Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مراقبة دورة القوارض الحثالة باستخدام غسل المهبل: لا يوجد شيء مثل الدورة العادية

Published: August 30, 2021 doi: 10.3791/62884
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2
1Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, 2Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

Summary

تفصل هذه الدراسة العوامل الحاسمة التي يجب مراعاتها في التصاميم التجريبية التي تشمل إناث الفئران. وبمعنى أوسع، تعمل هذه البيانات على تقليل وصمة العار والمساعدة في تطوير أدوات تشخيص وتدخل أكثر شمولا.

Abstract

تضع المنهجية الحالية نهجا قابلا للتكرار وموحدا وفعالا من حيث التكلفة لرصد الدورة الاستروسية لإناث الفئران المراهقة Sprague Dawley (SD). توضح هذه الدراسة مدى تعقيد الدورات الهرمونية والطيف الواسع من الفهم المطلوب لبناء تقنية مراقبة موثوقة وصالحة. ومن خلال دراسة متعمقة للتصميم التجريبي الرئيسي والعناصر الإجرائية، يوفر هذا الوصف للدورة ومبادئها الأساسية إطارا لمزيد من الفهم وتفكيك المفاهيم الخاطئة لتكرارها في المستقبل.

جنبا إلى جنب مع مخطط لعملية جمع العينات التي تستخدم غسل المهبل ، يصف الإجراء آلية تصنيف البيانات في نموذج من أربع مراحل من proestrus ، شبق ، metestrus ، و diestrus. تتميز هذه المراحل بنهج مقترح جديد ، باستخدام محددات تصنيف 4 لحالة السائل المهبلي ، ونوع (أنواع) الخلايا الموجودة ، وترتيب الخلايا ، وكمية الخلية في وقت الجمع. يتم تقديم الاختلافات في كل مرحلة ، والعينات المواتية وغير المواتية ، والتمييز بين الدورية واللادورية ، والصور البيانية لمكونات التصنيف التي تم جمعها جنبا إلى جنب مع الممارسات التفسيرية والتنظيمية الفعالة للبيانات. وعموما، تسمح هذه الأدوات بنشر نطاقات بيانات قابلة للقياس الكمي لأول مرة، مما يؤدي إلى توحيد عوامل التصنيف عند تكرارها.

Introduction

مساهمات جديدة
تم تحديد دورة استروس القوارض كمؤشر أساسي للعافية. ومع ذلك ، فإن التحيزات اللاواعية للمحققين والتفسيرات غير الدقيقة فيما يتعلق بالجسد الأنثوي تعيق المجتمع العلمي. إن أصل كلمة "estrous" ينطوي على شعور بالدونية والسلبية. استخدم يوريبيدس المصطلح لوصف "الجنون" أو الجنون ، وهوميروس لوصف الذعر ، وأفلاطون لوصف الدافع غير العقلاني. تسلط هذه الدراسة الضوء على كيفية تأثير هذه المنظورات البدائية على المجتمع العلمي الحالي وتعالج هذه المخاوف من خلال نموذج فسيفساء جديد - وهو مزيج محدث من الأساليب التي تمت دراستها سابقا ، وتم توسيعها في نطاق نهج أكثر شمولا.

ودراسة هذه التقنية واستخدامها ضروريان، أولا، نظرا لعدم وجود تقنية رصد موحدة وشاملة، ويمكن أن تكون ممارسات تفسير البيانات غير واضحة. ثانيا ، على الرغم من أن خصائص دورة estrous تعتمد على الفئران الفردية التي تتم دراستها ، إلا أنها غالبا ما تكون عالمية. ثالثا ، في حين أن الدورات الهرمونية هي عمليات روتينية ومفيدة ، إلا أنها محاطة بوصمة عار خطيرة تم استكشافها في قسم "الترجمة إلى البشر". تهدف هذه الدراسة إلى معالجة هذه القضايا الثلاث بثلاث طرق - (أ) من خلال وصف تقنية مراقبة دورة استروس متعمقة وتوضيح كيفية تفسير النتائج ، (ب) من خلال تحديد الطرق التي تحافظ على سلامة وفردية كل دورة ، و (ج) من خلال لفت الانتباه إلى المفاهيم الخاطئة التي تديم الممارسات غير المثبتة.

هذه الدراسة فريدة من نوعها أيضا في تركيزها على الفئران المراهقة ، وهي فترة تميزت بتغيرات تنموية حاسمة تلقي الضوء على مختلف المظاهر السلوكية والتشريحية والفسيولوجية في مرحلة البلوغ1. إن بناء تصميم تجريبي موحد لمراقبة الدورات الهرمونية في مجموعة سكانية لم يتم بحثها بشكل كاف مع تفكيك التحيزات الشائعة سيسمح بتطوير ارتباطات هرمونية موثوقة وصالحة2،3،4 وتحديد اضطرابات الدورة المعتمدة على الحالة5،6،7،8،9،10 . في نهاية المطاف ، تعمل هذه المستجدات على توسيع معايير التشخيص والعلاجات والتدخلات لمختلف المخاوف الصحية.

التعاريف والاستخدامات الأساسية
دورة estrous هي مجموعة من العمليات الفسيولوجية الديناميكية التي تحدث استجابة لهرمونات الستيرويد الجنسية الأنثوية الثلاثة المتذبذبة: استراديول ، هرمون leuteinizing (LH) ، والبروجسترون (الشكل 1A ، B). التفاعلات بين الغدد الصماء والجهاز العصبي المركزي تنظم الدورة ، والتي غالبا ما تستمر لمدة 4-5 أيام وتتكرر من بداية النضج الجنسي حتى الشيخوخة الإنجابية و / أو التوقف. وهي مقسمة إلى فئات منفصلة بناء على مستويات الهرمونات - الأكثر شيوعا في 4 مراحل من diestrus (DIE) ، proestrus (PRO) ، شبق (EST) ، و metestrus (MET) ، والتي تتطور بطريقة دائرية. يمكن أن يتراوح عدد الأقسام من 3 مراحل11 إلى 13 مرحلة 12 ، اعتمادا على طبيعة الدراسة13. وغالبا ما يستبعد العدد الأدنى من الشعب برنامج العمل المتعدد الأطراف كمرحلة ويصنفه على أنه فترة انتقالية قصيرة الأجل. يتضمن العدد الأكبر عادة أقساما فرعية تسمح بإجراء فحص دقيق لظواهر مثل تطور الورم أو الحمل الكاذب التلقائي ، والحالة الفسيولوجية للحمل دون زرع جنيني12،14،15.

في هذه الدراسة ، تم تحديد المراحل من خلال مكونات القناة المهبلية ، وسميت 3 محددات تصنيف - نوع (أنواع) الخلايا الموجودة ، وترتيب الخلايا ، وكمية الخلية (الشكل 2A-D). في حين لم يتم رصد حالة السائل المهبلي في هذه الدراسة ، فمن المستحسن إدراجه كمكون تصنيف رابع. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول فحص السائل المهبلي في القائمة المرجعية16. يمكن فحص مكونات التصنيف عن طريق استخراج الخلايا عن طريق غسل المهبل ، وهي التقنية الأساسية الموصى بها في مراقبة دورة استروس في العصر الحديث. في حين أن العمليات الفسيولوجية المتعمقة داخل كل مرحلة هي خارج نطاق هذه الدراسة ، يمكن العثور على مزيد من المعلومات في الأدبيات17.

إن استخدام تقنية مراقبة دورة estrous هذه وتطويرها المستمر متجذر في الروابط بين هرمونات الستيرويد الجنسية ووظيفة الأنظمة الجسدية مثل نظام القلب والأوعية الدموية18 ونظام الغدد الصماء8 والجهاز العصبي المركزي19،20،21. في الوقت نفسه ، قد لا يكون من الضروري دائما مراقبة دورة estrous عندما تشارك القوارض الإناث22،23،24،25. بدلا من ذلك ، من المهم أولا النظر فيما إذا كان قد تم الإبلاغ عن الاختلافات بين الجنسين في مجال الدراسة المحدد ، والذي يمكن استكشافه بشكل أكبر في المراجعات المنشورة22,23. على الرغم من أن مراقبة دورة الاستروس أمر حيوي في مجموعة واسعة من التحقيقات البحثية ، إلا أنه لا ينبغي النظر إليها على أنها عقبة أمام إشراك القوارض الإناث في التجارب. في حين أن هذه التقنية قد تبدو معقدة وتستغرق وقتا طويلا ، إلا أن الإجراء نفسه قد يستغرق أقل من 15 دقيقة لإكماله ، اعتمادا على المحقق ، وهو فعال من حيث التكلفة. بشكل عام ، فإن إدراج القوارض الإناث في الدراسات العلمية مفيد لفهم أنظمة الجسم ، والظروف والأمراض المختلفة ، والعافية العامة ، حيث استندت هذه التطورات بشكل أساسي إلى قالب جسم الذكور.

المعلمات العالمية والتغيرات الطبيعية في القوارض
ومن الضروري تحديد نطاقات للجوانب التي ينظر إليها على أنها "نموذجية" لتحديد أنماط الدورات القياسية، ووضع بارامترات لأغراض المقارنة والتحليل، والكشف عن التشوهات والقيم المتطرفة. في الوقت نفسه ، من المهم أيضا إدراك أن دورة كل فأر فريدة من نوعها ، ومن المتوقع حدوث انحرافات بناء على سلالة الحيوان والعمليات الفسيولوجية والظروف البيئية. في الواقع ، واحدة من أكثر الجوانب "الطبيعية" لدورة estrous هي التباين. وينظر إلى هذا في طول الدورة الإجمالية, مع مجموعة من 3-38 يوما26,27; عمر النضج الجنسي الذي يمكن أن يتراوح من 32-34 يوما إلى عدة أسابيع28،29،30 ؛ ما يعتبر غير دوري 11 ، وتصنيف الأنماط المحددة11,13. بشكل عام ، لا يوجد قالب عالمي لدورة estrous ، وترجمة ذلك إلى كل من المجتمع العلمي وعامة الناس هو جزء مهم من العملية التجريبية.

النقاط الزمنية التجريبية وعمر النمو
إن الاعتراف بمبدأ التباين هذا يساعد في بناء تصميم تجريبي موثوق وصالح. على سبيل المثال ، تعتمد بداية مراقبة ركوب الدراجات الاستروس على التطور التشريحي والفسيولوجي للفئران ، والذي يختلف بناء على العوامل البيئية والفسيولوجية. لا يمكن أن تبدأ المراقبة حتى تطور الفتحة المهبلية (VO) ، وهي الفتحة المهبلية الخارجية المحاطة بالفرج التي تؤدي إلى الجزء الداخلي من القناة المهبلية (الشكل 3A-D). في حين أن VO غالبا ما يتطور بشكل كامل بين سن 32 و 34 يوما ، إلا أنه يظل فرديا لكل موضوع ، ولا يزال الكثير عن العملية غير معروف. تم استخدام هذه الفتحة لتحديد بداية النضج الجنسي ، والتي تم ربطها بزيادة استراديول31 ، ونضج محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والمبيض32 ، والإباضة الأولى في الفئران17،33،34،35. ومع ذلك ، فقد وجدت المنشورات الحديثة أنه ليس سوى علامة غير مباشرة على التطور التناسلي ، حيث يمكن أن يصبح منفصلا عن الأحداث الهرمونية والتنموية في البيئات غير المواتية31 وقد يمثل تغيرات في مستويات الاستراديول بدلا من النضج الجنسي33. لذلك ، يوصى بعدم الاعتماد فقط على VO لتحديد عمر النمو وكمؤهل لمراقبة دورة estrous36 ولكن أيضا الاستفادة من ظهور المرحلة الأولى من EST وكورن الخلايا الظهارية30 للاحتفال ببداية النضج الجنسي.

يرتبط وزن الجسم بشكل ملحوظ بعمر النمو خلال فترة المراهقة في القوارض30,37 وبالتالي يمكن أن يساعد أيضا في تحديد عمر النمو في هذه الفترة. تشمل الآليات المقترحة المتعلقة بهذه الظاهرة تحفيز الهرمونات اللازمة للنمو التناسلي ، مثل هرمون النمو ، وتثبيط محور الغدة الكظرية تحت المهاد والغدة النخامية (HPA) بواسطة منظم الشهية ، اللبتين30. ومع ذلك ، لا ينصح باستخدام هذا المقياس كمؤشر وحيد لعمر النمو بسبب التباين الكبير الذي شوهد بين الفئران عبر الأنواع ومقدمي البائعين38. التباين الذي شوهد في تطوير VO ووزن الجسم يجسد أهمية المفهوم في العملية التجريبية الشاملة.

الترجمة إلى البشر: السياقات الثقافية والعلمية
العلاقة الانتقالية للدراسات الإنجابية بين الحيوان والإنسان ثنائية الاتجاه. تؤثر نتائج الدراسات القائمة على الحيوانات على كيفية تقييم العمليات البشرية والتعامل معها وتحليلها39. يؤثر تصور الجهاز التناسلي البشري والعمليات المرتبطة به على كيفية دراسة الحيوانات. في الواقع ، تنبع واحدة من أعلى المؤشرات لمزيد من البحث في هذا المجال من المعتقدات الاجتماعية والثقافية المتحيزة المتعلقة بالدورات الهرمونية التي تؤثر على العملية العلمية. العديد من هذه الاتفاقيات مستمدة من نفور ثقافي عام من مناقشة الحيض ، مما أدى إلى فجوة في البيانات في المعرفة المثبتة جيدا40,41. هذا له مجموعة من العواقب التي تمتد من طفيفة إلى قاتلة - من ارتفاع الرفوف وحجم الهاتف الذكي إلى تركيب دروع جسم الشرطة وتشخيص السرطان الفائت42.

