Gnaver estrous cyklus overvågning ved hjælp af vaginal skylning: Ikke sådan noget som en normal cyklus

Summary

Denne undersøgelse beskriver de afgørende faktorer, der skal overvejes i eksperimentelle designs, der involverer hunrotter. I en større forstand tjener disse data til at mindske stigmatisering og hjælpe med udviklingen af mere inkluderende diagnostiske og interventionsværktøjer.

Abstract

Den nuværende metode etablerer en reproducerbar, standardiseret og omkostningseffektiv tilgang til overvågning af den estrouscyklus hos kvindelige Sprague Dawley (SD) unge rotter. Denne undersøgelse demonstrerer kompleksiteten af hormonelle cyklusser og det brede spektrum af forståelse, der kræves for at konstruere en pålidelig og gyldig overvågningsteknik. Gennem en grundig undersøgelse af de vigtigste eksperimentelle design- og proceduremæssige elementer giver denne beskrivelse af cyklussen og dens grundlæggende principper en ramme for yderligere forståelse og dekonstruerer misforståelser til fremtidig replikation.

Sammen med en oversigt over prøveindsamlingsprocessen, der anvender vaginal skylning, beskriver proceduren mekanismen for datakategorisering i firetrinsmodellen af proestrus, østrus, metestrus og diestrus. Disse stadier er kendetegnet ved en ny foreslået tilgang, der anvender de 4 kategoriserende determinanter for vaginal væsketilstand, celletype (r) til stede, cellearrangement og cellemængde på indsamlingstidspunktet. Variationer af hvert trin, gunstige og ugunstige prøver, sondringen mellem cyklisk og acykliskitet og grafiske skildringer af de indsamlede kategoriseringskomponenter præsenteres sammen med effektiv fortolkning og organisatorisk praksis af dataene. Samlet set giver disse værktøjer mulighed for offentliggørelse af kvantificerbare dataområder for første gang, hvilket fører til standardisering af kategoriseringsfaktorer ved replikering.

Introduction

Nye bidrag
Gnaverens østrocyklus er blevet identificeret som en væsentlig indikator for velvære. Imidlertid hindrer ubevidste forstyrrelser af efterforskere og unøjagtige fortolkninger vedrørende den kvindelige krop det videnskabelige samfund. Selve etymologien af ordet "estrous" indebærer en følelse af underlegenhed og negativitet. Euripides brugte udtrykket til at beskrive en "vanvid" eller galskab, Homer til at beskrive panik og Platon til at beskrive en irrationel drift. Denne undersøgelse fremhæver, hvordan disse oprindelige perspektiver påvirker det nuværende videnskabelige samfund og adresserer disse bekymringer gennem et nyt mosaikparadigme - en opdateret kombination af tidligere studerede metoder, udvidet i omfang for en mere omfattende tilgang.

Undersøgelsen og brugen af denne teknik er for det første nødvendig, da der ikke er nogen standardiseret og omfattende overvågningsteknik, og datafortolkningspraksis kan være uklar. For det andet, selvom østrocyklusegenskaber er afhængige af individuelle rotter, der undersøges, er de ofte universaliserede. For det tredje, mens hormonelle cyklusser er rutinemæssige og gavnlige processer, er de omgivet af farlig stigmatisering udforsket i afsnittet 'Oversættelse til mennesker'. Denne undersøgelse har til formål at løse disse tre problemer på tre måder - (A) ved at beskrive en dybdegående østrøs cyklusovervågningsteknik og afklare, hvordan resultaterne kan fortolkes, (B) ved at skitsere metoder, der opretholder integriteten og individualiteten af hver cyklus, og (C) ved at henlede opmærksomheden på misforståelser, der opretholder udokumenterede praksis.

Denne undersøgelse er også unik i sit fokus på unge rotter, en periode præget af afgørende udviklingsændringer, der kaster lys over forskellige adfærdsmæssige, anatomiske og fysiologiske manifestationer i voksenalderen¹. Opbygning af et standardiseret eksperimentelt design til overvågning af hormoncyklusser i en underforsket population, samtidig med at almindelige forstyrrelser dekonstrueres, vil muliggøre udvikling af pålidelige og gyldige hormonelle korrelationer ^2,3,4 og bestemmelse af tilstandsafhængige cyklusforstyrrelser 5,6,7,8,9,10 . I sidste ende tjener disse nyheder til at udvide diagnostiske kriterier, behandlinger og interventioner af forskellige wellness-bekymringer.

Grundlæggende definitioner og anvendelser
Den østrøse cyklus er en samling af dynamiske fysiologiske processer, der forekommer som reaktion på de tre oscillerende kvindelige kønssteroidhormoner: østradiol, leuteiniserende hormon (LH) og progesteron (figur 1A, B). Interaktioner mellem det endokrine og centralnervesystemet regulerer cyklussen, som oftest vedvarer i 4-5 dage og gentager sig fra begyndelsen af seksuel modning til reproduktiv ældning og / eller ophør. Det er opdelt i separate kategorier baseret på hormonniveauer - oftest i de 4 faser af diestrus (DIE), proestrus (PRO), østrus (EST) og metestrus (MET), som udvikler sig på en cirkulær måde. Antallet af divisioner kan variere fra 3 trin¹¹ til 13 trin¹² afhængigt af undersøgelsens art¹³. Det lavere antal divisioner udelukker ofte MET som en fase og klassificerer det som en overgangsperiode af kort varighed. Det højere tal inkluderer typisk underafsnit, der giver mulighed for en nærmere undersøgelse af fænomener som tumorudvikling eller spontan pseudograviditet, den fysiologiske tilstand af graviditet uden embryonal implantation 12,14,15.

I denne undersøgelse blev stadierne identificeret gennem komponenter i vaginalkanalen, navngivet de 3 kategoriserende determinanter-celletype (r) til stede, cellearrangement og cellemængde (figur 2A-D). Mens tilstanden af vaginalvæsken ikke blev overvåget i denne undersøgelse, anbefales det at inkludere det som en fjerde kategoriseringskomponent. Yderligere oplysninger om undersøgelse af vaginalvæsken findes i referencelisten¹⁶. De kategoriserende komponenter kan undersøges ved at ekstrahere celler via vaginal skylning, den primære teknik, der anbefales i moderne østrocyklusovervågning. Mens de dybtgående fysiologiske processer inden for hvert trin ligger uden for rammerne af denne undersøgelse, kan flere oplysninger findes i litteraturen¹⁷.

Brugen og den fortsatte udvikling af denne østrocyklusovervågningsteknik er forankret i forbindelserne mellem kønssteroidhormoner og funktionen af kropslige systemer såsom det kardiovaskulære system¹⁸, endokrine system⁸ og centralnervesystemet 19,20,21. Samtidig er det ikke altid nødvendigt at overvåge østrocyklus, når hungnavere er involveret 22,23,24,25. Det er snarere vigtigt først at overveje, om kønsforskelle er blevet rapporteret inden for det specifikke undersøgelsesområde, som kan undersøges yderligere i offentliggjorte anmeldelser ^22,23. Selv om overvågning af skumringscyklus er afgørende i et bredt spektrum af forskningsundersøgelser, bør det ikke ses som en hindring for at inkludere hungnavere i forsøg. Selvom denne teknik kan virke kompleks og tidskrævende, kan selve proceduren tage mindre end 15 minutter at gennemføre, afhængigt af efterforskeren, og er omkostningseffektiv. Samlet set er inddragelsen af kvindelige gnavere i videnskabelige undersøgelser fordelagtig for forståelsen af kropslige systemer, forskellige tilstande og patologier og generel velvære, da denne udvikling hovedsageligt har været baseret på den mandlige kropsskabelon.

Universelle parametre og naturlige variationer i gnaveren
Etablering af intervaller for aspekter, der betragtes som "typiske", er nødvendig for at definere standardcyklusmønstre, indstille parametre til komparative og analytiske formål og detektere abnormiteter og outliers. Samtidig er det også vigtigt at erkende, at hver rottes cyklus er unik, og afvigelser baseret på dyrestamme, fysiologiske processer og miljøforhold forventes. Faktisk er et af de mest "normale" aspekter af den østrøse cyklus variabilitet. Dette ses i den samlede cykluslængde med et interval på 3-38 dage^26,27; alderen for seksuel modning, der kan variere fra 32-34 dage til flere uger 28,29,30; hvad der betragtes som acyklisk¹¹, og de kategoriserende determinantmønstre ^11,13. Samlet set er der ingen universel skabelon for den estrous cyklus, og at oversætte det til både det videnskabelige samfund og offentligheden er en vigtig del af den eksperimentelle proces.

Eksperimentelle tidspunkter og udviklingsalder
At anerkende dette princip om variabilitet hjælper med at opbygge et pålideligt og gyldigt eksperimentelt design. For eksempel er starten på overvågning af østrocykling afhængig af rotternes anatomiske og fysiologiske udvikling, som varierer afhængigt af miljømæssige og fysiologiske faktorer. Overvågning kan ikke begynde før udviklingen af vaginalåbningen (VO), som er den eksterne vaginale åbning omgivet af vulva, der fører til den indre del af vaginalkanalen (figur 3A-D). Mens VO ofte udvikler sig fuldt ud mellem 32 og 34 dage, forbliver den individualiseret til hvert emne, og meget om processen forbliver ukendt. Denne åbning er blevet brugt til at identificere begyndelsen af seksuel modning, som har været forbundet med stigningen i østradiol³¹, modningen af hypothalamus-hypofyse-ovarieaksen³² og den første ægløsning hos rotter 17,33,34,35. Nylige publikationer har imidlertid fundet ud af, at det kun er en indirekte markør for reproduktiv udvikling, da det kan blive afkoblet fra hormonelle og udviklingsmæssige forekomster i ugunstige miljøer³¹ og kan repræsentere ændringer i østradiolniveauer snarere end seksuel modning³³. Derfor anbefales det ikke udelukkende at stole på VO for at bestemme udviklingsalder og som en kvalifikation til overvågning af østruscyklus³⁶, men også at udnytte udseendet af det første EST-trin og cornificering af epitelcellerne³⁰ for at markere begyndelsen af seksuel modning.

