ثلاثة أشكال متساوية: c-FLIPLong (c-FLIPL)،c-FLIPShort (c-FLIPS)،وc-FLIPRaji (c-FLIPR). تحتوي جميع الأشكال الثلاثة على اثنين من DEDs في منطقة N-terminal الخاصة بهم. ج-فليبL أيضا C-محطة نشطة بشكل حفاز caspase مثل المجال12,13. كل isoforms قصيرة من C-FLIP-C-FLIPS و C-FLIPR-العملبطريقة مضادة للapoptotic عن طريق تعطيل تشكيل خيوط DED في القرص6,14,15. وبالإضافة إلى ذلك، C-FLIPL يمكن تنظيم caspase-8 التنشيط بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يمكن أن يؤدي إلى كل من الموالية ومكافحة apoptotic آثار16,17,18. من خلال تشكيل procaspase-8/c-FLIPL heterodimer النشطة تحفيزيا، c-FLIPL يؤدي إلى استقرار المركز النشط من procaspase-8 وتفعيله. تعتمد الدالة المؤيدة أو المضادة للأبوبتوتيك ل c-FLIPL بشكل مباشر على مقدارها في خيوط DED والمبلغ اللاحق من procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. تركيزات منخفضة أو متوسطة من C-FLIPL في DISC يؤدي إلى كميات كافية من التروديمرات procaspase-8/c-FLIPL في خيوط DED، والتي تدعم تنشيط caspase-8. في المقابل، زيادة كميات C-FLIPL يؤدي مباشرة إلى آثارها المضادة لل أبوتوبوتيك في القرص20.

معا، وتنشيط وتجهيز procaspase-8a/b في القرص هو عملية منظمة للغاية تنطوي على عدة خطوات. تناقش هذه الورقة قياس معالجة procaspase-8 مباشرة في DISC بالإضافة إلى تحليل تكوين هذا المجمع. وسيتم تقديم هذا باستخدام CD95 DISC كمجمع DR المثالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء تجارب الخلايا التائية وفقا للاتفاق الأخلاقي 42502-2-1273 Uni MD.

1. إعداد الخلايا للتجربة

ملاحظة: متوسط عدد الخلايا لهذا التكفير المناعي هو 1 × 107. يجب أن تزرع الخلايا الملتصقة قبل يوم واحد من التجربة بحيث يكون هناك 1 × 107 خلايا في يوم التجربة.

  1. إعداد الخلايا الملتصقة للتجربة
    1. البذور 5-8 × 106 خلايا معتنقة في 20 مل من المتوسط (انظر جدول المواد لتكوين) لكل شرط في أطباق 14.5 سم قبل يوم واحد من بدء التجربة.
    2. في يوم التجربة ، تأكد من أن الخلايا هي التقاء بنسبة 80-90 ٪ وتمسك الطبق. تجاهل المتوسط وإضافة وسط جديد إلى الخلايا الملتصقة.
  2. إعداد خلايا التعليق للتجربة
    1. ضع بعناية 1 × 107 خلايا تعليق في 10 مل من متوسط الثقافة (انظر جدول المواد للتكوين) لكل حالة في أطباق 14.5 سم قبل بدء التجربة مباشرة.
    2. إذا كنت تستخدم الخلايا الأساسية، قم بعزل الخلايا التائية الأساسية وفقا للإجراء21الموصوف سابقا. علاج الخلايا التائية الأولية مع 1 ميكروغرام / مل phytohemagglutinin لمدة 24 ساعة، تليها 25 U / مل IL2 العلاج لمدة 6 أيام.
    3. ضع بعناية 1 × 108 خلايا تي الأولية في 10 مل من المتوسطة الثقافة (انظر جدول المواد لتكوين) لكل شرط في أطباق 14.5 سم مباشرة قبل بدء التجربة.
      ملاحظة: ينصح بهذا العدد الأعلى من الخلايا التائية الأساسية، حيث أن هذه الخلايا أصغر.

2. CD95L التحفيز

  1. تحفيز الخلايا مع CD95L (المنتجة كما هو موضح سابقا20 أو المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد)).
    ملاحظة: تركيز CD95L ووقت التحفيز هي خلية نوع تعتمد13,15,22,23,24,25. إعداد شرط تحفيز واحد مرتين لتوليد عينة "التحكم في حبة" بالتوازي.
    1. تحفيز الخلايا الملتصقة بتركيز محدد من CD95L. عقد لوحة في زاوية وماصة ليغاند في الوسط دون لمس الخلايا الملتصقة.
    2. تحفيز خلايا التعليق مع CD95L عن طريق pipetting الحل ليغاند في تعليق الخلية.