إن وصف الحيض بأنه غير صحي ومدمر وسام - ينظر إليه في النصوص الموقرة ووسائل الإعلام والقواميس والتعاليم الطبية - محفوظ من خلال المنشورات العلمية. يحدث هذا من خلال أوصاف غير دقيقة ومتحيزة للدورات الهرمونية ، وعزل الجهاز التناسلي عن نظرائه من الغدد الصماء العصبية والتأثيرات البيئية ، والمنظور الاختزالي لإكمال الدورة على أنها "فشل في الحمل"43,44. وهذا يؤدي إلى خلق ممارسات تجريبية غير سليمة، مثل إغفال المتغيرات الخارجية التي تؤثر على الدورات الهرمونية، وتحديد نقاط البداية والنهاية استنادا فقط إلى التطورات التشريحية، وقياس تقدم الدورة بطريقة خطية بدلا من دائرية. على الرغم من العلاقة المباشرة بين العوامل الاجتماعية والثقافية والعواقب البيولوجية ، إلا أنه لا يتم النظر فيها غالبا في الأدبيات العلمية. من خلال فحص المنشورات الأكثر شمولية43،44،45 ، يمكن للباحثين تفكيك هذه الوصمات وإنشاء تصميمات تجريبية أكثر موثوقية وصلاحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تتوافق جميع طرق المناولة والإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول مع إرشادات رعاية واستخدام الحيوانات التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) وقد تمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة Pepperdine ولجنة أبحاث الحيوان التابعة لجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (ARC).

1. رعاية الحيوانات واستخدامها

  1. الحصول على الفئران الإناث ، بأعداد وفقا لتحليل الطاقة ، والفئران الذكور لتعزيز تأثير ويتن أو ركوب الدراجات أكثر اتساقا46. تحديد السلالة بناء على الهدف من الدراسة في قواعد البيانات المعروفة47.
    ملاحظة: تعكس البيانات الحالية بيانات برنامج التقييس الجيني الدولي SD (IGS) للمراهقات في وجود ذكور فئران SD الموجودة في كل من مختبرات جامعة Pepperdine و UCLA كجزء من دراسة تعاونية. وصلت هذه الفئران في مجموعات منفصلة في عمر 28 يوما ، وتم رصد تطور دورة استروس لمدة 10 أو 20 يوما لإظهار الاختلافات على المستويات الحادة والمزمنة ، بدءا من 34 يوما من العمر (بعد فترة تأقلم مدتها 7 أيام).
  2. قبل المناولة ، اسمح بالحجر الصحي و / أو فترة التأقلم لتحقيق الاستقرار الفسيولوجي بعد النقل والتكيف مع البيئة الجديدة.
    ملاحظة: تم الاستشهاد بفترة لا تقل عن 3 أيام ، مع فترة 7 أيام موصى بها48،49،50،51،52. بشكل عام ، يعتمد هذا على ظروف النقل ، وسلالة الحيوانات ، وأهداف الدراسة.
  3. تأكد من تقليل التوتر باستخدام فترة التأقلم ، لأن الإجهاد يمكن أن يعطل أداء الجهاز التناسلي السليم53. ومع ذلك ، لا تبالغ في التعويض من خلال محاولة القضاء عليه ، لأن كمية معتدلة من الإجهاد مفيدة لرفاهية الحيوانات51.
  4. استضافة الفئران في بيئة درجة حرارة (68-79 درجة فهرنهايت ، أي 20-26 درجة مئوية) وبيئة يتم التحكم فيها بالرطوبة (30-70٪) عن طريق الاتصال بمديري vivarium أو المختبرات وضمان هذه الميزات. توزيع المياه و chow ad libitum مع المكونات الغذائية المدرجة على موقع الشركة وتنظيف الأقفاص مرة واحدة في الأسبوع.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إيواء الفئران في مجموعات من 2 مفصولة بالجنس في أقفاص بلاستيكية شفافة قابلة لإعادة الاستخدام مقاس 19 بوصة × 10 بوصة × 8 بوصة وكان بإمكانها الوصول إلى فراش كوز الذرة الذي تم تغييره مرة واحدة في الأسبوع. تم الحفاظ على درجة الحرارة عند 70 درجة فهرنهايت والرطوبة عند 35-79 ٪ ، بمتوسط 62 ٪.
  5. تحقق من تطور الذيل الحلقي أو النخر الإقفاري للذيل وأصابع القدم للحصول على دليل على انخفاض مستويات الرطوبة النسبية ودرجات الحرارة القصوى ، والتي قد تسبب تناوب الاستجابات البيولوجية.
    ملاحظة: درجة الحرارة والرطوبة مهمة للجهاز التناسلي ، والنضج الجنسي ، ودورية estrous54,55,56,57,58.
  6. ضمان الإضاءة المناسبة والمتوازنة في جميع أنحاء مساحة السكن عن طريق إيداع كميات متساوية من مصادر الضوء في جميع أنحاء مساحة المختبر التي تعمل على نظام الضوء المظلم الذي يتم التحكم فيه زمنيا.
    ملاحظة: هنا ، تم التحكم في دورة الضوء 12:12-h : الظلام ، مع أضواء مضاءة من 06:00-18:00 h ، بواسطة مصابيح LED خطية 2,550 لومن.
  7. اتبع متطلبات لوكس المقدمة52 بناء على الاختلافات في تصبغ الحيوانات وعمرها وإجهادها وجنسها وحالتها الهرمونية.
    ملاحظة: عندما يصنف الباحثون عينات الخلايا التي تم جمعها ، فإن الإضاءة المتسقة ستسمح بالكشف البصري السليم والتدريج الموثوق به59. ترتبط مدة وشدة الضوء ارتباطا مباشرا بالجهاز التناسلي والنضج الجنسي وركوب الدراجاتفي المناطق الشرقية 54,55,56,57,60,61.

2. المعدات وإعداد التجارب

  1. مراجعة محددات التصنيف (كما هو موضح في الشكل 2A): كيفية تحديد كل مرحلة من مراحل دورة estrous وكيفية تشغيل المجهر ومعدات الكاميرا.
  2. تأكد من أن كل موضوع يخضع للمراقبة قد وصل إلى مرحلة النضج الجنسي ويظهر مؤشرات مناسبة للنمو - VO ووزن الجسم والعمر. وزن الفئران وفحصها بحثا عن VO في نفس الوقت كل يوم لإجراء مقارنات دقيقة ونقلها باستخدام طريقة معالجة معتمدة. استشر الطبيب البيطري التابع للجامعة إذا فقد أكثر من 20٪ من وزن جسمه السابق.
    ملاحظة: يبقى VO ذيليا إلى فتحة مجرى البول وجمجمة إلى فتحة الشرج ، وتقع بين الاثنين ، كما هو موضح في الشكل 3.
  3. وبما أن هذه العوامل تعتمد على الإجهاد، تحقق مع المورد من المواصفات والنظر في العوامل البيئية الخاصة بالمختبر62.
    ملاحظة: بشكل عام ، سيحدث هذا بين 32-34 يوما من العمر ومتوسط وزن الجسم يتراوح بين 75-150 جراما63 للفئران SD ويشار إليه بفتحة دائرية الشكل كانت مغطاة سابقا بغمد غشائي.
  4. حدد فترة جمع العينات المناسبة لمجموعة الفئران التي يتم رصدها لمنع جمع العينات الانتقالية. أولا ، قم بأخذ عينة من عدد قليل من الحيوانات في 2 أو 3 نقاط زمنية مختلفة على مدار اليوم لتحديد الوقت الذي توجد فيه معظم مراحل الدورة (على سبيل المثال ، أخذ العينات في الساعة 12:00 و 13:00 و 14:00 ساعة للحيوانات المختلفة). أكمل غسل المهبل في نفس الوقت كل يوم للحصول على تدريج متسق وموثوق.
    ملاحظة: تم الإبلاغ عن أن الساعات بين الساعة 12:00 و 14:00 هي الأفضل لالتقاط جميع المراحل. في هذه الدراسة ، حدث رصد دورة estrous بين الساعة 12:00 و 14:00 ، وتم التعامل معه باستخدام عقد نمط الضغط (انظر الخطوة 3.4). تعد أهمية توقيت مراقبة دورة estrous بالنسبة للتدخلات التجريبية الأخرى (مثل التكييف السلوكي والأدوية) مجالا متطورا للبحث ويمكن استكشافه بشكل أكبر11. يعتمد تحديد مدة مراقبة دورة estrous على الدراسة ويمكن استكشافه بشكل أكبر في الدراسات المنشورة11,33.
  5. قم بإزالة الغطاء الواقي من المجهر وقم بتوصيل الكاميرا بالكمبيوتر عن طريق إزالة غطاء عدسة الكاميرا الواقية ووضع العدسة فوق عدسة المجهر.
  6. ثم افتح البرنامج المحدد مسبقا على الكمبيوتر. لاستخدام البرنامج المحدد في هذه الدراسة، حدد الكاميرا المرفقة ب USB الموجودة على الجانب الأيسر من الشاشة، ضمن علامة التبويب المسماة قائمة الكاميرات. تأكد من توصيل كاميرا USB بالكمبيوتر بشكل صحيح، والتي ستقرأ " لا يوجد جهاز " ضمن علامة التبويب المسماة "قائمة الكاميرات"، إن لم يكن الأمر كذلك.
  7. بمجرد تحديد كاميرا USB ضمن علامة التبويب ، قم بتشغيل مفتاح ضوء المجهر الموجود على القاعدة.
  8. إنشاء مجلد على الكمبيوتر المخصص لصور عينة الخلية. قم بإنشاء مجلد ملفات لكل يوم منفصل يتم فيه جمع البيانات ، وإعدادها مسبقا قبل التقاط الصور.
  9. مع إعداد المعدات ، استرجع قفص الموضوع من مكان احتجازه وأحضره إلى محطة جمع العينات.

3. جمع الخلايا المهبلية

  1. استرجع حقنة يمكن التخلص منها واملأ كل حقنة من المحاقن ب 0.2 مل من كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪. في حالة وجود فقاعات هواء ، قم بتحريك حقنة البرميل بلطف حتى تصل جميع فقاعات الهواء إلى الطرف المفتوح من المحقنة وطرد الهواء. إذا كانت لا تزال هناك فقاعات هواء موجودة ، فقم بطرد المحلول مرة أخرى إلى وعاء كلوريد الصوديوم وأعد تعبئته حتى لا يكون هناك أي شيء.
    ملاحظة: قد يؤدي الخفقان المفرط إلى تكوين المزيد من فقاعات الهواء.
  2. أعد كل حقنة إلى الغلاف البلاستيكي للحفاظ على حقل معقم ، مع طرف المحقنة داخل الجزء المختوم من اللف.
  3. افتح القفص وارفع الموضوع برفق إما عن طريق قاعدة الذيل أو جذع الجسم ، وأغلق غطاء القفص لمنع الآخرين من الخروج. حدد طريقة احتجاز من تلك المدرجة أدناه بناء على التفضيل الشخصي واستجابة الحيوان.
  4. استخدم عقد الضغط على غرار الفئران المراهقة عن طريق وضع الهدف على منطقة الصدر العليا ، مع توجيه أنف الشخص إلى الأرض. قبل البدء في المسحة ، تأكد من أن الهدف مضغوط بما يكفي لمنع الحركة ولكنه مريح وآمن في الانتظار. كشف القناة المهبلية للموضوع عن طريق ثني الذيل بلطف قبل إدخال المحقنة.
  5. استخدم Hind Leg Lift للفئران البالغة عن طريق وضع الكفوف الأمامية للحيوان إما على الجزء العلوي أو الجانبي من القفص ، في حين يتم تقييد الذيل والأطراف الخلفية بقبضة لطيفة بين الإصبعين الأول والثاني ، مما يترك الإبهام حرا في تشغيل المحقنة64.
  6. السماح للحيوانات بالتأقلم مع التعامل والرصد. تعامل مع الحيوانات بلطف ولكن بأمان للحد من الإجهاد الزائد وحماية الباحث من العدوان مثل العض.
    ملاحظة: قد لا تسفر الأيام القليلة الأولى من المراقبة عن النتائج المرجوة حيث تتأقلم الحيوانات مع ظروفها. التعامل مع الحيوانات لجمع أوزان الجسم خلال فترة التأقلم يمكن أن يساعد في هذا الانتقال33.
  7. أثناء تثبيت المحقنة بالسبابة والإصبع الأوسط، أدخل طرف المحقنة (لا يزيد عن 2 مم) بزاوية موازية للقناة المهبلية. اطرد كلوريد الصوديوم ببطء إلى القناة عن طريق دفع المكبس إلى الداخل. لا تقم بإدخال المحقنة أكثر في القناة ، لأن القيام بذلك قد يعطل دورة الاستروس.
  8. استخرج كلوريد الصوديوم من القناة المهبلية عن طريق سحب مكبس المحقنة بعيدا عن البطانة الظهارية (لأعلى). إذا كانت هناك صعوبة في إبقاء الموضوع في الانتظار أثناء هذه العملية ، فضعه مرة أخرى في القفص لفترة راحة قصيرة قبل محاولة استخراج كلوريد الصوديوم.
  9. بمجرد جمع عينة الخلية ، ضع الموضوع مرة أخرى في القفص وكرر هذا الإجراء لكل قبل تقييم جميع العينات تحت المجهر.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن جمع كل عينة وتقييمها قبل الانتقال إلى الحيوان التالي. قد يحتاج الحيوان إلى غسل ثان إذا لم يكن من الممكن تصنيف العينة. يمكن إعادة استخدام نفس المحقنة من المجموعة الأولية إذا لم تتصل بالمياه المالحة مباشرة في الحاوية وفقط لنفس الحيوان.