Kropsvægt er især korreleret med udviklingsalder i ungdomsperioden hos gnavere^30,37 og kan derfor også hjælpe med at bestemme udviklingsalderen i denne periode. Foreslåede mekanismer relateret til dette fænomen omfatter stimulering af hormoner, der er nødvendige for reproduktiv udvikling, såsom væksthormon, og inhibering af hypothalamus-hypofyse adrenal (HPA) akse af appetitregulatoren, leptin³⁰. Det anbefales dog ikke at bruge denne foranstaltning som den eneste indikator for udviklingsalder på grund af den store varians, der ses mellem rotter på tværs af arter og leverandørudbydere³⁸. Den variation, der ses i udviklingen af VO og kropsvægt, eksemplificerer konceptets betydning i den samlede eksperimentelle proces.

Oversættelse til mennesker: kulturelle og videnskabelige sammenhænge
Det translationelle forhold mellem dyr-til-menneske reproduktive undersøgelser er tovejs. Resultaterne fra dyrebaserede undersøgelser påvirker, hvordan de menneskelige processer vurderes, nærmer sig og analyseres³⁹. Opfattelsen af det menneskelige reproduktive system og dets relaterede processer påvirker, hvordan dyr studeres. Faktisk stammer en af de højeste indikationer for yderligere forskning på dette område fra partiske sociokulturelle overbevisninger relateret til hormonelle cyklusser, der påvirker den videnskabelige proces. Mange af disse konventioner er afledt af en generel kulturel modvilje mod at diskutere menstruation, hvilket har ført til et datagab i velunderbygget viden ^40,41. Dette har et spektrum af konsekvenser, der spænder fra mindre til dødelig - fra reolhøjde og smartphonestørrelse til politiets kropspansertilpasning og ubesvarede kræftdiagnoser⁴².

Beskrivelsen af menstruation som uhygiejnisk, destruktiv og giftig - set i ærede tekster, medier, ordbøger og medicinsk lære - bevares af videnskabelige publikationer. Dette sker gennem unøjagtige og partiske beskrivelser af hormonelle cyklusser, isoleringen af reproduktionssystemet fra dets neuroendokrine modstykker og miljøpåvirkninger og det reduktionistiske perspektiv på afslutningen af en cyklus som en 'manglende undfangelse'43,44. Dette fører til skabelsen af usund eksperimentel praksis, såsom udeladelse af eksterne variabler, der påvirker hormonelle cyklusser, bestemmelse af start og endepunkter udelukkende baseret på anatomiske udviklinger og måling af cyklusfremskridt på en lineær snarere end cirkulær måde. På trods af den direkte sammenhæng mellem sociokulturelle faktorer og biologiske konsekvenser overvejes det ikke ofte i videnskabelig litteratur. Gennem inspektion af mere holistiske publikationer 43,44,45 kan forskere dekonstruere disse stigmas og skabe mere pålidelige og gyldige eksperimentelle designs.

Protocol

Alle håndterings- og proceduremetoder, der er beskrevet i denne protokol, er i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for dyrepleje og brug og er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Pepperdine University og UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC).

1. Pleje og brug af dyr

1. Erhverv hunrotter, i antal ifølge effektanalyse, og hanrotter for at fremme Whitten-effekten eller mere konsekvent cykling⁴⁶. Bestem stammen baseret på undersøgelsens formål i kendte databaser⁴⁷.
   BEMÆRK: De nuværende data afspejler det kvindelige unge SD International Genetic Standardization Program (IGS) i nærværelse af mandlige SD-rotter placeret på både Pepperdine University og UCLA laboratorier som en del af en samarbejdsundersøgelse. Disse rotter ankom i separate grupper ved 28 dages alderen, og den østrøse cyklusprogression blev overvåget i enten 10 eller 20 dage for at demonstrere forskelle på akutte og kroniske niveauer, begyndende ved 34 dage (efter en 7-dages akklimatiseringsperiode).
2. Før håndtering skal der gives mulighed for en karantæne og/eller en akklimatiseringsperiode for fysiologisk stabilisering efter transport og tilpasning til det nye miljø.
   BEMÆRK: En minimumsperiode på 3 dage er blevet citeret, med en 7-dages periode anbefalet 48,49,50,51,52. Samlet set afhænger dette af transportforholdene, dyrestammen og undersøgelsesmålene.
3. Sørg for, at stress reduceres ved brug af en akklimatiseringsperiode, da stress kan forstyrre korrekt reproduktionssystemfunktion⁵³. Overkompenser dog ikke ved at forsøge at eliminere det, da en moderat mængde stress er gavnligt for dyrenes velbefindende⁵¹.
4. Host rotter i et temperatur- (68-79 ° F, dvs. 20-26 ° C) og fugtighedskontrolleret (30-70%) miljø ved at kontakte vivarium- eller laboratorieledere og sikre disse funktioner. Distribuer vand og chow ad libitum med næringsstoffer, der er anført på virksomhedens hjemmeside og burrensning en gang om ugen.
   BEMÆRK: I denne undersøgelse blev rotterne anbragt i grupper på 2 adskilt af køn i 19 "x 10" x 8 "klare genanvendelige plastbure og havde adgang til corncob sengetøj, der blev skiftet en gang om ugen. Temperaturen blev opretholdt ved 70 ° F og fugtighed ved 35-79%, med et gennemsnit på 62%.
5. Kontroller for udviklingen af ringtail eller iskæmisk nekrose af hale og tæer for tegn på lave relative fugtighedsniveauer og ekstreme temperaturer, hvilket kan forårsage veksling af biologiske reaktioner.
   BEMÆRK: Temperatur og fugtighed er vigtige for reproduktionssystemet, seksuel modning og østrøs cykliskitet 54,55,56,57,58.
6. Sørg for korrekt og afbalanceret belysning i hele boligrummet ved at deponere lige store mængder lyskilder i hele laboratorierummet, der fungerer på et tidsstyret lys: mørkt system.
   BEMÆRK: Her blev en 12:12-timers lys:mørk cyklus, med lys tændt fra 06:00-18:00 h, styret af 2.550 lumen lineære LED-pærer.
7. Følg lux-kravene⁵² baseret på variationer af dyrs pigmentering, alder, stamme, køn og hormonelle status.
   BEMÆRK: Når forskere kategoriserer de indsamlede celleprøver, vil ensartet belysning give mulighed for korrekt visuel detektion og pålidelig iscenesættelse⁵⁹. Lysets varighed og intensitet er direkte relateret til reproduktionssystemet, seksuel modning og østrocykling 54,55,56,57,60,61.

2. Udstyr og forberedelse af forsøg

1. Gennemgå de kategoriserende determinanter (set i figur 2A): hvordan man identificerer hvert trin i den østrøse cyklus, og hvordan man betjener mikroskopet og kameraudstyret.
2. Sørg for, at hvert emne, der skal overvåges, har nået seksuel modning og viser passende indikatorer for udvikling - VO, kropsvægt og alder. Vej rotterne og undersøg dem for VO mellem på samme tidspunkt hver dag for nøjagtige sammenligninger og overfør dem med en godkendt håndteringsmetode. Kontakt den universitetstilknyttede dyrlæge, hvis et dyr mister mere end 20% af sin tidligere kropsvægt.
   BEMÆRK: VO forbliver kaudal til urinrørsåbningen og kranial til anus, der ligger mellem de to, som afbildet i figur 3.
3. Da disse faktorer er belastningsafhængige, skal du kontakte leverandøren for specifikationer og overveje miljøfaktorer, der er specifikke for laboratoriet⁶².
   BEMÆRK: Generelt vil dette forekomme mellem 32-34 dage og en gennemsnitlig kropsvægt på mellem 75-150 gram⁶³ for SD-rotter og er angivet med en cirkelformet åbning, der tidligere var dækket af en membranøs kappe.
4. Vælg en prøveindsamlingsperiode, der passer til den gruppe rotter, der overvåges, for at forhindre indsamling af overgangsprøver. Prøv først et par dyr på 2 eller 3 forskellige tidspunkter i løbet af dagen for at bestemme det tidspunkt, hvor de fleste cyklusstadier er til stede (f.eks. Prøveudtagning kl. 12:00, 13:00 og 14:00 timer for forskellige dyr). Fuldfør vaginal skylning på samme tid hver dag for konsekvent og pålidelig iscenesættelse.
   BEMÆRK: Det er blevet rapporteret, at timerne mellem 12:00 og 14:00 er bedst til at fange alle faser. I denne undersøgelse fandt overvågning af østrocyklus sted mellem kl. 12.00 og 14.00, håndteret med kompressionsstilhold (se trin 3.4). Betydningen af evaluering af østrocyklus i forhold til andre eksperimentelle interventioner (f.eks. adfærdsmæssig konditionering, medicin) er et forskningsområde under udvikling og kan undersøges yderligere¹¹. Bestemmelse af varigheden af overvågningen af den østlige cyklus er undersøgelsesafhængig og kan undersøges yderligere i offentliggjorte undersøgelser^11,33.
5. Fjern beskyttelsesdækslet fra mikroskopet, og fastgør kameraet til computeren ved at fjerne det beskyttende kameralinsedæksel og placere linsen over mikroskopets okular.
6. Åbn derefter den forudvalgte software på computeren. For at bruge den software, der er valgt i denne undersøgelse, skal du vælge det kamera, der er tilsluttet USB'en, der er placeret i venstre side af skærmen, under fanen mærket Kameraliste. Sørg for, at USB-kameraet er korrekt tilsluttet computeren, som vil læse Ingen enhed under fanen mærket Kameraliste, hvis ikke.
7. Når USB-kameraet er valgt under fanen, skal du tænde mikroskoplyskontakten placeret på basen.
8. Opret en mappe på den computer, der er beregnet til celleeksempelbillederne. Opret en filmappe for hver enkelt dag, hvor data indsamles, forberedt, før der tages billeder.
9. Når udstyret er klar, skal du hente forsøgspersonens bur fra dets opbevaringssted og bringe det til prøveindsamlingsstationen.

