Surveillance du cycle œstral des rongeurs à l’aide d’un lavage vaginal: pas de cycle normal

Summary

Cette étude détaille les facteurs cruciaux à prendre en compte dans les plans expérimentaux impliquant des rats femelles. Dans un sens plus large, ces données servent à réduire la stigmatisation et à aider à l’élaboration d’outils de diagnostic et d’intervention plus inclusifs.

Abstract

La méthodologie actuelle établit une approche reproductible, normalisée et rentable pour surveiller le cycle œstral des rats adolescents femelles de Sprague Dawley (SD). Cette étude démontre la complexité des cycles hormonaux et le large spectre de compréhension nécessaire pour construire une technique de surveillance fiable et valide. Grâce à un examen approfondi de la conception expérimentale principale et des éléments procéduraux, cette description du cycle et de ses principes fondamentaux fournit un cadre pour une meilleure compréhension et déconstruit les idées fausses pour une réplication future.

En plus d’un aperçu du processus de prélèvement d’échantillons utilisant le lavage vaginal, la procédure décrit le mécanisme de catégorisation des données dans le modèle en quatre étapes du proestrus, de l’œstrus, du metestrus et du diestrus. Ces étapes sont caractérisées par une nouvelle approche proposée, utilisant les 4 déterminants de catégorisation de l’état du liquide vaginal, du ou des types de cellules présents, de l’arrangement cellulaire et de la quantité de cellules au moment de la collecte. Les variations de chaque étape, les échantillons favorables et défavorables, la distinction entre cyclicité et acyclicité et les représentations graphiques des composantes de catégorisation collectées sont présentées parallèlement à des pratiques interprétatives et organisationnelles efficaces des données. Dans l’ensemble, ces outils permettent pour la première fois de publier des plages de données quantifiables, ce qui conduit à la normalisation des facteurs de catégorisation lors de la réplication.

Introduction

Contributions inédites
Le cycle œstral des rongeurs a été identifié comme un indicateur essentiel du bien-être. Cependant, les préjugés inconscients des chercheurs et les interprétations inexactes concernant le corps féminin entravent la communauté scientifique. L’étymologie même du mot « œstral » implique un sentiment d’infériorité et de négativité. Euripide a utilisé le terme pour décrire une « frénésie » ou une folie, Homère pour décrire la panique et Platon pour décrire une pulsion irrationnelle. Cette étude met en évidence comment ces perspectives primitives influencent la communauté scientifique actuelle et répond à ces préoccupations grâce à un nouveau paradigme de mosaïque – une combinaison mise à jour de méthodes précédemment étudiées, élargie dans la portée d’une approche plus globale.

L’étude et l’utilisation de cette technique sont d’abord nécessaires, car il n’existe pas de technique de surveillance normalisée et complète, et les pratiques d’interprétation des données peuvent être peu claires. Deuxièmement, bien que les caractéristiques du cycle œstral dépendent de l’étude individuelle des rats, elles sont souvent universalisées. Troisièmement, bien que les cycles hormonaux soient des processus routiniers et bénéfiques, ils sont entourés d’une stigmatisation dangereuse explorée dans la section « Traduction chez l’homme ». Cette étude vise à aborder ces trois questions de trois façons : (A) en décrivant une technique approfondie de surveillance du cycle œstral et en clarifiant la façon dont les résultats peuvent être interprétés, (B) en décrivant des méthodes qui maintiennent l’intégrité et l’individualité de chaque cycle, et (C) en attirant l’attention sur les idées fausses qui perpétuent des pratiques non fondées.

Cette étude est également unique en ce qu’elle se concentre sur les rats adolescents, une période marquée par des changements cruciaux du développement qui mettent en lumière diverses manifestations comportementales, anatomiques et physiologiques à l’âge adulte¹. L’élaboration d’une conception expérimentale normalisée pour surveiller les cycles hormonaux dans une population sous-étudiée tout en déconstruisant les biais communs permettra le développement de corrélations hormonales fiables et valides ^2,3,4 et la détermination des perturbations du cycle dépendantes de la condition ^5,6,7,8,9,10 . En fin de compte, ces nouveautés servent à élargir les critères de diagnostic, les traitements et les interventions de diverses préoccupations en matière de bien-être.

Définitions et utilisations fondamentales
Le cycle œstral est un ensemble de processus physiologiques dynamiques qui se produisent en réponse aux trois hormones stéroïdes sexuelles féminines oscillantes: l’œstradiol, l’hormone lutéinisante (LH) et la progestérone (Figure 1A, B). Les interactions entre le système endocrinien et le système nerveux central régulent le cycle, qui persiste le plus souvent pendant 4 à 5 jours et se répète du début de la maturation sexuelle jusqu’à la sénescence reproductive et / ou l’arrêt. Il est divisé en catégories distinctes en fonction des niveaux d’hormones, le plus souvent dans les 4 stades du diestrus (DIE), du proestrus (PRO), de l’estrus (EST) et du metestrus (MET), qui progressent de manière circulaire. Le nombre de divisions peut varier de 3 étapes¹¹ à 13 étapes¹², selon la nature de l’étude¹³. Le nombre inférieur de divisions exclut souvent le STATUT de société opérant dans les conditions d’une économie de marché en tant qu’étape et la classe comme une période de transition de courte durée. Le nombre le plus élevé comprend généralement des sous-sections qui permettent une inspection plus approfondie de phénomènes tels que le développement de tumeurs ou la pseudoprégnance spontanée, l’état physiologique de la grossesse sans implantation embryonnaire 12,14,15.

Dans cette étude, les stades ont été identifiés à travers les composants du canal vaginal, nommés les 3 déterminants de catégorisation - type(s) de cellules présent(s), l’arrangement cellulaire et la quantité de cellules (Figure 2A-D). Bien que l’état du liquide vaginal n’ait pas été surveillé dans cette étude, il est recommandé de l’inclure comme quatrième composant de catégorisation. De plus amples renseignements sur l’examen du liquide vaginal se trouvent dans la liste de référence¹⁶. Les composants de catégorisation peuvent être examinés en extrayant les cellules par lavage vaginal, la principale technique recommandée dans la surveillance du cycle œstral moderne. Bien que les processus physiologiques approfondis à l’intérieur de chaque étape soient en dehors de la portée de cette étude, plus d’informations peuvent être trouvées dans la littérature¹⁷.

L’utilisation et le développement continu de cette technique de surveillance du cycle œstral sont enracinés dans les liens entre les hormones stéroïdes sexuelles et la fonction des systèmes corporels tels que le système cardiovasculaire¹⁸, le système endocrinien⁸ et le système nerveux central 19,20,21. Dans le même temps, la surveillance du cycle œstral peut ne pas toujours être nécessaire lorsque des rongeurs femelles sont impliqués ^22,23,24,25. Il est plutôt important de déterminer d’abord si des différences entre les sexes ont été signalées dans le domaine d’étude spécifique, ce qui peut être exploré plus en détail dans les revues publiées^22,23. Bien que la surveillance du cycle œstral soit vitale dans un large éventail d’investigations de recherche, elle ne doit pas être considérée comme un obstacle à l’inclusion des rongeurs femelles dans les expériences. Bien que cette technique puisse sembler complexe et prendre beaucoup de temps, la procédure elle-même peut prendre moins de 15 minutes, selon l’investigateur, et est rentable. Dans l’ensemble, l’inclusion des rongeurs femelles dans les études scientifiques est avantageuse pour la compréhension des systèmes corporels, de diverses conditions et pathologies, et du bien-être général, car ces développements ont été principalement basés sur le modèle corporel masculin.

Paramètres universels et variabilités naturelles chez le rongeur
Il est nécessaire d’établir des fourchettes pour les aspects considérés comme « typiques » pour définir des modèles de cycle standard, définir des paramètres à des fins de comparaison et d’analyse et détecter les anomalies et les valeurs aberrantes. Dans le même temps, il est également important de reconnaître que le cycle de chaque rat est unique et que des écarts basés sur la souche animale, les processus physiologiques et les conditions environnementales sont attendus. En fait, l’un des aspects les plus « normaux » du cycle œstral est la variabilité. Cela se voit dans la durée totale du cycle, avec une plage de 3 à 38 jours^26,27; l’âge de maturation sexuelle qui peut varier de 32-34 jours à plusieurs semaines 28,29,30; ce qui est considéré comme acyclique¹¹, et les modèles de déterminants de catégorisation^11,13. Dans l’ensemble, il n’existe pas de modèle universel pour le cycle œstral, et le traduire à la fois à la communauté scientifique et au grand public est une partie importante du processus expérimental.

Points temporels expérimentaux et âge du développement
Reconnaître ce principe de variabilité aide à construire une conception expérimentale fiable et valide. Par exemple, le début de la surveillance du cycle œstral repose sur le développement anatomique et physiologique des rats, qui varie en fonction de facteurs environnementaux et physiologiques. La surveillance ne peut commencer qu’après le développement de l’ouverture vaginale (VO), qui est l’orifice vaginal externe entouré de la vulve qui mène à la partie interne du canal vaginal (Figure 3A-D). Bien que la VO se développe souvent pleinement entre 32 et 34 jours, elle reste individualisée à chaque sujet, et beaucoup de choses sur le processus restent inconnues. Cette ouverture a été utilisée pour identifier le début de la maturation sexuelle, qui a été liée à l’augmentation de l’œstradiol³¹, à la maturation de l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien³² et à la première ovulation chez le rat 17,33,34,35. Cependant, des publications récentes ont montré qu’il ne s’agit que d’un marqueur indirect du développement reproductif, car il peut être découplé des occurrences hormonales et développementales dans des environnements défavorables³¹ et peut représenter des changements dans les niveaux d’œstradiol plutôt que la maturation sexuelle³³. Par conséquent, il est recommandé de ne pas se fier uniquement à la VO pour déterminer l’âge de développement et comme qualificatif pour la surveillance du cycle œstral³⁶, mais également d’utiliser l’apparition du premier stade EST et la cornification des cellules épithéliales³⁰ pour marquer le début de la maturation sexuelle.