4. تقييم العينة

  1. ابدأ التصنيف بفحص عينة السائل المهبلي المستخرجة. سجل اللزوجة إما لزجة أو غير لزجة والتلوين إما غير شفاف أو شفاف على مستند الوصف أو نظام تسجيل آخر.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا القسم من البروتوكول في وقت جمع العينات أو في وقت لاحق.
  2. اطرد 2-3 قطرات من السائل على شريحة المجهر وضع زجاج غطاء المجهر أعلى الشريحة. ضع زجاج الغطاء على شريحة المجهر من أعلى الشريحة إلى أسفلها أو من جانب واحد من الشريحة إلى الآخر لمنع تكوين فقاعات الهواء. إذا كان ذلك ممكنا، اترك ما يقرب من نصف العينة التي تم جمعها في المحقنة إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الفحص ولمنع وضع كمية زائدة من السوائل على الشريحة.
  3. حدد موقع الخلايا التي تم جمعها عن طريق تحريك شريحة المجهر عبر المرحلة. إذا كان هناك عدد قليل جدا من الخلايا أو كمية كبيرة من الحطام، اطرد السائل المتبقي إلى شريحة جديدة وأعد فحصه. إذا كانت كمية العينة المتبقية في المحقنة غير كافية ، أو إذا كانت القطرة الثانية تمثل مشكلات مماثلة ، فقم بجمع عينة أخرى من الموضوع قبل محاولة تحديد مرحلة دورة estrous.
  4. بمجرد تحديد موقع الخلايا وقبل لمس الكمبيوتر أو لوحة مفاتيح الكمبيوتر ، قم بإزالة القفاز الواحد لمنع تلويث لوحة المفاتيح.
  5. احصل على صور لعينات الخلايا من خلال النقر على الوظيفة المسماة Snap على الجانب الأيسر من لوحة البرامج.
  6. ثم احفظ الملف بالنقر فوق حفظ باسم أسفل أيقونة الملف في الزاوية العلوية اليسرى من الصفحة. احفظ الصورة ضمن مجلد مسمى مسبقا على الكمبيوتر.
    ملاحظة: مثال قالب التسمية: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective العدسة المستخدمة.
  7. التقط أكثر من صورة واحدة في كل عدسة موضوعية إذا لم يكن هناك العديد من الخلايا داخل كل إطار.
    ملاحظة: أمثلة على التسميات لصور متعددة: #1_01/09/2021_EST_4x1 و#1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. كرر الإجراء لكل عينة تم جمعها تحت عدسات موضوعية متعددة. قم بتضمين كائن واحد أصغر على الأقل ، مثل 4x ، وكائن واحد أكبر على الأقل ، مثل 20x.
  9. قم بتحميل الصور إلى محرك أقراص / مجلد مشترك أو محرك أقراص ثابت خارجي حتى يتمكن جميع الباحثين المعنيين من الوصول إلى الملفات وهناك نسخ احتياطية متاحة.

5. تصنيف المرحلة

  1. قم بإعداد شاشة الكمبيوتر لعرض الصور التي تم التقاطها وورقة التسجيل في وقت واحد (الشكل 4A-C).
    ملاحظة: سيسمح ذلك بحدوث الوثائق أثناء عرض العينة التي تم جمعها. يمكن إكمال هذا الجزء من البروتوكول في وقت جمع العينات أو في وقت لاحق.
  2. حدد أنواع الخلايا الموجودة في العينة. اختر من بين الخيارات الأربعة المدرجة في الخطوات 5.2.1-5.2.4 باستخدام المعايير وسجل النتائج.
    1. الخلايا الظهارية الكيراتينية (AKE) / الخلايا الظهارية المتقرنة
      1. ابحث عن الخلايا الخشنة أو ذات الحواف الزاوية، كما هو موضح في الشكل 2B والشكل 5C، والتي على الرغم من عدم وجود نواة، قد تظهر مناطق مستديرة ضوئية (أشباح نووية) داخل الخلية تمثل المكان الذي كانت توجد فيه النواة ذات يوم. استخدم تكبيرات أعلى ، مثل 20x وما فوق ، للتمييز بين هذه الخلايا النووية والخلايا غير النواة.
      2. استخدم تكبيرا أعلى لتمييز الجزء الكيراتيني أو المتقرن من الخلية - وهي طبقة رقيقة من الخلايا تفتقر إلى النوى ومليئة بالكيراتين - إذا رغبت في ذلك.
        ملاحظة: بالإضافة إلى مظهرها الخشن ، يمكن تمييزها أيضا عن طريق كيفية طيها أو تفكيكها ، وإنشاء هياكل خشنة وممدودة تعرف باسم قضبان الكيراتين.
    2. الخلايا الظهارية النووية الكبيرة (LNE)
      1. ابحث عن هذه الخلايا المستديرة إلى المضلع الشكل عادة المغطاة بحدود غير منتظمة أو خشنة أو زاوية.
      2. لاحظ كيف يمكن أن تتخذ نواتها أشكالا مختلفة ، تتراوح من سليمة إلى منحلة أو pykontic ، فيما يتعلق بالتكثيف الذي لا رجعة فيه للكروماتين في نواة خلية تمر بالموت أو التدهور ، كما هو موضح في الشكل 2B والشكل 5D1,2. لاحظ كيف تشغل هذه النوى مساحة أقل من السيتوبلازم داخل الخلية ، مع نسبة نووية إلى سيتوبلازمية أقل (N: C) من الخلايا الظهارية الصغيرة. ابحث عن حبيبات السيتوبلازم التي يمكن رؤيتها عند التكبيرات الأعلى13.
    3. الكريات البيض (LEUs)/العدلات/الخلايا النووية المتعددة الأشكال
      1. ابحث عن هذه الخلايا الكروية المدمجة ذات النوى متعددة الفصيصات (وبالتالي ، تعرف باسم الخلايا متعددة الأشكال النووية) ، والتي تختفي مع نضوج الخلية (الشكل 2B والشكل 5A). يمكن استخدام تكبير أعلى (على سبيل المثال ، 40x) لمراقبة النوى متعددة الفصوص.
        ملاحظة: عند الجمع والتحضير، قد تتكثف هذه الخلايا أو تطوى أو تتمزق.
    4. الخلايا الظهارية الصغيرة النواة (SNE)
      1. ابحث عن هذه الخلايا المستديرة إلى البيضاوية الشكل التي هي أكبر من العدلات الموصوفة أعلاه.
      2. راقب النوى المستديرة لهذه الخلايا الظهارية غير الكيراتينية (الشكل 2B) ، والتي تشغل مساحة أكبر من السيتوبلازم داخل الخلية ، مما يخلق نسبة N: C أعلى بالنسبة للخلايا الظهارية الكبيرة.
        ملاحظة: عند الجمع والتحضير، قد تطوى هذه الخلايا أو تتداخل لإنشاء شكل يشبه سلسلة أو شريط، كما هو موضح في الشكل 5B1.
  3. افحص كيفية تنظيم الخلايا الموجودة في العينة لكل تشييئ. استخدم التجسيد السفلي، مثل 4x، لعرض طريقة عرض تمثيلية لترتيب الخلايا الكلي. سجل ما إذا كانت الخلايا مجمعة معا (C) أو مشتتة بالتساوي (ED) أو مشتتة عشوائيا (RD) (انظر الشكل 4C) ، ولاحظ التنظيم المحدد لكل نوع من أنواع الخلايا (على سبيل المثال ، يتم تكتل الخلايا الظهارية الصغيرة ذات النواة ، ويتم توزيع العدلات بالتساوي).
  4. بعد ذلك ، قم بتقدير وتسجيل إجمالي كمية الخلايا (smidge ، معتدلة ، عديدة) وكميات الخلايا الفردية (النسبة المئوية لكل نوع خلية موجود).
    ملاحظة: يمثل ال smidge أصغر عدد من الخلايا الموجودة التي يمكن استخدامها لتحديد تصنيف العينة، ويمثل العديد منها وجود عدد لا يحصى من الخلايا التي تمثل إما معظم إن لم يكن كل المساحة الموجودة على الشريحة أو مكدسة فوق بعضها البعض، ويمثل عدد معتدل من الخلايا عددا متوسطا نسبيا من الخلايا (الأمثلة الموضحة في الشكل 5A-D والشكل 6A-D).
  5. لاحظ ما إذا كانت هناك أي انحرافات عن المعايير المدرجة أو الجوانب النموذجية للموضوع المحدد في فئة "الشذوذ" واستشر الطبيب البيطري إذا لزم الأمر.
  6. حدد مرحلة دورة الاستروس التي يتم تقديمها في العينة باستخدام مكونات التصنيف والأوصاف أدناه.
    1. مات
      1. ابحث عن LEUs كنوع الخلايا السائد أو الوحيد الموجود ، مرتبة بطريقة متكتلة في بداية DIE ولكنها أكثر تشتتا في المراحل المتأخرة.
        ملاحظة: أثناء الانتقال إلى DIE ، قد تنخفض كمية الخلايا عندما تبدأ الخلايا الظهارية في الانهيار ، كما هو موضح في الشكل 6D1. في الوقت نفسه ، يبدأ عدد LEUs في الزيادة ، وتميل إلى ترتيبها بطريقة متكتلة في البداية وتنتشر بمرور الوقت.
      2. لاحظ أن الكمية الإجمالية للخلايا قد تكون منخفضة نسبيا ، وغالبا في المراحل اللاحقة من فترة DIE ، في اليوم الثاني أو الثالث.
      3. لاحظ الكمية العالية من المخاط التي قد تكون موجودة في هذه المرحلة ، والتي تظهر كخيوط مركزة من LEUs (الشكل 5A1). ابحث عن كتل صغيرة أو خيوط خلوية من خلايا SNE المصاحبة ل LEUs خلال المراحل المتأخرة في الانتقال إلى PRO (الشكل 5A1,2).
      4. راقبي المظهر اللزج وغير الشفاف للسائل المهبلي عند الانتقال إلى DIE والانتقال إليه بالكامل والخروج منه.
        ملاحظة: متوسط مدة هذه المرحلة هو 48 ساعة خلال دورة مدتها 4 أيام وربما 72 ساعة خلال دورة مدتها 5 أيام.
    2. برو
      1. ابحث عن خلايا SNE كخلايا مهيمنة وعن LEUs و / أو LNE و / أو خلايا AKE التي يمكن رؤيتها بأعداد منخفضة. استخدم التشييء العالي لمراقبة المظهر الحبيبي لخلايا SNE التي يتم ترتيبها عادة في مجموعات أو أوراق أو خيوط خلال هذه المرحلة (الشكل 5B1,2).
      2. راقبي المظهر اللزج وغير الشفاف للسائل المهبلي عند الانتقال من DIE إلى PRO ، وكيف يصبح غير لزج وشفاف بمجرد انتقاله بالكامل إلى مرحلة PRO (متوسط مدة 14 ساعة في الفئران).
    3. مؤسسه
      1. ابحث عن هيمنة خلايا AKE ، وتناقص خلايا SNE في EST ، وزيادة في عدد وحجم الخلايا مع استمرار EST11,13.
      2. دون السمة المميزة للترتيب العنقودي في كثير من الأحيان لخلايا AKE ، في شكل قضبان كيراتين أو تحتوي على نوى أشباح ، والتي يمكن أن تصبح أكثر تشتتا بشكل عشوائي في الانتقال من PRO (الشكل 6B) وإلى MET (الشكل 6C).
      3. راقبي السائل المهبلي الشفاف وغير اللزج المميز، والذي يمكن توقعه أثناء انتقال الفئران إلى EST وانتقالها بالكامل إليها وخروجها منها.
        ملاحظة: يتضمن تقدم EST الكثير من التنويع (الشكل 5C والشكل 6B ، C). تحدث المرحلة عادة بمعدل 24 ساعة في دورة مدتها 4 أيام أو ربما 48 ساعة في دورة مدتها 5 أيام.
    4. اجتمع
      1. ابحث عن أعداد أكبر من خلايا SNE و LNE أثناء انتقال الفئران إلى MET ، إما مهيمنة من حيث نسبة الخلايا داخل القناة أو قريبة من نسبة متساوية مع LEUs11,13. علاوة على ذلك ، لاحظ الكمية الأكبر من الحطام في MET والتحولات مقارنة بالمراحل الأخرى بسبب اضمحلال الخلايا الظهارية بعد EST والانتقال إلى DIE.
      2. لاحظ عدم وجود ترتيب متسق حيث يتم رؤية جميع أنواع الخلايا وبكميات مختلفة (الشكل 5D1-3). ومع ذلك ، ابحث عن LEUs المعبأة أو المتجمعة بالقرب من الخلايا الظهارية في المراحل الأولى التي قد تعود إلى الترتيب المتكتل عند الانتقال إلى DIE.
      3. راقبي المظهر غير اللزج والشفاف للسائل المهبلي في هذه المرحلة والتغيير إلى مظهر أكثر لزوجة وغير شفاف أثناء الانتقال إلى DIE.
        ملاحظة: متوسط مدة هذه المرحلة هو 6-8 ساعات.
  7. عينات التسمية في الانتقالات مع المرحلة التي يتحرك الموضوع نحوها ، مع الانتقال بين قوسين لتتبع وقت جمعها. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول كيفية التمييز بين هذه المراحل ال 4 وانتقالاتها في النتائج التمثيلية.
    ملاحظة: نظرا لأن العينات التي تم جمعها ثابتة والدورة ديناميكية، فقد تصور الشرائح الانتقالات بين المراحل (كما هو موضح في الشكل 6A-D).
  8. أكمل هذه العملية لكل حتى تكتمل مرحلة الرصد.
  9. في أي من اليومين 11 (45 يوما من العمر) أو 21 (55 يوما من العمر) ، قم بالقتل الرحيم للفئران بنسبة 5٪ من الأيزوفلوران و 2٪ من الأكسجين قبل قطع الرأس بالمقصلة. قد تختلف هذه النقاط الزمنية اعتمادا على طبيعة الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتعكس البيانات الحالية بيانات المراهقات في البرنامج الدولي للتوحيد الجيني SD (IGS) في وجود ذكور من فئران SD. كانت هذه الحيوانات موجودة في كل من جامعة بيبردين ومختبرات جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس كجزء من دراسة تعاونية. يعرض الشكل 5 اختلافات متعددة لمراحل الدورة ال 4. تم تحديد الشكل 5A1 كعينة ديستروس مع وجود عدة أنواع من الخلايا. يوضح هذا المثال أن العينات التي تحتوي على عدد أكبر من الخلايا الظهارية مؤهلة كديستروس عندما تستوفي مؤهلات مكونات التصنيف الأخرى ، مثل هيمنة LEUs. أظهرت هذه العينة أيضا ترتيب حبلا المخاط المكون من LEUs التي غالبا ما تظهر في هذه المرحلة ، والتي تشبه الخيوط التي تتكون من خلايا SNE التي شوهدت في مرحلة PRO. لتمييز حبلا مخاطيا في مرحلة DIE عن الخيوط التي تظهر في مرحلة PRO المكونة من خلايا SNE ، من المهم تحديد هيمنة LEUs. يعرض الشكل 5A2,3 تطور ترتيب الخلايا الذي غالبا ما لوحظ - وهو تكتل أولي ل LEUs التي تجمع وتنتقل إلى عشوائي (RD) أو حتى الصرف (ED) في العينات التي تم جمعها في فترات لاحقة من مرحلة DIE. على وجه التحديد ، كان الشكل 5A2 عينة DIE مع وجود العديد من الخلايا. وهذا يعكس كيف يمكن أيضا أن تكون LEUs مصحوبة بعدد كبير من الخلايا الظهارية (الشكل 5A1,2) ، تتميز عن metestrus بهيمنة LEUs وغياب قضبان الكيراتين. وعلى النقيض من ذلك، يوضح الشكل 5A3 أن عددا منخفضا من الخلايا الكلية (smidge) شوهد عادة خلال المرحلة اللاحقة من مرحلة DIE، مثل اليوم الثاني أو الثالث. خلال مرحلة PRO ، تم ترتيب خلايا SNE في كثير من الأحيان في خيوط مع العديد من الخلايا المكدسة فوق بعضها البعض (الشكل 5 B1) أو مجموعة من الخلايا مرتبة في كتل أصغر (الشكل 5B2). يجسد الشكل 5B3 عينة PRO مع التكتل المميز الشبيه بالورقة لخلايا SNE التي تتداخل وتشكل أشرطة يمكن الخلط بينها وبين قضبان الكيراتين المكونة من خلايا AKE الموجودة في مرحلة EST. للتمييز بين الاثنين ، من المهم تحديد هيمنة خلايا SNE في PRO وخلايا AKE في EST.