3. Indsamling af vaginale celler

1. Hent en engangssprøjte, og fyld hver af sprøjterne med 0,2 ml steril 0,9% NaCl. Hvis der er luftbobler, skal du forsigtigt svirpe cylindersprøjten, indtil alle luftbobler har nået sprøjtens åbne spids og udstøde luften. Hvis der stadig er luftbobler til stede, skal opløsningen hældes tilbage i NaCl-beholderen og genopfyldes, indtil der ikke er nogen.
   BEMÆRK: Overdreven svirpning kan resultere i dannelse af flere luftbobler.
2. Sæt hver sprøjte tilbage til plastindpakningen for at opretholde et sterilt felt med spidsen af sprøjten inde i den forseglede del af indpakningen.
3. Åbn buret og løft forsigtigt motivet ved enten bunden af halen eller kroppens bagagerum, luk låget på buret for at forhindre andre i at komme ud. Vælg en bedriftsmetode blandt dem, der er anført nedenfor, baseret på personlige præferencer og dyrenes reaktion.
4. Brug kompressionsstilgrebet til unge rotter ved at placere motivet mod det øverste brystområde med motivets næse pegende ned mod jorden. Før du begynder vatpinden, skal du sikre dig, at motivet er komprimeret nok til at forhindre bevægelse, men er behageligt og sikkert i lastrummet. Udsæt forsøgspersonens vaginalkanal ved forsigtigt at bøje halen, inden sprøjten indsættes.
5. Brug bagbensløftet til voksne rotter ved at placere dyrets forpoter på enten toppen eller siden af buret, mens halen og bagbenene fastholdes med et blidt greb mellem første og anden finger, så tommelfingeren er fri til at betjene sprøjten⁶⁴.
6. Lad dyrene akklimatisere sig til håndtering og overvågning. Håndter dyrene forsigtigt, men sikkert for at reducere overskydende stress og for at beskytte forskeren mod aggression såsom bid.
   BEMÆRK: De første par dages overvågning giver muligvis ikke de ønskede resultater, da dyrene akklimatiserer sig til deres forhold. Håndtering af dyrene for at indsamle kropsvægt i akklimatiseringsperioden kan hjælpe denne overgang³³.
7. Mens du holder sprøjten stabil med pegefingeren og langfingeren, skal du indsætte spidsen af sprøjten (højst 2 mm) i en vinkel parallelt med vaginalkanalen. Udvis langsomt NaCl i kanalen ved at skubbe stemplet indad. Indsæt ikke sprøjten længere ind i kanalen, da dette kan forstyrre østruscyklussen.
8. Udtræk NaCl fra vaginalkanalen ved at trække sprøjtens stempel væk fra epitelforingen (opad). Hvis der er problemer med at holde forsøgspersonen i lastrummet under denne proces, skal du sætte dem tilbage i buret i en kort hvileperiode, før du forsøger nacl-ekstraktion.
9. Når celleprøven er indsamlet, skal forsøgspersonen placeres tilbage i buret og gentages denne procedure for hvert dyr, før alle prøver evalueres under mikroskopet.
   BEMÆRK: Alternativt kan hver prøve indsamles og evalueres, inden den går videre til det næste dyr. Et dyr kan kræve en anden skylning, hvis prøven ikke kan kategoriseres. Den samme sprøjte fra den første indsamling kan genbruges, hvis den ikke kommer i kontakt med saltvandet direkte i beholderen og kun til det samme dyr.

4. Evaluering af stikprøver

1. Begynd kategoriseringen ved at undersøge den vaginale væskeprøve ekstraheret. Viskositeten registreres som enten tyktflydende eller ikke-synskøs, og farven som enten uigennemsigtig eller gennemsigtig på beskrivelsesdokumentet eller et andet registreringssystem.
   BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen kan udføres på tidspunktet for prøveindsamling eller senere.
2. Udstød 2-3 dråber af væsken på et mikroskopglas og læg et mikroskopdækselglas oven på diaset. Placer dækglasset på mikroskopglasset fra toppen af diaset til bunden eller fra den ene side af diaset til den anden for at forhindre dannelse af luftbobler. Hvis det er muligt, efterlades ca. halvdelen af den indsamlede prøve i sprøjten, hvis yderligere undersøgelse er påkrævet, og for at forhindre, at der anbringes en overskydende mængde væske på rutsjebanen.
3. Find de indsamlede celler ved at flytte mikroskopet glide over scenen. Hvis der er for få celler eller en stor mængde snavs, skal du udvise den resterende væske på et nyt dias og undersøge igen. Hvis mængden af prøve, der er tilbage i sprøjten, er utilstrækkelig, eller hvis den anden dråbe præsenterer lignende problemer, skal du indsamle en anden prøve fra forsøgspersonen, før du forsøger at identificere det estrouscyklusstadium.
4. Når cellerne er blevet placeret, og før du rører ved computeren eller computertastaturet, skal du fjerne den ene handske for at forhindre tilsmudsning af tastaturet.
5. Få billeder af celleprøverne ved at klikke på funktionen mærket Snap i venstre side af softwarepanelet.
6. Gem derefter filen ved at klikke på Gem som under ikonet Filer i øverste venstre hjørne af siden. Gem billedet under en forudmærket mappe på computeren.
   BEMÆRK: Eksempel på etiketskabelon: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective anvendte objektiv.
7. Tag mere end et billede ved hvert objektiv, hvis der ikke er mange celler i hver ramme.
   BEMÆRK: Eksempeletiketter til flere billeder: #1_01/09/2021_EST_4x1 og #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Gentag proceduren for hver indsamlet prøve under flere objektive linser. Medtag mindst én mindre objektivering, f.eks. 4x, og mindst én større objektivering, f.eks. 20x.
9. Upload billederne til et delt drev / mappe eller en ekstern harddisk, så alle involverede forskere har adgang til filerne, og der er sikkerhedskopier tilgængelige.