Le poids corporel est notamment corrélé avec l’âge de développement pendant la période de l’adolescence chez les rongeurs^30,37 et peut donc également aider à déterminer l’âge de développement au cours de cette période. Les mécanismes proposés liés à ce phénomène comprennent la stimulation des hormones nécessaires au développement de la reproduction, telles que l’hormone de croissance, et l’inhibition de l’axe hypothalamo-hypophysaire surrénalien (HPA) par le régulateur de l’appétit, la leptine³⁰. Cependant, il n’est pas recommandé d’utiliser cette mesure comme seul indicateur de l’âge de développement en raison de la grande variance observée entre les rats d’une espèce à l’autre et les fournisseurs de fournisseurs³⁸. La variabilité observée dans le développement de la VO et le poids corporel illustrent l’importance du concept dans le processus expérimental global.

Traduction à l’homme : contextes culturels et scientifiques
La relation translationnelle des études de reproduction entre l’animal et l’homme est bidirectionnelle. Les résultats d’études sur des animaux influencent la façon dont les processus humains sont évalués, approchés et analysés³⁹. La perception du système reproducteur humain et de ses processus connexes influence la façon dont les animaux sont étudiés. En fait, l’une des indications les plus fortes pour d’autres recherches dans ce domaine provient de croyances socioculturelles biaisées liées aux cycles hormonaux qui influencent le processus scientifique. Bon nombre de ces conventions découlent d’une aversion culturelle générale pour la discussion sur les menstruations, ce qui a entraîné un manque de données dans les connaissances bien étayées^40,41. Cela a un éventail de conséquences qui vont de mineures à mortelles, de la hauteur des étagères et de la taille du smartphone à l’ajustement du gilet pare-balles de la police et aux diagnostics de cancer manqués⁴².

La description de la menstruation comme insalubre, destructrice et toxique – vue dans les textes vénérés, les médias, les dictionnaires et les enseignements médicaux – est conservée par des publications scientifiques. Cela se produit par des descriptions inexactes et biaisées des cycles hormonaux, l’isolement du système reproducteur de ses homologues neuroendocriniens et des influences environnementales, et la perspective réductionniste de l’achèvement d’un cycle comme un « échec à concevoir»^43,44. Cela conduit à la création de pratiques expérimentales malsaines, telles que l’omission de variables externes qui influencent les cycles hormonaux, la détermination du début et des extrémités basées uniquement sur les développements anatomiques et la mesure de l’avancement du cycle de manière linéaire plutôt que circulaire. Malgré la corrélation directe entre les facteurs socioculturels et les conséquences biologiques, elle n’est pas souvent prise en compte dans la littérature scientifique. Grâce à l’inspection de publications plus holistiques 43,44,45, les chercheurs peuvent déconstruire ces stigmates et créer des plans expérimentaux plus fiables et valides.

Protocol

Toutes les méthodes de manipulation et de procédure décrites dans ce protocole sont conformes aux directives de soins et d’utilisation des animaux des National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Pepperdine et le Comité de recherche animale (ARC) du chancelier de l’UCLA.

1. Soins et utilisation des animaux

1. Acquérir des rats femelles, en nombre selon l’analyse de puissance, et des rats mâles pour favoriser l’effet Whitten ou un cycle plus cohérent⁴⁶. Déterminer la souche en fonction de l’objectif de l’étude dans des bases de données connues⁴⁷.
   REMARQUE: Les données actuelles reflètent celles du Programme international de normalisation génétique (IGS) de SD chez les adolescentes en présence de rats SD mâles situés dans les laboratoires de l’Université Pepperdine et de l’UCLA dans le cadre d’une étude collaborative. Ces rats sont arrivés en groupes distincts à l’âge de 28 jours, et la progression du cycle œstral a été surveillée pendant 10 ou 20 jours pour démontrer des différences sur les niveaux aigus et chroniques, à partir de l’âge de 34 jours (après une période d’acclimatation de 7 jours).
2. Avant la manipulation, prévoir une période de quarantaine et/ou d’acclimatation pour la stabilisation physiologique après le transport et l’adaptation au nouvel environnement.
   NOTE: Une période minimale de 3 jours a été citée, avec une période de 7 jours recommandée 48,49,50,51,52. Dans l’ensemble, cela dépend des conditions de transport, de la souche animale et des objectifs de l’étude.
3. Assurez-vous que le stress est réduit avec l’utilisation d’une période d’acclimatation, car le stress peut perturber le bon fonctionnement du système reproducteur⁵³. Cependant, ne surcompensez pas en essayant de l’éliminer, car une quantité modérée de stress est bénéfique pour le bien-être des animaux⁵¹.
4. Hébergez les rats dans un environnement à température contrôlée (68-79 °F, c’est-à-dire 20-26 °C) et à humidité contrôlée (30-70 %) en contactant le vivarium ou les gestionnaires de laboratoire et en assurant ces caractéristiques. Distribuez de l’eau et du chow ad libitum avec les composants nutritifs énumérés sur le site Web de l’entreprise et nettoyez la cage une fois par semaine.
   REMARQUE: Dans cette étude, les rats ont été logés dans des groupes de 2 séparés par sexe dans des cages en plastique réutilisables transparentes de 19 « x 10 » x 8 » et ont eu accès à une litière en épi de maïs qui était changée une fois par semaine. La température a été maintenue à 70 ° F et l’humidité à 35-79%, avec une moyenne de 62%.
5. Vérifiez le développement d’une nécrose à queue annulaire ou ischémique de la queue et des orteils pour détecter des signes de faibles niveaux d’humidité relative et de températures extrêmes, ce qui peut entraîner l’alternance des réponses biologiques.
   REMARQUE: La température et l’humidité sont importantes pour le système reproducteur, la maturation sexuelle et la cyclicité^{œstrale 54,55,56,57,58}.
6. Assurer un éclairage adéquat et équilibré dans tout l’espace du logement en déposant des quantités égales de sources lumineuses dans tout l’espace du laboratoire qui agissent sur un système lumière/obscurité contrôlé dans le temps.
   REMARQUE: Ici, un cycle lumière:obscurité de 12:12-h, avec des lumières allumées de 06h00 à 18h00, était contrôlé par des ampoules LED linéaires de 2 550 lumens.
7. Suivez les exigences de lux fournies⁵² en fonction des variations de la pigmentation, de l’âge, de la souche, du sexe et du statut hormonal des animaux.
   REMARQUE: Lorsque les chercheurs classent les échantillons de cellules collectés, un éclairage cohérent permettra une détection visuelle appropriée et une mise en scène^{fiable 59}. La durée et l’intensité de la lumière sont directement liées au système reproducteur, à la maturation sexuelle et au cycle œstral 54,55,56,57,60,61.

2. Équipement et préparation des expériences

1. Passez en revue les déterminants de la catégorisation (vus à la figure 2A) : comment identifier chaque étape du cycle œstral et comment utiliser le microscope et l’équipement de caméra.
2. Assurez-vous que chaque sujet à surveiller a atteint la maturation sexuelle et présente des indicateurs de développement appropriés – VO, poids corporel et âge. Pesez les rats et examinez-les pour la VO entre la même heure chaque jour pour des comparaisons précises et transférez-les avec une méthode de manipulation approuvée. Consultez le vétérinaire affilié à l’université si un animal perd plus de 20% de son poids corporel précédent.
   REMARQUE: Le VO reste caudal à l’ouverture urétrale et crânien à l’anus, situé entre les deux, comme illustré à la figure 3.
3. Comme ces facteurs dépendent de la souche, vérifiez auprès du fournisseur les spécifications et tenez compte des facteurs environnementaux spécifiques au laboratoire⁶².
   REMARQUE: En général, cela se produira entre 32 et 34 jours et un poids corporel moyen allant de 75 à 150 grammes⁶³ pour les rats SD et est indiqué par une ouverture de forme circulaire préalablement recouverte d’une gaine membraneuse.
4. Choisir une période de prélèvement d’échantillons appropriée pour le groupe de rats surveillés afin d’éviter le prélèvement d’échantillons transitoires. Tout d’abord, échantillonnez quelques animaux à 2 ou 3 moments différents tout au long de la journée pour déterminer l’heure à laquelle la plupart des étapes du cycle sont présentes (par exemple, échantillonnage à 12h00, 13h00 et 14h00 pour différents animaux). Complétez le lavage vaginal à la même heure chaque jour pour une stadification cohérente et fiable.
   REMARQUE: Il a été rapporté que les heures entre 12h00 et 14h00 sont les meilleures pour capturer toutes les étapes. Dans cette étude, la surveillance du cycle œstral a eu lieu entre 12h00 et 14h00, gérée avec la prise de style compression (voir étape 3.4). L’importance du calendrier de surveillance du cycle œstral par rapport à d’autres interventions expérimentales (p. ex., conditionnement comportemental, médicaments) est un domaine de recherche en développement et peut être exploré plus avant¹¹. La détermination de la durée de la surveillance du cycle œstral dépend de l’étude et peut être explorée plus en détail dans les études publiées^11,33.
5. Retirez le couvercle de protection du microscope et fixez l’appareil photo à l’ordinateur en retirant le couvercle de l’objectif de l’appareil photo de protection et en plaçant l’objectif sur l’oculaire du microscope.
6. Ensuite, ouvrez le logiciel présélectionné sur l’ordinateur. Pour utiliser le logiciel sélectionné dans cette étude, sélectionnez l’appareil photo connecté à l’USB situé sur le côté gauche de l’écran, sous l’onglet intitulé Liste des caméras. Assurez-vous que la caméra USB est correctement connectée à l’ordinateur, qui lira Aucun périphérique sous l’onglet intitulé Liste des caméras, sinon.
7. Une fois que la caméra USB a été sélectionnée sous l’onglet, allumez l’interrupteur d’éclairage du microscope situé sur la base.
8. Créez un dossier sur l’ordinateur désigné pour les exemples de photos de cellule. Créez un dossier de fichiers pour chaque jour distinct où les données sont collectées, préparées à l’avance avant que les images ne soient prises.
9. Une fois l’équipement préparé, récupérez la cage du sujet de son lieu de détention et apportez-la à la station de prélèvement d’échantillons.