يوضح الشكل 5C1,2 التكتل النموذجي والصرف العشوائي لخلايا AKE التي شوهدت في EST ، حيث تضم الأولى العديد من الخلايا والأخيرة عددا معتدلا. وتظهر في هذه الأمثلة نوى الأشباح وتكوينات شريط الكيراتين والبكتيريا التي غالبا ما يتم جمعها خلال هذه المرحلة. تم تمثيل خلايا SNE في بعض الأحيان خلال مرحلة EST (الشكل 5C1) كبقايا لمرحلة PRO السابقة. غالبا ما يتم الخلط بين مرحلة EST المتأخرة ، عندما تبدأ خلايا SNE في الظهور مع تحرك الموضوع نحو MET ، ومرحلة PRO. للتمييز بين الاثنين ، من المهم أن نأخذ الحجم النووي في الاعتبار. بشكل عام ، تتمتع الخلايا النووية ل PRO بنسبة N: C أعلى. قدمت العينة الموضحة في الشكل 5C3 ترتيبا يشبه الخيط للعديد من خلايا AKE التي لم ينظر إليها على أنها سمة من سمات مرحلة EST. وهذا يدل على أن كل فريد من نوعه، وأن الانحرافات عن المعايير قد تحدث، وأنه يجب فحص محددات التصنيف مجتمعة.

للتمييز بين EST و PRO عند وجود خلايا SNE ، لوحظ أن نسبة N: C أقل حدثت في هذه الخلايا خلال مرحلة EST. للتمييز بين قضبان الكيراتين الموجودة في EST وتلك التي تشكلت من خلال تداخل أو تدحرج خلايا SNE في مرحلة PRO (الشكل 5B3) وتلك التي شكلتها الخلايا الظهارية المتحللة في الانتقال من MET (الشكل 6D1) ، من المهم تحديد نوع الخلية السائدة وترتيبها وكميتها لتمييز المرحلة التي يتم تمثيلها. وأخيرا، يجسد الشكل 5دال-1-2 الجمع بين جميع أنواع الخلايا الموجودة في الصرف العشوائي الذي يمثل مرحلة الأرصاد الجوية. بالإضافة إلى الخلايا العديدة الموجودة في هذه الأمثلة ، كان من الشائع جمع كمية أكبر من الحطام خلال هذه المرحلة (الشكل 5D2) بسبب اضمحلال الخلايا الظهارية بعد EST والانتقال إلى DIE مع هيمنة LEUs التي تعمل على تطهير القناة المهبلية للخلايا الظهارية. ويبين الشكل 5D2 أيضا كيف يمكن تمييز MET عن DIE من خلال تركيزه العالي من الخلايا الظهارية ووجود قضبان الكيراتين. وعموما، تصور هذه التمثيلات الطيف الواسع الموجود داخل كل مرحلة وهي غير شاملة.

ويبين الشكل 6 تمثيلات للمراحل الانتقالية ال 4. في حين صنفت هذه الدراسة العينات في المرحلة الانتقالية كواحدة من 4 مراحل دورة استروس ، يبقى من المهم تحديد المراحل الانتقالية بشكل صحيح. في الانتقال من DIE إلى PRO (الشكل 6A) ، كان هناك في كثير من الأحيان انخفاض عام في عدد LEUs وزيادة في عدد خلايا SNE. كانت خلايا LNE و AKE موجودة في بعض الأحيان في هذا الانتقال ، ولكن ليس بكميات كبيرة (الشكل 6A1). ويصور الشكل 6A2-4 العدد الأكبر من خلايا SNE المتجمعة والمنتشرة عشوائيا والتي غالبا ما تم جمعها خلال هذا الانتقال، مع وجود عدد قليل من وحدات LEUs المنتشرة عشوائيا ومتساويا. بشكل عام ، عند التمييز عن المراحل الانتقالية الأخرى ، كان من المهم ملاحظة هيمنة خلايا SNE وبداية الكتل وتكوينات الخيوط التي شوهدت في PRO. تمثل جميع الأمثلة الواردة في الشكل 6A عددا كبيرا من الخلايا باستثناء الشكل 6A4 ، مع ذرة. في الشكل 6B ، توضح الصورة مثالا على العديد من خلايا SNE و AKE المتكتلة التي شوهدت في الانتقال من PRO إلى EST.

خلال هذا الانتقال ، ينظر إلى خلايا SNE بأعداد أكبر مع مدفوعات أقل تكتل وأكثر عشوائية من خلايا AKE مما كانت عليه خلال EST. يوضح الشكل 6C ظهور AKE و SNE و LNE وانخفاض خلايا AKE في الانتقال من EST إلى MET مع عدد كبير من الخلايا. يمثل الحطام الموجود خلايا AKE المتحللة من مرحلة الشبق السابقة التي غالبا ما تظهر في metestrus. ويظهر هذا أيضا في المرحلة الانتقالية النهائية ، من MET إلى DIE ، حيث بدأت الخلايا الظهارية في الاضمحلال وإنتاج الحطام (الشكل 6D1,2) ، مع وجود العديد من الخلايا في الأولى وعدد معتدل في الأخير. تظهر هذه الأرقام ظاهرة تزايد عدد اليورانيوم المنخفض لتصبح نوع الخلايا المهيمن في الانتقال إلى diestrus. بالنسبة للمجموعة التي تم رصدها لمدة 20 يوما (n = 3) ، كان هناك 12 يوما تم فيها جمع عينات انتقالية ، بمتوسط 4. بالنسبة للمجموعة التي تمت مراقبتها لمدة 10 أيام (n = 3) ، كانت هناك 9 أيام تم فيها جمع عينات انتقالية ، بمتوسط 3.

يمثل الشكل 7 مجموعات عينات الخلايا غير المواتية ، والتي يستدعي معظمها تكرار الغسل. ويبين الشكل 7A1 كتلة من الخلايا الحرشفية التي تم جمعها بسبب إدخال حقنة واستخراجها بشكل غير صحيح، مما تسبب في شفط الخلايا الحرشفية من جدار القناة المهبلية. يمكن تمييز هذه الخلايا عن الخلايا الظهارية المتكتلة أو LEUs بسبب الكثافة العالية والانضغاط للكتلة وحدودها المميزة. يمثل الشكل 7B مجموعة من الحطام، حيث إما أنه لم يتم استخراج أي خلايا، أو أن مستوى التركيز غير صحيح، أو لم يتم مسح الشريحة بالكامل بحثا عن خلايا. يمكن تمييز الحطام عن الخلايا من خلال الإلمام بأنواع الخلايا والحجم الصغير والتكتل المميز في كثير من الأحيان. غالبا ما ينبع هذا الحطام من فراش الحيوانات أو الشعر أو تسوس الخلايا. يصور الشكل 7C شريحة تحتوي على عدد خلايا أقل من smidge. في حين أن انخفاض عدد الخلايا كان شائعا خلال أواخر MET و DIE المبكر ، فإن هذا يمثل الشرائح التي تحتوي على عدد قليل جدا من الخلايا لتصنيفها بدقة إلى مرحلة.

يوضح الشكل 7D مثالين على محلول استخراج كلوريد الصوديوم جنبا إلى جنب مع السائل المهبلي من القناة على شريحة المجهر. في الصورة الأولى ، الشكل 7D1 ، كان السائل موجودا وخارج التركيز البؤري ، مما أعاق القدرة على التصنيف بدقة. في الشكل 7D2 ، تم نشر السائل عبر الشريحة في دوائر متماسكة إلى جانب LEUs. في حين أن هذا المثال لا يتطلب تكرار الغسل بسبب الوجود العالي للخلية ، فمن المهم مراعاة كمية السائل الموضوعة على الشريحة ووضع شريحة غطاء المجهر لمنع اللطاخات. بشكل عام ، تؤكد هذه الصور على أهمية التقاط صور تمثيلية عالية الجودة للتصنيف المناسب. ويشمل ذلك النظر في طريقة استخراج الخلايا ومستوى التركيز البؤري ومحتوى الصورة عن طريق مسح كل شريحة ضوئيا قبل التقاط صورة.

بعد تصنيف كل في المجموعة (المجموعات) التجريبية ، من الشائع رسم تقدم المرحلة إما على رسم بياني شريطي أو خطي. هذا يسمح للباحثين بفحص نمط الدورة الكلي وتحديد متى يقدم الحيوان تقدما غير منتظم لمراحل الاستروس ، والمعروفة باسم اللاحلجة. يمكن بعد ذلك تحليل العينات حسب طول الدورة ونمط تقدم المرحلة في أداة التحليل هذه. ويتضمن هذا المفهوم، المبين في الشكل 8 ألف، باء، تعيين أشرطة ذات ارتفاعات متفاوتة، في حالة هذه الدراسة، للمراحل الفردية وترجمة البيانات المسجلة (الشكل 4 ب) عبر المحور x. في هذه الأمثلة ، يتم تمثيل MET و DIE بالأدنى ، و PRO بالوسط ، و EST بأطول ارتفاعات البار. نظرا لقصر مدة مرحلة MET ، يتم دمجها مع مرحلة DIE في شريط واحد. على الرغم من وجود طرق مختلفة لقياس اكتمال الدورة ، فمن الشائع حساب دورة كاملة واحدة كحركة من EST إلى11 أخرى. ومع ذلك ، هذا لا يعكس إكمال الدورة ولكن مدة مرحلة EST لمدة 2 يوم عندما تكون هناك مراحل EST متتالية.

يعكس الشكل 8A بيانات من الفئران التي تتقدم من خلال تقدم ثابت ومتكرر من خلال MET / DIE ، PRO ، و EST. بالإضافة إلى ذلك ، وقع هذا الجرذ ضمن نطاق دورات 4 إلى 5 أيام بمتوسط طول 4.375. لا تتجاوز كل مرحلة النطاقات القياسية للطول ، بمتوسط 1.0625 يوما تقضيها في EST ، وهو تقييم نموذجي لعدم التردد. إذا كانت البيانات المستخرجة تتبع هذا النمط من EST إلى EST بانتظام ، فهذا يؤكد ليس فقط أن مستويات هرمون الشخص ظلت ضمن نطاقات مقبولة ، ولكن أيضا أن الإجراء تم إجراؤه دون مقاطعة الطبيعة الدورية للعملية بشكل كبير. أخيرا ، أكمل هذا الفئران 16 دورة ، تم تحديدها من خلال حساب عدد قضبان EST إلى EST.

ويمثل الشكل 8 باء الأنواع الشائعة من عدم التردد، بما في ذلك المراحل الموسعة (التي ينظر إليها على أنها EXT) والمراحل غير المسجلة. يسلط هذا الشكل الضوء أيضا على أهمية فحص كل من نمط الدورة وطول وعدد الأيام التي تقضيها في كل مرحلة. على وجه التحديد ، في هذا المثال ، في حين أن متوسط طول الدورة وعدد الأيام في EST يندرجان ضمن المعلمات المحددة ، فإن نمط دورة تقدم المرحلة كشف عن وجود تشوهات. لذلك ، من المهم فحص دورة estrous بشكل شامل. تم تسجيل كل من مراحل DIE الموسعة (المسماة Ext Diest) و EST (المصنفة باسم Ext Est) طوال الدورات الموضحة في الشكل ، وكانت هناك دورات متعددة حيث لم يتم تسجيل مرحلة PRO. يوضح هذا المثال أيضا أهمية فحص عدد المراحل المتتالية التي شوهدت ، والتي تقع خارج النطاقات النموذجية ، بدلا من فحص متوسط طول الدورة والأيام في EST ، والتي تقع ضمن النطاقات النموذجية.