3. حصاد الخلية وتحلل

  1. ضع أطباق الزنزانة على الثلج.
    ملاحظة: لا تجاهل الوسيطة. تطفو الخلايا المحتضرة في الوسط وهي مهمة للتحليل.
  2. إضافة 10 مل من المالحة الباردة الفوسفات المخزنة (PBS) إلى تعليق الخلية وكشط الخلايا المرفقة قبالة لوحة. جمع تعليق الخلية في أنبوب 50 مل.
  3. غسل طبق الخلية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة مرتين ووضع محلول الغسيل في نفس أنبوب 50 مل. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية.
  4. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل.
  5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
  6. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من العازلة تحلل (تحتوي على 4٪ كوكتيل مثبطات البروتيز). احتضنه لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  7. الطرد المركزي lysate في أقصى سرعة (~ 17000 × غرام)لمدة 15 دقيقة ، 4 درجة مئوية.
  8. نقل supernatant (lysate) إلى أنبوب نظيف. تجاهل بيليه. خذ 50 ميكرولتر من اللذوب في أنبوب آخر. تحليل تركيز البروتين من قبل برادفورد المقايسة واتخاذ كمية من التحلل المقابلة ل25 ميكروغرام من البروتين في قارورة. أضف مخزن التحميل المؤقت (راجع جدول المواد للتركيب) إلى القارورة. تخزينه في -20 درجة مئوية كما lysate التحكم.

4. التكفير المناعي (IP)

  1. إضافة 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة APO-1 و 10 ميكرولتر من البروتين حبات سيفاروز (أعدت على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) إلى lysate. أضف 10 ميكرولتر فقط من الخرز إلى أنبوب منفصل يحتوي على lysate (عينة محفزة) لتوليد "عنصر تحكم حبة".
    ملاحظة: استخدام نصائح pipet مع فتحات واسعة إما عن طريق قطع النصائح أو شراء نصائح خاصة للملكية الفكرية أثناء التعامل مع البروتين حبات سيفاروز.
  2. احتضان خليط من اللحواف مع الأجسام المضادة / البروتين حبات سيفاروز مع خلط لطيف بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. الطرد المركزي ليسات مع الأجسام المضادة / البروتين حبات سيفاروز في 500 × غرام لمدة 4 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى الخرز، وتكرار هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل.
  3. تجاهل الناتنات الفائق. يستنشق الخرز ويفضل مع حقنة هاملتون 50 ميكرولتر.

5. بقعة الغربية

  1. أضف 20 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 4x (انظر جدول المواد للتركيب) إلى الخرز والحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. سخني عناصر التحكم في التسليك عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تحميل الليزات، IPs، ومعيار البروتين على 12.5٪ هلام كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) (انظر جدول المواد لإعداد هلام) وتشغيل مع الجهد المستمر من 80 V.
  3. نقل البروتينات من هلام SDS إلى غشاء النيتروسليلوز.
    ملاحظة: هنا، تم استخدام تقنية شبه جافة، الأمثل للبروتينات ذات الفائدة، لنقل أكثر من 12 دقيقة (25 V؛ 2.5 A = ثابت). نقع غشاء النيتروسليلوز واثنين من مداخن نقل صغيرة الحجم في العازلة الكهربائي (انظر جدول المواد لتكوين، وإعداد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) لبضع دقائق قبل النشاف الغربي.
  4. ضع الغشاء الملطخ في صندوق وحجبه لمدة ساعة واحدة في محلول الحجب (0.1٪ توين-20 في PBS (PBST) + 5٪ حليب). احتضان الغشاء مع حل حجب تحت التحريض لطيف.
  5. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.