3. Collecte de cellules vaginales

1. Récupérez une seringue jetable et remplissez chacune des seringues avec 0,2 mL de NaCl stérile à 0,9 %. Si des bulles d’air sont présentes, faites glisser doucement la seringue en baril jusqu’à ce que toutes les bulles d’air aient atteint l’extrémité ouverte de la seringue et expulsez l’air. S’il y a encore des bulles d’air présentes, expulser la solution dans le récipient NaCl et remplir jusqu’à ce qu’il n’y en ait pas.
   REMARQUE: Un scintillement excessif peut entraîner la formation de plus de bulles d’air.
2. Retournez chaque seringue sur l’emballage en plastique pour maintenir un champ stérile, avec l’extrémité de la seringue à l’intérieur de la partie scellée de l’emballage.
3. Ouvrez la cage et soulevez doucement le sujet par la base de la queue ou le tronc du corps, en fermant le couvercle de la cage pour empêcher les autres de sortir. Sélectionnez une méthode de détention parmi celles énumérées ci-dessous en fonction des préférences personnelles et de la réponse des animaux.
4. Utilisez la prise de style compression pour les rats adolescents en plaçant le sujet contre la région supérieure de la poitrine, le nez du sujet pointant vers le sol. Avant de commencer l’écouvillonnage, assurez-vous que le sujet est suffisamment comprimé pour empêcher le mouvement, mais qu’il est confortable et sûr dans la prise. Exposez le canal vaginal du sujet en fléchissant doucement la queue avant d’insérer la seringue.
5. Utilisez le lifting des pattes postérieures pour les rats adultes en plaçant les pattes antérieures de l’animal sur le dessus ou le côté de la cage, tandis que la queue et les membres postérieurs sont retenus avec une prise douce entre le premier et le deuxième doigt, laissant le pouce libre pour faire fonctionner la seringue⁶⁴.
6. Permettre aux animaux de s’acclimater à la manipulation et à la surveillance. Manipulez les animaux doucement mais en toute sécurité pour réduire l’excès de stress et protéger le chercheur contre les agressions telles que les morsures.
   REMARQUE: Les premiers jours de surveillance peuvent ne pas produire les résultats souhaités car les animaux s’acclimatent à leurs conditions. La manipulation des animaux pour collecter des poids corporels pendant la période d’acclimatation peut faciliter cette transition³³.
7. Tout en maintenant la seringue stable avec l’index et le majeur, insérez l’extrémité de la seringue (pas plus de 2 mm) à un angle parallèle au canal vaginal. Expulsez lentement le NaCl dans le canal en poussant le piston vers l’intérieur. N’insérez pas la seringue plus loin dans le canal, car cela pourrait perturber le cycle œstral.
8. Extrayez le NaCl du canal vaginal en tirant le piston de la seringue loin de la muqueuse épithéliale (vers le haut). S’il est difficile de garder le sujet dans la cale pendant ce processus, replacez-le dans la cage pendant une courte période de repos avant de tenter l’extraction du NaCl.
9. Une fois l’échantillon cellulaire prélevé, replacez le sujet dans la cage et répétez cette procédure pour chaque animal avant que tous les échantillons ne soient évalués au microscope.
   REMARQUE: Alternativement, chaque échantillon peut être collecté et évalué avant de passer à l’animal suivant. Un animal peut nécessiter un deuxième lavage si l’échantillon ne peut pas être catégorisé. La même seringue de la collecte initiale peut être réutilisée si elle n’entre pas en contact avec la solution saline directement dans le récipient et uniquement pour le même animal.

4. Évaluation de l’échantillon

1. Commencez la catégorisation en examinant l’échantillon de liquide vaginal extrait. Enregistrez la viscosité comme visqueuse ou non visqueuse et la coloration comme opaque ou transparente sur le document de description ou tout autre système d’enregistrement.
   REMARQUE : Cette section du protocole peut être effectuée au moment du prélèvement de l’échantillon ou ultérieurement.
2. Expulsez 2-3 gouttes du fluide sur une lame de microscope et placez un verre de couverture de microscope sur le dessus de la lame. Placez le verre de couverture sur la lame du microscope du haut de la lame vers le bas ou d’un côté de la lame à l’autre pour éviter la formation de bulles d’air. Si possible, laissez environ la moitié de l’échantillon prélevé dans la seringue si un examen plus approfondi est nécessaire et pour éviter qu’une quantité excessive de liquide ne soit placée sur la lame.
3. Localisez les cellules collectées en déplaçant la lame du microscope sur la scène. S’il y a trop peu de cellules ou une grande quantité de débris, expulser le liquide restant sur une nouvelle lame et réexaminer. Si la quantité d’échantillon laissée dans la seringue est insuffisante ou si la deuxième goutte présente des problèmes similaires, prélever un autre échantillon sur le sujet avant d’essayer d’identifier le stade du cycle œstral.
4. Une fois les cellules localisées et avant de toucher l’ordinateur ou le clavier de l’ordinateur, retirez le gant pour éviter de salir le clavier.
5. Obtenez des images des échantillons de cellules en cliquant sur la fonction intitulée Snap sur le côté gauche du panneau logiciel.
6. Ensuite, enregistrez le fichier en cliquant sur Enregistrer sous sous l’icône Fichier dans le coin supérieur gauche de la page. Enregistrez la photo sous un dossier pré-étiqueté sur l’ordinateur.
   REMARQUE: Exemple de modèle d’étiquette: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective lentille utilisée.
7. Prenez plus d’une photo à chaque objectif s’il n’y a pas beaucoup de cellules dans chaque cadre.
   REMARQUE: Exemples d’étiquettes pour plusieurs images: #1_01/09/2021_EST_4x1 et #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Répétez la procédure pour chaque échantillon prélevé sous plusieurs objectifs. Incluez au moins une objectivation plus petite, telle que 4x, et au moins une objectivation plus grande, telle que 20x.
9. Téléchargez les images sur un lecteur/dossier partagé ou un disque dur externe afin que tous les chercheurs impliqués aient accès aux fichiers et que des copies de sauvegarde soient disponibles.