يمكن أن تشمل أسباب وارتباطات هذه الأمثلة عوامل مثل التشوهات الفسيولوجية (الأورام ، الحمل الكاذب ، الإجهاد لفترات طويلة) ، الظروف البيئية الضارة (الإضاءة المطولة ، التعرض للمواد الكيميائية السامة ، السكن الانفرادي) ، التوقيت غير المناسب لجمع العينات ، خطأ الباحث (سوء جمع العينات ، التقاط الصور ، التدريج غير السليم) ، الظواهر المرتبطة بالعمر (عدم انتظام شائع شوهد في مرحلة المراهقة والشيخوخة الإنجابية) ، أو الانحرافات الفريدة من نوعها الحيوان. لفصل خطأ الباحث أو التوقيت غير المناسب لجمع العينات والتشوهات الجسدية أو الظواهر المرتبطة بالعمر ، من المفيد فحص مكونات التصنيف 4 بمزيد من التفصيل. هذا يمكن أن يساعد في تحديد الأسباب المحتملة للمخالفات أو ، بمعنى أوسع ، يمكن استخدامه في الدراسات التي تدرس خصائص دورة estrous عن كثب.

يوضح الشكل 9 هذا الفحص الدقيق من خلال تضمين كميات الخلايا الإجمالية والفردية على المحور y ، ونوع (أنواع) الخلايا الممثلة بألوان تعبئة شريط مختلفة ، وترتيب (ترتيبات) الخلايا الممثلة بأنماط تعبئة شريط مختلفة ، بيانية عبر فترة المراقبة الإجمالية. سمحت طريقة التحليل هذه بفحص العدد الإجمالي للدورات المكتملة ، وطول كل دورة ، وتطور المرحلة ، وتصنيف المكونات بمزيد من التفصيل لكل فأر على حدة. ويمثل الشكل 9 ألف فأرا كان لديه عدد دورات أقل من المتوسط، مع ما مجموعه 3 دورات كاملة في 10 أيام تم رصدها - دورتان مدة كل منهما 3 أيام ودورة واحدة مدتها 5 أيام (متوسط 3.67). تضمنت المخالفات التي شوهدت في تقدم المرحلة مع 50٪ من الأيام مرحلة واحدة أو أكثر من المراحل غير المسجلة و 30٪ من العينات التي تم جمعها في مرحلة انتقالية - اليوم 2 ك MET-DIE ، واليوم 5 ك EST-MET ، واليوم 8 كانتقال PRO-DIE. قد يكون هذا بسبب التوقيت غير السليم لجمع العينات ، أو خطأ الباحث ، أو ظاهرة مرتبطة بالعمر ، أو انحرافات فريدة. وكان من الممكن أن يوفر المزيد من الرصد وضوحا بشأن ما ينطبق عليه.

وقد شوهدت الترتيبات السائدة النموذجية، وأنواع الخلايا، وكميات الخلايا الفردية والكلية داخل كل مرحلة من المراحل المسجلة. ضمن مراحل EST ، شوهدت خلايا AKE متكتلة (25٪ من العينات) ، معتدلة (25٪ من العينات) ، والعديد من (50٪ من العينات) ، مع وجود أقل لخلايا LEUs و SNE و LNE. في مرحلة MET الوحيدة التي تم التقاطها ، كان هناك مزيج من العديد من LEUs المنتشرة عشوائيا (50٪) ، وخلايا AKE (20٪) ، و LNE (15٪) ، و SNE (15٪). بالنسبة لمراحل DIE ، شوهدت كمية صغيرة (50٪ من العينات) والعديد من (50٪ من العينات) من المنتشرة عشوائيا ، والمشتتة بالتساوي ، ومزيج من LEUs المهيمنة تتخللها خلايا AKE و LNE و SNE. في مرحلة PRO الوحيدة التي تم جمعها ، كانت هناك مجموعة من LEUs المنتشرة عشوائيا (60٪ من الخلايا الموجودة) وخلايا SNE (40٪ من الخلايا الموجودة) ، والتي كانت في مزيج من الترتيبات ، مما يمثل انتقالا من DIE إلى PRO.

في الشكل 9 ب ، كان لدى الفئران الممثلة ما مجموعه 3 دورات كاملة ، مع نمط دورة لمدة 4 أيام. لم تمثل العينات التي تم جمعها تقدما ثابتا في المرحلة ، مع فترة DIE ممتدة (الأيام 6-9) و 5 حالات أخرى من المراحل غير المسجلة (2 مراحل MET غير المسجلة ، و 2 مراحل PRO غير المسجلة ، و 1 مرحلة EST غير المسجلة). نظرا لأن 20٪ فقط من العينات كانت في مرحلة انتقالية (اليوم 3 باسم DIE-PRO ، واليوم 5 باسم EST-MET ، واليوم 18 باسم MET-DIE ، واليوم 19 باسم DIE-PRO) ، ولم يتم تسجيل سوى 3 مراحل خارج مرحلة MET وفترة DIE المطولة ، فقد تم التوصل إلى أن توقيت جمع العينات كان مناسبا لهذا الحيوان المحدد. وبما أن آخر 10 أيام تم رصدها تضمنت تقدما مرتبا خلال المراحل ال 4 ، يمكن أن تعزى المخالفات الأولية إلى سن المراهقة. وكلما زادت مدة الرصد (20 يوما) سمحت بحدوث هذا الاستنتاج.

كشف فحص مكونات التصنيف عن نطاقات نموذجية. عكست مراحل EST هيمنة معتدلة (50٪ من العينات) على كمية عديدة (50٪ من العينات) من خلايا AKE المتكتلة مع عدد أقل من LEUs و SNE و LNE. في عينات MET التي تم جمعها ، كان هناك مزيج من معتدل (33.33٪ من العينات) إلى العديد (66.67٪ من العينات) LEUs المنتشرة والتكتل عشوائيا (مع نطاق كمية من 10-90٪) ، SNE المتكتل (0-30٪) ، LNE المشتت عشوائيا (0-10٪) ، وخلايا AKE المتكتلة والمنتشرة عشوائيا (10-90٪). عكست مراحل DIE هيمنة معتدلة (20٪) على كمية عديدة (80٪ من العينات) من وحدات LEUs المنتشرة بالتساوي والمنتشرة عشوائيا والمتجمعة (تتراوح بين 50-100٪) في وجود كل من خلايا AKE و SNE المنتشرة عشوائيا. تم تحديد مراحل PRO من خلال هيمنة smidge (3.33٪ من العينات) والعديد من (66.67٪ من العينات) كمية من خلايا SNE المنتشرة والتكتل عشوائيا (10-99٪) في وجود خلايا LEUs و AKE و LNE.

خيار آخر عند تحليل البيانات المستخرجة هو إنشاء ملفات تعريف دورة estrous من خلال تضمين العناصر الموصوفة سابقا - كميات الخلايا الإجمالية والفردية على المحور y ، ونوع (أنواع) الخلايا الممثلة بألوان تعبئة شريط مختلفة ، وترتيب (ترتيبات) الخلايا الممثلة بأنماط تعبئة شريط مختلفة ، رسومية بيانية عبر فترة المراقبة الإجمالية لكل مرحلة دورة. يمكن إكمال ذلك لكل فأر أو متوسطات المجموعة بأكملها. الغرض من أداة التحليل هذه هو فحص تصنيف اتجاهات المكونات لكل مرحلة ، مما يساعد المجتمع العلمي العام في توصيف تمييز تصنيفات المكونات الخاصة بتصنيفات مرحلة دورة estrous. في الشكل 10 A1 ، أظهر ملف تعريف DIE لمدة 10 أيام هيمنة على كمية معتدلة (50٪ من العينات) والعديد (50٪ من العينات) من LEUs المنتشرة بالتساوي (متوسط 78.25٪) إلى جانب عدد أقل من خلايا SNE و AKE و LNE. في الشكل 10 A2 ، أظهر ملف تعريف diestrus لمدة 20 يوما هيمنة على كمية معتدلة (20٪ من العينات) والعديد (80٪ من العينات) من وحدات LEUs المنتشرة بالتساوي والمتكتلة والمنتشرة عشوائيا (متوسط 82٪ كما هو موجود في جميع الأيام ال 10) إلى جانب عدد أقل من خلايا AKE و SNE.

أظهرت مرحلة PRO المعروضة في الشكل 10B1 هيمنة عدد معتدل من خلايا SNE المنتشرة عشوائيا (60٪) في وجود LEUs وخلايا AKE. أظهر ملف تعريف مرحلة PRO لمدة 20 يوما في الشكل 10B2 هيمنة على smidge (33.33٪ من العينات) وكمية عديدة (66.67٪ من العينات) من مزيج من الترتيبات و SNE المنتشرة عشوائيا (متوسط 66.33٪ كما هو موجود في جميع العينات الثلاثة) إلى جانب LEUs وخلايا KE. أظهر ملف تعريف EST لمدة 10 أيام الذي شوهد في الشكل 10C1 هيمنة كمية معتدلة (50٪ من العينات) أو كمية عديدة (50٪ من العينات) من خلايا AKE (متوسط 80٪ لليومين الحاليين) في مزيج من الترتيبات ، إلى جانب عدد أقل من LEUs و SNE و LNE. في الشكل 10 C2 ، أظهر ملف تعريف EST لمدة 20 يوما هيمنة معتدلة (75٪ من العينات) أو كمية عديدة (15٪ من العينات) من خلايا AKE المنتشرة عشوائيا (متوسط 57.5٪ للأيام الأربعة الحالية) أو تلك الموجودة في مجموعة من الترتيبات ، إلى جانب عدد أقل من LEUs و SNE و LNE.

تضمن ملف تعريف مرحلة MET لمدة 10 أيام في الشكل 10D1 العديد من وحدات LEUs المنتشرة عشوائيا (50٪) ، وخلايا AKE (20٪) ، وخلايا SNE (30٪). أظهر ملف تعريف مرحلة MET لمدة 20 يوما في الشكل 10 D2 كمية معتدلة (3.33٪ من العينات) أو العديد (6.667٪ من العينات) من LEUs (متوسط 50٪ في جميع العينات الثلاث) ، SNE (متوسط 15٪ كما هو موجود في جميع العينات الثلاث) ، خلايا AKE (مع 23.33٪ في العينات الثلاث الموجودة) ، خلايا LNE (متوسط 15٪ في جميع العينات 2 الموجودة). تم توزيع نصف وحدات LEUs بشكل عشوائي (عينة واحدة) وكانت نسبة 50٪ المتبقية عبارة عن مزيج من الترتيبات (عينة واحدة). تم تشتيت ثلثي خلايا SNE بشكل عشوائي عند وجودها ، في حين أن 33.33٪ المتبقية كانت في مزيج من الترتيبات عند وجودها (1 من 3 عينات). وأخيرا ، تم تجميع 66.67٪ من خلايا AKE في العينات الموجودة (2 أيام) ، في حين أن 33.33٪ المتبقية كانت في مزيج من الترتيبات (1 يوم). ويتضمن الجدول 1 المتوسطات العددية لمحددات التصنيف من المجموعتين. في حين أن البيانات الواردة في الشكل 9A و B والشكل 10A-D تتضمن معلومات عن محددات التصنيف من الحيوانات الفردية ، فإن هذه الجداول تتضمن متوسطات لمرحلة الشبق كمثال. وعند استنساخها في مختبرات أخرى، يمكن أن تصبح هذه البارامترات معيارا لتحديد المرحلة. وهذا بدوره يمكن أن يقلل من مستوى الذاتية التي تنطوي عليها حاليا عملية التدريج.

الاحصاءات
بشكل عام ، هناك بعض المعلمات التي يجب مراعاتها عند تفسير خصائص الدورة ، على الرغم من عدم وجود توافق في الآراء حول ما يعتبر "غير طبيعي" ، والانحرافات نموذجية. يحدد Goldman et al. "العادية" كدورة مدتها 4-5 أيام مع 24-48 ساعة بتوقيت شرق الولايات المتحدة و 48-72 ساعة DIE المراحل11. يمكن أن يكون الاختلاف عن هذه المعلمات بسبب عوامل مختلفة ، بما في ذلك واحد أو أكثر من التشوهات الفسيولوجية ، أو توقيت الجمع غير السليم ، أو عدم الدورية الأولية التي غالبا ما تعاني منها الفئران المراهقة مع نضج مستويات الهرمونات. بالإضافة إلى استشارة الطبيب البيطري المختبري ، وتمكين فترة جمع التجارب لضمان التوقيت المناسب ، ومراقبة الحيوانات بعد سن المراهقة لوضع جدول زمني مقارن ، يمكن أن تكون التحليلات الإحصائية مفيدة لعزو السببية و / أو الارتباط إلى أي شذوذ. بعد توصيف الدورات إلى فئات (على سبيل المثال ، متسقة وغير طبيعية) ، يمكن أن يساعد تحليل مربع تشي في مقارنة المجموعات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن مقارنة مكونات التصنيف أو خصائص الدورة العامة بعد التدخل باستخدام تحليل التباين (ANOVA)11. ومع ذلك ، قد لا تكون هذه الانحرافات ذات مغزى بيولوجي ، كما نوقش في المقدمة ، وبالتالي يجب النظر في السياق التجريبي.