5. Trinkategorisering

1. Indstil computerskærmen til samtidig at se de fotos, der er taget, og optagelsesarket (figur 4A-C).
   BEMÆRK: Dette gør det muligt for dokumentationen at forekomme, mens du ser den indsamlede prøve. Denne del af protokollen kan udfyldes på tidspunktet for prøveindsamling eller senere.
2. Bestem, hvilke celletyper der er til stede i prøven. Vælg mellem de fire indstillinger, der er angivet i trin 5.2.1-5.2.4, ved hjælp af kriterierne, og registrer resultaterne.
   1. Anukleerede keratiniserede epitelceller (AKE)/cornified epitelceller
      1. Kig efter takkede eller kantede celler, som det ses i figur 2B og figur 5C, som på trods af manglen på kerner kan vise lyse runde områder (nukleare spøgelser) i cellen, der repræsenterer, hvor en kerne engang var til stede. Brug højere forstørrelse, såsom 20x og derover, til at skelne mellem sådanne nukleerede og anukleerede celler.
      2. Brug højere forstørrelse til at skelne den keratiniserede eller cornificerede del af cellen - et tyndt lag celler, der mangler kerner og fyldt med keratin - hvis det ønskes.
         BEMÆRK: Ud over deres takkede udseende kan disse også skelnes ved, hvordan de kan foldes eller adskilles, hvilket skaber takkede og aflange strukturer kendt som keratinstænger.
   2. Store nukleerede epitelceller (LNE)
      1. Se efter disse typisk runde til polygonale celler indkapslet af uregelmæssige, takkede eller kantede kanter.
      2. Observere, hvordan deres kerner kan antage forskellige former, lige fra intakte til degenererede eller pykontic, der vedrører den irreversible kondensation af kromatin i kernen i en celle, der gennemgår død eller forringelse, som vist i figur 2B og figur 5D1,2. Vær opmærksom på, hvordan disse kerner optager mindre plads end cytoplasmaet i cellen, med et lavere nukleart til cytoplasmisk (N: C) forhold end de små epitelceller. Hold øje med cytoplasmatiske granulater, der kan ses ved højere forstørrelser¹³.
   3. Leukocytter (LEUs)/neutrofiler/polymorfonukleære celler
      1. Kig efter disse kompakte, sfæriske celler med multilobulerede kerner (derfor kendt som polymorfonukleære celler), som forsvinder, når cellen modnes (figur 2B og figur 5A). Højere forstørrelse (f.eks. 40x) kan bruges til at observere de multilobulerede kerner.
         BEMÆRK: Ved indsamling og forberedelse kan disse celler kondensere, folde eller briste.
   4. Små nukleerede epitelceller (SNE)
      1. Hold øje med disse runde til ovale celler, der er større end de ovenfor beskrevne neutrofiler.
      2. Overhold de runde kerner af disse ikke-karatiniserede epitelceller (figur 2B), som optager en større mængde plads end cytoplasmaet inde i cellen, hvilket skaber et højere N: C-forhold i forhold til store epitelceller.
         BEMÆRK: Ved indsamling og forberedelse kan disse celler foldes eller overlappe hinanden for at skabe en form, der ligner en streng eller bjælke, som vist i figur 5B1.
3. Undersøg, hvordan cellerne i prøven er organiseret for hver objektivering. Brug den nederste objektivering, f.eks. 4x, til at få vist en repræsentativ visning af det overordnede cellearrangement. Registrer, om cellerne er klumpet sammen (C), jævnt dispergeret (ED) eller tilfældigt dispergeret (RD) (se figur 4C), og bemærk den specifikke organisation af hver celletype (f.eks. små nukleerede epitelceller klumpes, og neutrofiler fordeles jævnt).
4. Derefter skal du visuelt estimere og registrere den samlede cellemængde (en smidge, moderat, talrige) og de enkelte cellemængder (procentdel af hver celletype til stede).
   BEMÆRK: En smidge repræsenterer det mindste antal celler, der er til stede, der kan bruges til at bestemme prøvekategoriseringen, talrige repræsenterer tilstedeværelsen af et utalligt antal celler, der enten tegner sig for det meste, hvis ikke hele rummet på diaset eller er stablet oven på hinanden, og et moderat antal celler repræsenterer et forholdsvis gennemsnitligt antal celler (eksempler set i figur 5A-D og figur 6A-D).
5. Bemærk, om der er afvigelser fra enten de anførte kriterier eller aspekter, der er typiske for det specifikke emne i kategorien "abnormiteter", og rådfør dig om nødvendigt med en dyrlæge.
6. Bestem hvilket østroscyklustrin der præsenteres i prøven ved hjælp af kategoriseringskomponenterne og beskrivelserne nedenfor.
   1. Dø
      1. Se efter LEU'er som den dominerende eller eneste celletype, der er til stede, arrangeret på en klumpet måde i begyndelsen af DIE, men mere spredt i sene stadier.
         BEMÆRK: Under overgangen til DIE kan mængden af celler falde, når epitelcellerne begynder at nedbrydes, som det ses i figur 6D1. Samtidig begynder antallet af LEI'er at stige, og de har tendens til at blive arrangeret på en klumpet måde oprindeligt og sprede sig over tid.
      2. Bemærk, at den samlede mængde celler kan være forholdsvis lav, oftest i de senere stadier af DIE-perioden, på den anden eller tredje dag.
      3. Overhold den høje mængde slim, der kan være til stede i dette stadium, som præsenterer sig som koncentrerede tråde af LEUs (figur 5A1). Hold øje med små klumper eller cellulære tråde af SNE-celler, der ledsager LEU'erne i sene faser i overgangen til PRO (figur 5A1,2).
      4. Overhold det viskøse og uigennemsigtige udseende af vaginalvæsken, når du overgår til, fuldt overgået til og overgår ud af DIE.
         BEMÆRK: Den gennemsnitlige varighed af dette trin er 48 timer i løbet af en 4-dages cyklus og muligvis 72 timer i løbet af en 5-dages cyklus.
   2. Pro
      1. Se efter SNE-celler som de dominerende celler og efter LEU-, LNE- og / eller AKE-celler, der kan ses i lave tal. Brug høj objektivering til at observere det granulære udseende af de SNE-celler, der typisk er arrangeret i klynger, ark eller tråde i løbet af dette trin (figur 5B1,2).
      2. Overhold det viskøse og uigennemsigtige udseende af vaginalvæsken, når du bevæger dig fra DIE til PRO, og hvordan den bliver ikke-visuel og gennemsigtig, når den er fuldt overgået til PRO-stadiet (gennemsnitlig varighed på 14 timer hos rotter).
   3. Est
      1. Se efter dominans af AKE-celler, en formindskelse af SNE-cellerne i EST og en stigning i antallet og størrelsen af celler, da EST fortsætter^11,13.
      2. Bemærk det karakteristiske træk ved det ofte grupperede arrangement af AKE-celler i form af keratinstænger eller indeholdende spøgelseskerner, som kan blive mere tilfældigt spredt i overgangen fra PRO (figur 6B) og til MET (figur 6C).
      3. Overhold den karakteristiske ikke-vikarøse og gennemsigtige vaginale væske, som kan forventes, når rotterne overgår til, fuldt overgået til og overgår ud af EST.
         BEMÆRK: Udviklingen af EST omfatter meget diversificering (figur 5C og figur 6B, C). Scenen forekommer typisk i gennemsnit 24 timer i en 4-dages cyklus eller muligvis 48 timer i en 5-dages cyklus.
   4. Mødte
      1. Se efter højere antal SNE- og LNE-celler, da rotten overgår til MET, enten dominerende med hensyn til celleproportion i kanalen eller tæt på lige stor andel af^{LEU'erne 11,13}. Noter endvidere den større mængde affald i MET og overgangene end i andre faser på grund af epitelcelleforfaldet efter EST og bevæger sig ind i DIE.
      2. Overhold manglen på konsistent arrangement, da alle celletyper ses og i forskellige mængder (figur 5D1-3). Se dog efter de LEI'er, der er pakket eller klumpet i nærheden af epitelcellerne i begyndelsesfaserne, der kan vende tilbage til det klumpede arrangement, når de overgår til DIE.
      3. Overhold det ikke-vikarøse og gennemsigtige udseende af vaginalvæsken i dette stadium og ændringen til et mere tyktflydende og uigennemsigtigt udseende, mens du bevæger dig ind i DIE.
         BEMÆRK: Den gennemsnitlige varighed af dette trin er 6-8 timer.
7. Mærk prøver i overgange med det stadium, motivet bevæger sig mod, med overgangen i parentes for at spore, hvornår disse indsamles. Yderligere oplysninger om, hvordan man skelner mellem disse 4 faser og deres overgange, findes i de repræsentative resultater.
   BEMÆRK: Da de indsamlede prøver er statiske, og cyklussen er dynamisk, kan diasene vise overgange mellem faser (ses i figur 6A-D).
8. Afslut denne proces for hvert dyr, indtil overvågningsfasen er afsluttet.
9. På enten dag 11 (45 dage) eller 21 (55 dage) aflives rotterne med 5% isofluran og 2% ilt før en guillotin halshugning. Disse tidspunkter kan variere afhængigt af undersøgelsens art.

Representative Results

De nuværende data afspejler det kvindelige unge SD International Genetic Standardization Program (IGS) i nærværelse af mandlige SD-rotter. Disse dyr blev placeret på både Pepperdine University og UCLA laboratorier som en del af en samarbejdsundersøgelse. Figur 5 viser flere variationer af de 4 cyklusfaser. Figur 5A1 blev identificeret som en diestrus-prøve med flere celletyper til stede. Dette eksempel viser, at prøver med et større antal epitelceller kvalificerer sig som diestrus, når de opfylder de andre kategoriseringskomponentkvalifikationer, såsom en dominans af LEU'er. Denne prøve viste også slimstrengsarrangementet sammensat LEU'er, der ofte ses i dette trin, som ligner trådene bestående af SNE-celler, der ses i PRO-stadiet. For at skelne en slimstreng i DIE-stadiet fra de tråde, der forekommer i PRO-stadiet, der består af SNE-celler, er det vigtigt at identificere LEU'ernes dominans. Figur 5A2,3 viser en cellearrangementsprogression, der ofte observeres - en indledende sammenklumpning af LEU'erne, der indsamler og flytter til en tilfældig (RD) eller endda udbetaling (ED) i prøver indsamlet i senere perioder af DIE-stadiet. Specifikt var figur 5A2 en DIE-prøve med adskillige celler til stede. Dette afspejler, hvordan LEU'erne også kan ledsages af et stort antal epitelceller (figur 5A1,2), adskilt fra metestrus ved en dominans af LEU'er og fraværet af keratinstænger. I modsætning hertil viser figur 5A3 , at et lavt totalt celletal (en smidge) almindeligvis blev set i den senere fase af DIE-stadiet, såsom i løbet af den anden eller tredje dag. I PRO-fasen blev SNE-cellerne ofte arrangeret i tråde med adskillige celler stablet oven på hinanden (figur 5B1) eller en smule celler arrangeret i mindre klumper (figur 5B2). Figur 5B3 eksemplificerer en PRO-prøve med den karakteristiske arklignende klumpning af SNE-celler, der overlapper og danner stænger, der kan forveksles med keratinstængerne sammensat af AKE-celler, der er til stede i EST-stadiet. For at skelne mellem de to er det vigtigt at identificere dominansen af SNE-celler i PRO og af AKE-celler i EST.

Figur 5C1,2 viser den typiske sammenklumpning og tilfældige udbetaling af AKE-celler, der ses i EST, hvor førstnævnte omfatter adskillige celler og sidstnævnte et moderat antal. Spøgelseskerner, keratinstangformationer og bakterier, der ofte indsamles i løbet af dette stadium, ses i disse eksempler. SNE-celler var til tider repræsenteret i EST-fasen (figur 5C1) som rester af det foregående PRO-stadie. Det sene EST-stadie, hvor SNE-celler begynder at dukke op, når motivet bevæger sig mod MET, forveksles ofte med PRO-stadiet. For at skelne mellem de to er det vigtigt at tage hensyn til den nukleare størrelse. Generelt har de nukleerede celler i PRO et højere N: C-forhold. Prøven vist i figur 5C3 præsenterede et strenglignende arrangement af adskillige AKE-celler, der ikke blev set som et kendetegn ved EST-stadiet. Dette viser, at hvert dyr er unikt, at der kan forekomme afvigelser fra kriterierne, og at de kategoriserende determinanter skal undersøges i kombination.

For at skelne mellem EST og PRO, når SNE-celler er til stede, blev det set, at der opstod et lavere N: C-forhold i disse celler under EST-stadiet. For at skelne de keratinstænger, der er til stede i EST, fra dem, der dannes ved overlapning eller rullning af SNE-celler i PRO-stadiet (figur 5B3) og dem, der dannes af henfaldende epitelceller i overgangen fra MET (figur 6D1), er det vigtigt at identificere den dominerende celletype, arrangement og mængde for at skelne mellem det stadium, der repræsenteres. Endelig eksemplificerer figur 5D1,2 kombinationen af alle celletyper, der er til stede i den tilfældige udbetaling, der repræsenterer MET-stadiet. Ud over de mange celler, der var til stede i disse eksempler, var det almindeligt at indsamle en højere mængde affald i løbet af dette stadium (figur 5D2) på grund af henfaldet af epitelceller efter EST og overgangen til DIE med en dominans af LEU'er, der fungerer til at rydde vaginalkanalen af epitelceller. Figur 5D2 viser også, hvordan MET kan skelnes fra DIE ved sin højere koncentration af epitelceller og tilstedeværelsen af keratinstænger. Samlet set skildrer disse repræsentationer det brede spektrum, der findes inden for hvert trin og er ikke-udtømmende.

Repræsentationer af de 4 overgangsfaser er vist i figur 6. Mens denne undersøgelse kategoriserede prøver i overgang som et af de 4 østrøse cyklusstadier, er det fortsat vigtigt at identificere overgangsfaserne korrekt. I overgangen fra DIE til PRO (figur 6A) var der ofte et samlet fald i antallet af LEI'er og en stigning i antallet af SNE-celler. LNE- og AKE-celler var til tider til stede i denne overgang, men ikke i store mængder (figur 6A1). Figur 6A2-4 viser det højere antal klumpede og tilfældigt spredte SNE-celler, der ofte blev indsamlet under denne overgang, med et lavt antal tilfældigt og jævnt fordelte LEI'er. Samlet set var det vigtigt at bemærke DOMINANSEN AF SNE-celler og begyndelsen af klumper og strengformationer set i PRO, når man skelner fra andre overgangsstadier. Alle eksempler i figur 6A repræsenterer et talrigt celletal undtagen figur 6A4 med en smidge. I figur 6B viser billedet et eksempel på adskillige klumpede SNE- og AKE-celler, der ses i overgangen fra PRO til EST.