5. Catégorisation des étapes

1. Configurez l’écran de l’ordinateur pour afficher simultanément les photos prises et la feuille d’enregistrement (Figure 4A-C).
   REMARQUE : Cela permettra à la documentation de se produire lors de l’affichage de l’échantillon collecté. Cette partie du protocole peut être complétée au moment du prélèvement de l’échantillon ou plus tard.
2. Déterminez quels types de cellules sont présents dans l’échantillon. Choisissez parmi les quatre options énumérées aux étapes 5.2.1 à 5.2.4 à l’aide des critères et consignez les résultats.
   1. Cellules épithéliales kératinisées anucléées (AKE)/épithéliales cornifiées
      1. Recherchez des cellules déchiquetées ou à bords angulaires, comme on le voit sur les figures 2B et 5C, qui, malgré l’absence de noyaux, peuvent montrer des zones rondes claires (fantômes nucléaires) à l’intérieur de la cellule qui représentent l’endroit où un noyau était autrefois présent. Utilisez un grossissement plus élevé, tel que 20x et plus, pour différencier ces cellules nucléées et anucléées.
      2. Utilisez un grossissement plus élevé pour distinguer la partie kératinisée ou cornifiée de la cellule – une fine couche de cellules dépourvues de noyaux et remplies de kératine – si vous le souhaitez.
         REMARQUE: En plus de leur aspect déchiqueté, ceux-ci peuvent également être distingués par la façon dont ils peuvent se plier ou se désassembler, créant des structures déchiquetées et allongées connues sous le nom de barres de kératine.
   2. Grandes cellules épithéliales nucléées (LNE)
      1. Recherchez ces cellules de forme généralement ronde à polygonale entourées de bordures irrégulières, déchiquetées ou angulaires.
      2. Observez comment leurs noyaux peuvent prendre diverses formes, allant de intactes à dégénérées ou pykontiques, liées à la condensation irréversible de la chromatine dans le noyau d’une cellule en cours de mort ou de détérioration, comme le montrent les figures 2B et 5D1,2. Prenez note de la façon dont ces noyaux occupent moins d’espace que le cytoplasme dans la cellule, avec un rapport nucléaire / cytoplasmique (N: C) inférieur à celui des petites cellules épithéliales. Recherchez les granules cytoplasmiques qui peuvent être vus à des grossissements plus élevés¹³.
   3. Leucocytes (LEU)/neutrophiles/cellules polymorphonucléaires
      1. Recherchez ces cellules sphériques compactes avec des noyaux multilobulés (d’où le nom de cellules polymorphonucléaires), qui disparaissent à mesure que la cellule mûrit (Figure 2B et Figure 5A). Un grossissement plus élevé (par exemple, 40x) peut être utilisé pour observer les noyaux multilobulés.
         REMARQUE: Lors de la collecte et de la préparation, ces cellules peuvent se condenser, se plier ou se rompre.
   4. Petites cellules épithéliales nucléées (SNE)
      1. Recherchez ces cellules de forme ronde à ovale qui sont plus grandes que les neutrophiles décrits ci-dessus.
      2. Observez les noyaux ronds de ces cellules épithéliales non kératinisées (Figure 2B), qui occupent une plus grande quantité d’espace que le cytoplasme à l’intérieur de la cellule, créant un rapport N:C plus élevé par rapport aux grandes cellules épithéliales.
         REMARQUE : Lors de la collecte et de la préparation, ces cellules peuvent se plier ou se chevaucher pour créer une forme qui ressemble à une chaîne ou à une barre, comme illustré à la figure 5B1.
3. Examinez comment les cellules présentes dans l’exemple sont organisées pour chaque objectivation. Utilisez l’objectivation inférieure, telle que 4x, pour afficher une vue représentative de la disposition globale des cellules. Indiquez si les cellules sont agglomérées (C), dispersées uniformément (DE) ou dispersées de façon aléatoire (RD) (voir la figure 4C) et notez l’organisation spécifique de chaque type de cellule (p. ex., les petites cellules épithéliales nucléées sont agglomérées et les neutrophiles sont répartis uniformément).
4. Ensuite, estimez et enregistrez visuellement la quantité totale de cellules (un smidge, modéré, nombreux) et les quantités de cellules individuelles (pourcentage de chaque type de cellule présent).
   REMARQUE : Un smidge représente le plus petit nombre de cellules présentes qui peuvent être utilisées pour déterminer la catégorisation de l’échantillon, beaucoup représentent la présence d’un nombre incalculable de cellules qui représentent la majeure partie, sinon la totalité, de l’espace sur la diapositive ou qui sont empilées les unes sur les autres, et un nombre modéré de cellules représente un nombre relativement moyen de cellules (exemples vus à la figure 5A-D et à la figure 6A-D).
5. Notez s’il y a des écarts par rapport aux critères énumérés ou aux aspects typiques du sujet spécifique dans la catégorie « anomalies » et consultez un vétérinaire si nécessaire.
6. Déterminez quelle étape du cycle œstral est présentée dans l’échantillon à l’aide des composants de catégorisation et des descriptions ci-dessous.
   1. Mourir
      1. Recherchez les LEU comme le type de cellule dominant ou unique présent, disposé de manière agglomérée au début de DIE mais plus dispersé dans les derniers stades.
         REMARQUE: Lors de la transition vers DIE, la quantité de cellules peut diminuer à mesure que les cellules épithéliales commencent à se décomposer, comme le montre la figure 6D1. Dans le même temps, le nombre d’UFE commence à augmenter et ils ont tendance à être disposés de manière agglomérée au départ et à se disperser au fil du temps.
      2. Notez que la quantité totale de cellules peut être relativement faible, le plus souvent dans les derniers stades de la période DIE, le deuxième ou le troisième jour.
      3. Observez la grande quantité de mucus qui peut être présente à ce stade, qui se présente sous forme de brins concentrés de LEU (Figure 5A1). Recherchez de petits amas ou des brins cellulaires de cellules SNE accompagnant les LEU pendant les phases tardives de la transition vers PRO (Figure 5A1,2).
      4. Observez l’aspect visqueux et opaque du liquide vaginal lors de la transition vers, de la transition complète vers et de la transition hors de DIE.
         REMARQUE: La durée moyenne de cette étape est de 48 h au cours d’un cycle de 4 jours et éventuellement de 72 h au cours d’un cycle de 5 jours.
   2. Pro
      1. Recherchez les cellules SNE comme cellules dominantes et les cellules LEUs, LNE et / ou AKE qui peuvent être vues en faible nombre. Utilisez une objectivation élevée pour observer l’aspect granulaire des cellules SNE qui sont généralement disposées en grappes, feuilles ou brins au cours de cette étape (Figure 5B1,2).
      2. Observez l’aspect visqueux et opaque du liquide vaginal lors du passage de DIE à PRO, et comment il devient non visible et transparent une fois complètement passé au stade PRO (durée moyenne de 14 h chez le rat).
   3. HNE
      1. Recherchez la dominance des cellules AKE, une diminution des cellules SNE dans l’EST et une augmentation du nombre et de la taille des cellules à mesure que l’EST se poursuit^11,13.
      2. Notez la caractéristique distinctive de la disposition souvent groupée des cellules AKE, sous la forme de barres de kératine ou contenant des noyaux fantômes, qui peuvent se disperser de manière plus aléatoire lors de la transition de PRO (Figure 6B) à MET (Figure 6C).
      3. Observez le liquide vaginal non visqueux et transparent caractéristique, auquel on peut s’attendre lorsque les rats font la transition vers, complètement transférés et sortis de l’EST.
         NOTE : La progression de l’EST comprend une grande diversification (Figure 5C et Figure 6B, C). Le stade se produit généralement pendant une moyenne de 24 heures dans un cycle de 4 jours ou peut-être 48 heures dans un cycle de 5 jours.
   4. Rencontrèrent
      1. Recherchez un nombre plus élevé de cellules SNE et LNE au fur et à mesure que le rat passe au MET, soit dominant en termes de proportion cellulaire dans le canal, soit presque égale à la proportion égale des LEU^11,13. De plus, notez la plus grande quantité de débris dans le MET et les transitions qu’à d’autres stades en raison de la désintégration des cellules épithéliales après l’EST et le passage dans DIE.
      2. Observez le manque d’arrangement cohérent au fur et à mesure que tous les types de cellules sont vus et en différentes quantités (Figure 5D1-3). Cependant, recherchez les LEU qui sont emballés ou agglutinés à proximité des cellules épithéliales dans les premiers stades qui peuvent revenir à l’arrangement aggloméré lors de la transition vers DIE.
      3. Observez l’aspect non visible et transparent du liquide vaginal à ce stade et le passage à un aspect plus visqueux et opaque lors du passage à DIE.
         REMARQUE: La durée moyenne de cette étape est de 6-8 h.
7. Étiquetez les échantillons dans les transitions avec l’étape vers laquelle le sujet se dirige, avec la transition entre parenthèses pour suivre quand ceux-ci sont collectés. De plus amples informations sur la façon de distinguer entre ces 4 étapes et leurs transitions peuvent être trouvées dans les résultats représentatifs.
   REMARQUE : Comme les échantillons prélevés sont statiques et que le cycle est dynamique, les diapositives peuvent représenter des transitions entre les étapes (voir la figure 6A-D).
8. Terminez ce processus pour chaque animal jusqu’à ce que la phase de surveillance soit terminée.
9. Le jour 11 (45 jours) ou le jour 21 (55 jours), euthanasier les rats avec 5% d’isoflurane et 2% d’oxygène avant une décapitation à la guillotine. Ces délais peuvent varier en fonction de la nature de l’étude.

Representative Results

Les données actuelles reflètent celles des adolescentes SD International Genetic Standardization Program (IGS) en présence de rats mâles SD. Ces animaux ont été localisés dans les laboratoires de l’Université Pepperdine et de l’UCLA dans le cadre d’une étude collaborative. La figure 5 présente de multiples variations des 4 étapes du cycle. Figure 5A1 a été identifié comme un échantillon de diestrus avec plusieurs types de cellules présentes. Cet exemple montre que les échantillons avec un plus grand nombre de cellules épithéliales sont qualifiés de diestrus lorsqu’ils répondent aux autres qualifications des composants de catégorisation, telles qu’une dominance des LEU. Cet échantillon a également démontré l’arrangement des brins de mucus composés de LEU souvent observés à ce stade, qui ressemble aux brins constitués de cellules SNE vus au stade PRO. Pour distinguer un brin de mucus au stade DIE des brins qui apparaissent au stade PRO constitués de cellules SNE, il est important d’identifier la dominance des LEU. La figure 5A2,3 montre une progression de l’agencement cellulaire souvent observée – un agglutination initiale des LEU qui collectent et se déplacent vers un décaissement aléatoire (RD) ou même un décaissement (ED) dans des échantillons prélevés dans les périodes ultérieures de l’étape DIE. Plus précisément, la figure 5A2 était un échantillon DIE avec de nombreuses cellules présentes. Cela reflète la façon dont les LEU peuvent également être accompagnées d’un nombre élevé de cellules épithéliales (Figure 5A1,2), distinguées du metestrus par une dominance des LEU et l’absence de barres de kératine. En revanche, la figure 5A3 démontre qu’un faible nombre total de cellules (un smidge) était couramment observé au cours de la phase ultérieure du stade DIE, par exemple au cours du deuxième ou du troisième jour. Au cours de l’étape PRO, les cellules SNE étaient fréquemment disposées en brins avec de nombreuses cellules empilées les unes sur les autres (Figure 5B1) ou un tas de cellules disposées en amas plus petits (Figure 5B2). La figure 5B3 illustre un échantillon PRO avec l’agglutination caractéristique en forme de feuille des cellules SNE qui se chevauchent et forment des barres qui pourraient être confondues avec les barres de kératine composées de cellules AKE présentes au stade EST. Pour distinguer les deux, il est important d’identifier la dominance des cellules SNE dans PRO et des cellules AKE dans EST.

La figure 5C1,2 illustre l’agglutination typique et le décaissement aléatoire des cellules AKE observées dans l’EST, la première comprenant de nombreuses cellules et la seconde un nombre modéré. Les noyaux fantômes, les formations de barres de kératine et les bactéries souvent collectées au cours de cette étape sont observés dans ces exemples. Les cellules SNE ont parfois été représentées au cours de l’étape EST (Figure 5C1) en tant que restes de l’étape PRO précédente. Le stade EST tardif, lorsque les cellules SNE commencent à émerger lorsque le sujet se dirige vers le MET, est souvent confondu avec le stade PRO. Pour distinguer les deux, il est important de prendre en compte la taille nucléaire. En général, les cellules nucléées de PRO ont un rapport N:C plus élevé. L’échantillon illustré à la figure 5C3 présentait un arrangement en forme de brin de nombreuses cellules AKE qui n’était pas considéré comme une caractéristique de l’étape EST. Cela démontre que chaque animal est unique, que des écarts par rapport aux critères peuvent se produire et que les déterminants de la catégorisation doivent être examinés en combinaison.

Pour faire la distinction entre EST et PRO lorsque des cellules SNE sont présentes, il a été observé qu’un rapport N:C plus faible s’est produit dans ces cellules au cours de la phase EST. Pour distinguer les barres de kératine présentes dans l’EST de celles formées par le chevauchement ou le roulement des cellules SNE au stade PRO (Figure 5B3) et celles formées par les cellules épithéliales en décomposition lors de la transition à partir de MET (Figure 6D1), il est important d’identifier le type de cellule dominante, la disposition et la quantité pour distinguer le stade représenté. Enfin, la figure 5D1,2 illustre la combinaison de tous les types de cellules présents dans le décaissement aléatoire représentant l’étape du MET. En plus des nombreuses cellules présentes dans ces exemples, il était courant de recueillir une plus grande quantité de débris au cours de cette étape (Figure 5D2) en raison de la désintégration des cellules épithéliales après l’EST et de la transition vers DIE avec une dominance de LEU qui fonctionnent pour nettoyer le canal vaginal des cellules épithéliales. La figure 5D2 montre également comment le MET peut être distingué du DIE par sa concentration plus élevée de cellules épithéliales et la présence de barres de kératine. Dans l’ensemble, ces représentations dépeignent le large spectre qui existe à l’intérieur de chaque étape et ne sont pas exhaustives.

Les représentations des 4 phases de transition sont illustrées à la figure 6. Bien que cette étude ait classé les échantillons en transition comme l’une des 4 étapes du cycle œstral, il reste important d’identifier correctement les phases de transition. Lors de la transition de DIE à PRO (Figure 6A), il y avait souvent une diminution globale du nombre d’EVP et une augmentation du nombre de cellules SNE. Les cellules LNE et AKE étaient parfois présentes dans cette transition, mais pas en grande quantité (Figure 6A1). La figure 6A2-4 illustre le nombre plus élevé de cellules SNE agglomérées et dispersées de manière aléatoire qui ont souvent été collectées au cours de cette transition, avec un faible nombre d’ULE dispersées de manière aléatoire et uniforme. Dans l’ensemble, en distinguant des autres stades de transition, il était important de noter la dominance des cellules SNE et le début des formations d’amas et de brins observés dans PRO. Tous les exemples de la figure 6A représentent un nombre de cellules nombreuses, à l’exception de la figure 6A4, avec un smidge. Dans la figure 6B, l’image montre un exemple de nombreuses cellules SNE et AKE agglomérées qui sont vues dans la transition de PRO à EST.