Figure 1
الشكل 1: إيقاع الهرمونات في مراحل دورة استروس. (أ) يتم تحديد وتلخيص مستويات هرمون الستيرويد الجنسي المتفاوتة خلال مراحل دورة استروس البارزة. يبدأ تطور المرحلة وينتهي مع metestrus لإظهار مستويات هرمون البناء والتقدم الدائري للعملية. مقتبس من مصدر خارجي11. (ب) تدفق هرمونات الستيرويد الجنسية من الجهاز العصبي المركزي إلى الجهاز التناسلي عبر مجرى الدم. ويلاحظ أن مستويات الهرمون تزداد من خلال إشارات من منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية عن طريق الهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية (GrH أو LHRH) والجمع بين الهرمون المنبه للجريب والهرمون الملوتن، على التوالي. وهذا يشمل كل من حلقات التغذية المرتدة الإيجابية والسلبية اعتمادا على تركيز استراديول والبروجسترون. المعلومات17 والصور التي تم تتبعها من مصادر خارجية65،66،67. اختصار: LHRH = هرمون مطلق للهرمونات الملوتن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: دورة Estrous تصنيف المحددات المقاسة. (أ) ترد هنا المكونات المستخدمة عند ترتيب عينات الخلايا التي تم جمعها والمكونات السائدة لكل مرحلة. من المهم أن نتذكر أن هذه معلمات عامة ومن المتوقع حدوث اختلافات. (ب) فيما يلي أنواع الخلايا السائدة الموجودة في كل مرحلة. في حين أن هذه انقسامات عامة ، يمكن العثور على كل نوع من الخلايا في جميع المراحل. (ج) تظهر هنا أنواع ترتيب الخلايا الموجودة في هذه الدراسة. (د) تعكس الصورة هنا كميات الخلايا النموذجية الموجودة في كل مرحلة من مراحل دورة الاستروس ال 4 ، حيث يمثل الحجم الرباعي كميات الخلايا التقريبية. تم الحصول عليها من مصدر خارجي13 وتم تكييفها سابقا68. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الفتحة المهبلية في فئران سبراغ داولي. (أ) التوجه التشريحي للأعضاء التناسلية الخارجية غير المطورة والفتحة المهبلية التي تؤدي إلى القناة المهبلية فيما يتعلق بفتحة مجرى البول. (ب) تمثيل مرئي للمنطقة غير المطورة، مع وضع علامة عليها بسهم. (ج) التوجه التشريحي للأعضاء التناسلية الخارجية المتقدمة والفتحة المهبلية فيما يتعلق بفتحة مجرى البول ، وعادة ما يحدث حوالي 34 يوما من العمر. (د) التمثيل البصري المطابق للمنطقة المتقدمة المبينة في الصورة ألف. جميع الأرقام مصدرها مصدر خارجي29. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصنيف قوالب تسجيل بيانات المحددات. (أ) خيار واحد لتسجيل البيانات؛ (ب) خيار واحد لتسجيل البيانات؛ (ج يتضمن أوصافا لتصنيف المحددات. يجب استخدام هذا يوميا ، واحد لكل فأر يتم مراقبته. (ب) هذا النموذج هو خيار لإدخال البيانات، مع تسجيل مبسط لمحددات التصنيف وتحديد هوية الفئران. يسمح هذا بإدخال الملاحظات في ورقة البيانات في تصنيف PRO الثاني. يعكس اللون الموجود في الصف العلوي اللون المخصص للمجموعة التجريبية الممثلة، مما يساعد على تمييز مجموعة عن أخرى. (ج) خيار قالب آخر؛ يتضمن جميع محددات التصنيف ويمكن تعديلها بناء على التفضيل الشخصي أو أهداف الدراسة. الاختصارات: AKE = الظهارية الكيراتينية غير الشقيقة. LEU = الكريات البيض. LNE = ظهارة كبيرة نواة ؛ SNE = ظهارة صغيرة نواة. C = متكتلة. الضعف الجنسي = مشتت بالتساوي ؛ RD = مشتتة عشوائيا ؛ COM = مجتمعة; SMD = smidge; وزارة الدفاع = معتدلة; NUM = عديدة; EXE = تمرين; SED = المستقرة. Est = شبق; يموت = ديستروس. met-die = انتقال metestrus-diestrus ؛ برو = برويستروس. pro-Est = انتقال proestrus-estrus ؛ ** = مثال الجودة الذي يمكن أن يكون مفيدا في المنشور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الاختلافات المحددة لتصنيف المرحلة . (أ) تصور هذه السلسلة من الصور أمثلة مختلفة لمرحلة الديستروس. تصور الصورة الأولى (A1) رواسب من المخاط تمثلها خيوط من وحدات LEUs المركزة ، مع وجود خلايا ظهارية في عمليات صرف عشوائية. هذا مثال على أهمية استخدام كل من التكبير 4x و 10x. يبدو هذا التكبير 4x مشابها لشريط proestrus ولكن عند الفحص الدقيق عند 10x ، يعرض هيمنة LEUs. الصورة الثانية (A2) تصور ما شوهد في كثير من الأحيان في مراحل diestrus - هيمنة LEUs التي شوهدت جنبا إلى جنب مع ترتيب متكتل من الخلايا الظهارية: SNE و LNE و AKE الخلايا. تعكس الصورة الأخيرة في هذه السلسلة (A3) توزيعا عشوائيا للوحدات النمطية الحمامية المنخفضة، وغالبا ما ينظر إليها ضمن مرحلة الديسترس وسط قطرات السوائل المهبلية والمالحة. (ب) تصور هذه السلسلة من الصور أمثلة مختلفة لمرحلة البروستروس. الصورة الأولى (B1) تصور ترتيبا متكتلا لخلايا SNE في خيوط. تعكس الصورة الثانية (B2) شريحة ذات عدد إجمالي خلايا أقل وتكتل خلايا SNE. الصورة الثالثة (B3) تصور التكتل الشائع والصرف العشوائي لخلايا SNE والأعداد المنخفضة من LEUs وخلايا AKE. (ج) تصور هذه السلسلة من الصور أمثلة مختلفة لمرحلة الشبق. تصور الصورة الأولى (C1) ترتيبا مشتركا للتكتل لخلايا AKE ، مع تكوينات شريط الكيراتين ، في وجود خلايا SNE. تعرض الصورة الثانية (C2) تكتل خلايا AKE مع نوى الأشباح والبكتيريا. تعرض الصورة الأخيرة (C3) ترتيبا يشبه الخيط لخلايا KE. (د) تصور هذه السلسلة من الصور أمثلة مختلفة لمرحلة metestrus. الصورة الأولى (D1) تصور الصرف العشوائي والتكتل من LEUs وخلايا SNE وخلايا AKE وخلايا LNE في وجود الحطام. تعكس الصورة الثانية (D2) جميع أنواع الخلايا الموجودة في ترتيب التكتل ، إلى جانب قضبان الكيراتين. تظهر الصورة الأخيرة (D3) ترتيبا أكثر شمولا لخلايا LEUs و SNE و AKE و LNE الموجودة. تم تكبير هذه الأرقام ، التي تم التقاطها إما عند 4x (A1 و A2 و B2 و B3 و D1 و D3) أو 10x (A3 و C1 و C2 و C3 و D2) ، للسماح بزيادة تصور مكونات التصنيف. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. للرجوع إلى الحجم ؛ يبلغ قطر خلايا AKE حوالي 40-52 ميكرومتر ، و LEUs حوالي 10 ميكرومتر ، وخلايا LNE من 36-40 ميكرومتر ، وخلايا SNE من حوالي 25-32 ميكرومتر16. الاختصارات: SNE = الظهارية الصغيرة النواة. LNE = ظهارة كبيرة نواة ؛ AKE = الظهارية الكيراتينية غير النواة. LEUs = الكريات البيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: عينات المرحلة الانتقالية. (أ) تصور هذه السلسلة من الصور أمثلة على الانتقال بين مرحلتي DIE و PRO. تعرض الصورة الأولى (A1) كتلا كبيرة وصرفا عشوائيا لخلايا LEUs و SNE و LNE و KE. تتضمن الصورة الثانية (A2) كتلة كبيرة من LEUs المتكتلة و SNE مع خيوط متداخلة من LEUs. تتضمن الصورة الثالثة (A3) كتلا وحتى مدفوعات من وحدات التخصيص الطويلة الأجل وكمية صغيرة من SNEs. الصورة الرابعة والأخيرة (A4) تصور كلا من خلايا SNE ووحدات LEUs المجمعة والعشوائية الصرف. (ب) تصور هذه الصورة مثالا على الانتقال بين مرحلتي PRO و EST مع تكتل خلايا SNE و AKE. (ج) تصور هذه الصورة تكتل خلايا AKE و SNE و LNE وصرفها عشوائيا في وسط الحطام لتمثيل الانتقال من EST إلى MET. (د) تصور الصورة الأولى (D1) مثالا على الانتقال بين مرحلتي MET و DIE ، مع الخلايا الظهارية المتحللة المصاحبة لزيادة في LEUs. الصورة الثانية (D2) تصور خلايا AKE في وجود وحدات LEUs متكتلة وخلايا SNE الموصوفة سابقا. تم تكبير هذه الأرقام ، التي تم التقاطها إما بتكبير 4x (A1 و A2 و A3 و B و C) أو 10x (A4 و D1 و D2) ، للسماح بزيادة تصور مكونات التصنيف. أشرطة المقياس = 100 متر. بالنسبة للرجوع إلى الحجم ، يبلغ قطر خلايا AKE حوالي 40-52 ميكرومتر ، و LEUs حوالي 10 ميكرومتر ، وخلايا LNE من 36-40 ميكرومتر ، وخلايا SNE من حوالي 25-32 ميكرومتر16. الاختصارات: AKE = الظهارية الكيراتينية غير الشقيقة. LEUs = الكريات البيض; LNE = ظهارة كبيرة نواة ؛ SNE = ظهارة صغيرة نواة. C = متكتلة. EST = شبق; DIE = diestrus; PRO = proestrus; MET = metestrus. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: مجموعات عينات الخلايا غير المواتية. (أ) في هاتين الصورتين ، تم شفط الخلايا الحرشفية من جدار القناة المهبلية ، بالإضافة إلى وحدات LEUs المنتشرة عشوائيا. (ب) تتضمن هذه الصورة كمية منخفضة من الحطام، حيث لم تشاهد الخلايا أو لم تجمع. (ج) في هذا المثال، شوهد إجمالي عدد قليل من الخلايا. (د) في هاتين الصورتين (D1 و D2) ، شوهد محلول استخراج كلوريد الصوديوم (NaCl) والسائل المهبلي وانتشرا عبر شرائح المجهر. تم تكبير هذه الأرقام ، التي تم التقاطها إما عند التكبير 4x (A1 و A2 و D1) أو 10x (B و C و D2) ، للسماح بزيادة تصور مكونات التصنيف. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. بالنسبة للرجوع إلى الحجم ، يبلغ قطر خلايا AKE حوالي 40-52 ميكرومتر ، و LEUs حوالي 10 ميكرومتر ، وخلايا LNE من 36-40 ميكرومتر ، وخلايا SNE من حوالي 25-32 ميكرومتر16. الاختصارات: AKE = الظهارية الكيراتينية غير الشقيقة. LEUs = الكريات البيض; LNE = ظهارة كبيرة نواة ؛ SNE = ظهارة صغيرة نواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: عينة نمط ركوب الدراجات المنتظمة وغير المنتظمة . (أ) تعكس هذه الصورة ما مجموعه 16 دورة كاملة تتقدم من خلال نمط متكرر وثابت ، مما يعكس التذبذب المنتظم لهرمونات الستيرويد الجنسية. ضمن هذا ، يتم تمثيل diestrus بواسطة الأدنى ، proestrus من الوسط ، ويتم تمثيل الشبق بواسطة الشريط على أطول ارتفاع. يتم تحليل هذه البيانات عن طريق تتبع الأيام بين مراحل الشبق ، حيث يمثل كل شبق إلى شبق دورة كاملة واحدة. وتعكس هذه البيانات بيانات إناث الفئران الموجودة في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس. (ب) تمثل هذه الصورة مزيجا نظريا من أنماط غير دورية مختلفة من 22 فأرا. يمكن رؤية الشبق الممتد مع أيام متكررة متعددة من القضبان على ارتفاع كامل ، و diestrus ممتد مع أيام متكررة متعددة من أدنى ارتفاع للشريط ، وغياب النمط الدوري للتقدم من diestrus من خلال metestrus. الاختصارات: Est = شبق; Diest/Die = diestrus. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: محددات التصنيف الفردية. (أ) يعكس هذا الرسم البياني الشريطي المكدس كل مكون من مكونات الأدوات المستخدمة لتصنيف العينات الفردية التي تم جمعها في مراحل عينة estrous. هنا ، يظهر الموضوع الذي تمت مراقبته لمدة 10 أيام مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وكمياتها وترتيباتها. هذا متوقع للحيوانات المراهقة ، لأن المستويات الهرمونية لا تصبح عادة متسقة أو منتظمة حتى سن البلوغ. (ب) هنا ، يتم تقديم ملف تعريف استروس لحيوان تم رصده لمدة 20 يوما. يمكن رؤية مخالفات مماثلة هنا ، حيث ظل الموضوع في diestrus لمدة 4 أيام مقابل 1-2 النموذجي. تمثل هذه البيانات 6 فئران أنثى موجودة في جامعة بيبردين. الاختصارات: AKE = الظهارية الكيراتينية غير الشقيقة. LEU = الكريات البيض. LNE = ظهارة كبيرة نواة ؛ SNE = ظهارة صغيرة نواة. C = متكتلة. الضعف الجنسي = مشتت بالتساوي ؛ RD = مشتتة عشوائيا ؛ COM = مجتمعة; SMD = smidge; وزارة الدفاع = معتدلة; NUM = عديدة; EXE = ممارسة ; SED = المستقرة. Est = شبق; يموت = ديستروس. برو = برويستروس. Met = metestrus.