Under denne overgang ses SNE-celler at være i højere antal med mindre klumpede og mere tilfældige udbetalinger af AKE-celler end under EST. Figur 6C viser fremkomsten af AKE, SNE og LNE og faldet i AKE-celler i overgangen fra EST til MET med et stort antal celler. Det tilstedeværende affald repræsenterer de forfaldne AKE-celler fra det foregående østrusstadium, der ofte ses i metestrus. Dette ses også i den sidste overgangsfase, fra MET til DIE, hvor epitelcellerne begyndte at henfalde og producere affald (figur 6D1,2), med adskillige celler til stede i førstnævnte og et moderat antal i sidstnævnte. Disse tal viser fænomenet LEU'er, der stiger i antal for at blive den dominerende celletype i overgangen til diestrus. For gruppen overvåget i 20 dage (n = 3) var der 12 dage, hvor overgangsprøver blev indsamlet, med et gennemsnit på 4. For gruppen overvåget i 10 dage (n = 3) var der 9 dage, hvor overgangsprøver blev indsamlet, med et gennemsnit på 3.

Figur 7 repræsenterer ugunstige celleprøvesamlinger, hvoraf størstedelen berettigede gentagne skylninger. Figur 7A1 viser en masse pladeceller indsamlet på grund af en forkert sprøjteindsættelse og ekstraktion, hvilket får pladeceller til at blive suget ud af vaginalkanalvæggen. Disse celler kan skelnes fra klumpede epitelceller eller LEI'er på grund af massens høje densitet og kompaktitet og dens karakteristiske grænser. Figur 7B repræsenterer en samling af affald, hvor der enten ikke blev ekstraheret celler, fokusplanet er forkert, eller diaset ikke blev fuldt scannet for celler. Affald kan skelnes fra celler gennem kendskab til celletyperne og den ofte karakteristiske lille størrelse og klumpning. Dette affald stammer ofte fra dyrestrøelse, hår eller celleforfald. Figur 7C viser et dias, der indeholder et celleantal, der er under en smidge. Mens lave celletal almindeligvis blev set under sen MET og tidlig DIE, repræsenterer dette dias, der har for få celler til nøjagtigt at kategorisere i et stadium.

Figur 7D viser to eksempler på NaCl-ekstraktionsopløsningen kombineret med vaginal væske fra kanalen på mikroskopglasset. I det første billede, figur 7D1, var væsken til stede og ude af fokus, hvilket hindrede evnen til nøjagtigt at kategorisere. I figur 7D2 blev væsken spredt over diaset i sammenhængende cirkler sammen med LEUerne. Selvom dette eksempel ikke kræver en gentagen skylning på grund af den høje celletilstedeværelse, er det vigtigt at overveje mængden af væske placeret på diaset og placeringen af mikroskopdækslet for at forhindre udtværinger. Samlet set understreger disse billeder vigtigheden af at tage kvalitetsrepræsentative billeder for korrekt kategorisering. Dette inkluderer at overveje måden for celleekstraktion, fokusplanet og indholdet af billedet ved at scanne hvert dias, før du tager et billede.

Efter kategorisering af hvert dyr i forsøgsgruppen /-erne er det almindeligt at tegne trinprogressionerne på enten en søjle- eller linjegraf. Dette giver forskere mulighed for at undersøge det overordnede cyklusmønster og identificere, hvornår dyret præsenterer en uregelmæssig progression af de østrøse stadier, kendt som acyclicitet. Prøverne kan derefter analyseres af cykluslængden og trinprogressionsmønsteret i dette analyseværktøj. Vist i figur 8A,B omfatter dette koncept tildeling af søjler af varierende højde, i tilfælde af denne undersøgelse, til de enkelte faser og oversættelse af de registrerede data (figur 4B) over x-aksen. I disse eksempler er MET og DIE repræsenteret af den laveste, PRO i midten og EST af de højeste stanghøjder. På grund af met-stadiets korte varighed kombineres det med DIE-stadiet i en bjælke. Selvom der er forskellige metoder til måling af cyklusafslutninger, er det almindeligt at tælle en komplet cyklus som bevægelsen fra en EST til en anden¹¹. Dette afspejler dog ikke en cyklusafslutning, men en 2-dages EST-fasevarighed, når der er på hinanden følgende EST-faser.

Figur 8A afspejler data fra en rotte, der udvikler sig gennem en konsekvent og gentagen progression gennem MET / DIE, PRO og EST. Derudover faldt denne rotte inden for området 4- til 5-dages cyklusser med en gennemsnitlig længde på 4.375. Hvert trin overstiger ikke de standardiserede længdeintervaller med et gennemsnit på 1.0625 dage brugt i EST, en typisk evaluering for acyclicitet. Hvis de ekstraherede data følger dette mønster af EST til EST med regelmæssighed, bekræfter dette ikke kun, at forsøgspersonens hormonniveauer forblev inden for acceptable intervaller, men også at proceduren blev udført uden væsentligt at afbryde processens cykliske karakter. Endelig gennemførte denne rotte 16 cyklusser, bestemt ved at tælle antallet af EST til EST-barer.

Figur 8B repræsenterer almindelige typer af acykliskitet, herunder udvidede (set som EXT) og uregistrerede faser. Dette tal fremhæver også vigtigheden af at undersøge både cyklusmønsteret og længden og antallet af dage brugt i hvert trin. Specifikt i dette eksempel, mens den gennemsnitlige cykluslængde og antallet af dage i EST falder inden for skitserede parametre, afslørede cyklusmønsteret for trinprogression abnormiteter. Derfor er det vigtigt at undersøge den østrøse cyklus omfattende. Både udvidede DIE -stadier (mærket som Ext Diest) og EST (mærket som Ext Est) blev registreret gennem de cyklusser, der er vist i figuren, og der var flere cyklusser, hvor PRO -stadiet ikke blev optaget. Dette eksempel viser også vigtigheden af at undersøge antallet af på hinanden følgende stadier, der ses, som falder uden for typiske intervaller, snarere end udelukkende at undersøge den gennemsnitlige længde af cyklussen og dage i EST, som falder inden for typiske intervaller.

Årsagerne og korrelationerne af disse eksempler kan omfatte faktorer som fysiologiske abnormiteter (tumorer, pseudograviditet, langvarig stress), skadelige miljøforhold (langvarig belysning, eksponering for giftige kemikalier, ensom bolig), forkert timing af prøveindsamling, forskerfejl (dårlig prøveindsamling, billedoptagelse, forkert iscenesættelse), aldersrelaterede fænomener (almindelig uregelmæssighed set i ungdomsårene og reproduktiv ældning) eller afvigelser, der er unikke for den specifikke dyr. For at adskille forskerfejl eller forkert timing af prøveindsamling og fysiske abnormiteter eller aldersrelaterede fænomener er det nyttigt at undersøge de 4 kategoriserende komponenter mere detaljeret. Dette kan hjælpe med at bestemme de mulige årsager til uregelmæssigheder eller i bredere forstand kan bruges i undersøgelser, der studerer de østrøse cyklusegenskaber nærmere.

Figur 9 illustrerer denne nærmere inspektion ved at inkludere samlede og individuelle cellemængder på y-aksen, celletype(r) repræsenteret af forskellige søjlefyldfarver og cellearrangement(er) repræsenteret af forskellige søjlefyldningsmønstre, der er afbildet på tværs af den samlede overvågningsperiode. Denne analysemetode gjorde det muligt at undersøge det samlede antal afsluttede cyklusser, længden af hver cyklus, trinprogression og kategoriseringskomponenterne mere detaljeret for hver enkelt rotte. Figur 9A repræsenterer en rotte, der havde et lavere antal cyklusser end gennemsnittet, med i alt 3 fulde cyklusser i de 10 dage overvåget - to 3-dages cyklusser og en 5-dages cyklus (gennemsnit på 3,67). Uregelmæssigheden set i faseprogressionen med 50% af dagene omfattede et eller flere uregistrerede stadier, og 30% af de indsamlede prøver var i overgang - dag 2 som en MET-DIE, dag 5 som en EST-MET og dag 8 som en PRO-DIE-overgang. Dette kunne have været på grund af forkert timing af prøveindsamling, forskerfejl, et aldersrelateret fænomen eller unikke afvigelser. Yderligere overvågning kunne have skabt klarhed om, hvilken anvendelse der fandt anvendelse.

De typiske dominerende arrangementer, celletyper og individuelle og samlede cellemængder blev set inden for hvert af de registrerede stadier. Inden for EST-stadierne blev der set en smidge (25% af prøverne), moderat (25% af prøverne) og talrige (50% af prøverne) klumpede AKE-celler med en lavere tilstedeværelse af LEU-, SNE- og LNE-celler. I det ene MET-trin, der blev fanget, var en kombination af talrige tilfældigt dispergerede LEI'er (50%), AKE-celler (20%), LNE (15%) og SNE (15%) celler til stede. For DIE-stadierne blev der set en smidge (50% af prøverne) og talrige (50% af prøverne) mængde tilfældigt dispergeret, jævnt dispergeret og en kombination af dominerende LEU'er blandet med AKE-, LNE- og SNE-celler. I det ene PRO-trin, der blev indsamlet, var der en smule tilfældigt dispergerede LEU'er (60% af de tilstedeværende celler) og SNE-celler (40% af de tilstedeværende celler), som var i en kombination af arrangementer, hvilket repræsenterer en overgang fra DIE til PRO.