Au cours de cette transition, les cellules SNE sont plus nombreuses avec moins de décaissements agglomérés et plus aléatoires de cellules AKE que pendant l’EST. La figure 6C montre l’émergence d’AKE, SNE et LNE et la diminution des cellules AKE dans la transition de EST à MET avec un nombre élevé de cellules. Les débris présents représentent les cellules AKE en décomposition du stade antérieur de l’oestrus souvent observées dans le metestrus. Cela se voit également dans la phase finale de transition, de MET à DIE, où les cellules épithéliales ont commencé à se désintégrer et à produire des débris (Figure 6D1,2), avec de nombreuses cellules présentes dans la première et un nombre modéré dans la seconde. Ces chiffres montrent le phénomène de l’augmentation du nombre d’ULE pour devenir le type de cellule dominant dans la transition vers le diestrus. Pour le groupe surveillé pendant 20 jours (n = 3), il y a eu 12 jours où des échantillons de transition ont été prélevés, avec une moyenne de 4. Pour le groupe surveillé pendant 10 jours (n = 3), il y a eu 9 jours où des échantillons de transition ont été prélevés, avec une moyenne de 3.

La figure 7 représente des prélèvements d’échantillons cellulaires défavorables, dont la majorité justifiait des lavages répétés. La figure 7A1 montre une masse de cellules squameuses prélevées en raison d’une insertion et d’une extraction incorrectes de la seringue, ce qui provoque l’aspiration des cellules squameuses de la paroi du canal vaginal. Ces cellules peuvent être distinguées des cellules épithéliales agglomérées ou LEU en raison de la densité et de la compacité élevées de la masse et de ses bordures distinctives. La figure 7B représente une collection de débris, où soit aucune cellule n’a été extraite, soit le plan de mise au point est incorrect, soit la diapositive n’a pas été entièrement scannée à la recherche de cellules. Les débris peuvent être distingués des cellules par la familiarité avec les types de cellules et la petite taille et l’agglutination souvent distinctives. Ces débris proviennent souvent de la litière animale, des poils ou de la décomposition cellulaire. La figure 7C illustre une diapositive qui contient un nombre de cellules qui se trouve en dessous d’un smidge. Bien que de faibles nombres de cellules aient été fréquemment observés à la fin du MET et au début du DIE, il s’agit de lames qui ont trop peu de cellules pour être classées avec précision dans une étape.

La figure 7D montre deux exemples de la solution d’extraction de NaCl combinée avec du liquide vaginal du canal sur la lame du microscope. Dans la première image, figure 7D1, le fluide était présent et flou, obstruant la capacité de catégoriser avec précision. Dans la figure 7D2, le fluide était réparti sur la glissière en cercles cohésifs le long des LEU. Bien que cet exemple ne nécessite pas de lavage répété en raison de la présence élevée de cellules, il est important de tenir compte de la quantité de liquide placée sur la lame et de l’emplacement de la lame de couverture du microscope pour éviter les frottis. Dans l’ensemble, ces images soulignent l’importance de capturer des images représentatives de qualité pour une catégorisation appropriée. Cela inclut la prise en compte du mode d’extraction des cellules, du plan de mise au point et du contenu de l’image en scannant chaque diapositive avant de capturer une image.

Après avoir catégorisé chaque animal dans le(s) groupe(s) expérimental(s), il est courant de représenter graphiquement les progressions des étapes sur un graphique à barres ou linéaire. Cela permet aux chercheurs d’examiner le schéma de cycle global et d’identifier quand l’animal présente une progression irrégulière des stades œstral, connue sous le nom d’acyclicité. Les échantillons peuvent ensuite être analysés en fonction de la durée du cycle et du modèle de progression des étapes dans cet outil d’analyse. Illustré à la figure 8A, B, ce concept comprend l’attribution de barres de hauteurs variables, dans le cas de la présente étude, aux différentes étapes et la traduction des données enregistrées (figure 4B) sur l’axe des x. Dans ces exemples, MET et DIE sont représentés par le plus bas, PRO par le milieu et EST par les hauteurs de barre les plus hautes. En raison de la courte durée de l’étape MET, il est combiné avec l’étape DIE en une seule barre. Bien qu’il existe différentes méthodes de mesure de l’achèvement des cycles, il est courant de compter un cycle complet comme le mouvement d’un EST à un autre¹¹. Cependant, cela ne reflète pas l’achèvement d’un cycle, mais une durée d’étape est de 2 jours lorsqu’il y a des étapes est consécutives.

La figure 8A reflète les données d’un rat qui progresse à travers une progression constante et répétitive à travers MET/DIE, PRO et EST. De plus, ce rat se situait dans la plage des cycles de 4 à 5 jours à une longueur moyenne de 4,375. Chaque étape ne dépasse pas les plages normalisées de longueur, avec une moyenne de 1,0625 jour passé en HNE, une évaluation typique de l’acyclicité. Si les données extraites suivent ce schéma d’EST à EST avec régularité, cela confirme non seulement que les niveaux d’hormones du sujet sont restés dans des plages acceptables, mais aussi que la procédure a été menée sans interrompre de manière significative la nature cyclique du processus. Enfin, ce rat a effectué 16 cycles, déterminés en comptant le nombre de barres EST à EST.

La figure 8B représente les types courants d’acyclicité, y compris les stades étendus (considérés comme EXT) et non enregistrés. Cette figure souligne également l’importance d’examiner à la fois le cycle et la durée et le nombre de jours passés à chaque étape. Plus précisément, dans cet exemple, bien que la durée moyenne du cycle et le nombre de jours dans l’EST correspondent aux paramètres décrits, le modèle de cycle de progression du stade a révélé des anomalies. Par conséquent, il est important d’examiner le cycle œstral de manière exhaustive. Les étapes DIE étendue (étiquetée Comme Ext Diest) et EST (étiquetée comme Ext Est) ont été enregistrées tout au long des cycles illustrés dans la figure, et il y a eu plusieurs cycles où l’étape PRO n’a pas été enregistrée. Cet exemple démontre également l’importance d’examiner le nombre d’étapes consécutives observées, qui se situent en dehors des plages typiques, plutôt que d’examiner uniquement la durée moyenne du cycle et les jours en HNE, qui se situent dans des fourchettes typiques.

Les causes et les corrélations de ces exemples peuvent inclure des facteurs tels que des anomalies physiologiques (tumeurs, pseudo-grossesse, stress prolongé), des conditions environnementales nocives (éclairage prolongé, exposition à des produits chimiques toxiques, logement solitaire), un mauvais moment de prélèvement d’échantillons, une erreur de chercheur (mauvaise collecte d’échantillons, capture d’images, mise en scène incorrecte), des phénomènes liés à l’âge (irrégularité courante observée à l’adolescence et à la sénescence reproductive), ou des écarts uniques à la spécificité animal. Pour séparer l’erreur du chercheur ou le mauvais moment de la collecte de l’échantillon et les anomalies physiques ou les phénomènes liés à l’âge, il est utile d’examiner plus en détail les 4 composants de catégorisation. Cela peut aider à déterminer les causes possibles des irrégularités ou, dans un sens plus large, pourrait être utilisé dans des études qui étudient de plus près les caractéristiques du cycle œstral.

La figure 9 illustre cet examen plus approfondi en incluant les quantités totales et individuelles de cellules sur l’axe des y, le ou les types de cellules représentés par différentes couleurs de remplissage de barres et les dispositions de cellules représentées par différents modèles de remplissage de barres, représentés graphiquement sur l’ensemble de la période de surveillance. Cette méthode d’analyse a permis d’examiner plus en détail le nombre total de cycles terminés, la durée de chaque cycle, la progression des étapes et les composantes de catégorisation pour chaque rat. La figure 9A représente un rat qui a eu un nombre de cycles inférieur à la moyenne, avec un total de 3 cycles complets au cours des 10 jours surveillés - deux cycles de 3 jours et un cycle de 5 jours (moyenne de 3,67). L’irrégularité observée dans la progression du stade avec 50% des jours comprenait un ou plusieurs stades non enregistrés et 30% des échantillons prélevés étant en transition - le jour 2 en tant que MET-DIE, le jour 5 en tant que MET-MET et le jour 8 en tant que transition PRO-DIE. Cela pourrait être dû au mauvais moment de la collecte des échantillons, à une erreur du chercheur, à un phénomène lié à l’âge ou à des écarts uniques. Une surveillance plus poussée aurait pu permettre de préciser ce qui s’appliquait.

Les arrangements dominants typiques, les types de cellules et les quantités de cellules individuelles et totales ont été observés à chacune des étapes enregistrées. Au cours des stades est, on a observé une mouche des cellules AKE agglutinées (25 % des échantillons), modérée (25 % des échantillons) et nombreuse (50 % des échantillons), avec une présence plus faible de leUs, de SNE et de cellules LNE. Au cours de la seule étape MET capturée, une combinaison de nombreuses LEU dispersées au hasard (50 %), de cellules AKE (20 %), de cellules LNE (15 %) et de cellules SNE (15 %) était présente. Pour les stades DIE, une quantité de poussières (50 % des échantillons) et de nombreuses (50 % des échantillons) dispersées au hasard, uniformément dispersées, et une combinaison de LEU dominantes ont été observées entrecoupées de cellules AKE, LNE et SNE. Au cours de la seule étape PRO recueillie, une multitude de LEU dispersés au hasard (60 % des cellules présentes) et de cellules SNE (40 % des cellules présentes), qui étaient dans une combinaison d’arrangements, étaient présentes, ce qui représentait une transition de DIE à PRO.