Figure 10
الشكل 10: ملامح المرحلة . (أ) يصور هذا القسم البيانات المحددة المصنفة لفئران فردية خلال كل يوم مصنفة على أنها diestrus. تمثل الصورة الأولى (A1) البيانات التي تم جمعها على مدار 10 أيام والثانية (A2) لمدة 20 يوما. (ب) يصور هذا القسم بيانات لفئران فردية خلال كل يوم مصنفة على أنها بروستروس. تمثل الصورة الأولى (B1) البيانات التي تم جمعها على مدار 10 أيام والثانية (B2) لمدة 20 يوما. (ج) يصور هذا بيانات لفئران فردية خلال كل يوم تم تحديده على أنه مرحلة شبق. تمثل الصورة الأولى (C1) البيانات التي تم جمعها على مدار 10 أيام والثانية (C2) لمدة 20 يوما. (دال) يصور هذا القسم من السلسلة بيانات المكونات المصنفة لفئران فردية خلال كل يوم يتم تحديده على أنه مرحلة metestrus. تمثل الصورة الأولى (D1) البيانات التي تم جمعها على مدار 10 أيام والثانية (D2) لمدة 20 يوما. وتعكس البيانات الواردة في هذه الأرقام بيانات 6 فئران أنثى موجودة في جامعة بيبردين. الاختصارات: AKE = الظهارية الكيراتينية غير الشقيقة. LEU = الكريات البيض. LNE = ظهارة كبيرة نواة ؛ SNE = ظهارة صغيرة نواة. C = متكتلة. الضعف الجنسي = مشتت بالتساوي ؛ RD = مشتتة عشوائيا ؛ COM = مجتمعة; SMD = smidge; وزارة الدفاع = معتدلة; NUM = عديدة; EXE = ممارسة ; SED = المستقرة. Est = شبق; يموت = ديستروس. برو = برويستروس. Met = metestrus. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تقديرا: 10 أيام المدة (أيام) AKE (٪) LEU (٪) LNE (٪) SNE (٪) إجمالي عدد الخلايا (٪)
3 88 2.78 1.89 7.33 تعديل: 44.44 نوم: 44.44 SMD: 11.11
نطاقات 2–4 70–100 0–10 0–17 0–20 Smidge–عديدة
ترتيب ج: 50
إد: 0
RD: 50		 ج: 0
إد: 0
RD: 100		 ج: 0
إد: 0
RD: 100		 ج: 50
إد: 0
RD: 50
تقديرا: 20 يوما المدة (أيام) AKE (٪) LEU (٪) LNE (٪) SNE (٪) إجمالي عدد الخلايا (٪)
4 71.92 5.5 2.92 19.67 تعديل: 50 عدد: 50 SMD: 0
نطاقات 4–4 10–100 0–20 0–20 0–80 Smidge–عديدة
ترتيب ج: 60
المحرر: 6.67
RD: 33.33		 ج: 0
الإصدار: 12.5
RD: 87.5		 ج: 33.33
إد: 0
الرد: 66.67		 ج: 44.44
إد: 0
RD: 55.56

الجدول 1: متوسط عينة محدد المرحلة. توضح هذه الجداول متوسطات محددات التصنيف ونظرة عامة لجميع مراحل EST التي تم جمعها. يعكس الجدول العلوي متوسطات جميع الحيوانات التي تم رصدها لمدة 10 أيام والجدول السفلي لمدة 20 يوما. ويشمل ذلك مدة دورة الاستروس، وأنواع الخلايا والنسب المئوية، وترتيبات الخلايا والنسبة المئوية لكل ترتيب شوهد لكل نوع من أنواع الخلايا. وتعكس هذه البيانات بيانات 6 فئران أنثى موجودة في جامعة بيبردين. الاختصارات: AKE = الظهارية الكيراتينية غير الشقيقة. LEU = الكريات البيض. LNE = ظهارة كبيرة نواة ؛ SNE = ظهارة صغيرة نواة. C = متكتلة. الضعف الجنسي = مشتت بالتساوي ؛ RD = مشتتة عشوائيا ؛ EST = شبق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الرئيسية والاعتبارات الهامة
تتطلب بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول المقدم التركيز ، خاصة داخل مجموعة الخلايا المهبلية. أثناء استخراج السائل المهبلي ، يعد ضمان الزاوية والعمق المناسبين لإدخال المحقنة أمرا أساسيا لتحقيق نتائج مرضية ومنع التهيج أو الإصابة أو تحفيز عنق الرحم للحيوان في نهاية المطاف. يمكن أن يكون تحفيز عنق الرحم أحد مصادر تحريض الحمل الكاذب ، المشار إليه من خلال 12-14 يوما من مسحة المهبل المكونة من الكريات البيض فقط11. خلال مرحلة تقييم المجهر ، من الأهمية بمكان التركيز على المستوى البصري الذي يعرض الخلايا المهبلية التي تم جمعها. يتم الانتهاء من ذلك عن طريق تحديد خلية واحدة أو خليتين وضبط التصور حتى يتم تحقيق التركيز.

بعد ذلك ، يحدث التقاط صور تمثيلية للخلايا المهبلية للتدريج عن طريق مسح كامل شريحة المجهر. وهذا يضمن أن الصور الملتقطة تعكس تصويرا دقيقا لما يتم جمعه ووجوده في القناة المهبلية للحيوانات. قبل التصنيف ، من الضروري الإلمام بمحددات التصنيف ، مثل التمييز بين أنواع الخلايا والتحولات المختلفة التي يمكن أن يمتلكها كل نوع من أنواع الخلايا. يوصى بأن يتم تدريب كل مشارك بشكل صحيح وأن يمارس تحديد المرحلة من خلال شرائح الممارسة المعدة مسبقا.

لتقليل مقدار التحيز والذاتية التي تنطوي عليها العملية ، يوصى بتضمين مشاركين اثنين في مرحلة التصنيف ، وكلاهما يظلان عميان عن مهام مجموعة العلاج مع معرفة تعريفات المرحلة المسجلة مسبقا لكل. تعيين اثنين من المشاركين لتصنيف العينات يسمح بالمؤتمر وانخفاض في الذاتية في تحديد الهوية. ومع ذلك ، إذا كان للمشاركين تصنيف العينات بشكل منفصل ، فمن المستحسن أن تكون هناك فترة تعاون أولية لزيادة موثوقية المصنفين مع تطوير الخبرات. يمكن استخدام نظام امتحان ثانوي لمنع النتائج غير المتسقة ، مثل تبادل مجموعات البيانات بعد التصنيف واستخدام الصور لتأكيد التقييمات الأولية.

القيود والتعديلات
تشمل قيود التقنية الحالية مدة البقاء. بسبب الإصابة أو التهيج الذي يمكن أن يصاحب الإدخال المتكرر للمحقنة ، فإن المراقبة المطولة والمتكررة لا تتماشى مع الرعاية المناسبة واستخدام الحيوانات. لذلك ، عند إجراء دراسة طولية ، قد يكون من الضروري تعديل الإجراء عن طريق تقليل وتيرة الغسل. على سبيل المثال ، بدلا من مراقبة كل مرة واحدة في اليوم ، يمكن تقسيم الفئران إلى مجموعات تتم مراقبتها في أيام مختلفة على مدار الأسبوع. وينطوي القيد الثاني على عدم وجود تلطيخ للعينات في العملية المحددة، مع عدم فصل المكونات الخلوية حسب اللون، مما يخلق اعتمادا أكبر على محددات التصنيف المدرجة في البروتوكول أعلاه.

بالإضافة إلى ذلك ، ضمن محددات التصنيف هذه ، هناك عناصر ذاتية يمكن أن تحد من التكرار الدقيق. على وجه التحديد ، تستند النسب المئوية لكمية الخلايا داخل العينات التي تم جمعها إلى تقديرات شخصية. يمكن أن تشمل التعديلات في هذا الصدد تطوير خوارزمية رياضية لتحديد أنواع الخلايا الفردية الموجودة. ويمكن أن تشمل التعديلات البديلة عدد العينات المودعة على شريحة مجهرية واحدة، والتي يمكن زيادتها تبعا لحجم الشريحة والغطاء. يمكن أن تشمل القيود الأخرى نقص بيانات السائل المهبلي في هذه الدراسة - يمكن أن يشمل تعديل الدراسات المستقبلية تسجيل ظروف السائل المهبلي الذي تم جمعه كمساهمة في تصنيف المرحلة. ويمكن أن تشمل التعديلات الإضافية للبروتوكول استخدام سائل متساوي التوتر آخر لاستخراج الخلايا، والذي من شأنه أن يؤدي إلى نفس النتائج، مثل الملح المخزن بالفوسفات13. أخيرا ، عند تطبيق هذا الإجراء على الفئران من مختلف الأعمار أو السلالات ، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات مثل تقنيات التعامل مع الحيوانات بسبب حجم الجسم أو مستوى النشاط. يمكن أن يشمل ذلك طريقة الإمساك69 وطرق Forelimb Crisscross 64 للبالغين وطريقة تقييد اليد الواحدة والثانية64 المستخدمة للفئران الأصغر سنا.

طرق بديلة
بالمقارنة مع الطرق البديلة لمراقبة دورة استروس ، فإن غسل المهبل فريد من نوعه في دقته ، وكمية المعلومات المنتجة ، والحد الأدنى من الغزو ، والتكاليف المرتبطة المنخفضة. يمكن استخدام الفحص النسيجي للرحم والمبيضين لتحديد مراحل الدورة ولكنه أكثر تدخلا ولا يسمح بالمراقبة المستمرة. في حين أن قياس مستويات هرمون الستيرويد الجنسي يساعد في مراقبة دورة استروس ، فإنه يتطلب جمع الدم ولا يسمح بتوصيف ملف تعريف السائل الخلوي أو المهبلي الفريد لكل موضوع. نظرا لأن تطور الأعضاء التناسلية الخارجية يرتبط بشكل غير مباشر بمستويات هرمون الستيرويد الجنسي ، فإن فحص فتحة المهبل يمكن أن يوفر معلومات عن النضج الجنسي. بالإضافة إلى ذلك ، تم ربط تلوين الأنسجة ومستوى الرطوبة والحجم وتورم فتحة المهبل بمراحل دورة estrous70. ومع ذلك ، فإن علم وظائف الأعضاء الدقيق الذي يؤدي إلى فتح القناة المهبلية في الفئران لم يتم الإبلاغ عنه بالكامل بعد. وقد وجدت المنشورات الحديثة أن هذا ليس سوى علامة غير مباشرة على التطور التناسلي ولا يتماشى دائما مع الزغب31,34. التحليل الكيميائي الحيوي لعينات البول فعال من حيث التكلفة ويتم إجراؤه بسهولة ، لكنه لا يسمح بخصوصية وموثوقية الطرق الأخرى71. لذلك ، فهي ليست موثوقة أو صالحة مثل فحص الخلايا الموجودة في القناة المهبلية.

بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام قياس المعاوقة الكهربائية لمراقبة دورة estrous وهو أقل إزعاجا جسديا من غسل السائل. ومع ذلك ، لا توفر هذه الطريقة الكثير من المعلومات حول مكونات التصنيف. تم تصميم هذا الجهاز خصيصا لتحسين توقيت التزاوج المتعمد ، وقياس متى تكون مستويات هرمون الستيرويد الجنسي أعلى72،73،74. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن هذه الطريقة فعالة للتمييز بين EST وغير EST ولكنها محدودة في قدرتها على مراقبة دورة estrous خارج ذلك75. وعموما، أفيد بأن هذه الطريقة غير موثوقة، وليست دائما فعالة من حيث التكلفة، ولا تستخدم في كثير من الأحيان في الأدبيات مما يؤدي إلى نقص البيانات القابلة للمقارنة74. في حين أن المسحة المهبلية تشبه إلى حد كبير الغسل في المعلومات التي تقدمها ، إلا أنها تتضمن زيادة خطر التهيج أو الإصابة لأنها تتطلب الاتصال ببطانة القناة المهبلية مباشرة لاسترداد الخلايا. وأخيرا، في حين أن تلطيخ شرائح المجهر قد يوفر تباينا أكثر حدة بين أنواع الخلايا ويسمح بحفظ العينات، إلا أنه مسعى أكثر استهلاكا للوقت ومكلفا من الحامل الرطب53. وعموما، فإن لكل تقنية رصد حدودها ومزاياها، وقد يكون من المفيد استخدام مزيج من هذه الأساليب لتلقي فحص شامل لدورة استروس القوارض.