I figur 9B havde den repræsenterede rotte i alt 3 komplette cyklusser med et 4-dages cyklusmønster. De indsamlede prøver repræsenterede ikke en konsistent faseprogression med en forlænget DIE-periode (dag 6-9) og 5 andre forekomster af uregistrerede faser (2 uregistrerede MET-faser, 2 uregistrerede PRO-faser og 1 uregistreret EST-fase). Da kun 20% af prøverne var i overgang (dag 3 som DIE-PRO, dag 5 som EST-MET, dag 18 som MET-DIE og dag 19 som DIE-PRO), og kun 3 faser ikke blev registreret uden for MET-stadiet og den forlængede DIE-periode, blev det konkluderet, at tidspunktet for prøveindsamling var passende for dette specifikke dyr. Da de sidste 10 overvågede dage omfattede en ordnet progression gennem de 4 faser, kunne de indledende uregelmæssigheder tilskrives den unge alder. Jo længere længere overvågningsvarighed (20 dage) gjorde det muligt at drage denne konklusion.

Undersøgelsen af kategoriseringskomponenterne afslørede typiske intervaller. EST-stadierne afspejlede en dominans af en moderat (50% af prøverne) til en lang række (50% af prøverne) klumpede AKE-celler med færre LEU-, SNE- og LNE-celler. I de indsamlede MET-prøver var der en kombination af en moderat (33,33% af prøverne) til talrige (66,67% af prøverne) tilfældigt dispergerede og klumpede LEI'er (med et mængdeområde på 10-90%), klumpet SNE (0-30%), tilfældigt dispergeret LNE (0-10%) og klumpede og tilfældigt dispergerede AKE-celler (10-90%). DIE-stadierne afspejlede en dominans på en moderat (20%) til en talrige (80% af prøverne) mængde jævnt dispergerede, tilfældigt dispergerede og klumpede LEU'er (interval på 50-100%) i nærværelse af både tilfældigt dispergerede AKE- og SNE-celler. PRO-stadierne blev identificeret ved dominansen af en smidge (3,33% af prøverne) og talrige (66,67% af prøverne) mængde tilfældigt dispergerede og klumpede SNE (10-99%) celler i nærværelse af LEUs,AKE og LNE-celler.

En anden mulighed ved analyse af de ekstraherede data er oprettelsen af østruscyklusprofiler ved at inkludere de tidligere beskrevne elementer - samlede og individuelle cellemængder på y-aksen, celletype (r) repræsenteret af forskellige bjælkefyldfarver og cellearrangement (er) repræsenteret af forskellige søjlefyldningsmønstre, graferet over den samlede overvågningsperiode for hvert cyklustrin. Dette kan udfyldes pr. rotte eller gennemsnit af hele gruppen. Formålet med dette analyseværktøj er at undersøge kategoriseringskomponenttendenser pr. trin, hvilket hjælper det overordnede videnskabelige samfund med at karakterisere de kategoriserende komponentforskelle, der er specifikke for kategoriseringskategorierne for det østlige cyklusstadium. I figur 10A1 viste 10-dages DIE-profilen en dominans på en moderat (50% af prøverne) og talrige (50% af prøverne) mængde jævnt dispergerede LEI'er (gennemsnit på 78,25%) sammen med færre SNE-, AKE- og LNE-celler. I figur 10A2 udviste 20-dages diestrus-profilen en dominans på en moderat (20% af prøverne) og talrige (80% af prøverne) mængde jævnt dispergerede, klumpede og tilfældigt dispergerede LEU'er (gennemsnit på 82% som til stede i alle 10 dage) sammen med et lavere antal AKE- og SNE-celler.

PRO-stadiet udstillet i figur 10B1 viste en dominans på et moderat antal tilfældigt dispergerede SNE-celler (60%) i nærværelse af LEU-celler og AKE-celler. 20-dages PRO-trinprofilen i figur 10B2 viste en dominans af en smidge (33,33% af prøverne) og en talrige (66,67% af prøverne) mængde af en kombination af arrangementer og tilfældigt dispergeret SNE (gennemsnit på 66,33% som til stede i alle 3 prøver) celler sammen med LEU' og AKE-celler. 10-dages EST-profilen, der ses i figur 10C1 , udviste en dominans af en moderat (50% af prøverne) eller en talrige (50% af prøverne) mængde AKE-celler (gennemsnit på 80% for de 2 dage til stede) i en kombination af arrangementer sammen med et lavere antal LEU-, SNE- og LNE-celler. I figur 10C2 udviste 20-dages EST-profilen en dominans af moderate (75% af prøverne) eller en lang række (15% af prøverne) antal tilfældigt dispergerede AKE-celler (gennemsnit på 57,5% for de 4 dage til stede) celler eller dem i en kombination af arrangementer sammen med et lavere antal LEI'er, SNE- og LNE-celler.

10-dages MET-trinprofilen i figur 10D1 omfattede adskillige tilfældigt dispergerede LEI'er (50%), AKE (20%) celler og SNE (30%) celler. 20-dages MET-trinprofilen i figur 10D2 udviste en moderat (3,33% af prøverne) eller en talrig (6,667% af prøverne) mængde LEU'er (gennemsnit på 50% i alle 3 prøver), SNE (gennemsnit på 15% som til stede i alle 3 prøver), AKE-celler (med 23,33% i de 3 tilstedeværende prøver), LNE-celler (gennemsnit på 15% i alle 2 tilstedeværende prøver). Halvdelen af LEU'erne var tilfældigt dispergeret (1 prøve), og de resterende 50% var en kombination af arrangementer (1 prøve). To tredjedele af de udstationerede nationale ekspertceller blev tilfældigt dispergeret, når de var til stede, mens de resterende 33,33 % var i en kombination af arrangementer, når de var til stede (1 ud af 3 prøver). Endelig blev 66,67% af AKE-cellerne klumpet i de tilstedeværende prøver (2 dage), mens de resterende 33,33% var i en kombination af arrangementer (1 dag). Tabel 1 indeholder de numeriske gennemsnit af de kategoriserende determinanter fra de to grupper. Mens dataene i figur 9A, B og figur 10A-D indeholder oplysninger om kategoriseringsdeterminanter fra individuelle dyr, inkluderer disse tabeller gennemsnit for østrusstadiet som et eksempel. Når de gengives i andre laboratorier, kan disse parametre blive standarden for sceneidentifikation. Dette kan igen reducere niveauet af subjektivitet, der i øjeblikket er involveret i iscenesættelsesprocessen.

Statistik
Generelt er der et par parametre at overveje, når man fortolker cyklusegenskaberne, selvom der mangler konsensus om, hvad der betragtes som "unormalt", og afvigelser er typiske. Goldman et al. identificerer "regelmæssig" som en 4-5 dages cyklus med 24-48 h EST og 48-72 h DIE trin¹¹. Afvigelse fra disse parametre kan skyldes forskellige faktorer, herunder en eller flere fysiologiske abnormiteter, forkert indsamlingstidspunkt eller den indledende acykliskitet, der ofte opleves af unge rotter, når hormonniveauerne modnes. Ud over at konsultere laboratoriedyrlægen, muliggøre en forsøgsindsamlingsperiode for at sikre korrekt timing og overvåge dyr forbi ungdomsårene for at etablere en sammenlignende tidslinje, kan statistiske analyser være nyttige til at tilskrive årsagssammenhæng og / eller korrelation til eventuelle abnormiteter. Efter at have karakteriseret cyklusserne i kategorier (f.eks. Konsistent og unormal), kan en chi-square-analyse hjælpe med at sammenligne grupperne. Derudover kan kategoriseringskomponenterne eller de generelle cykluskarakteristika sammenlignes efter intervention ved hjælp af variansanalyse (ANOVA)¹¹. Sådanne afvigelser er dog muligvis ikke biologisk meningsfulde, som diskuteret i indledningen, og derfor skal den eksperimentelle kontekst overvejes.