6. غرب كشف لطخة

  1. إضافة أول الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المشار إليها (انظر جدول المواد)إلى الغشاء واحتضانه بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع التحريض لطيف.
  2. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.
  3. احتضان الغشاء مع 20 مل من الأجسام المضادة الثانوية (المخفف 1:10،000 في PBST + 5٪ الحليب) مع اهتزاز لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.
  5. تجاهل PBST وإضافة ما يقرب من 1 مل من ركيزة البيروكسيديز الفجل إلى الغشاء.
  6. الكشف عن إشارة كيمولومينسنت (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يعتمد وقت التعرض وعدد الصور الملتقطة على كمية البروتين في الخلية وخصوصية الأجسام المضادة المستخدمة. يجب أن يتم إنشاؤه تجريبيا لكل الأجسام المضادة المستخدمة للكشف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحليل caspase -8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها في القرص CD95 ، هذه الورقة يصف سير العمل الكلاسيكية ، الذي يجمع بين الملكية الفكرية للقرص CD95 مع تحليل لطخة الغربية. وهذا يسمح للكشف عن العديد من السمات الرئيسية لتفعيل caspase-8 في DISC: تجميع منصة caspase-8-activating الجزيئية، وتجنيد procaspase-8 إلى القرص، ومعالجة هذا caspase البادئ (الشكل 1 والشكل 2). يتضمن سير العمل هذا معالجة الخلايا الحساسة مع CD95L بطريقة تعتمد على الوقت ، تليها تحللها ، وسرعة المناعة باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل CD95 (anti-APO-1) ، وتحليل البقع الغربية اللاحقة(الشكل 3).

سرطان عنق الرحم HeLa-CD95 استخدمت الخلايا كمثال لتحليل تشكيل القرص26. أدى تحفيز هذه الخلايا مع CD95L في مستوى عال من تشكيل القرص CD95، ورصدها عن طريق CD95-المناعي(الشكل 4). CD95، FADD، procaspase-8، procaspase-10، وC-FLIPs لوحظ في هذه التكالب CD95 المناعية، مما يدل على تشكيل القرص كفاءة. الأهم من ذلك، تم الكشف عن منتجات الانقسام من procaspase-8a/b: p43/p41، p30، و P18 في القرص، مما يشير إلى تفعيل procaspase-8 ومعالجتها اللاحقة. وعلى وجه الخصوص، تم الكشف عن منتجات الانقسام من procaspase-8 p43/p41 و P18، مما يدل على الخطوتين المذكورتين أعلاه من مسار المعالجة P43. وبالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن المنتج P30، مما يدل على المسار البديل للمعالجة caspase-8. وعلاوة على ذلك، يتبع تنشيط procaspase-8 في DISC انشقاق ركائزه مثل بروتينات c-FLIP.

في الواقع ، تم الكشف عن منتجات الانقسام من c-FLIP-p43-FLIP و p22-FLIP في التخصصات المناعية ، مما يشير إلى تنشيط caspase-8(الشكل 4). الأهم من ذلك، لم يتم الكشف عن FADD، procaspase-8، procaspase-10، وC-FLIPs، ولا منتجاتها الانقسام في عينات مناعة من الخلايا غير المعالجة، مما يؤكد على خصوصية الديسك-المناعي(الشكل 4). ويمكن الحصول على معلومات هامة من هذه التجارب عن طريق تحديد النطاقات المقابلة لمختلف المنتجات الانقسام من procaspase-8(الشكل 4). ويمكن استخدام هذه المعلومات في النمذجة الرياضية لشبكات موت الخلايا المبرمج وتوفر رؤى كمية في تنظيم المسار.

يتم تعديل مستوى تنشيط caspase-8 في DISC بواسطة c-FLIPs. وبالتالي، تم اختيار خلايا HeLa-CD95 التي تفرط في التعبير عن c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 كمثال ثان(الشكل 5). ويمكن ملاحظة آثار النظائرC-FLIP L في هذه التجارب، مما أدى إلى معدل مختلف من معالجة procaspase-8a/b إلى p43/p41 في DISC مقارنة بالتحلل المقابل للبروكاسباس-8 في القرص في خلايا HeLa-CD95 الأبوية، كما وصفها هيلرت وآخرون. 15.على غرار الملاحظات الواردة في الشكل 4، لم يتم الكشف عن أي تجنيد من فاد ، procaspase - 8 ، procaspase - 10 ، c - FLIP البروتينات ، ومنتجاتها الانقسام في البروبروسيبيشنات المناعية من خلايا HeLa - CD95 - FL دون CD95L العلاج ، والذي يدعم خصوصية هذه التخصصات المناعية. مزيد من الأدلة على خصوصية البروبريسيبيات المناعية هو عدم وجود تجنيد procaspase-3 وبولي (ADP-ريبوز)بوليمراز 1 (PARP1) إلى القرص، الذي لوحظ في البروسيبسيبيشنات المعالجة CD95L(الشكل 5). هذه البروتينات ليست جزءا من المجمع، وغيابها في إشارات المناعة يمكن أن تكون بمثابة دليل على عدم وجود ربط غير محدد من البروتينات الخلوية وفيرة.

وأخيرا، تم تنفيذ الابتهاك المناعي للقرص CD95 من الخلايا المعلقة كمثال ثالث، على سبيل المثال، الخلايا التائية الأولية المنشطة(الشكل 6). وتتميز هذه الخلايا أيضا بمستويات عالية من CD95، FADD، procaspase-8، procaspase-10، وC-FLIPs التي لوحظت في مكافحة CD95-المناعية مع منتجاتها الانقسام(الشكل 6). الكشف عن المنتجات الانقسام procaspase-8 في التهيئة المناعية يشير إلى تفعيل ومعالجة هذا caspase البادئ في الديسك المناعي من الخلايا التائية الأولية. تشير هذه التجارب إلى أن القرص يمكن أن يكون مناعيا من العديد من الخلايا الملتصقة والموقفة وأنه يمكن التحقق من صحة معالجة caspase-8 وتنشيطه من خلال تحليل البقع الغربية.

Figure 1
الشكل 1:عرض تخطيطي لمسار الإشارات CD95. CD95L بتشغيل التجميع DISC. ويتكون القرص CD95، FADD، بروكاسباس-8/-10، وC-FLIP. يرتبط FADD ب CD95 عبر DD الخاص به ، في حين يتفاعل procaspase-8 و procaspase-10 و c-FLIPs عبر DEDs الخاصة بهم ، مما يشكل خيوط DED. تشكيل خيوط DED بمثابة منصة لderization procaspase-8، وتجهيز، والتنشيط اللاحقة. و caspase-8 هيتروتريمر النشطة، p182/p102،ينشط caspase-3 عن طريق الانقسام، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. المختصرات: CD = مجموعة من التمايز; CD95L = CD95 ليغند; DISC = مجمع الإشارات المسببة للوفاة؛ DD = مجال الموت; FADD = نطاق الموت المرتبط ب Fas؛ ج-فليب = الخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتين المثبطة للإنزيم; DED = مجال تأثير الموت؛ ج-فليبL = ج-فليبطويل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: Procaspase-8 تجهيز في القرص. يتم عرض طريقتين لمعالجة procaspase-8a/b في القرص. الطريقة الأولى تنطوي على الجيل p43/p41 تليها تشكيل P18. الطريقة الثانية ينطوي على الجيل P30 تليها معالجتها إلى p18 و P10. يتم ترقيم المخلفات وفقا لتسلسل بروكاسباس-8a. الاختصارات: DED = مجال تأثير الموت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:عرض تخطيطي للإعداد التجريبي للقرص IP. يتم تحفيز الخلايا مع CD95L. بعد التحفيز ، يتم حصاد الخلايا وجمعها ، تليها خطوات غسيل مختلفة. ثم يتم الخلايا lysed، ويتم جمع lysates. في وقت لاحق، تمت إضافة البروتين A-sepharose الخرز والأجسام المضادة المضادة APO-1 (المضادة CD95) إلى اللحوت واحتضانها بين عشية وضحاها. بعد عدة خطوات غسل ، تم تحليل النشاف المناعي عن طريق النشاف الغربي. الاختصارات: DISC = مجمع الإشارات المسببة للوفاة؛ IP = النسيب المناعي؛ CD95L = CD95 ليغند. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: CD95 تشكيل القرص في خلايا هيلا CD95. تم تحفيز خلايا HeLa-CD95 مع 125 نانوغرام / مل CD95L لمدة 30 دقيقة أو 1 ساعة. تم فحص تكوين ال IPs من خلال تحليل البقع الغربية باستخدام الأجسام المضادة للبروتينات المشار إليها. تم استخدام أكتين كعنصر تحكم في التحميل. يتم عرض المدخلات. يتم عرض القياس الكمي لمنتجات الانقسام procaspase-8 في DISC وتطبيعه إلى إشارة CD95. المختصرات: مثل التعرض الطويل؛ s.e. = التعرض القصير؛ BC = التحكم في الملكية الفكرية مع 'الخرز فقط'، دون إضافة الأجسام المضادة؛ CD95L = CD95 ليغند; DISC = مجمع الإشارات المسببة للوفاة؛ IP = النسيب المناعي؛ FADD = نطاق الموت المرتبط ب Fas؛ ج-فليب = الخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتين المثبطة للإنزيم; ج-فليبL = ج-فليبطويل; ج-فليبS = c-FLIPقصيرة; M = الوزن الجزيئي بالكيلودالتون (kDa). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: CD95 تشكيل القرص في ج فليبL-overexpressing هيلا-CD95 الخلايا. تم تحفيز خلايا HeLa-CD95-FL مع 250 نانوغرام/مل CD95L للنقاط الزمنية المشار إليها (1-3 ساعة). تم تنفيذ CD95 DISC-IPs باستخدام الأجسام المضادة المضادة APO-1 (المضادة للCD95). تم فحص تكوين IPs من خلال تحليل البقع الغربية وتحليلها للبروتينات المشار إليها. تم استخدام أكتين كعنصر تحكم في التحميل. يتم عرض المدخلات. يتم عرض القياس الكمي لمنتجات الانقسام procaspase-8 في DISC وتطبيعه إلى إشارة CD95. يتم عرض تجربة تمثيلية واحدة من أصل اثنتين. المختصرات: مثل التعرض الطويل؛ s.e. = التعرض القصير؛ BC = التحكم في الملكية الفكرية مع 'الخرز فقط'، دون إضافة الأجسام المضادة؛ CD95L = CD95 ليغند; DISC = مجمع الإشارات المسببة للوفاة؛ IP = النسيب المناعي؛ FADD = نطاق الموت المرتبط ب Fas؛ ج-فليب = الخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتين المثبطة للإنزيم; ج-فليبL = ج-فليبطويل; PARP1 = بولي (ADP-الريبوز)بوليمراز 1; M = الوزن الجزيئي بالكيلودالتون (kDa). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: CD95 DISC تشكيل في الخلايا التائية الأولية. تم تحفيز الخلايا التائية المنشطة الأولية مع 500 نانوغرام / مل CD95L لمدة 15 دقيقة و 30 دقيقة. تم فحص تكوين IPs من خلال تحليل البقع الغربية وتحليلها للبروتينات المشار إليها. تم استخدام أكتين كعنصر تحكم في التحميل. يتم عرض القياس الكمي لمنتجات الانقسام procaspase-8 في DISC وتطبيعه إلى إشارة CD95. يتم عرض المدخلات. المختصرات: مثل التعرض الطويل؛ s.e. = التعرض القصير؛ CD95L = CD95 ليغند; DISC = مجمع الإشارات المسببة للوفاة؛ IP = النسيب المناعي؛ FADD = نطاق الموت المرتبط ب Fas؛ ج-فليب = الخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتين المثبطة للإنزيم; ج-فليبL = ج-فليبطويل; M = الوزن الجزيئي بالكيلودالتون (kDa). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وصف هذا النهج في البداية كيشكل وآخرون27 وقد طورته بنجاح منذ ذلك الحين عدة مجموعات. ويتعين النظر في عدة مسائل هامة من أجل كفاءة معالجة الكاسباس -8 في هذا المجمع.

أولا، من الضروري اتباع جميع خطوات الغسيل أثناء التكفير المناعي. أهمية خاصة هي الخطوات النهائية لغسل حبات سيفاروز وتجفيف حبات سيفاروز. يجب أن يتم ذلك بشكل صحيح لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء من السبق المناعي ، مما يسمح بالكشف عن تجنيد caspase-8 ومعالجته في DISC. والأهم من ذلك ، بالنسبة للتقنيات التحليلية الحساسة للغاية ، مثل قياس الطيف الكتلي ، يمكن أن تكون "خطوة التخليص المسبق" ، والتي تشمل حضانة الليسات مع حبات sepharose فقط أو الأجسام المضادة للتحكم متساوية النوع ، مهمة أيضا في الحد من الضوضاء. ومع ذلك، أظهرت العديد من الدراسات أن هذه الخطوة التخليص المسبق ليست ضرورية للكشف عن تجنيد caspase-8 إلى القرص عن طريق النشاف الغربي7،23. ومع ذلك ، كما ذكر ، فإن غسل الخرز في نهاية النسيب المناعي أمر ضروري للحصول على نتائج موثوقة. ربط غير محدد من البروتينات الخلوية وفيرة إلى حبات سيفاروز يمكن أن تقلل أساسا إشارات محددة من مكونات القرص الأساسية. وكعنصر تحكم مهم لعدم وجود الربط غير المحدد ، يمكن إجراء تحليل لطخة غربية للبروتينات ، التي تم الإبلاغ عن عدم وجودها في القرص. 10- وترد مثال على هذا التحليل في الشكل 5،حيث لم يلاحظ تجنيد البارباب1 والكاسباس-3 في التكفير المناعي للقرص. وهذا يشير إلى خصوصية التوافر المناعي الخاص والغسيل الكافي لخرزات السفاروز أثناء التجربة.

ثانيا، من المهم إجراء ضوابط سلبية مثل التحكم بالخرز فقط أو التحكم في المناعة مع الأجسام المضادة ذات النمط المتساوي نفسه مثل الجسم المضاد المستخدم في التكفير المناعي. بالنسبة للأجسام المضادة المضادة APO-1، يمكن استخدام الأجسام المضادة IgG3 المضادة للفأرة كتحكم متساوي النمط. ثالثا، من المهم رصد نتائج التكفير المناعي من العينات غير المعالجة، التي ينبغي أن يلاحظ فيها CD95 فقط. الكشف عن FADD، ج فليب، أو procaspase-8 في هذه العينات يشير عادة إلى وجود بعض أوجه القصور في بروتوكول المناعة أو خطوات الغسيل. وهذا يمكن أن يؤدي إلى افتراضات بشأن الارتباط المستقل التحفيزي ل FADD أو c-FLIP مع CD95 ، والتي قد لا تكون صحيحة تماما ، وبدلا من ذلك تشير إلى عيوب في القصور المناعي. رابعا، لكل من التخصصات المناعية، يجب تحليل المدخلات أو التحللات بعناية بالتوازي لقياس التعبير والتعديلات اللاحقة للبروتينات الأساسية التي يتم تحليلها عن طريق التحلل المناعي.

خامسا، يسمح التحليل المعتمد على الوقت بمتابعة التغييرات في المجمع بمرور الوقت، ويوفر تأكيدا مهما آخر على خصوصية البروتينات التي يتم توظيفها في المجمع. وفي هذا الصدد، هناك مسألة هامة هي أن كل خط من خطوط الخلايا له مستوى مختلف من التعبير CD95 والمكونات داخل الخلايا في هذا المجمع. وبناء على ذلك، يجب تحديد التوقيت الدقيق لتشكيل القرص CD95 بعناية لكل نوع معين من الخلايا. وأخيرا، فإن القضية الحاسمة لتحليل ديناميات القرص هي مقارنة كمية البروتين في كل من التخصصات المناعية. بالنسبة لأجهزة CD95 المناعية القرصية التي يتم إجراؤها باستخدام أجسام مضادة مضادة ل APO-1 ، فإن كمية CD95 هي مقياس رئيسي للكمية المتساوية من المجمعات التي يتم مقارنتها. قد يكون هذا صعبا لأن كثافة إشارة CD95 في النسيب المناعي عالية نسبيا. ومع ذلك، يجب على المرء أن يجد الفاصل الزمني الأمثل لقياس إشارة لطخة الغربية المقابلة. وثمة عقبة أخرى هي أن CD95 هو بروتين جليكوسيلات عالية، والذي يساهم أيضا في الصعوبات في الكشف عنه في النعوت المناعية بسبب وجود نمط معين من عدة نطاقات "ضبابية"28.

يوفر تحليل الأقراص المناعية أساسا مثاليا للكشف عن تنشيط caspase ومعالجته. في الواقع، يسمح التهيؤ المناعي المقترن بالنشاف الغربي بالكشف الكمي عن منتجات الانقسام من البروكاسباس-8a/b: p43/p41 و p30 و p18، كما هو موضح في هذه الدراسة (الشكل 4، الشكل 5، والشكل 6). وهذا بدوره يمكن المجربين من متابعة التغيرات في معالجة procaspase-8a/b بمرور الوقت والتمييز بين خطوات الانقسام المختلفة للبروكاسباس-8. وقد استخدم هذا النهج بنجاح لوصف تنشيط caspase-8 في النماذج الرياضية والتمييز بين بين وبين الجزيئية procaspase-8 تجهيز في DISC7,20,29. وعلاوة على ذلك، قياس المنتجات انشقاق caspase-8 عن طريق النشاف الغربي له مزايا واضحة بالمقارنة مع المقايسات نشاط caspase-8 التقليدية على أساس الركيزة IETD. وفي الحالة الأخيرة، من الثابت أن ال IETD يعمل أيضا كركيزة للكاسباسات الأخرى. ومن ثم، هناك أدلة متزايدة على أن الكشف عن نشاط IETD يشير إلى زيادة عامة في نشاط الكاسباس في الخلية. في المقابل ، يمكن أن يساعد استخدام تحليل البقع الغربية على تعيين النطاقات المقابلة في البقعة الغربية على caspase-8 ، مما يسمح للباحث بأن يكون واثقا من تنشيط caspase-8 في هذا المجمع. وعلاوة على ذلك، وكما ذكر أعلاه، فإن قياس معالجة الكاسباس-8 في القرص يقدم أداة ممتازة للنمذجة الرياضية ودراسات بيولوجيا النظم. معا ، يتم تقديم سير عمل كلاسيكي للسماح برصد الخطوات المختلفة لتنشيط ومعالجة procaspase-8 ، وهو أمر ضروري لكشف الآليات الجزيئية لوفاة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgments

نعترف بمؤسسة فيلهلم ساندر (2017.008.02)، ومركز الأنظمة الديناميكية (CDS)، الممول من قبل صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي) وبرنامج DFG (LA 2386) لدعم عملنا. نشكر كارينا غوتيك لدعمها تجاربنا. نحن نعترف البروفيسور ديرك راينهولد (OvGU، ماغديبورغ) لتوفير لنا الخلايا التائية الأولية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12.5% SDS gel self made for two separating gels:
3.28 mL distilled H2O
2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M
4.06 mL acrylamide
100 µL 10% SDS
100 µL 10% APS
7.5 µL TEMED

for two collecting gels:
3.1 mL distilled H2O
1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 mL acrylamide
50 µL 10% SDS
25 µL 10% APS
7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes Greiner 639160
acrylamide Carl Roth A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice VWR 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab Sigma Aldrich A2103 dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo ALX-805-038-C100 used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab Biozol MBL-M059-3 dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab cell signaling 9662 S dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15 provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-804-242-C100 dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab Santa Cruz sc-715 dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-804-961-0100 dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ADI-AAM-212-E dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab cell signaling 9542 dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS Carl Roth 9592.3
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml		 Bio Rad 500-0006 used according to manufacturer's instructions
CD95L provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector
Chem Doc XRS+		 Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) Sigma Aldrich 11 836 145 001 prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg PAN Biotech P04-53500 dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer self made 10x electrophoresis buffer:
60.6 g Tris
288 g glycine
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 dilution before usage
glycine Carl Roth 3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP SouthernBiotech 1070-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP SouthernBiotech 1090-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP SouthernBiotech 4030-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2) Merckgroup/ Roche 11011456001 for activation of T cells
KCl Carl Roth 6781.2
KH2PO4 Carl Roth 3904.1
loading buffer
4x Laemmli Sample Buffer,10 mL		 Bio Rad 161-0747 prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUFO500
lysis buffer self made 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L PAN Biotech P04-41154 adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells gibco by Life Technologie 21875034 adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder Carl Roth T145.4
Na2HPO4 Carl Roth P030.3
NaCl Carl Roth 3957.2
PBST self made 20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk self made 50 g milk powder + 1 L PBST
PHA Thermo Fisher Scientific R30852801 for activation of T Cells
Power Pac HC Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue Bio Rad 161-0373 use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads Novodirect/ Th.Geyer GE 17-0780-01 affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper VWR 734-2602
SDS Carl Roth 4360.2
shaker Heidolph
sodium azide Carl Roth K305.1
TEMED Carl Roth 2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks Bio Rad 170-4270 used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer Bio Rad 10026938 prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane Bio Rad 170-4270 used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo Bio Rad
Tris Chem Solute 8,08,51,000
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Tween-20 Pan Reac Appli Chem A4974,1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 174، تشكيل القرص CD95، التحلل المناعي، كاسباس-8
قياس تكوين CD95 الموت المسببة للإشارات المعقدة ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hillert-Richter, L. K., Lavrik, I.… More

Hillert-Richter, L. K., Lavrik, I. N. Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. Vis. Exp. (174), e62842, doi:10.3791/62842 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter