Summary
Hier wird ein experimenteller Workflow vorgestellt, der den Nachweis der Caspase-8-Verarbeitung direkt am todesinduzierenden Signalkomplex (DISC) ermöglicht und die Zusammensetzung dieses Komplexes bestimmt. Diese Methodik hat breite Anwendungen, von der Entschlüsselung der molekularen Mechanismen von Zelltodwegen bis hin zur dynamischen Modellierung von Apoptose-Netzwerken.
Abstract
Die extrinsische Apoptose wird durch die Aktivierung von Todesrezeptoren (DRs) wie CD95/Fas/APO-1 oder Tumornekrosefaktor-bedingtem Apoptose-induzierendem Liganden (TRAIL)-Rezeptor 1/Rezeptor 2 (TRAIL-R1/R2) vermittelt. Die Stimulation dieser Rezeptoren mit ihren verwandten Liganden führt zum Aufbau des todinduzierenden Signalkomplexes (DISC). DISC umfasst DR, das Adapterprotein Fas-assoziiertes Protein mit Todesdomäne (FADD), Procaspasen-8/-10 und zelluläre FADD-ähnliche Interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Die DISC dient als Plattform für die Procaspase-8-Verarbeitung und -Aktivierung. Letzteres geschieht durch seine Dimerisierung / Oligomerisierung in den an der DISC zusammengesetzten Filamenten der Death Effector Domain (DED).
Auf die Aktivierung von Procaspase-8 folgt seine Verarbeitung, die in mehreren Schritten erfolgt. In dieser Arbeit wird ein etablierter experimenteller Workflow beschrieben, der die Messung der DISC-Bildung und die Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex ermöglicht. Der Workflow basiert auf Immunpräzipitationstechniken, die durch die Western-Blot-Analyse unterstützt werden. Dieser Workflow ermöglicht eine sorgfältige Überwachung verschiedener Schritte der Procaspase-8-Rekrutierung in die DISC und ihrer Verarbeitung und ist für die Untersuchung molekularer Mechanismen der extrinsischen Apoptose von hoher Relevanz.
Introduction
Einer der am besten untersuchten Todesrezeptoren (DRs) ist CD95 (Fas, APO-1). Der extrinsische apoptotische Signalweg beginnt mit der Interaktion des DR mit seinem verwandten Liganden, d.h. CD95L interagiert mit CD95 oder TRAIL bindet an TRAIL-Rs. Dies führt zur Bildung der DISC an der entsprechenden DR. DISC besteht aus CD95, FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP Proteinen1,2. Darüber hinaus wird die DISC durch Wechselwirkungen zwischen Death Domain (DD)-haltigen Proteinen wie CD95 und FADD und DED-haltigen Proteinen wie FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP zusammengesetzt (Abbildung 1). Procaspase-8 wird durch Assoziation seiner DEDs oligomerisiert, was zur Bildung von DED-Filamenten führt, gefolgt von procaspase-8-Aktivierung und -Verarbeitung. Dies löst eine Caspase-Kaskade aus, die zum Zelltod führt (Abbildung 1)3,4. Somit ist Procaspase-8 eine zentrale Initiator-Caspase des extrinsischen Apoptoseweges, vermittelt durch CD95 oder den TRAIL-Rs, aktiviert an der entsprechenden makromolekularen Plattform, DISC.
Es ist bekannt, dass zwei Isoformen von Procaspase-8, nämlich Procaspase-8a (p55) und -8b (p53), für die DISC5rekrutiert wurden. Beide Isoformen bestehen aus zwei DEDs. DED1 und DED2 befinden sich im N-terminalen Teil der Procaspase-8a/b, gefolgt von den katalytischen Domänen p18 und p10. Eine detaillierte Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Analyse von Procaspase-8-DEDs ergab die Assemblierung von Procaspase-8-Proteinen zu fadenförmigen Strukturen, den sogenannten DED-Filamenten4,6. Bemerkenswerterweise wurde zunächst vorgeschlagen, dass die linearen Procaspase-8-Ketten an der Dimerisierung beteiligt sind, gefolgt von der Procaspase-8-Aktivierung an der DISC. Nun ist bekannt, dass diese Ketten nur eine Unterkonstruktion des Procaspase-8-DED-Filaments sind, das aus drei Ketten besteht, die zu einer Dreifachhelix3, 4,6,7zusammengesetzt sind.
Bei der Dimerisierung am DED-Filament führen Konformationsänderungen in der Procaspase-8a/b zur Bildung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und seiner Aktivierung3,8. Es folgt die Procaspase-8-Verarbeitung, die über zwei Wege vermittelt wird: Der erste geht über die Erzeugung eines p43/p41-Spaltprodukts und der zweite über die initiale Erzeugung eines p30-Spaltprodukts. Der p43/p41-Signalweg wird durch die Spaltung von Procaspase-8a/b an Asp374 eingeleitet, was zu p43/p41- und p12-Spaltprodukten führt (Abbildung 2). Ferner werden diese Fragmente bei Asp384 und Asp210/216 automatisch katalytisch gespalten, was zur Bildung des aktiven Caspase-8-Heterotetramers, p102/p1829, 10,11führt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass parallel zum p43/p41-Verarbeitungsweg auch procaspase-8a/b an Asp216 gespalten wird, was zur Bildung des C-terminalen Spaltprodukts p30 führt, gefolgt von dessen Proteolyse zu p10 und p1810 (Abbildung 2).
Die Procaspase-8a/b-Aktivierung am DED-Filament wird streng durch Proteine namens c-FLIPs12reguliert. Die c-FLIP Proteine kommen in drei Isoformen vor: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) und c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle drei Isoformen enthalten zwei DEDs in ihrem N-terminalen Bereich. c-FLIPL hat auch eine C-terminale katalytisch inaktive Caspase-ähnliche Domäne12,13. Beide kurzen Isoformen von c-FLIP-c-FLIPS und c-FLIPRwirken anti-apoptotisch, indem sie die Bildung von DED-Filamenten an der DISC 6,14,15stören. Darüber hinaus kann c-FLIPL die Caspase-8-Aktivierung konzentrationsabhängig regulieren. Dies kann sowohl zu pro- als auch zu anti-apoptotischen Wirkungen führen16,17,18. Durch die Bildung des katalytisch aktiven Procaspase-8/c-FLIPL Heterodimers führt c-FLIPL zur Stabilisierung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und dessen Aktivierung. Die pro- oder anti-apoptotische Funktion von c-FLIPL ist direkt abhängig von seiner Menge an den DED-Filamenten und der anschließenden Menge an zusammengesetzten Procaspase-8/c-FLIPL Heterodimeren19. Niedrige oder mittlere Konzentrationen von c-FLIPL an der DISC führen zu ausreichenden Mengen an Procaspase-8/c-FLIP L-Heterodimeren am DED-Filament, was die Aktivierung von Caspase-8 unterstützt. Im Gegensatz dazu führen erhöhte Mengen an c-FLIPL direkt zu seiner anti-apoptotischen Wirkung an der DISC20.
Zusammengenommen ist die Aktivierung und Verarbeitung von Procaspase-8a/b am DISC ein stark regulierter Prozess, der mehrere Schritte umfasst. Dieser Beitrag diskutiert die Messung der Procaspase-8-Verarbeitung direkt am DISC sowie die Analyse der Zusammensetzung dieses Komplexes. Dies wird anhand der CD95 DISC als exemplarischem DR-Komplex präsentiert.
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Protocol
T-Zell-Experimente wurden gemäß der ethischen Vereinbarung 42502-2-1273 Uni MD durchgeführt.
1. Zellen für das Experiment vorbereiten
HINWEIS: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen für diese Immunpräzipitation beträgt 1 × 107. Adhärente Zellen müssen einen Tag vor dem Experiment ausgesät werden, so dass es am Tag des Experiments 1 ×10 7 Zellen gibt.
- Adhärenzzellen für das Experiment vorbereiten
- Samen Sie 5-8 × 106 adhärente Zellen in 20 ml Medium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) für jede Bedingung in 14,5 cm Schalen einen Tag vor Beginn des Experiments.
- Stellen Sie am Tag des Experiments sicher, dass die Zellen zu 80-90% konfluent sind und an der Schale haften. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie den adhärenten Zellen frisches Medium hinzu.
- Vorbereitung von Suspensionszellen für das Experiment
- 1 × 107 Suspensionszellen vorsichtig in 10 mL Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien für die Zusammensetzung) pro Zustand unmittelbar vor Beginn des Experiments in 14,5 cm Schalen geben.
- Wenn Primärzellen verwendet werden, isolieren Sie primäre T-Zellen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren21. Behandeln Sie primäre T-Zellen mit 1 μg / ml Phytohämagglutinin für 24 h, gefolgt von einer 25 U / ml IL2-Behandlung für 6 Tage.
- 1 × 108 primäre T-Zellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) pro Bedingung unmittelbar vor Beginn des Experiments in 14,5 cm Schalen geben.
HINWEIS: Diese höhere Anzahl von primären T-Zellen wird empfohlen, da diese Zellen kleiner sind.
2. CD95L Stimulation
- Stimulieren Sie die Zellen mit CD95L (hergestellt wie zuvorbeschrieben 20 oder kommerziell erhältlich (siehe Tabelle der Materialien)).
ANMERKUNG: Die Konzentration des CD95L und der Zeitpunkt der Stimulation sind zelltypabhängig13,15,22,23,24,25. Bereiten Sie eine Stimulationsbedingung zweimal vor, um parallel eine "Perlenkontrollprobe" zu erzeugen.- Stimulieren Sie adhärente Zellen mit der ausgewählten Konzentration von CD95L. Halten Sie die Platte in einem Winkel und pipettieren Sie den Liganden in das Medium, ohne die adhäsiven Zellen zu berühren.
- Stimulieren Sie Die Suspensionszellen mit CD95L, indem Sie die Ligandenlösung in die Zellsuspension pipettieren.
3. Zellernte und Lyse
- Stellen Sie das Zellgeschirr auf Eis.
HINWEIS: Entsorgen Sie das Medium nicht. Sterbende Zellen schweben im Medium und sind wichtig für die Analyse. - 10 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Zellsuspension geben und die angeschlossenen Zellen von der Platte abkratzen. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die Zellschale zweimal mit 10 ml kaltem PBS und geben Sie die Waschlösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml Lysepuffer (mit 4% Protease-Inhibitor-Cocktail). Inkubieren Sie es für 30 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie das Lysat mit maximaler Geschwindigkeit (~17.000 × g) für 15 min, 4 °C.
- Den Überstand (Lysat) in ein sauberes Röhrchen geben. Entsorgen Sie das Pellet. Nehmen Sie 50 μL des Lysats in einem anderen Röhrchen. Analysieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay und nehmen Sie die Menge an Lysat, die 25 μg Protein entspricht, in eine Durchstechflasche. Fügen Sie der Durchstechflasche Ladepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) hinzu. Lagern Sie es bei -20 °C als Lysatkontrolle.
4. Immunpräzipitation (IP)
- Dem Lysat werden 2 μL Anti-APO-1-Antikörper und 10 μL Protein-A-Sepharoseperlen (wie vom Hersteller empfohlen hergestellt) zugegeben. Geben Sie nur 10 μL der Kügelchen in ein separates Röhrchen, das Lysat enthält (stimulierte Probe), um eine "Perlenkontrolle" zu erzeugen.
HINWEIS: Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiten Öffnungen, indem Sie entweder die Spitzen schneiden oder spezielle Spitzen für IP kaufen, während Sie mit den Protein-A-Sepharose-Perlen umgehen. - Inkubieren Sie die Mischung aus Lysat mit Antikörpern/Eiweiß A-Sepharoseperlen mit sanftem Mischen über Nacht bei 4 °C. Zentrifugieren Sie die Lysate mit Antikörpern/Protein A Sepharoseperlen bei 500 × g für 4 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 1 ml kaltes PBS zu den Kügelchen und wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal.
- Verwerfen Sie den Überstand. Die Kügelchen vorzugsweise mit einer 50 μL Hamilton Spritze absaugen.
5. Western Blot
- 20 μL 4x Ladepuffer (siehe Tabelle der Materialien für die Zusammensetzung) zu den Kügelchen geben und bei 95 °C für 10 min erhitzen. Erhitzen Sie die Lysatsteuerungen bei 95 °C für 5 min.
- Laden Sie die Lysate, IPs und einen Proteinstandard auf ein 12,5% iges Natriumdodecylsulfat (SDS) -Gel (siehe Materialtabelle für die Gelvorbereitung) und laufen Sie mit einer konstanten Spannung von 80 V.
- Übertragen Sie die Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran.
HINWEIS: Hier wurde die für die interessierenden Proteine optimierte Halbtrockentechnik für den Transfer über 12 min (25 V; 2,5 A= konstante) verwendet. Weichen Sie die Nitrocellulosemembran und zwei Mini-Transferstapel in Elektrophoresepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung, bereiten Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers vor) für einige Minuten vor dem Western Blotting ein. - Legen Sie die abgefleckte Membran in eine Box und blockieren Sie sie für 1 h in Blocklösung (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% Milch). Inkubieren Sie die Membran mit der Blockierlösung unter sanfter Bewegung.
- Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.
6. Erkennung von Western Blot
- Der erste Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung (siehe Materialtabelle)wird in die Membran gegeben und über Nacht bei 4 °C unter sanfter Bewegung inkubiert.
- Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.
- Inkubieren Sie die Membran mit 20 ml sekundärem Antikörper (verdünnt 1:10.000 in PBST + 5% Milch) mit sanftem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.
- Entsorgen Sie PBST und geben Sie etwa 1 ml Meerrettichperoxidase-Substrat zur Membran.
- Erkennen Sie das chemolumineszente Signal (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Belichtungszeit und die Anzahl der aufgenommenen Bilder hängen von der Proteinmenge in der Zelle und der Spezifität der verwendeten Antikörper ab. Sie muss für jeden zum Nachweis verwendeten Antikörper empirisch ermittelt werden.
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Representative Results
Um die Caspase-8-Rekrutierung auf die DISC und deren Verarbeitung an der CD95 DISC zu analysieren, beschreibt dieses Papier einen klassischen Workflow, der IP der CD95 DISC mit Western-Blot-Analyse kombiniert. Dies ermöglicht den Nachweis mehrerer Schlüsselmerkmale der Caspase-8-Aktivierung an der DISC: die Montage der Caspase-8-aktivierenden makromolekularen Plattform, die Rekrutierung von Procaspase-8 in die DISC und die Verarbeitung dieser Initiator-Caspase (Abbildung 1 und Abbildung 2). Dieser Workflow beinhaltet die zeitabhängige Behandlung empfindlicher Zellen mit CD95L, gefolgt von ihrer Lyse, Immunpräzipitation mit Anti-CD95 (Anti-APO-1) Antikörpern und anschließender Western-Blot-Analyse (Abbildung 3).
Gebärmutterhalskrebs HeLa-CD95 Zellen wurden als Beispiel verwendet, um die DISC-Bildung26zu analysieren. Die Stimulation dieser Zellen mit CD95L führte zu einer hohen CD95-DISC-Bildung, die durch CD95-Immunpräzipitation überwacht wurde (Abbildung 4). CD95, FADD, Procaspase-8, Procaspase-10 und c-FLIPs wurden in diesen CD95-Immunpräzipitationen beobachtet, was auf eine effiziente DISC-Bildung hinweist. Wichtig ist, dass die Spaltprodukte von Procaspase-8a/b: p43/p41, p30 und p18 an der DISC nachgewiesen wurden, was auf die Aktivierung von Procaspase-8 und ihre anschließende Verarbeitung hinweist. Insbesondere wurden die Spaltprodukte von Procaspase-8 p43/p41 und p18 nachgewiesen, was auf die beiden oben genannten Schritte des p43-Verarbeitungsweges hinweist. Darüber hinaus wurde das p30-Produkt nachgewiesen, was auf den alternativen Weg der Caspase-8-Verarbeitung hinweist. Darüber hinaus folgt auf die Aktivierung der Procaspase-8 an der DISC die Spaltung ihrer Substrate wie c-FLIP-Proteine.
Tatsächlich wurden die Spaltprodukte von c-FLIP-p43-FLIP und p22-FLIP-in den Immunpräzipitationen nachgewiesen, was auf eine Caspase-8-Aktivierung hinweist (Abbildung 4). Wichtig ist, dass weder FADD, Procaspase-8, Procaspase-10 und c-FLIPs noch deren Spaltprodukte in den Immunpräzipitationsproben von unbehandelten Zellen nachgewiesen wurden, was die Spezifität der DISC-Immunpräzipitation unterstreicht (Abbildung 4). Wichtige Informationen können aus diesen Experimenten gewonnen werden, indem die Banden quantifiziert werden, die den verschiedenen Spaltprodukten von Procaspase-8 entsprechen (Abbildung 4). Diese Informationen können in der mathematischen Modellierung von Apoptose-Netzwerken verwendet werden und liefern quantitative Einblicke in die Signalwegregulation.
Der Grad der Caspase-8-Aktivierung an der DISC wird durch c-FLIPs moduliert. Daher wurden HeLa-CD95-Zellen, die c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 überexprimieren, als zweites Beispiel ausgewählt (Abbildung 5). Die Effekte der c-FLIPL-Isoform in diesen Experimenten konnten beobachtet werden, was zu einer anderen Rate der Procaspase-8a/b-Verarbeitung zu p43/p41 an der DISC führte als die entsprechende Proteolyse von Procaspase-8 an der DISC in elterlichen HeLa-CD95-Zellen, wie von Hillert et al. beschrieben. 15. Ähnlich wie bei den Beobachtungen in Abbildung 4wurde in den Immunpräzipitationen aus HeLa-CD95-FL-Zellen ohne CD95L-Behandlung keine Rekrutierung von FADD-, Procaspase-8-, Procaspase-10-, c-FLIP-Proteinen und deren Spaltprodukten nachgewiesen, was die Spezifität dieser Immunpräzipitationen unterstützt. Ein weiterer Beweis für die Spezifität von Immunpräzipitationen ist das Fehlen der Rekrutierung von Procaspase-3 und Poly(ADP-ribose)polymerase 1 (PARP1) in die DISC, die bei den CD95L-behandelten Immunpräzipitationen beobachtet wurde (Abbildung 5). Diese Proteine sind nicht Teil des Komplexes, und ihre Abwesenheit in den Immunpräzipitationssignalen kann als Beweis für das Fehlen einer unspezifischen Bindung von reichlich vorhandenen zellulären Proteinen dienen.
Schließlich wurden als drittes Beispiel Immunpräzipitationen von CD95 DISC aus Suspensionszellen durchgeführt, z.B. aktivierte primäre T-Zellen (Abbildung 6). Diese Zellen sind auch durch hohe Konzentrationen von CD95, FADD, Procaspase-8, Procaspase-10 und c-FLIPs gekennzeichnet, die in Anti-CD95-Immunpräzipitationen zusammen mit ihren Spaltprodukten beobachtet wurden (Abbildung 6). Der Nachweis von Procaspase-8-Spaltprodukten in den Immunpräzipitationen weist auf die Aktivierung und Verarbeitung dieser Initiator-Caspase in der DISC-Immunpräzipitation aus primären T-Zellen hin. Diese Experimente deuten darauf hin, dass die DISC aus vielen Adhärenz- und Suspensionszellen immunpräzipitiert werden kann und dass die Caspase-8-Verarbeitung und -Aktivierung durch Western-Blot-Analyse validiert werden kann.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des CD95-Signalwegs. CD95L löst die DISC-Baugruppe aus. Die DISC besteht aus CD95, FADD, procaspase-8/-10 und c-FLIP. FADD bindet über sein DD an CD95, während Procaspase-8, Procaspase-10 und c-FLIPs über ihre DEDs interagieren und DED-Filamente bilden. Die Bildung der DED-Filamente dient als Plattform für die Procaspase-8-Dimerisierung, -Verarbeitung und anschließende Aktivierung. Der aktive Caspase-8-Heterotetramer, p182/p102,aktiviert Caspase-3 durch Spaltung, was zur Apoptose führt. Abkürzungen: CD = Cluster der Differenzierung; CD95L = CD95-Ligand; DISC = todesinduzierender Signalkomplex; DD = Todesdomäne; FADD= Fas-assoziierte Todesdomäne; c-FLIP = zelluläres FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory protein; DED = Todeseffektor-Domäne; c-FLIPL = c-FLIPLang. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Procaspase-8-Verarbeitung an der DISC. Zwei Möglichkeiten der Procaspase-8a/b-Verarbeitung an der DISC werden gezeigt. Der erste Weg beinhaltet die p43 / p41-Generierung, gefolgt von der p18-Bildung. Der zweite Weg beinhaltet die p30-Generierung, gefolgt von der Verarbeitung zu p18 und p10. Die Rückstände sind nach der Sequenz der Procaspase-8a nummeriert. Abkürzungen: DED = Death Effector Domain. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus des DISC-IP. Zellen werden mit CD95L stimuliert. Nach der Stimulation werden die Zellen geerntet und gesammelt, gefolgt von verschiedenen Waschschritten. Die Zellen werden dann lysiert und die Lysate werden gesammelt. Anschließend wurden dem Lysat Protein-A-Sepharose-Kügelchen und Anti-APO-1 (Anti-CD95)-Antikörper zugesetzt und über Nacht inkubiert. Nach mehreren Waschschritten wurden die Immunpräzipitationen durch Western Blotting analysiert. Abkürzungen: DISC = todesinduzierender Signalkomplex; IP = Immunpräzipitation; CD95L = CD95 Ligand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: CD95 DISC-Bildung in HeLa-CD95-Zellen. HeLa-CD95-Zellen wurden mit 125 ng/ml CD95L für 30 min oder 1 h stimuliert. CD95 DISC-IPs wurden unter Verwendung von Anti-APO-1 (Anti-CD95) Antikörpern durchgeführt. Die Zusammensetzung der IPs wurde mittels Western-Blot-Analyse anhand der Antikörper für die angegebenen Proteine untersucht. Aktin wurde als Ladesteuerung verwendet. Eingaben werden angezeigt. Die Quantifizierung von Procaspase-8-Spaltprodukten an der DISC wird gezeigt und auf das CD95-Signal normalisiert. Abkürzungen: l.e. = Langzeitexposition; s.e. = Short-Exposure; BC = Kontroll-IP mit "nur Perlen", ohne Zusatz von Antikörpern; CD95L = CD95-Ligand; DISC = todesinduzierender Signalkomplex; IP = Immunpräzipitation; FADD = Fas-assoziierte Todesdomäne; c-FLIP = zelluläres FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory protein; c-FLIPL = c-FLIPLang; c-FLIPS = c-FLIPKurz; M = Molekulargewicht in KiloDalton (kDa). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: CD95 DISC Bildung in c-FLIPL-überexprimierenden HeLa-CD95 Zellen. HeLa-CD95-FL-Zellen wurden mit 250 ng/ml CD95L für die angegebenen Zeitpunkte (1-3 h) stimuliert. CD95 DISC-IPs wurden unter Verwendung von Anti-APO-1 (Anti-CD95) Antikörpern durchgeführt. Die Zusammensetzung der IPs wurde mittels Western-Blot-Analyse untersucht und auf die angegebenen Proteine analysiert. Aktin wurde als Ladesteuerung verwendet. Eingaben werden angezeigt. Die Quantifizierung von Procaspase-8-Spaltprodukten an der DISC wird gezeigt und auf das CD95-Signal normalisiert. Ein repräsentatives Experiment von zwei wird gezeigt. Abkürzungen: l.e. = Langzeitexposition; s.e. = Short-Exposure; BC = Kontroll-IP mit "nur Perlen", ohne Zusatz von Antikörpern; CD95L = CD95-Ligand; DISC = todesinduzierender Signalkomplex; IP = Immunpräzipitation; FADD = Fas-assoziierte Todesdomäne; c-FLIP = zelluläres FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory protein; c-FLIPL = c-FLIPLang; PARP1 = Poly(ADP-ribose)polymerase 1; M = Molekulargewicht in KiloDalton (kDa). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: CD95 DISC-Bildung in primären T-Zellen. Primär aktivierte T-Zellen wurden mit 500 ng/ml CD95L für 15 min und 30 min stimuliert. CD95 DISC-IPs wurden unter Verwendung von Anti-APO-1 (Anti-CD95) Antikörpern durchgeführt. Die Zusammensetzung der IPs wurde mittels Western-Blot-Analyse untersucht und auf die angegebenen Proteine analysiert. Aktin wurde als Ladesteuerung verwendet. Die Quantifizierung von Procaspase-8-Spaltprodukten an der DISC wird gezeigt und auf das CD95-Signal normalisiert. Eingaben werden angezeigt. Abkürzungen: l.e. = Langzeitexposition; s.e. = Short-Exposure; ; CD95L = CD95-Ligand; DISC = todesinduzierender Signalkomplex; IP = Immunpräzipitation; FADD = Fas-assoziierte Todesdomäne; c-FLIP = zelluläres FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory protein; c-FLIPL = c-FLIPLang; M = Molekulargewicht in KiloDalton (kDa). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieser Ansatz wurde erstmals von Kischkel et al.27 beschrieben und seitdem von mehreren Gruppen erfolgreich entwickelt. Für eine effiziente DISC-Immunpräzipitation und überwachung der Caspase-8-Verarbeitung in diesem Komplex müssen mehrere wichtige Aspekte berücksichtigt werden.
Erstens ist es wichtig, alle Waschschritte während der Immunpräzipitation zu befolgen. Besonders wichtig sind die letzten Waschschritte der Sepharoseperlen und das Trocknen der Sepharoseperlen. Dies muss korrekt durchgeführt werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis der Immunpräzipitation zu erhöhen, was den Nachweis der Caspase-8-Rekrutierung und -Verarbeitung an der DISC ermöglicht. Wichtig ist, dass für sehr empfindliche Analysetechniken wie die Massenspektrometrie auch ein "Preclearing-Schritt" wichtig sein kann, der die Inkubation der Lysate nur mit den Sepharoseperlen oder Isotyp-Kontrollantikörpern umfasst, um das Rauschen zu reduzieren. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass dieser Vorclearing-Schritt für den Nachweis der Caspase-8-Rekrutierung in die DISC durch Western Blotting nicht wesentlich ist7,23. Wie bereits erwähnt, ist jedoch das Waschen der Perlen am Ende der Immunpräzipitation unerlässlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die unspezifische Bindung von reichlich vorhandenen zellulären Proteinen an die Sepharoseperlen kann im Wesentlichen die spezifischen Signale der DISC-Kernkomponenten verringern. Als wichtige Kontrolle für das Fehlen der unspezifischen Bindung könnte eine Western-Blot-Analyse der Proteine durchgeführt werden, von denen berichtet wird, dass sie an der DISC nicht vorhanden sind. Ein Beispiel für diese Analyse ist in Abbildung 5gegeben, in der die Rekrutierung von PARP1 und Caspase-3 zur DISC-Immunpräzipitation nicht beobachtet wurde. Dies zeigt die Spezifität der jeweiligen Immunpräzipitation und das ausreichende Waschen der Sepharoseperlen während des Experiments an.
Zweitens ist es entscheidend, Negativkontrollen wie eine reine Kügelchenkontrolle oder eine Immunpräzipitationskontrolle mit einem Antikörper mit dem gleichen Isotyp wie der für die Immunpräzipitation verwendete Antikörper durchzuführen. Für Anti-APO-1-Antikörper können Anti-Maus-IgG3-Antikörper als Isotypkontrolle verwendet werden. Drittens ist es wichtig, die Ergebnisse der Immunpräzipitation aus unbehandelten Proben zu überwachen, bei denen nur CD95 beobachtet werden sollte. Der Nachweis von FADD, c-FLIP oder Procaspase-8 in diesen Proben weist typischerweise auf das Vorhandensein einiger Mängel im Immunpräzipitationsprotokoll oder in den Waschschritten hin. Dies könnte zu Annahmen über die stimulationsunabhängige Assoziation von FADD oder c-FLIP mit CD95 führen, die möglicherweise nicht ganz korrekt sind, und stattdessen auf Mängel in der Immunpräzipitation hinweisen. Viertens müssen für jede Immunpräzipitation die Inputs oder Lysate sorgfältig parallel analysiert werden, um die Expression und die posttranslationalen Modifikationen der durch Immunpräzipitation analysierten Kernproteine zu messen.
Fünftens ermöglicht die zeitabhängige Analyse die Verfolgung von Veränderungen im Komplex im Laufe der Zeit und liefert eine weitere wichtige Bestätigung für die Spezifität der für den Komplex rekrutierten Proteine. In diesem Zusammenhang ist ein wichtiges Problem, dass jede Zelllinie ein unterschiedliches Niveau der CD95-Expression und der intrazellulären Komponenten dieses Komplexes aufweist. Dementsprechend muss der genaue Zeitpunkt der CD95 DISC-Bildung für jeden einzelnen Zelltyp sorgfältig festgelegt werden. Schließlich ist die entscheidende Frage für die Analyse der DISC-Dynamik der Vergleich der Proteinmenge in jeder Immunpräzipitation. Für CD95 DISC-Immunpräzipitationen, die mit Anti-APO-1-Antikörpern durchgeführt werden, ist die Menge an CD95 ein Schlüsselmaß für die gleiche Menge der verglichenen Komplexe. Dies kann schwierig sein, da die Intensität des CD95-Signals in den Immunpräzipitationen relativ hoch ist. Allerdings muss man das optimale Zeitintervall für die Messung des entsprechenden Western-Blot-Signals finden. Ein weiteres Hindernis besteht darin, dass CD95 ein stark glykosyliertes Protein ist, das auch zu den Schwierigkeiten bei der Erkennung in der Immunpräzipitation beiträgt, da ein bestimmtes Muster mehrerer "verschwommener" Banden vorhanden ist28.
Die DISC-Immunpräzipitationsanalyse bietet eine optimale Grundlage für den Nachweis der Caspase-Aktivierung und -Verarbeitung. Tatsächlich ermöglicht die Immunpräzipitation in Kombination mit Western Blotting den quantitativen Nachweis von Spaltprodukten von Procaspase-8a/b: p43/p41, p30 und p18, wie in dieser Studie gezeigt (Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 6). Dies wiederum ermöglicht es den Experimentatoren, Veränderungen in der Procaspase-8a/b-Verarbeitung im Laufe der Zeit zu verfolgen und verschiedene Spaltungsschritte von Procaspase-8 zu unterscheiden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich verwendet, um die Caspase-8-Aktivierung in mathematischen Modellen zu beschreiben und zwischen inter- und intramolekularer Procaspase-8-Verarbeitung an der DISC7,20,29zuunterscheiden. Darüber hinaus hat die Messung von Caspase-8-Spaltprodukten durch Western Blotting klare Vorteile gegenüber den herkömmlichen Caspase-8-Aktivitätsassays auf Basis von IETD-Substrat. Im letzteren Fall ist es allgemein bekannt, dass IETD auch als Substrat für die anderen Caspasen dient. Daher gibt es zunehmend Hinweise darauf, dass der Nachweis der IETD-Aktivität auf einen allgemeinen Anstieg der Caspase-Aktivität in der Zelle hinweist. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung der Western-Blot-Analyse dazu beitragen, caspase-8 die entsprechenden Banden im Western Blot spezifisch zuzuordnen, so dass der Forscher sicher sein kann, dass Caspase-8 in diesem Komplex aktiviert ist. Darüber hinaus stellt die Messung der Caspase-8-Verarbeitung auf der DISC, wie oben erwähnt, ein hervorragendes Werkzeug für mathematische Modellierung und systembiologische Studien dar. Zusammengenommen wird ein klassischer Workflow vorgestellt, der die Überwachung verschiedener Schritte der Procaspase-8-Aktivierung und -Verarbeitung ermöglicht, die für die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen des Zelltods unerlässlich ist.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken der Wilhelm Sander-Stiftung (2017.008.02), dem Center of Dynamic Systems (CDS), gefördert durch das EU-Programm EFRE (Europäischer Fonds für regionale Entwicklung) und der DFG (LA 2386) für die Unterstützung unserer Arbeit. Wir danken Karina Guttek für die Unterstützung unserer Experimente. Wir danken Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) für die Bereitstellung von primären T-Zellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
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| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
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| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
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| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
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| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