Dans la figure 9B, le rat représenté avait un total de 3 cycles complets, avec un modèle de cycle de 4 jours. Les échantillons prélevés ne représentaient pas une progression d’étape cohérente, avec une période DIE prolongée (jours 6 à 9) et 5 autres cas d’étapes non enregistrées (2 étapes MET non enregistrées, 2 étapes PRO non enregistrées et 1 étape EST non enregistrée). Comme seulement 20 % des échantillons étaient en transition (jour 3 comme DIE-PRO, jour 5 comme EST-MET, jour 18 comme MET-DIE et jour 19 comme DIE-PRO), et seulement 3 étapes n’ont pas été enregistrées en dehors de l’étape MET et de la période DIE prolongée, il a été conclu que le moment du prélèvement de l’échantillon était approprié pour cet animal spécifique. Comme les 10 derniers jours surveillés comprenaient une progression ordonnée à travers les 4 étapes, les irrégularités initiales ont pu être attribuées à l’âge de l’adolescent. L’augmentation de la durée de surveillance (20 jours) a permis de tirer cette conclusion.

L’examen des composantes de catégorisation a révélé des fourchettes typiques. Les étapes de l’EST reflétaient une dominance d’une quantité modérée (50 % des échantillons) à une quantité nombreuse (50 % des échantillons) de cellules AKE agglomérées avec moins de LEU, de SNE et de cellules LNE. Dans les échantillons de MET prélevés, il y avait une combinaison d’ULE modérés (33,33 % des échantillons) à nombreux (66,67 % des échantillons) dispersés et agglutinés au hasard (avec une gamme de quantités de 10 à 90 %), d’ENS agglomérés (0 à 30 %), d’ANLs dispersés au hasard (0 à 10 %) et de cellules d’AKE agglutinées et dispersées au hasard (10 à 90 %). Les stades DIE reflétaient une dominance d’une quantité modérée (20%) à nombreuse (80% des échantillons) de LEU uniformément dispersées, dispersées au hasard et agglomérées (plage de 50 à 100%) en présence de cellules AKE et SNE dispersées au hasard. Les stades PRO ont été identifiés par la dominance d’une moucheron (3,33 % des échantillons) et de nombreuses (66,67 % des échantillons) quantité de cellules SNE (10-99 %) dispersées et agglomérées au hasard en présence de cellules LEU, AKE et LNE.

Une autre option lors de l’analyse des données extraites consiste à créer des profils de cycle œstral en incluant les éléments décrits précédemment : quantités totales et individuelles de cellules sur l’axe des y, type(s) de cellules représenté(s) par différentes couleurs de remplissage de barres et disposition(s) de cellules représentée(s) par différents modèles de remplissage de barres, représentés graphiquement sur la période de surveillance totale pour chaque étape du cycle. Cela peut être complété par rat ou par moyenne de l’ensemble du groupe. Le but de cet outil d’analyse est d’examiner les tendances des composantes de catégorisation par étape, ce qui aide l’ensemble de la communauté scientifique à caractériser les distinctions des composantes de catégorisation spécifiques aux catégorisations des étapes du cycle œstral. Dans la figure 10A1, le profil DIE sur 10 jours a montré une dominance d’une quantité modérée (50 % des échantillons) et nombreuse (50 % des échantillons) d’ULE uniformément dispersées (moyenne de 78,25 %) ainsi que moins de cellules SNE, AKE et LNE. Dans la figure 10A2, le profil diestrus de 20 jours présentait une dominance d’une quantité modérée (20 % des échantillons) et nombreuse (80 % des échantillons) d’ULE uniformément dispersées, agglutinées et dispersées de manière aléatoire (moyenne de 82 % présentes au cours des 10 jours) ainsi qu’un nombre plus faible de cellules AKE et SNE.

L’étape PRO présentée à la figure 10B1 a montré une dominance d’un nombre modéré de cellules SNE dispersées au hasard (60%) en présence de LEU et de cellules AKE. Le profil du stade PRO de 20 jours de la figure 10B2 a montré une dominance d’une moucheron (33,33 % des échantillons) et d’une quantité nombreuse (66,67 % des échantillons) d’une combinaison d’arrangements et de cellules SNE dispersées au hasard (moyenne de 66,33 % comme présent dans les 3 échantillons) aux côtés des LEU et des cellules AKE. Le profil EST sur 10 jours observé à la figure 10C1 présentait une dominance d’une quantité modérée (50 % des échantillons) ou d’une quantité nombreuse (50 % des échantillons) de cellules AKE (moyenne de 80 % pour les 2 jours présents) dans une combinaison d’arrangements, ainsi qu’un nombre plus faible de LEU, de SNE et de cellules LNE. Dans la figure 10C2, le profil EST sur 20 jours présentait une dominance de cellules modérées (75 % des échantillons) ou d’une quantité nombreuse (15 % des échantillons) de cellules AKE dispersées au hasard (moyenne de 57,5 % pour les 4 jours présents) ou celles dans une combinaison d’arrangements, ainsi qu’un nombre inférieur de cellules LEU, SNE et LNE.

Le profil du stade MET de 10 jours de la figure 10D1 comprenait de nombreuses LEU (50 %), cellules AKE (20 %) et SNE (30 %) dispersées au hasard. Le profil du stade MET de 20 jours de la figure 10D2 présentait une quantité modérée (3,33 % des échantillons) ou une quantité nombreuse (6,667 % des échantillons) d’ULE (moyenne de 50 % dans les 3 échantillons), d’ENS (moyenne de 15 % présents dans les 3 échantillons), de cellules AKE (avec 23,33 % dans les 3 échantillons présents), de cellules LNE (moyenne de 15 % dans les 2 échantillons présents). La moitié des LEU ont été dispersées au hasard (1 échantillon) et les 50 % restants étaient une combinaison d’arrangements (1 échantillon). Les deux tiers des cellules DEN ont été dispersées au hasard lorsqu’elles étaient présentes, tandis que les 33,33 % restants étaient dans une combinaison d’arrangements lorsqu’elles étaient présentes (1 échantillon sur 3). Enfin, 66,67% des cellules AKE ont été agglutinées dans les échantillons présents (2 jours), tandis que les 33,33% restants étaient dans une combinaison d’arrangements (1 jour). Le tableau 1 comprend les moyennes numériques des déterminants de la catégorisation des deux groupes. Bien que les données de la figure 9A, B et de la figure 10A-D comprennent des informations sur la catégorisation des déterminants des animaux individuels, ces tableaux incluent des moyennes pour le stade de l’oestrus à titre d’exemple. Lorsqu’ils sont reproduits dans d’autres laboratoires, ces paramètres pourraient devenir la norme pour l’identification des étapes. Ceci, à son tour, pourrait diminuer le niveau de subjectivité actuellement impliqué dans le processus de mise en scène.

Statistiques
En général, il y a quelques paramètres à prendre en compte lors de l’interprétation des caractéristiques du cycle, bien qu’il n’y ait pas de consensus sur ce qui est considéré comme « anormal » et que les écarts soient typiques. Goldman et al. identifient « régulier » comme un cycle de 4-5 jours avec 24-48 h EST et 48-72 h DIE étapes¹¹. La divergence par rapport à ces paramètres pourrait être due à divers facteurs, notamment une ou plusieurs anomalies physiologiques, un mauvais moment de collecte ou l’acyclicité initiale souvent ressentie par les rats adolescents à mesure que les niveaux d’hormones mûrissent. En plus de consulter le vétérinaire de laboratoire, de permettre une période de collecte des essais pour assurer un bon moment et de surveiller les animaux après l’adolescence pour établir un calendrier comparatif, les analyses statistiques peuvent être utiles pour attribuer la causalité et / ou la corrélation à toute anomalie. Après avoir caractérisé les cycles en catégories (p. ex., cohérent et anormal), une analyse du chi carré peut aider à comparer les groupes. De plus, les composantes de catégorisation ou les caractéristiques générales du cycle peuvent être comparées après l’intervention à l’aide de l’analyse de variance (ANOVA)¹¹. Cependant, de tels écarts peuvent ne pas être biologiquement significatifs, comme discuté dans l’introduction, et donc le contexte expérimental doit être pris en compte.

Figure 1: Rythmicité hormonale aux stades du cycle œstral. (A) Les différents niveaux d’hormones stéroïdes sexuelles au cours des étapes importantes du cycle œstral sont décrits et résumés. La progression de l’étape commence et se termine par le méestre pour démontrer les niveaux d’hormones de construction et la progression circulaire du processus. Adapté d’une source externe¹¹. (B) Flux d’hormones stéroïdes sexuelles du système nerveux central vers le système reproducteur via la circulation sanguine. On voit que les niveaux d’hormones sont augmentés par les signaux de l’hypothalamus et de l’hypophyse via l’hormone de libération des gonadotrophines (GrH ou LHRH) et la combinaison de l’hormone folliculo-stimulante et de l’hormone lutéinisante, respectivement. Cela inclut les boucles de rétroaction positives et négatives en fonction de la concentration d’œstradiol et de progestérone. Informations¹⁷ et images tracées à partir de sources externes 65,66,67. Abréviation : LHRH = hormone de libération de l’hormone lutéinisante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Cycle œstral catégorisant les déterminants mesurés. (A) Voici la liste des composants utilisés lors de la mise en scène des échantillons cellulaires prélevés et des composants dominants pour chaque étape. Il est important de se rappeler qu’il s’agit de paramètres généraux et que des différences sont attendues. (B) Voici les types de cellules dominantes présents à chaque étape. Bien qu’il s’agisse de divisions générales, chaque type de cellule peut être trouvé à toutes les étapes. (C) Voici les types d’arrangement cellulaire trouvés dans cette étude. (D) L’image ici reflète les quantités cellulaires typiques présentes dans chacune des 4 étapes du cycle œstral, le volume du quadrant représentant les quantités cellulaires approximatives. Provenant d’une source externe¹³ et précédemment adapté⁶⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Ouverture vaginale chez les rats Sprague Dawley. (A) Orientation anatomique des organes génitaux externes non développés et de l’ouverture vaginale qui mènent au canal vaginal par rapport à l’ouverture urétrale. (B) Représentation visuelle de la zone non développée, marquée par une flèche. (C) Orientation anatomique des organes génitaux externes développés et de l’orifice vaginal par rapport à l’ouverture urétrale, se produisant généralement vers l’âge de 34 jours. (D) Représentation visuelle correspondante de la zone développée décrite dans l’image A. Tous les chiffres proviennent d’une source externe²⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Modèle d’enregistrement des données des déterminants de la catégorisation. (A) Une option pour l’enregistrement des données; comprend des descriptions de la catégorisation des déterminants. Celui-ci doit être utilisé quotidiennement, un pour chaque rat surveillé. (B) Ce modèle est une option pour la saisie de données, avec un enregistrement simplifié des déterminants de catégorisation et l’identification des rats. Cela permet d’entrer des notes dans la fiche technique dans la deuxième catégorisation PRO. La couleur sur la ligne supérieure reflète la couleur attribuée au groupe expérimental représenté, ce qui permet de distinguer un groupe d’un autre. C) Une autre option de modèle; comprend tous les déterminants de la catégorisation et peut être modifié en fonction des préférences personnelles ou des objectifs de l’étude. Abréviations : AKE = épithélial kératinisé anucléé ; LEU = leucocytes; LNE = grand épithélial nucléé; SNE = petit épithélial nucléé; C = agglutiné; ED = uniformément dispersé; RD = dispersé au hasard; COM = combiné; SMD = smidge; MOD = modéré; NUM = nombreux; EXE = exercice; SED = sédentaire; Est = oestrus; Die = diestrus; met-die = transition metestrus-diestrus; Pro = proestrus; pro-Est = transition proestrus-oestrus; ** = exemple de qualité qui pourrait être utile dans une publication. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Variations déterminantes de la catégorisation par étapes. (A) Cette série d’images présente divers exemples de l’étape diestrus. La première image (A1) représente un dépôt de mucus représenté par des brins de LEU concentrés, avec des cellules épithéliales présentes dans des décaissements aléatoires. Ceci est un exemple de l’importance d’utiliser à la fois le grossissement 4x et 10x. Ce grossissement 4x semble similaire à un brin de proestrus mais en y regardant de plus près à 10x, affiche une dominance de LEU. La deuxième image (A2) représente ce qui a souvent été vu dans les stades diestrus - une dominance de LEU vus à côté d’un arrangement aggloméré de cellules épithéliales: cellules SNE, LNE et AKE. La dernière image de cette série (A3) reflète un décaissement aléatoire de LEU, souvent observé dans la phase diestrus au milieu de gouttelettes vaginales et de liquide salin. (B) Cette série d’images présente divers exemples du stade proestrus. La première image (B1) représente un arrangement agglomérant de cellules SNE en brins. La deuxième image (B2) reflète une diapositive avec un nombre total de cellules inférieur et un agglutination des cellules SNE. La troisième image (B3) illustre l’agglutination commune et le décaissement plus aléatoire des cellules SNE et le faible nombre de LEU et de cellules AKE. (C) Cette série d’images représente divers exemples du stade de l’œstrus. La première image (C1) représente un arrangement d’agglutination commun des cellules AKE, avec des formations de barres de kératine, en présence de cellules SNE. La deuxième image (C2) présente l’agglutination des cellules AKE avec des noyaux fantômes et des bactéries. La dernière image (C3) présente un arrangement en forme de brin de cellules AKE. (D) Cette série d’images présente divers exemples du stade du méestre. La première image (D1) représente le décaissement aléatoire et l’agglutination des LEU, des cellules SNE, des cellules AKE et des cellules LNE en présence de débris. La deuxième image (D2) reflète tous les types de cellules présentes dans un arrangement d’agglutination, à côté de barres de kératine. La dernière image (D3) montre un arrangement plus complet des leus, SNE, AKE et LNE cellules présentes. Ces chiffres, pris à 4x (A1, A2, B2, B3, D1 et D3) ou 10x (A3, C1, C2, C3 et D2) objectivation, ont été zoomés pour permettre une visualisation accrue des composants de catégorisation. Barres d’échelle = 100 μm. Pour référence de taille; Les cellules AKE ont un diamètre d’environ 40-52 μm, les LEU d’environ 10 μm, les cellules LNE de 36-40 μm et les cellules SNE d’environ 25-32 μm¹⁶. Abréviations : SNE = petit épithélial nucléé ; LNE = grand épithélial nucléé; AKE = épithélium kératinisé anucléé; LEUs = leucocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Exemples d’étapes de transition. (A) Cette série d’images illustre des exemples de transition entre les étapes DIE et PRO. La première image (A1) présente de grandes touffes et un décaissement aléatoire de leUs, de cellules SNE, LNE et AKE. La deuxième image (A2) comprend une grande masse de LEU agglomérés et de SNE avec des brins entrecoupés de LEU. La troisième image (A3) comprend des amas et même des décaissements d’ULE et une petite quantité d’END. La quatrième et dernière image (A4) représente à la fois des cellules SNE et des LEU agglomérées et décaissées aléatoirement. (B) Cette image illustre un exemple de transition entre les étapes PRO et EST avec l’agglutination des cellules SNE et AKE. (C) Cette image représente l’agglutination et le décaissement aléatoire de cellules AKE, SNE et LNE vues au milieu de débris pour représenter la transition de l’EST au MET. (D) La première image (D1) illustre un exemple de transition entre les stades MET et DIE, avec des cellules épithéliales en décomposition accompagnant une augmentation des LEU. La deuxième image (D2) représente des cellules AKE en présence de LEU agglomérés et de cellules SNE décrites précédemment. Ces chiffres, pris au grossissement 4x (A1, A2, A3, B et C) ou 10x (A4, D1 et D2), ont été zoomés pour permettre une visualisation accrue des composants de catégorisation. Barres d’échelle = 100 m. Pour référence de taille, les cellules AKE ont un diamètre d’environ 40-52 μm, les LEU d’environ 10 μm, les cellules LNE de 36-40 μm et les cellules SNE d’environ 25-32 μm¹⁶. Abréviations : AKE = épithélial kératinisé anucléé ; LEUs = leucocytes; LNE = grand épithélial nucléé; SNE = petit épithélial nucléé; C = agglutiné; EST = oestrus; DIE = diestrus; PRO = proestrus; MET = metestrus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Prélèvements d’échantillons cellulaires défavorables. (A) Dans ces deux images, des cellules squameuses ont été aspirées de la paroi du canal vaginal, en plus des LEU dispersées au hasard. (B) Cette image comprend une faible quantité de débris, où les cellules n’ont pas été vues ou n’ont pas été collectées. (C) Dans cet exemple, un nombre total de cellules faible a été observé. (D) Dans ces deux images (D1 et D2), la solution d’extraction au chlorure de sodium (NaCl) et le liquide vaginal ont été vus et répartis dans les lames du microscope. Ces chiffres, pris au grossissement 4x (A1, A2 et D1) ou 10x (B, C et D2), ont été zoomés pour permettre une visualisation accrue des composants de catégorisation. Barres d’échelle = 100 μm. Pour référence de taille, les cellules AKE ont un diamètre d’environ 40-52 μm, les LEU d’environ 10 μm, les cellules LNE de 36-40 μm et les cellules SNE d’environ 25-32 μm¹⁶. Abréviations : AKE = épithélial kératinisé anucléé ; LEUs = leucocytes; LNE = grand épithélial nucléé; SNE = petit épithélial nucléé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Échantillon de modèles de cycles réguliers et irréguliers. (A) Cette image reflète un total de 16 cycles complets qui progressent selon un schéma répétitif et cohérent, reflétant l’oscillation régulière des hormones stéroïdes sexuelles. À l’intérieur de cela, diestrus est représenté par le plus bas, proestrus par le milieu, et l’oestrus est représenté par la barre à la plus haute hauteur. Ces données sont analysées en suivant les jours entre les stades de l’œstrus, chaque oestrus représentant un cycle complet. Ces données reflètent les données des rats femelles hébergés à UCLA. (B) Cette image représente une combinaison théorique de divers modèles acycliques de 22 rats. L’œstrus étendu peut être vu avec plusieurs jours répétitifs de barres à pleine hauteur, des diestrus étendus vus avec plusieurs jours répétitifs de la hauteur de barre la plus basse, et l’absence du modèle cyclique de progression du diestrus au métestre. Abréviations: Est = oestrus; Diest/Die = diestrus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Déterminants individuels de la catégorisation. (A) Ce graphique à barres empilées reflète chaque composante des outils utilisés pour catégoriser les échantillons individuels prélevés aux stades de l’échantillon œstral. Ici, un sujet qui a été surveillé pendant 10 jours montre une variété de types de cellules, de quantités et d’arrangements. Ceci est attendu pour les animaux adolescents, car les niveaux hormonaux ne deviennent généralement pas constants ou ne se régularisent pas avant l’âge adulte. (B) Ici, un profil œstral est présenté pour un animal qui a été surveillé pendant 20 jours. Des irrégularités similaires peuvent être observées ici, où le sujet est resté dans diestrus pendant 4 jours contre 1-2 typique. Ces données représentent les 6 rats femelles hébergés à l’Université Pepperdine. Abréviations : AKE = épithélial kératinisé anucléé ; LEU = leucocytes; LNE = grand épithélial nucléé; SNE = petit épithélial nucléé; C = agglutiné; ED = uniformément dispersé; RD = dispersé au hasard; COM = combiné; SMD = smidge; MOD = modéré; NUM = nombreux; EXE = exercice ; SED = sédentaire; Est = oestrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus.

Figure 10 : Profils des stades. (A) Cette section illustre les données déterminantes de catégorisation pour les rats individuels au cours de chaque jour classés comme diestrus. La première image (A1) représente les données collectées sur 10 jours et la seconde (A2) pendant 20 jours. (B) Cette section présente des données pour des rats individuels au cours de chaque jour classés comme proestrus. La première image (B1) représente les données collectées sur 10 jours et la seconde (B2) pendant 20 jours. (C) Il s’agit de données pour des rats individuels au cours de chaque jour identifié comme stade de l’œstrus. La première image (C1) représente les données collectées sur 10 jours et la seconde (C2) pendant 20 jours. (D) Cette section de la série décrit les données sur les composants de catégorisation pour les rats individuels au cours de chaque jour identifié comme stade metestrus. La première image (D1) représente les données collectées sur une période de 10 jours et la seconde (D2) sur une période de 20 jours. Les données de ces chiffres reflètent celles de 6 rats femelles hébergés à l’Université Pepperdine. Abréviations : AKE = épithélial kératinisé anucléé ; LEU = leucocytes; LNE = grand épithélial nucléé; SNE = petit épithélial nucléé; C = agglutiné; ED = uniformément dispersé; RD = dispersé au hasard; COM = combiné; SMD = smidge; MOD = modéré; NUM = nombreux; EXE = exercice ; SED = sédentaire; Est = oestrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

HNE : 10 jours	Durée (jours)	AKE(%)	UFE (%)	LNE (%)	SNE (%)	Nombre total de cellules (%)
	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44.44 NUM: 44.44 SMD: 11.11
Gammes	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge–nombreux
	Arrangement	C: 50 DE: 0 Dt.P. : 50	C: 0 DE: 0 DR : 100	C: 0 DE: 0 DR : 100	C: 50 DE: 0 Dt.P. : 50
HNE : 20 jours	Durée (jours)	AKE(%)	UFE (%)	LNE (%)	SNE (%)	Nombre total de cellules (%)
	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 NUM: 50 SMD: 0
Gammes	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge–nombreux
	Arrangement	C: 60 DE : 6,67 Dt.P. : 33,33	C: 0 DE : 12,5 Dt.P. : 87,5	C: 33,33 DE: 0 Dt.P. : 66,67	C: 44,44 DE: 0 Dt.P. : 55,56

Tableau 1 : Échantillon moyen de déterminants d’étape. Ces tableaux présentent les moyennes des déterminants de catégorisation et une vue d’ensemble de toutes les étapes de l’EST recueillies. Le tableau supérieur reflète les moyennes pour tous les animaux surveillés pendant 10 jours et le tableau inférieur pendant 20 jours. Cela comprend la durée du cycle œstral, les types et pourcentages de cellules, les arrangements cellulaires et le pourcentage de chaque arrangement observé pour chaque type de cellule. Ces données reflètent les données de 6 rats femelles hébergés à l’Université Pepperdine. Abréviations : AKE = épithélial kératinisé anucléé ; LEU = leucocytes; LNE = grand épithélial nucléé; SNE = petit épithélial nucléé; C = agglutiné; ED = uniformément dispersé; RD = dispersé au hasard; EST = oestrus.

Discussion

Étapes clés et considérations importantes
Certaines étapes critiques du protocole fourni nécessitent une emphase, en particulier dans la collecte des cellules vaginales. Pendant l’extraction du liquide vaginal, il est essentiel de s’assurer de l’angle et de la profondeur appropriés de l’insertion de la seringue pour produire des résultats satisfaisants et, en fin de compte, prévenir l’irritation, les blessures ou la stimulation cervicale de l’animal. La stimulation du col de l’utérus peut être une source d’induction de pseudo-grossesse, indiquée par 12 à 14 jours d’un frottis vaginal leucocytaire uniquement¹¹. Pendant la phase d’évaluation au microscope, il est crucial de se concentrer sur le plan visuel affichant les cellules vaginales collectées. Ceci est complété en identifiant une ou deux cellules et en ajustant la visualisation jusqu’à ce que la mise au point soit atteinte.

Ensuite, la capture d’images représentatives des cellules vaginales pour la stadification se produit en scannant l’intégralité de la lame du microscope. Cela garantit que les images capturées reflètent une représentation précise de ce qui est collecté et présent dans le canal vaginal des animaux. Avant la catégorisation, une connaissance des déterminants de la catégorisation est nécessaire, comme la distinction des types de cellules et des différentes transformations que chaque type de cellule peut posséder. Il est recommandé que chaque participant soit correctement formé et pratique l’identification de l’étape au moyen de diapositives de pratique préparées à l’avance.

Pour réduire la quantité de biais et de subjectivité impliqués dans le processus, il est recommandé d’inclure deux participants dans la phase de catégorisation, tous deux restant aveugles aux affectations du groupe de traitement tout en connaissant les identifications d’étape précédemment enregistrées pour chaque animal. L’affectation de deux participants pour catégoriser les échantillons permet une conférence et une diminution de la subjectivité dans les identifications. Toutefois, si les participants doivent catégoriser les échantillons séparément, il est recommandé qu’il y ait une période de collaboration initiale pour accroître la fiabilité entre les évaluateurs à mesure que l’expertise est développée. Un système d’examen secondaire peut être utilisé pour éviter des résultats incohérents, tels que l’échange d’ensembles de données après la catégorisation et l’utilisation des photos pour confirmer les évaluations initiales.

Limitations et modifications
Les limites de la technique actuelle comprennent la durée de viabilité. En raison de la blessure ou de l’irritation qui pourrait accompagner l’insertion répétitive d’une seringue, la surveillance prolongée et récurrente ne correspond pas aux soins et à l’utilisation appropriés des animaux. Par conséquent, lors de la réalisation d’une étude longitudinale, il peut être nécessaire de modifier la procédure en diminuant la fréquence du lavage. Par exemple, plutôt que de surveiller chaque animal une fois par jour, les rats pourraient être divisés en groupes surveillés à différents jours de la semaine. Une deuxième limitation implique l’absence de coloration de l’échantillon dans le processus décrit, sans séparation des composants cellulaires par couleur, créant une plus grande dépendance aux déterminants de la catégorisation énumérés dans le protocole ci-dessus.

En outre, dans ces déterminants de catégorisation, il existe des éléments de subjectivité qui pourraient limiter la réplication précise. Plus précisément, les pourcentages de quantité de cellules dans les échantillons prélevés sont basés sur des estimations personnelles. Des modifications à cet égard pourraient inclure le développement d’un algorithme mathématique pour quantifier les types de cellules individuelles présentes. D’autres modifications pourraient inclure le nombre d’échantillons déposés sur une lame de microscope, qui pourrait être augmenté en fonction de la taille de la lame et de la couverture. D’autres limites pourraient inclure le manque de données sur les sécrétions vaginales dans cette étude – une modification des études futures pourrait inclure l’enregistrement des conditions du liquide vaginal recueillies comme contribution à la catégorisation des stades. D’autres modifications du protocole pourraient inclure l’utilisation d’un autre fluide isotonique pour l’extraction cellulaire, qui produirait les mêmes résultats, comme la solution saline¹³ tamponnée au phosphate. Enfin, lors de l’application de cette procédure à des rats d’âges ou de souches différents, des modifications telles que les techniques de manipulation des animaux peuvent être nécessaires en raison de la taille du corps ou du niveau d’activité. Cela peut inclure la méthode de préhension⁶⁹ et les méthodes Forelimb Crisscross⁶⁴ pour les adultes et la méthode de retenue à une et^{deux mains 64} utilisée pour les rats plus jeunes.

Méthodes alternatives
Comparé aux méthodes alternatives de surveillance du cycle œstral, le lavage vaginal est unique par sa précision, la quantité d’informations produites, le caractère invasif minimal et les faibles coûts associés. L’examen histologique de l’utérus et des ovaires peut être utilisé pour identifier les stades du cycle, mais il est plus intrusif et ne permet pas une surveillance continue. Bien que la mesure des niveaux d’hormones stéroïdes sexuelles aide à surveiller le cycle œstral, elle nécessite une collecte de sang et ne permet pas de caractériser le profil cellulaire ou vaginal unique de chaque sujet. Comme le développement des organes génitaux externes est indirectement corrélé avec les niveaux d’hormones stéroïdes sexuelles, l’examen de l’ouverture vaginale peut fournir des informations sur la maturation sexuelle. De plus, la coloration du tissu, le niveau d’humidité, la taille et le gonflement de l’ouverture vaginale ont été corrélés avec les stades du cycle œstral⁷⁰. Cependant, la physiologie précise conduisant à l’ouverture du canal vaginal chez le rat n’a pas encore été entièrement rapportée. Des publications récentes ont montré qu’il ne s’agit que d’un marqueur indirect du développement reproductif et qu’il ne correspond pas toujours à^la pubescence ^31,34. L’analyse biochimique des échantillons d’urine est rentable et facile à réaliser, mais ne permet pas la spécificité et la fiabilité des autres méthodes⁷¹. Par conséquent, ce n’est pas aussi fiable ou valide que l’examen des cellules présentes dans le canal vaginal.

De plus, la mesure de l’impédance électrique a été utilisée pour surveiller le cycle œstral et est moins irritante physiquement que le lavage liquide. Toutefois, cette méthode ne fournit pas autant d’informations sur les composants de catégorisation. Cet appareil est spécialement conçu pour optimiser le moment de l’accouplement intentionnel, en mesurant quand les niveaux d’hormones stéroïdes sexuelles sont les plus élevés ^72,73,74. De plus, il a été rapporté que cette méthode est efficace pour faire la distinction entre l’EST et le nonEST, mais qu’elle est limitée dans sa capacité à surveiller le cycle œstral en dehors de^{ce 75}. Dans l’ensemble, cette méthode n’est pas fiable, n’est pas toujours rentable et n’est pas souvent utilisée dans la littérature, ce qui entraîne un manque de données comparables⁷⁴. Bien que l’écouvillonnage vaginal soit le plus similaire au lavage dans les informations qu’il fournit, il comprend un risque accru d’irritation ou de blessure car il nécessite de contacter directement la muqueuse du canal vaginal pour récupérer les cellules. Enfin, bien que la coloration des lames du microscope puisse offrir un contraste plus net entre les types de cellules et permettre la conservation des échantillons, il s’agit d’une entreprise plus longue et plus coûteuse que la monture humide⁵³. Dans l’ensemble, chaque technique de surveillance a ses limites et ses avantages, et il pourrait être bénéfique d’utiliser une combinaison de ces méthodes pour recevoir un examen complet du cycle œstral des rongeurs.

Applications
Il demeure important de considérer l’étude actuelle dans le contexte de la communauté scientifique élargie et du grand public. Cette méthodologie peut être utilisée dans tout projet impliquant l’examen d’animaux femelles, non seulement dans le cadre d’études axées sur la reproduction intentionnelle, afin d’exclure les animaux présentant des anomalies et / ou la fonction de l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien, mais également pour obtenir des informations principales au sein des groupes de traitement. Plus précisément, cette procédure a un impact dans i) les études pharmacologiques, car divers médicaments et produits chimiques perturbent ou modifient l’appareil reproducteur et le cycle œstral 11,27,76; ii) les études neurologiques, telles que celles axées sur les lésions cérébrales traumatiques, la cognition ou les troubles dégénératifs, dues aux interactions entre les hormones stéroïdes sexuelles et le système nerveux⁷⁷; iii) la recherche sur le système circulatoire en raison des récepteurs hormonaux stéroïdiens sexuels situés sur les myocytes et des interactions ultérieures⁷⁷; iv) la recherche liée à la croissance osseuse³⁸; au système endocrinien ^11,78; et v) d’autres études non productives³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4