Figur 1: Hormonetmicitet i østrøse cyklusstadier. (A) De varierende kønssteroidhormonniveauer under de fremtrædende østrocyklusstadier er skitseret og opsummeret. Faseprogressionen begynder og slutter med metestrus for at demonstrere bygningens hormonniveauer og den cirkulære progression af processen. Tilpasset fra en ekstern kilde¹¹. (B) Flow af kønssteroidhormoner fra centralnervesystemet til reproduktionssystemet via blodbanen. Det ses, at hormonniveauerne øges gennem signaler fra hypothalamus og hypofysen via gonadotropinfrigivende hormon (GrH eller LHRH) og kombinationen af henholdsvis follikelstimulerende hormon og luteiniserende hormon. Dette omfatter både positive og negative feedbacksløjfer afhængigt af koncentrationen af østradiol og progesteron. Information¹⁷ og billeder sporet fra eksterne kilder 65,66,67. Forkortelse: LHRH = luteiniserende hormonfrigivende hormon. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Østrøs cyklus kategorisering af determinanter målt. (A) Her er anført de komponenter, der anvendes ved iscenesættelse af de indsamlede celleprøver og de dominerende komponenter for hvert trin. Det er vigtigt at huske, at disse er generelle parametre, og der forventes forskelle. (B) Her er de dominerende celletyper, der er til stede i hvert trin. Selvom disse er generelle opdelinger, kan hver celletype findes inden for alle faser. (C) Præsenteret her er de cellearrangementstyper, der findes i denne undersøgelse. (D) Billedet her afspejler de typiske cellemængder, der er til stede i hvert af de 4 østrøse cyklustrin, hvor kvadrantvolumenet repræsenterer de omtrentlige cellemængder. Hentet fra en ekstern kilde¹³ og tidligere tilpasset⁶⁸. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Vaginal åbning i Sprague Dawley rotter. (A) Anatomisk orientering af de uudviklede ydre kønsorganer og vaginal åbning, der fører til vaginalkanalen i forhold til urinrørsåbningen. (B) Visuel repræsentation af det ubebyggede område, markeret med en pil. (C) Anatomisk orientering af de udviklede ydre kønsorganer og vaginal åbning i forhold til urinrørsåbningen, der typisk forekommer omkring 34 dage. (D) Tilsvarendevisuel repræsentation af det udviklede område skitseret i billede A. Alle tal stammer fra en ekstern kilde²⁹. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Kategorisering af determinanter dataregistreringsskabelon. (A) En mulighed for dataregistrering; indeholder beskrivelser af kategorisering af determinanter. Dette skal bruges dagligt, en for hver rotte, der overvåges. (B) Denne skabelon er en mulighed for dataindtastning med en forenklet registrering af kategoriseringsdeterminanterne og rotteidentifikation. Dette gør det muligt at indtaste noter i databladet i den anden PRO-kategorisering. Farven på den øverste række afspejler den farve, der er tildelt den repræsenterede eksperimentelle gruppe, hvilket hjælper med at skelne en gruppe fra en anden. (C) En anden skabelonmulighed; omfatter alle kategoriseringsdeterminanter og kan ændres baseret på personlig præference eller mål for undersøgelsen. Forkortelser: AKE = anukleeret keratiniseret epitel; LEU = leukocytter; LNE = stort nukleeret epitel; SNE = lille nukleeret epitel; C = klumpet; ED = jævnt fordelt; RD = tilfældigt spredt; COM = kombineret; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = talrige; EXE = motion; SED = stillesiddende; Est = østrus; Die = diestrus; met-die = metestrus-diestrus overgang; Pro = proestrus; pro-Est = proestrus-østrus overgang; ** = kvalitetseksempel, der kan være nyttigt i en publikation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Trinkategoriserende determinantvariationer. (A) Denne billedserie viser forskellige eksempler på diestrus-stadiet. Det første billede (A1) viser en aflejring af slim repræsenteret af tråde af koncentrerede LEI'er, med epitelceller til stede i tilfældige udbetalinger. Dette er et eksempel på vigtigheden af at udnytte både 4x og 10x forstørrelse. Denne 4x forstørrelse ligner en proestrusstreng, men ved nærmere inspektion ved 10x viser en dominans af LEU'er. Det andet billede (A2) viser, hvad der ofte blev set i diestrus-stadier - en dominans af LEI'er set sammen med et klumpet arrangement af epitelceller: SNE-, LNE- og AKE-celler. Det sidste billede i denne serie (A3) afspejler en tilfældig udbetaling af LEU'er, der ofte ses inden for diestrus-fasen midt i vaginale og saltvandsvæskedråber. (B) Denne billedserie viser forskellige eksempler på fremspringsstadiet. Det første billede (B1) viser et klumpende arrangement af SNE-celler i tråde. Det andet billede (B2) afspejler et dias med et lavere samlet celleantal og en sammenklumpning af SNE-celler. Det tredje billede (B3) viser den almindelige sammenklumpning og mere tilfældige udbetaling af SNE-celler og et lavt antal LEI'er og AKE-celler. (C) Denne billedserie viser forskellige eksempler på østrusstadiet. Det første billede (C1) viser et fælles klumparrangement af AKE-celler med keratinstangformationer i nærværelse af SNE-celler. Det andet billede (C2) præsenterer klumpning af AKE-celler med spøgelseskerner og bakterier. Det sidste billede (C3) præsenterer et strenglignende arrangement af AKE-celler. (D) Denne billedserie viser forskellige eksempler på metestrus-stadiet. Det første billede (D1) viser tilfældig udbetaling og sammenklumpning af LEU'er, SNE-celler, AKE-celler og LNE-celler i nærværelse af snavs. Det andet billede (D2) afspejler alle celletyper, der er til stede i et klumparrangement sammen med keratinstænger. Det sidste billede (D3) viser et mere omfattende arrangement af de tilstedeværende LEU-, SNE-, AKE- og LNE-celler. Disse tal, taget ved enten 4x (A1, A2, B2, B3, D1 og D3) eller 10x (A3, C1, C2, C3 og D2) objektivering, er blevet zoomet ind for at muliggøre øget visualisering af kategoriseringskomponenterne. Skalastænger = 100 μm. Til størrelse reference; AKE-celler har en diameter på ca. 40-52 μm, LEU'er på ca. 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm og SNE-celler på ca. 25-32 μm¹⁶. Forkortelser: SNE = lille nukleeret epitel; LNE = stort nukleeret epitel; AKE = anukleeret keratiniseret epitel; LEUs = leukocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Eksempler på overgangsfase. (A) Denne billedserie viser eksempler på overgangen mellem DIE- og PRO-stadierne. Det første billede (A1) viser store klumper og tilfældig udbetaling af LEI'er, SNE-, LNE- og AKE-celler. Det andet billede (A2) indeholder en stor masse klumpede LEU'er og SNE med spredte tråde af LEU'er. Det tredje billede (A3) omfatter klumper og endda udbetalinger af LEI'er og en lille mængde SNE'er. Det fjerde og sidste billede (A4) viser både klumpede og tilfældige udbetalte SNE-celler og LEI'er. (B) Dette billede viser et eksempel på overgangen mellem PRO- og EST-stadier med sammenklumpning af SNE- og AKE-celler. (C) Dette billede viser klumpning og tilfældig udbetaling af AKE-, SNE- og LNE-celler set midt i snavs for at repræsentere overgangen fra EST til MET. (D) Det første billede (D1) viser et eksempel på overgangen mellem MET- og DIE-stadierne med henfaldende epitelceller, der ledsager en stigning i LEU'er. Det andet billede (D2) viser AKE-celler i nærværelse af klumpede LEU'er og SNE-celler, der tidligere er beskrevet. Disse tal, taget ved enten 4x (A1, A2, A3, B og C) eller 10x (A4, D1 og D2) forstørrelse, er blevet zoomet ind for at muliggøre øget visualisering af kategoriseringskomponenterne. Vægtstænger = 100 m. Til størrelsesreference har AKE-celler en diameter på ca. 40-52 μm, LEU'er på ca. 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm og SNE-celler på ca. 25-32 μm¹⁶. Forkortelser: AKE = anukleeret keratiniseret epitel; LEUs = leukocytter; LNE = stort nukleeret epitel; SNE = lille nukleeret epitel; C = klumpet; EST = østrus; DIE = diestrus; PRO = fremestrus; MET = metestrus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Ugunstige celleprøvesamlinger. (A) I disse to billeder blev pladeceller suget fra vaginalkanalvæggen ud over tilfældigt dispergerede LEU'er. (B) Dette billede indeholder en lav mængde affald, hvor celler enten ikke blev set eller ikke indsamlet. (C) I dette eksempel blev der set et samlet lavt celletal. (D) I disse to billeder (D1 og D2) blev natriumchlorid (NaCl) ekstraktionsopløsningen og vaginalvæsken set og spredt gennem mikroskopets dias. Disse tal, taget ved enten 4x (A1, A2 og D1) eller 10x (B, C og D2) forstørrelse, er blevet zoomet ind for at muliggøre øget visualisering af kategoriseringskomponenterne. Skalastænger = 100 μm. Til størrelsesreference har AKE-celler en diameter på ca. 40-52 μm, LEU'er på ca. 10 μm, LNE-celler på 36-40 μm og SNE-celler på ca. 25-32 μm¹⁶. Forkortelser: AKE = anukleeret keratiniseret epitel; LEUs = leukocytter; LNE = stort nukleeret epitel; SNE = lille nukleeret epitel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Regelmæssig og uregelmæssig cykelmønsterprøve. (A) Dette billede afspejler i alt 16 komplette cyklusser, der skrider frem gennem et gentaget og konsistent mønster, hvilket afspejler den regelmæssige svingning af kønssteroidhormoner. Inden for dette er diestrus repræsenteret af den laveste fremspring i midten, og østrus er repræsenteret af stangen i den højeste højde. Disse data analyseres ved at spore dagene mellem østrusstadier, hvor hver østrus-til-østrus repræsenterer en fuld cyklus. Disse data afspejler data fra hunrotter, der er opstaldet på UCLA. (B) Dette billede repræsenterer en teoretisk kombination af forskellige acykliske mønstre af 22 rotter. Udvidet østrus kan ses med flere gentagne dage med stænger i fuld højde, forlængede diestrus set med flere gentagne dage med den laveste stanghøjde og fraværet af det cykliske mønster af progression fra diestrus gennem metestrus. Forkortelser: Est = østrus; Diest/Die = diestrus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: Individuel kategorisering af determinanter. (A) Dette stablede søjlediagram afspejler hver komponent i de værktøjer, der bruges til at kategorisere individuelle prøver indsamlet i de estrous prøvefaser. Her viser et emne, der blev overvåget i 10 dage, en række celletyper, mængder og arrangementer. Dette forventes for unge dyr, da hormonniveauerne typisk ikke bliver konsistente eller reguleres før voksenalderen. (B) Her præsenteres en østroprofil for et dyr, der blev overvåget i 20 dage. Lignende uregelmæssigheder kan ses her, hvor emnet forblev in diestrus i 4 dage mod den typiske 1-2. Disse data repræsenterer de 6 hunrotter, der er anbragt på Pepperdine University. Forkortelser: AKE = anukleeret keratiniseret epitel; LEU = leukocytter; LNE = stort nukleeret epitel; SNE = lille nukleeret epitel; C = klumpet; ED = jævnt fordelt; RD = tilfældigt spredt; COM = kombineret; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = talrige; EXE = motion ; SED = stillesiddende; Est = østrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus.

Figur 10: Trinprofiler. (A) Dette afsnit viser de kategoriserende determinantdata for individuelle rotter i løbet af hver dag kategoriseret som diestrus. Det første billede (A1) repræsenterer data indsamlet over 10 dage og det andet (A2) i 20 dage. (B) Dette afsnit viser data for individuelle rotter i løbet af hver dag kategoriseret som proestrus. Det første billede (B1) repræsenterer data indsamlet over 10 dage og det andet (B2) i 20 dage. (C) Dette viser data for individuelle rotter i løbet af hver dag, der identificeres som østrusstadiet. Det første billede (C1) repræsenterer data indsamlet over 10 dage og det andet (C2) i 20 dage. (D) Dette afsnit af serien viser de kategoriserende komponentdata for individuelle rotter i løbet af hver dag, der er identificeret som metestrusstadiet. Det første billede (D1) repræsenterer data indsamlet over en periode på 10 dage og det andet (D2) i 20 dage. Dataene i disse tal afspejler dataene for 6 hunrotter, der er anbragt på Pepperdine University. Forkortelser: AKE = anukleeret keratiniseret epitel; LEU = leukocytter; LNE = stort nukleeret epitel; SNE = lille nukleeret epitel; C = klumpet; ED = jævnt fordelt; RD = tilfældigt spredt; COM = kombineret; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = talrige; EXE = motion ; SED = stillesiddende; Est = østrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus. Klik her for at se en større version af denne figur.

EST: 10 dage	Varighed (dage)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	Udstationerede nationale eksperter (%)	Samlet celletal (%)
	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44,44 NUM: 44,44 SMD: 11,11
Områder	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge - talrige
	Arrangement	C: 50 RED: 0 Rd: 50	C: 0 RED: 0 Rd: 100	C: 0 RED: 0 Rd: 100	C: 50 RED: 0 Rd: 50
EST: 20 dage	Varighed (dage)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	Udstationerede nationale eksperter (%)	Samlet celletal (%)
	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 NUM: 50 SMD: 0
Områder	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge - talrige
	Arrangement	C: 60 Red:6,67 Rd: 33,33	C: 0 RED: 12,5 Rd: 87,5	C: 33,33 RED: 0 Rd: 66,67	C: 44,44 RED: 0 Rd: 55,56

Tabel 1: Prøve af gennemsnitlig fasedeterminant. Disse tabeller viser gennemsnittene for de kategoriseringsdeterminanter og oversigten for alle indsamlede EST-faser. Den øverste tabel afspejler gennemsnittet for alle dyr, der overvåges i 10 dage, og den nederste tabel i 20 dage. Dette inkluderer varigheden af den østrøse cyklus, celletyper og procentdele og cellearrangementer og procentdelen af hvert arrangement set for hver celletype. Disse data afspejler data fra 6 hunrotter, der er opstaldet på Pepperdine University. Forkortelser: AKE = anukleeret keratiniseret epitel; LEU = leukocytter; LNE = stort nukleeret epitel; SNE = lille nukleeret epitel; C = klumpet; ED = jævnt fordelt; RD = tilfældigt spredt; EST = østrus.

Discussion

Vigtige trin og vigtige overvejelser
Visse kritiske trin i den medfølgende protokol kræver vægt, især inden for indsamling af vaginale celler. Under vaginal væskeekstraktion er sikring af den rette vinkel og dybde af sprøjteindsættelse nøglen til at producere tilfredsstillende resultater og i sidste ende forhindre irritation, skade eller cervikal stimulering af dyret. Stimuleringen af livmoderhalsen kan være en kilde til pseudopregnancy induktion, indikeret ved 12-14 dage af en leukocyt-kun vaginal smear¹¹. Under mikroskopevalueringsfasen er det afgørende at fokusere på det visuelle plan, der viser de indsamlede vaginale celler. Dette afsluttes ved at identificere en eller to celler og justere visualiseringen, indtil fokus er opnået.

Herefter sker optagelse af repræsentative billeder af vaginalcellerne til iscenesættelse ved at scanne hele mikroskopets dias. Dette sikrer, at de optagne billeder afspejler en nøjagtig skildring af, hvad der er samlet og til stede i dyrenes vaginale kanal. Før kategorisering er det nødvendigt at være bekendt med de kategoriserende determinanter, såsom at skelne mellem celletyperne og de forskellige transformationer, som hver celletype kan have. Det anbefales, at hver deltager er korrekt uddannet og praktiserer sceneidentifikation gennem forberedte øvelsesdias.

For at reducere mængden af bias og subjektivitet, der er involveret i processen, anbefales det at inkludere to deltagere i kategoriseringsfasen, begge forbliver blinde for behandlingsgruppeopgaverne, mens de kender tidligere registrerede faseidentifikationer for hvert dyr. Tildeling af to deltagere til at kategorisere prøver giver mulighed for konference og et fald i subjektivitet i identifikationerne. Men hvis deltagerne skal kategorisere prøver separat, anbefales det, at der er en indledende samarbejdsperiode for at øge inter-rater pålidelighed, efterhånden som ekspertise udvikles. Et sekundært eksamenssystem kan anvendes til at forhindre inkonsekvente fund, såsom udveksling af datasæt efter kategorisering og brug af fotos til at bekræfte de indledende vurderinger.

Begrænsninger og ændringer
Begrænsninger af den nuværende teknik omfatter varigheden af levedygtighed. På grund af den skade eller irritation, der kan ledsage gentagen indsættelse af en sprøjte, stemmer langvarig og tilbagevendende overvågning ikke overens med korrekt pleje og brug af dyr. Derfor kan det være nødvendigt at ændre proceduren ved at reducere hyppigheden af skylningen ved at udføre en langsgående undersøgelse. For eksempel, i stedet for at overvåge hvert dyr en gang om dagen, kunne rotterne opdeles i grupper overvåget på forskellige dage i løbet af ugen. En anden begrænsning involverer fraværet af prøvefarvning i den skitserede proces uden adskillelse af cellulære komponenter efter farve, hvilket skaber en større afhængighed af de kategoriseringsdeterminanter, der er anført i protokollen ovenfor.

Derudover er der inden for sådanne kategoriseringsdeterminanter elementer af subjektivitet, der kan begrænse præcis replikation. Specifikt er cellemængdeprocenterne i de indsamlede prøver baseret på personlige skøn. Ændringer i denne henseende kunne omfatte udvikling af en matematisk algoritme til kvantificering af de enkelte celletyper, der er til stede. Alternative ændringer kan omfatte antallet af prøver, der er deponeret på et mikroskopglas, som kan øges afhængigt af størrelsen på diaset og dækslet. Yderligere begrænsninger kan omfatte manglen på vaginale væskedata i denne undersøgelse - en ændring af fremtidige undersøgelser kan omfatte registrering af betingelserne for vaginalvæsken indsamlet som et bidrag til fasekategorisering. Yderligere ændringer af protokollen kunne omfatte anvendelse af en anden isotonisk væske til celleekstraktion, hvilket ville give de samme resultater, såsom fosfatbufferet saltvand¹³. Endelig kan det være nødvendigt at foretage ændringer såsom dyrehåndteringsteknikker på grund af kropsstørrelse eller aktivitetsniveau, når denne procedure anvendes på rotter i forskellige aldre eller stammer. Dette kan omfatte gribemetoden⁶⁹ og Forben Crisscross^64-metoderne til voksne og en- og tohåndsbeholdelse^64-metoden , der anvendes til yngre rotter.

Alternative metoder
Sammenlignet med alternative metoder til overvågning af østrøscyklus er vaginal skylning unik i sin nøjagtighed, mængden af produceret information, minimal invasivitet og lave tilknyttede omkostninger. Den histologiske undersøgelse af livmoderen og æggestokkene kan bruges til at identificere cyklusstadier, men er mere påtrængende og tillader ikke løbende overvågning. Mens måling af kønssteroidhormonniveauerne hjælper med at overvåge den østrøse cyklus, det kræver blodindsamling og tillader ikke karakterisering af den unikke cellulære eller vaginale væskeprofil for hvert emne. Da udviklingen af eksterne kønsorganer er indirekte korreleret med kønssteroidhormonniveauer, kan undersøgelsen af vaginalåbningen give information om seksuel modning. Derudover er vævets farve, fugtighedsniveau, størrelse og hævelse af vaginalåbningen blevet korreleret med østrøstcyklusstadiet⁷⁰. Den præcise fysiologi, der fører til åbningen af vaginalkanalen hos rotter, er dog endnu ikke fuldt ud rapporteret. Nylige publikationer har fundet ud af, at dette kun er en indirekte markør for reproduktiv udvikling og ikke altid stemmer overens med pubescens^31,34. Den biokemiske analyse af urinprøver er omkostningseffektiv og let udført, men tillader ikke specificiteten og pålideligheden af andre metoder⁷¹. Derfor er det ikke så pålideligt eller gyldigt som at undersøge de celler, der er til stede i vaginalkanalen.

Derudover er måling af elektrisk impedans blevet brugt til at overvåge østrocyklusen og er mindre fysisk irriterende end væskeskylningen. Denne metode giver imidlertid ikke så meget information om kategoriseringskomponenterne. Denne enhed er specielt designet til at optimere timingen af forsætlig parring, måling, når kønssteroidhormonniveauer er højest 72,73,74. Derudover er det blevet rapporteret, at denne metode er effektiv til at skelne mellem EST og ikke-EST, men er begrænset i sin evne til at overvåge den østrøse cyklus uden for den⁷⁵. Samlet set er denne metode blevet rapporteret at være upålidelig, ikke altid omkostningseffektiv og anvendes ikke ofte i litteraturen, hvilket fører til mangel på sammenlignelige data⁷⁴. Mens den vaginale vatpind ligner mest skylningen i de oplysninger, den giver, inkluderer den en øget risiko for irritation eller skade, da det kræver at kontakte slimhinden i vaginalkanalen direkte for at hente celler. Endelig, mens farvning af mikroskopglasene kan give en skarpere kontrast mellem celletyper og give mulighed for prøvebevarelse, er det en mere tidskrævende og dyr indsats end den våde montering⁵³. Samlet set har hver overvågningsteknik sine begrænsninger og fordele, og det kan være gavnligt at bruge en kombination af disse metoder til at modtage en omfattende undersøgelse af gnaverens østrocyklus.

Programmer
Det er fortsat vigtigt at se den aktuelle undersøgelse i sammenhæng med det større videnskabelige samfund og offentligheden. Denne metode kan bruges i ethvert projekt, der involverer undersøgelse af hundyr - ikke kun inden for undersøgelser med fokus på forsætlig avl, for at udelukke dyr, der præsenterer abnormiteter og / eller funktionen af hypothalamus-hypofyse-ovarieaksen, men også for hovedindsigt inden for behandlingsgrupper. Mere specifikt er denne procedure effektiv inden for i) farmakologiske undersøgelser, da forskellige lægemidler og kemikalier forstyrrer eller ændrer reproduktionskanalen og østrocyklus 11,27,76; ii) neurologiske undersøgelser, såsom dem, der fokuserer på traumatiske hjerneskader, kognition, eller degenerative lidelser, på grund af interaktioner mellem kønssteroidhormoner og nervesystemet⁷⁷; iii) kredsløbsforskning på grund af kønssteroidhormonreceptorer placeret på myocytter og de efterfølgende interaktioner⁷⁷; iv) forskning relateret til knoglevækst³⁸; til det endokrine system^11,78; og v) andre ikke-produktive undersøgelser³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4