التطبيقات
ولا يزال من المهم النظر إلى الدراسة الحالية في سياق المجتمع العلمي الأكبر وعامة الجمهور. يمكن استخدام هذه المنهجية في أي مشروع يتضمن فحص الحيوانات الإناث - ليس فقط ضمن الدراسات التي تركز على التربية المتعمدة ، لاستبعاد الحيوانات التي تعاني من تشوهات ، و / أو وظيفة محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والمبيض ، ولكن أيضا للحصول على رؤى رئيسية داخل مجموعات العلاج. وبشكل أكثر تحديدا ، يكون هذا الإجراء مؤثرا في i) الدراسات الدوائية ، حيث أن الأدوية والمواد الكيميائية المختلفة تعطل أو تغير الجهاز التناسلي ودورة estrous 11,27,76; ب) الدراسات العصبية ، مثل تلك التي تركز على إصابات الدماغ الرضحية ، أو الإدراك ، أو الاضطرابات التنكسية ، بسبب التفاعلات بين هرمونات الستيرويد الجنسية والجهاز العصبي77 ؛ ج) أبحاث الدورة الدموية بسبب مستقبلات هرمون الستيرويد الجنسية الموجودة على الخلايا العضلية والتفاعلات اللاحقة77 ؛ د) البحوث المتعلقة بنمو العظام38 ؛ إلى نظام الغدد الصماء11,78 ؛ و v) دراسات أخرى غير إنجابية3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

أجريت هذه الدراسة من خلال تعاون تموله المعاهد الوطنية للصحة بين مركز أبحاث إصابات الدماغ بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (BIRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera AmScope Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5 https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV&
keywords=usb+camera+for+microscope&
qid=1572477663&s=industrial
&sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel Fischer Scientific 14-815-526 https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8 NEWCO 93009 https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass Fischer Scientific 12-553-7A https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses Fischer Scientific 12-553-464 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply Fischer Scientific 06-666 https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001  NEWCO Specialty and LabDiet 5012 https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm Grainger 36UX10 https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_
LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7
zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4
cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696
!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id=
CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW
1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ
Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo
Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc=
PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9% Live Action Safety ABB079830939 https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies BH Supplies ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821 https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7&
keywords=1ml+sterile+syringe&qid=
1572478649&s=industrial
&sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa=
ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy
PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm
VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ
yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy
eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM
0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h
bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja
1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2
xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen Allentown LV40326013 https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad Medline EAN: 0480196288558
 Global Trade Identification Number: 40080196288558		 https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853&
sr=8-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell and Tissue Research. 354 (1), 99-106 (2013).
  2. Camacho-Arroyo, I., Montor, J. M. Beyond reproductive effects of sex steroids. MiniReviews in Medicinal Chemistry. 12 (11), 1037-1039 (2012).
  3. Shah, S. I. A. Systemic non-reproductive effects of sex steroids in adult males and females. Human Physiology. 44, 83-87 (2018).
  4. Wierman, M. E. Sex steroid effects at target tissues: mechanisms of action. Advances in Physiology Education. 31 (1), 26-33 (2007).
  5. An, G., et al. Pathophysiological changes in female rats with estrous cycle disorder induced by long-term heat stress. BioMed Research International. 2020, 4701563 (2020).
  6. Donato, J., et al. The ventral premammillary nucleus links fasting-induced changes in leptin levels and coordinated luteinizing hormone secretion. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5240-5250 (2009).
  7. Fortress, A. M., Avcu, P., Wagner, A. K., Dixon, C. E., Pang, K. Experimental traumatic brain injury results in estrous cycle disruption, neurobehavioral deficits, and impaired GSK3β/β-catenin signaling in female rats. Experimental Neurology. 315, 42-51 (2019).
  8. Hatsuta, M., et al. Effects of hypothyroidism on the estrous cycle and reproductive hormones in mature female rats. European Journal of Pharmacology. 486 (3), 343-348 (2004).
  9. Jaini, R., Altuntas, C. Z., Loya, M. G., Tuohy, V. K. Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 279, 71-74 (2015).
  10. Tropp, J., Markus, E. J. Effects of mild food deprivation on the estrous cycle of rats. Physiology and Behavior. 73 (4), 553-559 (2001).
  11. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Research. Part B, Developmental and Reproductive Toxicology. 80 (2), 84-97 (2007).
  12. Thung, P. J., Boot, L. M., Muhlbock, O. Senile changes in the oestrous cycle and in ovarian structure in some inbred strains of mice. Acta Endocrinologica. 23 (1), 8-32 (1956).
  13. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  14. Bosch, L. Biochemical and endocrinological studies of normal and neoplastic tissue: The metabolism of estrogen-producing ovarian tumors and other malignancies in the mouse. , Available from: https://www.translatetheweb.com/?from=nl&to=en&ref=SERP&dl=en&rr=UC&a=https%3a%2f%2frepository.tudelft.nl%2fislandora%2fobject%2fuuid%253A8776d58a-6695-4a38-99ca-0abf607480f0 109-111 (2021).
  15. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta Physiologica Pharmacologica Neerlandica. 4 (3), 442-444 (1955).
  16. Paccola, C., Resende, C., Stumpp, T., Miraglia, S., Cipriano, I. The rat estrous cycle revisited: a quantitative and qualitative analysis. Animal Reproduction. 10 (4), 677-683 (2013).
  17. Knobil, E., Neill, J. D. Puberty in the rat. The Physiology of Reproduction. , Raven Press Ltd. New York. 363-409 (1994).
  18. Schallmayer, S., Hughes, B. M. Impact of oral contraception and neuroticism on cardiovascular stress reactivity across the menstrual cycle. Psychology, Health & Medicine. 15 (1), 105-115 (2010).
  19. Barreto-Cordero, L. M., et al. Cyclic changes and actions of progesterone andallopregnanolone on cognition and hippocampal basal (stratum oriens) dendritic spinesof female rats. Behavioural Brain Research. 379, 112355 (2020).
  20. de Zambotti, M., Trinder, J., Colrain, I. M., Baker, F. C. Menstrual cycle-related variation in autonomic nervous system functioning in women in the early menopausal transition with and without insomnia disorder. Psychoneuroendocrinology. 75, 44-51 (2017).
  21. Maghool, F., Khaksari, M., Khachki, A. S. Differences in brain edema and intracranial pressure following traumatic brain injury across the estrous cycle: Involvement of female sex steroid hormones. Brain Research. 1497, 61-72 (2013).
  22. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex as a biological variable: Who, what, when, why, and how. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 386-396 (2017).
  23. Becker, J. B., Prendergast, B. J., Liang, J. W. Female rats are not more variable than male rats: a meta-analysis of neuroscience studies. Biology of Sex Differences. 7, 34 (2016).
  24. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  25. Joel, D., McCarthy, M. M. Incorporating sex as a biological variable in neuropsychiatric research: where are we now and where should we be. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 379-385 (2017).
  26. Long, J. A., Evans, H. M. The oestrous cycle in the rat and its associated phenomena. Memoirs of the University of California. 6, 1 (1922).
  27. Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
  28. Lenschow, C., Sigl-Glöckner, J., Brecht, M. Development of rat female genital cortex and control of female puberty by sexual touch. PLoS Biology. 15 (9), 2001283 (2017).
  29. Lewis, E. M., Barnett, J. F., Freshwater, L., Hoberman, A. M., Christian, M. S. Sexual maturation data for Crl Sprague-Dawley rats: Criteria and confounding factors. Drug and Chemistry Toxicology. 25 (4), 437-458 (2002).
  30. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 24 (4), 417-463 (2000).
  31. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: the puberty ovarian maturation score (pub-score). Scientific Reports. 7, 46381 (2017).
  32. da Silva Faria, T., da Fonte Ramos, C., Sampaio, F. J. Puberty onset in the female offspring of rats submitted to protein or energy restricted diet during lactation. Journal of Nutritional Biochemistry. 15 (2), 123-127 (2004).
  33. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. 48 (1), 1 (2009).
  34. Engelbregt, M. J., et al. Delayed first cycle in intrauterine growth-retarded and postnatally undernourished female rats: follicular growth and ovulation after stimulation with pregnant mare serum gonadotropin at first cycle. Journal of Endocrinology. 173 (2), 297-304 (2002).
  35. Pescovitz, O. H., Walvoord, E. C. When puberty is precocious: Scientific and clinical aspects. , Humana Press. (2007).
  36. USEPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. Standard Evaluation Procedure Test Guidelines 890.1450: Pubertal development and thyroid function in intact juvenile/peripubertal female rats assay. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/final_890.1450_female_pubertal_assay_sep_8.24.11.pdf (2011).
  37. Kennedy, G. G., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. Journal of Physiology. 166 (2), 408-418 (1963).
  38. Sengupta, S., Arshad, M., Sharma, S., Dubey, M., Singh, M. M. Attainment of peak bone mass and bone turnover rate in relation to estrous cycle, pregnancy and lactation in colony-bred Sprague-Dawley rats: Suitability for studies on pathophysiology of bone and therapeutic measures for its management. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 94 (5), 421-429 (2005).
  39. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
  40. Koff, E., Rierdan, J., Stubbs, M. L. Conceptions and misconceptions of the menstrual cycle. Women & Health. 16 (3-4), 119-136 (1990).
  41. Sahay, N. Myths and misconceptions about menstruation: A study of adolescent school girls of Delhi. Journal of Women's Health and Development. 3 (3), 154-169 (2020).
  42. Criado-Perez, C. The deadly truth about a world built for men - from stab vests to car crashes. , Available from: https://www.theguardian.com/lifeandstyle/2019/feb/23/truth-world-built-for-men-car-crashes (2019).
  43. Chrisler, J. C. The menstrual cycle in a biopsychosocial context. Women's Psychology. Psychology of Women: A Handbook of Issues and Theories. Denmark, F. L., Paludi, M. A. , Praeger Publishers/Greenwood Publishing Group. 193-232 (2008).
  44. Rea, H. H. Re-cycling the menstrual cycle: A multidisciplinary reinterpretation of menstruation. , Available from: https://scholarworks.wmich.edu/masters_theses/3942 (1998).
  45. Sato, J., Nasu, M., Tsuchitani, M. Comparative histopathology of the estrous or menstrual cycle in laboratory animals. Journal of Toxicologic Pathology. 29 (3), 155-162 (2016).
  46. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
  47. Smith, J. R., et al. The year of the rat: The Rat Genome Database at 20: a multi-species knowledgebase and analysis platform. Nucleic Acids Research. 48 (1), 731-742 (2020).
  48. Capdevila, S., Giral, M., Ruiz de la Torre, J. L., Russell, R. J., Kramer, K. Acclimatization of rats after ground transportation to a new animal facility. Laboratory Animals. 41 (2), 255-261 (2007).
  49. Conour, L., Murray, K., Brown, M. Preparation of animals for research-issues to consider for rodents and rabbits. ILAR journal. 47 (4), 283-293 (2006).
  50. National Academies Press (US) Committee on Guidelines for the Humane Transportation of Laboratory Animals. Guidelines for the Humane Transportation of Research Animals. National Academies Press. , (2006).
  51. Obernier, J., Baldwin, R. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR Journal. 47 (4), 364-369 (2006).
  52. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. US) . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. , National Academies Press. US. (2011).
  53. Pantier, L. K., Li, J., Christian, C. A. Estrous cycle monitoring in mice with rapid data visualization and analysis. Bio-protocol. 9 (17), 1-17 (2019).
  54. Cohen, I., Mann, D. Seasonal changes associated with puberty in female rats: effect of photoperiod and ACTH administration. Biology of Reproduction. 20 (4), 757-776 (1979).
  55. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J Mice: I. cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
  56. Pennycuik, P. R. Seasonal changes in reproductive productivity, growth rate, and food intake in mice exposed to different regimens of day length and environmental temperature. Australian Journal of Biological Sciences. 25 (3), 627-635 (1972).
  57. Piacsek, B. E., Hautzinger, G. M. Effects of duration, intensity and spectrum of light exposure on sexual maturation time of female rats. Biology of Reproduction. 10 (3), 380-387 (1974).
  58. Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of the estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
  59. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  60. Campbell, C., Schwartz, N. The impact of constant light on the estrous cycle of the rat. Endocrinology. 106 (4), 1230-1238 (1980).
  61. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Osterburg, H. H., Finch, C. E. Altered profiles of estradiol and progesterone associated with prolonged estrous cycles and persistent vaginal cornification in aging C578L/6J mice. Biology of Reproduction. 24 (4), 784-794 (1981).
  62. Rivest, R. W. Sexual maturation in female rats: Hereditary, developmental and environmental aspects. Experientia. 47 (10), 1026-1038 (1991).
  63. Charles River Laboratories. CD® (Sprague Dawley) IGS Rat. Charles River Laboratories. , Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-sd-igs-rat?region=3611 (2021).
  64. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. JoVE. , (2020).
  65. Circulatory System. Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021).
  66. Urogenital System. n.d.). Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_urogenital.html (2021).
  67. Kiernan, J. A. Anatomical foundations of neuroscience: Mini-atlas of rat's brain. Anatomy and Cell Biology 9535b. , University of Western Ontario. Available from: https://instruct.uwo.ca/anatomy/530/535downs.htm (2008).
  68. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7 (4), 1-5 (2012).
  69. Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  70. Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
  71. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6 (5), (2020).
  72. Bartos, L. Vaginal impedance measurement used for mating in the rat. Laboratory Animals. 11 (1), 53-55 (1977).
  73. Belozertseva, I. V., Merkulov, D. D., Vilitis, O. E., Skryabin, B. V. Instrumental method for determining the stages of the estrous cycle in small laboratory rodents. Laboratory Animals for Scientific Research. (4), (2018).
  74. Ramos, S. D., Lee, J. M., Peuler, J. D. An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 667-670 (2001).
  75. Singletary, S. J., et al. Lack of correlation of vaginal impedance measurements with hormone levels in the rat. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (6), 37-42 (2005).
  76. Bretveld, R. W., Thomas, C. M., Scheepers, P. T., et al. Pesticide exposure: the hormonal function of the female reproductive system disrupted. Reproductive Biology Endocrinology. 4 (30), (2006).
  77. MacDonald, J. K., Pyle, W. G., Reitz, C. J., Howlett, S. E. Cardiac contraction, calcium transients, and myofilament calcium sensitivity fluctuate with the estrous cycle in young adult female mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 306 (7), 938-953 (2014).
  78. Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).

Tags

علم الأحياء العدد 174 أنثى مراهق سبراغ دولي الفئران هرمونات الستيرويد الجنسية دورة استروس غسل المهبل
مراقبة دورة القوارض الحثالة باستخدام غسل المهبل: لا يوجد شيء مثل الدورة العادية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robert, H., Ferguson, L., Reins, O., … More

Robert, H., Ferguson, L., Reins, O., Greco, T., Prins, M. L., Folkerts, M. Rodent Estrous Cycle Monitoring Utilizing Vaginal Lavage: No Such Thing As a Normal Cycle. J. Vis. Exp. (174), e62884, doi:10.3791/62884 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter