Monitoramento do ciclo estrous de roedores utilizando lavage vaginal: não existe tal coisa como um ciclo normal

Summary

Este estudo detalha os fatores cruciais a serem considerados em projetos experimentais envolvendo ratos fêmeas. Em um sentido maior, esses dados servem para diminuir o estigma e auxiliar no desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e intervenção mais inclusivas.

Abstract

A metodologia atual estabelece uma abordagem reprodutível, padronizada e econômica para monitorar o ciclo estrous de ratos adolescentes estrous fêmeas Sprague Dawley (SD). Este estudo demonstra a complexidade dos ciclos hormonais e o amplo espectro de compreensão necessário para a construção de uma técnica de monitoramento confiável e válida. Através de um exame aprofundado do desenho experimental principal e dos elementos processuais, esta descrição do ciclo e seus princípios fundamentais fornece um quadro para maior compreensão e desconstrói equívocos para replicação futura.

Juntamente com um esboço do processo de coleta de amostras empregando lavage vaginal, o procedimento descreve o mecanismo de categorização de dados no modelo de quatro estágios de proestrus, estrus, metestrus e diestrus. Essas etapas são caracterizadas por uma nova abordagem proposta, utilizando os 4 determinantes categorizadores da condição de fluido vaginal, tipo celular(s) presente, arranjo celular e quantidade celular no momento da coleta. Variações de cada estágio, amostras favoráveis e desfavoráveis, a distinção entre cíclica e acicllicidade e representações gráficas dos componentes categorizadores coletados são apresentadas juntamente com práticas interpretativas e organizacionais eficazes dos dados. No geral, essas ferramentas permitem a publicação de faixas de dados quantificáveis pela primeira vez, levando à padronização dos fatores de categorização após a replicação.

Introduction

Novas contribuições
O ciclo estrous de roedores tem sido identificado como um indicador essencial de bem-estar. No entanto, vieses inconscientes de investigadores e interpretações imprecisas sobre o corpo feminino dificultam a comunidade científica. A própria etimologia da palavra "estrous" implica um senso de inferioridade e negatividade. Eurípides usou o termo para descrever um "frenesi" ou loucura, Homer para descrever pânico, e Platão para descrever um impulso irracional. Este estudo destaca como essas perspectivas primitivas influenciam a comunidade científica atual e abordam essas preocupações através de um novo paradigma de mosaico — uma combinação atualizada de métodos previamente estudados, expandida em escopo para uma abordagem mais abrangente.

O estudo e o uso dessa técnica são necessários, em primeiro lugar, pois não há técnica de monitoramento padronizada e abrangente, e as práticas de interpretação de dados podem ser pouco claras. Em segundo lugar, embora as características do ciclo estrous dependam da estudo de ratos individuais, elas são muitas vezes universalizadas. Em terceiro lugar, enquanto os ciclos hormonais são processos rotineiros e benéficos, eles são cercados por estigmas perigosos explorados na seção "Tradução para Humanos". Este estudo tem como objetivo abordar essas três questões de três maneiras — (A) descrevendo uma técnica de monitoramento de ciclo estrous profunda e esclarecendo como os resultados podem ser interpretados, (B) delineando métodos que mantêm a integridade e a individualidade de cada ciclo, e (C) chamando a atenção para equívocos que perpetuam práticas infundadas.

Este estudo também é único em seu foco em ratos adolescentes, período marcado por mudanças cruciais de desenvolvimento que lançam luz sobre diversas manifestações comportamentais, anatômicas e fisiológicas na idade^{adulta 1}. A construção de um projeto experimental padronizado para monitorar ciclos hormonais em uma população sub-pesquisada, ao mesmo tempo em que a desconstrução de vieses comuns permitirá o desenvolvimento de correlações hormonais confiáveis e válidas ^2,3,4 e a determinação de interrupções do ciclo dependentes da condição ^5,6,7,8,9,10 . Em última análise, essas novidades servem para ampliar critérios diagnósticos, tratamentos e intervenções de várias preocupações com o bem-estar.

Definições e usos fundamentais
O ciclo estrous é uma coleção de processos fisiológicos dinâmicos que ocorrem em resposta aos três hormônios esteroides sexuais femininos oscilantes: estradiol, hormônio leuteinizador (LH) e progesterona (Figura 1A,B). As interações entre o sistema nervoso endócrino e central regulam o ciclo, que na maioria das vezes persiste por 4-5 dias e se repete desde o início da maturação sexual até senescência reprodutiva e/ou cessação. Ele é dividido em categorias separadas com base nos níveis hormonais — mais comumente nos 4 estágios de diestrus (DIE), proestrus (PRO), estrus (EST) e metestrus (MET), que progridem de forma circular. O número de divisões pode variar de 3 estágios¹¹ a 13 estágios¹², dependendo da natureza do estudo¹³. O menor número de divisões muitas vezes exclui o MET como um estágio e classifica-o como um período de transição de curta duração. O número maior normalmente inclui subseções que permitem uma inspeção mais aprofundada de fenômenos como desenvolvimento de tumores ou pseudopregnação espontânea, o estado fisiológico da gravidez sem implantação embrionária 12,14,15.

Neste estudo, os estágios foram identificados por meio de componentes do canal vaginal, denominados os 3 classificados de determinantes-células presentes, arranjo celular e quantidade celular (Figura 2A-D). Embora a condição do fluido vaginal não tenha sido monitorada neste estudo, recomenda-se incluí-lo como um quarto componente categorizador. Mais informações sobre o exame do fluido vaginal podem ser encontradas na lista de referência¹⁶. Os componentes categorizadores podem ser examinados extraindo células através de lavagem vaginal, a técnica primária recomendada no monitoramento do ciclo estrous moderno. Embora os processos fisiológicos aprofundados dentro de cada etapa estejam fora do escopo deste estudo, mais informações podem ser encontradas na literatura¹⁷.

O uso e o desenvolvimento contínuo desta técnica de monitoramento de ciclo estrous está enraizado nas conexões entre hormônios esteroides sexuais e a função de sistemas corporais como o sistema cardiovascular¹⁸, sistema endócrino⁸ e sistema nervoso central 19,20,21. Ao mesmo tempo, o monitoramento do ciclo estrous pode nem sempre ser necessário quando os roedores femininos estão envolvidos 22,23,24,25. Em vez disso, é importante primeiro considerar se as diferenças sexuais foram relatadas na área específica do estudo, o que pode ser ainda mais explorado nas revisões publicadas^22,23. Embora o monitoramento do ciclo estrous seja vital em um amplo espectro de investigações de pesquisa, não deve ser visto como um obstáculo para incluir roedores fêmeas em experimentos. Embora essa técnica possa parecer complexa e demorada, o procedimento em si pode levar menos de 15 minutos para ser concluído, dependendo do investigador, e é econômico. No geral, a inclusão de roedores femininos em estudos científicos é vantajosa para a compreensão dos sistemas corporais, das diversas condições e patologias e do bem-estar geral, uma vez que esses desenvolvimentos têm sido baseados principalmente no modelo corporal masculino.

Parâmetros universais e variabilidades naturais no roedor
Estabelecer faixas para aspectos vistos como "típicos" é necessário para definir padrões de ciclo padrão, definir parâmetros para fins comparativos e analíticos e detectar anormalidades e outliers. Ao mesmo tempo, também é importante reconhecer que o ciclo de cada rato é único, e são esperados desvios baseados em cepas animais, processos fisiológicos e condições ambientais. Na verdade, um dos aspectos mais "normais" do ciclo estrous é a variabilidade. Isso é visto no comprimento total do ciclo, com um intervalo de 3-38 dias^26,27; a idade de maturação sexual que pode variar de 32 a 34 dias a várias semanas 28,29,30; o que é considerado acíclico¹¹, e os padrões determinantes categorizadores ^11,13. No geral, não há um modelo universal para o ciclo estrous, e traduzir isso tanto para a comunidade científica quanto para o público em geral é uma parte importante do processo experimental.

Pontos de tempo experimentais e idade do desenvolvimento
Reconhecer esse princípio de variabilidade auxilia na construção de um design experimental confiável e válido. Por exemplo, o início do monitoramento do ciclismo estrous depende do desenvolvimento anatômico e fisiológico dos ratos, que varia de acordo com fatores ambientais e fisiológicos. O monitoramento não pode começar até o desenvolvimento da abertura vaginal (VO), que é o orifício vaginal externo cercado pela vulva que leva à porção interna do canal vaginal (Figura 3A-D). Embora o VO muitas vezes se desenvolva plenamente entre as idades de 32 e 34 dias, ele permanece individualizado para cada sujeito, e muito sobre o processo permanece desconhecido. Esta abertura tem sido utilizada para identificar o início do amadurecimento sexual, que tem sido associado ao aumento do estradiol³¹, ao amadurecimento do eixo hipotalâmica-pituitário-ovário³² e à primeira ovulação em ratos 17,33,34,35. No entanto, publicações recentes descobriram que é apenas um marcador indireto do desenvolvimento reprodutivo, pois pode se desacoplar de ocorrências hormonais e de desenvolvimento em ambientes desfavoráveis³¹ e pode representar mudanças nos níveis estradiol em vez de maturação sexual³³. Portanto, recomenda-se não depender apenas do VO para determinar a idade do desenvolvimento e como qualificação para o monitoramento do ciclo estrous³⁶, mas também utilizar o aparecimento do primeiro estágio EST e a cornificação das células epiteliais³⁰ para marcar o início da maturação sexual.

O peso corporal está notavelmente correlacionado com a idade de desenvolvimento durante o período adolescente em roedores^30,37 e, portanto, também pode auxiliar na determinação da idade do desenvolvimento nesse período. Os mecanismos propostos relacionados a esse fenômeno incluem a estimulação de hormônios necessários para o desenvolvimento reprodutivo, como o hormônio do crescimento, e a inibição do eixo adrenal hipotalâmico-pituitário (HPA) pelo regulador do apetite, a leptina³⁰. No entanto, não é recomendável utilizar essa medida como único indicador da idade do desenvolvimento devido à grande variância observada entre ratos entre espécies e fornecedores de fornecedores³⁸. A variabilidade observada no desenvolvimento do VO e do peso corporal exemplificam a importância do conceito no processo experimental global.

Tradução para humanos: contextos culturais e científicos
A relação translacional dos estudos reprodutivos animal-humano é bidirecional. Os resultados de estudos em animais influenciam a forma como os processos humanos são avaliados, abordados e analisados³⁹. A percepção do sistema reprodutivo humano e seus processos relacionados influenciam a forma como os animais são estudados. De fato, uma das indicações mais altas para novas pesquisas nessa área decorre de crenças socioculturais tendenciosas relacionadas a ciclos hormonais que influenciam o processo científico. Muitas dessas convenções são derivadas de uma aversão cultural geral à discussão da menstruação, o que levou a uma lacuna de dados no conhecimento bem fundamentado^40,41. Isso tem um espectro de consequências que vão de menor a letal — desde altura de prateleira e tamanho do smartphone até a montagem da armadura da polícia e diagnósticos de câncer perdidos⁴².

A descrição da menstruação como insalubre, destrutiva e tóxica — vista em textos reverenciados, mídia, dicionários e ensinamentos médicos — é conservada por publicações científicas. Isso ocorre através de descrições imprecisas e tendenciosas de ciclos hormonais, o isolamento do sistema reprodutivo de suas contrapartes neuroendócrinas e influências ambientais, e a perspectiva reducionista da conclusão de um ciclo como uma "falha na ^{concepção"43,44}. Isso leva à criação de práticas experimentais insalubres, como a omissão de variáveis externas que influenciam os ciclos hormonais, determinando os pontos de partida e os pontos finais baseados apenas em desenvolvimentos anatômicos e medindo o avanço do ciclo de forma linear e não circular. Apesar da correlação direta entre fatores socioculturais e consequências biológicas, muitas vezes não é considerada na literatura científica. Através da inspeção de publicações mais holísticas 43,44,45, os pesquisadores podem desconstruir esses estigmas e criar projetos experimentais mais confiáveis e válidos.

Protocol

Todos os métodos de manuseio e procedimento descritos neste protocolo estão alinhados com as diretrizes de cuidados e uso de animais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Pepperdine University e pelo Comitê de Pesquisa Animal (ARC) do Chanceler da UCLA.

1. Cuidados e uso de animais

1. Adquirir ratos fêmeas, em números de acordo com a análise de energia, e ratos machos para promover o efeito Whitten ou ciclismo mais consistente⁴⁶. Determinar a cepa com base no objetivo do estudo em bancos de dados conhecidos⁴⁷.
   NOTA: Os dados atuais refletem o do Programa Internacional de Padronização Genética (IGS) da adolescente na presença de ratos SD masculinos localizados nos laboratórios da Pepperdine University e da UCLA como parte de um estudo colaborativo. Esses ratos chegaram em grupos separados aos 28 dias de idade, e a progressão do ciclo estrous foi monitorada por 10 ou 20 dias para demonstrar diferenças em níveis agudos e crônicos, começando aos 34 dias de idade (após um período de aclimatação de 7 dias).
2. Antes do manuseio, permita uma quarentena e/ou um período de aclimatação para estabilização fisiológica após o transporte e ajuste ao novo ambiente.
   NOTA: Foi citado um período mínimo de 3 dias, com um período de 7 dias recomendado 48,49,50,51,52. No geral, isso depende das condições de transporte, da cepa animal e dos objetivos do estudo.
3. Certifique-se de que o estresse seja reduzido com o uso de um período de aclimatação, pois o estresse pode interromper o funcionamento adequado do sistema reprodutivo⁵³. No entanto, não compuscompensa ao tentar eliminá-lo, pois uma quantidade moderada de estresse é benéfica para o bem-estar dos animais⁵¹.
4. Ratos hospedeiros em ambiente de temperatura ( 68-79 °F, ou seja, 20-26 °C) e controlados pela umidade (30-70%) ao entrar em contato com os gerentes de vivarium ou laboratório e garantir essas características. Distribua água e chow ad libitum com componentes de nutrientes listados no site da empresa e limpeza de gaiolas uma vez por semana.
   NOTA: Neste estudo, os ratos foram alojados em grupos de 2 separados por sexo em gaiolas de plástico reutilizáveis transparentes de 19" x 10" x 8" e tiveram acesso à cama corncob que era alterada uma vez por semana. A temperatura foi mantida em 70 °F e umidade em 35-79%, com média de 62%.
5. Verifique o desenvolvimento de rabo de anel ou necrose isquêmica da cauda e dos dedos dos dedos para obter evidências de baixos níveis de umidade relativa e temperaturas extremas, o que pode causar a alternância de respostas biológicas.
   NOTA: Temperatura e umidade são importantes para o sistema reprodutivo, maturação sexual e cíclica estrous 54,55,56,57,58.
6. Garanta uma iluminação adequada e equilibrada em todo o espaço habitacional, depositando quantidades iguais de fontes de luz em todo o espaço de laboratório que atuam em um sistema claro controlado pelo tempo: escuro.
   NOTA: Aqui, um ciclo claro de 12:12 h: escuro, com luzes acesas das 06:00-18:00 h, foi controlado por lâmpadas LED Lineares de 2.550 lúmen.
7. Siga os requisitos lux fornecidos⁵² com base em variações de pigmentação, idade, tensão, sexo e estado hormonal dos animais.
   NOTA: Quando os pesquisadores categorizam as amostras de células coletadas, a iluminação consistente permitirá detecção visual adequada e estadiamento^{confiável 59}. A duração e intensidade da luz estão diretamente relacionadas ao sistema reprodutivo, ao amadurecimento sexual e ao ciclismo estrous 54,55,56,57,60,61.

2. Preparação de equipamentos e experimentos

1. Revise os determinantes categorizadores (vistos na Figura 2A): como identificar cada etapa do ciclo estrous e como operar o microscópio e o equipamento de câmera.
2. Certifique-se de que cada assunto a ser monitorado tenha atingido o amadurecimento sexual e mostre indicadores apropriados de desenvolvimento — VO, peso corporal e idade. Pesar os ratos e examiná-los para VO entre o mesmo tempo todos os dias para comparações precisas e transferi-los com um método de manuseio aprovado. Consulte o veterinário afiliado à universidade se um animal perde mais de 20% do seu peso corporal anterior.
   NOTA: O VO permanece caudal à abertura uretral e craniana ao ânus, localizado entre os dois, como descrito na Figura 3.
3. Como esses fatores são dependentes de tensão, verifique com o fornecedor as especificações e considere fatores ambientais específicos para o laboratório⁶².
   NOTA: Em geral, isso ocorrerá entre 32-34 dias de idade e um peso corporal médio variando de 75-150 gramas⁶³ para ratos SD e é indicado por uma abertura em forma circular previamente coberta por um baia membranouso.
4. Selecione um período de coleta de amostras apropriado para o grupo de ratos que está sendo monitorado para evitar a coleta de amostras transitórias. Primeiro, prove alguns animais em 2 ou 3 pontos de tempo diferentes ao longo do dia para determinar o horário em que a maioria dos estágios de ciclo estão presentes (por exemplo, amostragem às 12:00 horas, 13:00 horas e 14:00 horas para diferentes animais). Complete a lavagem vaginal ao mesmo tempo todos os dias para uma encenação consistente e confiável.
   NOTA: Foi relatado que as horas entre 12:00 e 14:00 h são melhores para capturar todas as etapas. Neste estudo, o monitoramento do ciclo estrous ocorreu entre 12:00 e 14:00 h, manuseado com o porão estilo de compressão (ver passo 3.4). A importância do tempo de monitoramento do ciclo estrous em relação a outras intervenções experimentais (por exemplo, condicionamento comportamental, medicação) é uma área de desenvolvimento da pesquisa e pode ser ainda mais explorada¹¹. Determinar a duração do monitoramento do ciclo estrous é dependente do estudo e pode ser ainda mais explorado em estudos publicados^11,33.
5. Remova a tampa protetora do microscópio e conecte a câmera ao computador removendo a tampa da lente protetora da câmera e colocando a lente sobre a ocular do microscópio.
6. Em seguida, abra o software pré-selecionado no computador. Para usar o software selecionado neste estudo, selecione a câmera anexada ao USB localizado no lado esquerdo da tela, sob a lista de câmeras rotulada pela guia. Certifique-se de que a câmera USB está conectada corretamente ao computador, que lerá No Device sob a lista de câmeras rotulada pela guia, se não.
7. Uma vez que a câmera USB tenha sido selecionada sob a guia, ligue o interruptor de luz do microscópio localizado na base.
8. Crie uma pasta no computador designado para as fotos de amostra de celular. Crie uma pasta de arquivo para cada dia separado que os dados são coletados, pré-preparados antes que as imagens sejam tiradas.
9. Com o equipamento preparado, recupere a gaiola do sujeito de seu local de detenção e leve-a para a estação de coleta de amostras.

3. Coleta de células vaginais

1. Recupere uma seringa descartável e encha cada uma das seringas com 0,2 mL de NaCl estéril de 0,9%. Se as bolhas de ar estiverem presentes, gire suavemente a seringa do barril até que todas as bolhas de ar tenham atingido a ponta aberta da seringa e expulse o ar. Se ainda houver bolhas de ar presentes, expulse a solução de volta para o recipiente de NaCl e refil até que não haja nenhuma.
   NOTA: O excesso de movimentos pode resultar na formação de mais bolhas de ar.
2. Devolva cada seringa ao plástico para manter um campo estéril, com a ponta da seringa dentro da porção selada do embrulho.
3. Abra a gaiola e levante suavemente o assunto pela base da cauda ou pelo tronco do corpo, fechando a tampa da gaiola para evitar que outros saiam. Selecione um método de retenção entre os listados abaixo com base na preferência pessoal e resposta animal.
4. Use o porão estilo de compressão para ratos adolescentes colocando o sujeito contra a região superior do tórax, com o nariz do sujeito apontando para o chão. Antes de iniciar o cotonete, certifique-se de que o sujeito esteja comprimido o suficiente para evitar o movimento, mas é confortável e seguro no porão. Exponha o canal vaginal do sujeito flexionando suavemente a cauda antes de inserir a seringa.
5. Use o Elevador de Perna Traseira para ratos adultos colocando as patas dianteiras do animal na parte superior ou lateral da gaiola, enquanto a cauda e as barras traseiras são contidas com um segurar suavemente entre o primeiro e o segundo dedo, deixando o polegar livre para operar a seringa⁶⁴.
6. Permita que os animais se aclimatar ao manuseio e monitoramento. Manuseie os animais com cuidado, mas com segurança, para reduzir o excesso de estresse e proteger o pesquisador de agressões como a mordida.
   NOTA: Os primeiros dias de monitoramento podem não produzir os resultados desejados à medida que os animais se aclimatam às suas condições. O manuseio dos animais para coletar pesos corporais durante o período de aclimatação pode auxiliar nessa transição³³.
7. Enquanto segura a seringa firme com o dedo indicador e o dedo médio, insira a ponta da seringa (não mais de 2 mm) em um ângulo paralelo ao canal vaginal. Lentamente expulse o NaCl para dentro do canal empurrando o êmbolo para dentro. Não insira a seringa mais adiante no canal, pois isso pode interromper o ciclo estrous.
8. Extrair o NaCl do canal vaginal puxando o êmbolo da seringa para longe do forro epitelial (para cima). Se houver dificuldade em manter o sujeito no porão durante esse processo, coloque-os de volta na gaiola por um curto período de descanso antes de tentar a extração de NaCl.
9. Uma vez coletada a amostra celular, coloque o sujeito de volta na gaiola e repita este procedimento para cada animal antes que todas as amostras sejam avaliadas sob o microscópio.
   NOTA: Alternativamente, cada amostra pode ser coletada e avaliada antes de passar para o próximo animal. Um animal pode exigir uma segunda lavagem se a amostra não puder ser categorizada. A mesma seringa da coleção inicial pode ser reutilizada se não entrar em contato diretamente com o soro fisiológico no recipiente e apenas para o mesmo animal.

4. Avaliação amostral

1. Comece a categorização examinando a amostra de fluido vaginal extraída. Registo a viscosidade como viscoso ou não e a coloração como opaca ou transparente no documento de descrição ou outro sistema de gravação.
   NOTA: Esta seção do protocolo pode ser realizada no momento da coleta da amostra ou posteriormente.
2. Expelir 2-3 gotas do fluido em um slide de microscópio e coloque um vidro de tampa de microscópio em cima do slide. Coloque o vidro de cobertura no deslizamento do microscópio do topo do slide para o fundo ou de um lado do slide para o outro para evitar a formação de bolhas de ar. Se possível, deixe aproximadamente metade da amostra coletada na seringa se for necessário um exame mais aprofundado e para evitar que um excesso de fluido seja colocado no slide.
3. Localize as células coletadas movendo o deslizamento do microscópio através do palco. Se houver poucas células ou uma grande quantidade de detritos, expulse o fluido restante em um novo slide e reexamina. Se a quantidade de amostra deixada na seringa for insuficiente ou se a segunda gota estiver apresentando problemas semelhantes, colete outra amostra do sujeito antes de tentar identificar o estágio do ciclo estrous.
4. Uma vez que as células tenham sido localizadas e antes de tocar no computador ou no teclado do computador, remova a única luva para evitar sujar o teclado.
5. Adquira imagens das amostras de células clicando na função rotulada Snap no lado esquerdo do painel de software.
6. Em seguida, salve o arquivo clicando em Salvar como no ícone Arquivo no canto superior esquerdo da página. Salve a foto sob uma pasta pré-rotulada no computador.
   NOTA: Modelo de etiqueta de exemplo: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective lente usada.
7. Tire mais de uma foto em cada lente objetiva se não houver muitas células dentro de cada quadro.
   NOTA: Rótulos de exemplo para múltiplas imagens: #1_01/09/2021_EST_4x1 e #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Repita o procedimento para cada amostra coletada em múltiplas lentes objetivas. Inclua pelo menos uma objetificação menor, como 4x, e pelo menos uma objetificação maior, como 20x.
9. Carregue as imagens em uma unidade/pasta compartilhada ou em um disco rígido externo para que todos os pesquisadores envolvidos tenham acesso aos arquivos e haja cópias de backup disponíveis.

5. Categorização do estágio

1. Configure a tela do computador para visualizar simultaneamente as fotos tiradas e a folha de gravação (Figura 4A-C).
   NOTA: Isso permitirá que a documentação ocorra durante a visualização da amostra coletada. Esta parte do protocolo pode ser concluída no momento da coleta da amostra ou posteriormente.
2. Determine quais tipos de células estão presentes na amostra. Selecione entre as quatro opções listadas nas etapas 5.2.1-5.2.4 usando os critérios e registos.
   1. Epitelial queratinizada anucleada (AKE)/células epiteliais cornificadas
      1. Procure por células irregulares ou com bordas angulares, como visto na Figura 2B e Figura 5C, que apesar da falta de núcleos, podem mostrar áreas redondas leves (fantasmas nucleares) dentro da célula que representam onde um núcleo já esteve presente. Use ampliação maior, como 20x ou mais, para diferenciar entre tais células nucleadas e anucleadas.
      2. Use uma ampliação mais elevada para distinguir a porção queratinizada ou cornificada da célula — uma fina camada de células sem núcleos e preenchidas com queratina — se desejar.
         NOTA: Além de sua aparência irregular, estes também podem ser distinguidos por como eles podem dobrar ou desmontar, criando estruturas irregulares e alongadas conhecidas como barras de queratina.
   2. Grandes células epiteliais nucleadas (LNE)
      1. Procure por essas células tipicamente redondas e em forma de poligonal envoltas em bordas irregulares, irregulares ou angulares.
      2. Observe como seus núcleos podem assumir várias formas, variando de intacto a degenerado ou pykontic, relacionado à condensação irreversível da cromatina no núcleo de uma célula submetida à morte ou deterioração, como visto na Figura 2B e Figura 5D1,2. Tome nota de como esses núcleos ocupam menos espaço do que o citoplasma dentro da célula, com uma proporção nuclear menor para citoplasmática (N:C) do que as pequenas células epiteliais. Cuidado com os grânulos citoplasmológicos que podem ser vistos em ampliações mais altas¹³.
   3. Leucócitos (LEUs)/neutrófilos/células polimorfórnucleares
      1. Procure por essas células compactas e esféricas com núcleos multilobulados (daí, conhecidos como células polimorfonucleares), que desaparecem à medida que a célula amadurece (Figura 2B e Figura 5A). Maior ampliação (por exemplo, 40x) pode ser usada para observar os núcleos multilojados.
         NOTA: Após a coleta e preparação, essas células podem condensar, dobrar ou romper.
   4. Pequenas células epiteliais nucleadas (SNE)
      1. Cuidado com essas células redondas e ovais que são maiores do que os neutrófilos descritos acima.
      2. Observe os núcleos redondos dessas células epiteliais não enquetinadas (Figura 2B), que tomam uma quantidade maior de espaço do que o citoplasma dentro da célula, criando uma maior razão N:C em relação às grandes células epiteliais.
         NOTA: Após a coleta e preparação, essas células podem dobrar ou se sobrepor para criar uma forma que se assemelha a uma corda ou barra, como demonstrado na Figura 5B1.
3. Examine como as células presentes na amostra são organizadas para cada objetificação. Use a objetificação inferior, como 4x, para visualizar uma visão representativa do arranjo celular geral. Regissuor se as células estão agrupadas (C), uniformemente dispersas (ED) ou dispersas aleatoriamente (RD) (ver Figura 4C), e observe a organização específica de cada tipo de célula (por exemplo, pequenas células epiteliais nucleadas são agrupadas, e os neutrófilos são distribuídos uniformemente).
4. Em seguida, estime visualmente e regise a quantidade total de células (um smidge, moderada, numerosa) e as quantidades celulares individuais (porcentagem de cada tipo de célula presente).
   NOTA: Um smidge representa o menor número de células presentes que podem ser utilizadas para determinar a categorização da amostra, numerosos representam a presença de um número incontável de células que são responsáveis pela maioria, se não todo o espaço no slide ou são empilhados em cima umas das outras, e um número moderado de células representa um número comparativamente médio de células (exemplos vistos na Figura 5A-D e Figura 6A-D).
5. Observe se há algum desvio dos critérios listados ou aspectos típicos do sujeito específico na categoria "anormalidades" e consulte um veterinário, se necessário.
6. Determine qual estágio de ciclo estrous está sendo apresentado na amostra utilizando os componentes de categorização e as descrições abaixo.
   1. Morrer
      1. Procure leus como o tipo de célula dominante ou único presente, dispostos de forma desajeitada no início do DIE, mas mais dispersos em estágios finais.
         NOTA: Durante a transição para o DIE, a quantidade de células pode diminuir à medida que as células epiteliais começam a se quebrar, como visto na Figura 6D1. Ao mesmo tempo, o número de LEUs começa a aumentar, e elas tendem a ser organizadas de forma desajeitada inicialmente e se dispersam ao longo do tempo.
      2. Observe que a quantidade total de células pode ser relativamente baixa, na maioria das vezes nos estágios posteriores do período DIE, no segundo ou terceiro dia.
      3. Observe a alta quantidade de muco que pode estar presente nesta etapa, que apresenta como fios concentrados de LEUs (Figura 5A1). Cuidado com pequenos aglomerados ou fios celulares de células SNE que acompanham as LEUs durante fases tardias na transição para PRO (Figura 5A1,2).
      4. Observe a aparência viscosa e opaca do fluido vaginal ao fazer a transição para, totalmente transitória e a transição para fora do DIE.
         NOTA: A duração média desta etapa é de 48 horas durante um ciclo de 4 dias e possivelmente 72 h durante um ciclo de 5 dias.
   2. Pró
      1. Procure por células SNE como as células dominantes e para células LEU, LNE e/ou AKE que podem ser vistas em números baixos. Use alta objetificação para observar a aparência granular das células SNE que são tipicamente dispostas em aglomerados, folhas ou fios durante esta fase (Figura 5B1,2).
      2. Observe a aparência viscosa e opaca do fluido vaginal ao mover-se do DIE para o PRO, e como ele se torna não-vísco e transparente uma vez totalmente transicionado para o estágio PRO (duração média de 14 h em ratos).
   3. Est
      1. Procure o domínio das células AKE, uma diminuição das células SNE no EST, e um aumento no número e tamanho das células à medida que o EST continua^{em 11,13}.
      2. Anote a característica distintiva do arranjo muitas vezes agrupado das células AKE, na forma de barras de queratina ou contendo núcleos fantasmas, que podem se tornar mais aleatoriamente dispersos na transição de PRO (Figura 6B) e para MET (Figura 6C).
      3. Observe a característica não-ocous e fluido vaginal transparente, que pode ser esperado à medida que os ratos estão em transição, totalmente transicionados para, e transicionados para fora do EST.
         NOTA: A progressão do EST inclui muita diversificação (Figura 5C e Figura 6B, C). O estágio normalmente ocorre por uma média de 24 horas em um ciclo de 4 dias ou possivelmente 48 horas em um ciclo de 5 dias.
   4. Conheci
      1. Procure por maior número de células SNE e LNE à medida que o rato está em transição para MET, seja dominante em termos de proporção celular dentro do canal ou perto da mesma proporção das LEUs^11,13. Além disso, anote a maior quantidade de detritos no MET e as transições do que em outros estágios devido à decadência das células epiteliais após o EST e a mudança para o DIE.
      2. Observe a falta de arranjo consistente, pois todos os tipos de células são vistos e em várias quantidades (Figura 5D1-3). No entanto, procure as LEUs que estão embaladas ou agrupadas nas proximidades das células epiteliais nos estágios iniciais que podem retornar ao arranjo desajeitado ao fazer a transição para o DIE.
      3. Observe a aparência não vícua e transparente do fluido vaginal nesta fase e a mudança para uma aparência mais viscosa e opaca ao se mover para DIE.
         NOTA: A duração média desta etapa é de 6-8 h.
7. Amostras de rótulos em transições com o estágio em que o sujeito está se movendo, com a transição entre parênteses para rastrear quando estas são coletadas. Podem ser encontradas mais informações sobre como distinguir entre essas 4 etapas e suas transições nos Resultados Representativos.
   NOTA: Como as amostras coletadas são estáticas e o ciclo é dinâmico, os slides podem representar transições entre os estágios (vistos na Figura 6A-D).
8. Complete este processo para cada animal até que a fase de monitoramento esteja completa.
9. Nos dias 11 (45 dias de idade) ou 21 (55 dias de idade), eutanize os ratos com 5% de isoflurane e 2% de oxigênio antes de uma decapitação de guilhotina. Esses pontos de tempo podem variar dependendo da natureza do estudo.

Representative Results

Os dados atuais refletem o do Programa Internacional de Padronização Genética (IGS) da adolescente na presença de ratos SD masculinos. Esses animais foram localizados nos laboratórios pepperdine e ucla como parte de um estudo colaborativo. A Figura 5 apresenta múltiplas variações dos 4 estágios do ciclo. A Figura 5A1 foi identificada como uma amostra de diestrus com vários tipos de células presentes. Este exemplo demonstra que amostras com um número maior de células epiteliais se qualificam como diestrus quando encontram as outras qualificações de componentes categorizadores, como o domínio das LEUs. Esta amostra também demonstrou o arranjo de fios de muco composto leus frequentemente vistos nesta fase, que se assemelha aos fios constituídas por células SNE vistas no estágio PRO. Para distinguir uma vertente de muco no estágio DIE dos fios que aparecem no estágio PRO composto por células SNE, é importante identificar o domínio das LEUs. A Figura 5A2,3 exibe uma progressão de arranjo celular frequentemente observada — uma aglomeração inicial das LEUs que coletam e se movem para um (RD) aleatório ou mesmo desembolso (ED) em amostras coletadas em períodos posteriores da fase DIE. Especificamente, a Figura 5A2 foi uma amostra DIE com numerosas células presentes. Isso reflete como as LEUs também podem ser acompanhadas por um alto número de células epiteliais (Figura 5A1,2), distinguidas do metestrus por uma dominância de LEUs e a ausência de barras de queratina. Em contraste, a Figura 5A3 demonstra que uma baixa contagem total de células (um smidge) foi comumente vista durante a fase posterior do estágio DIE, como durante o segundo ou terceiro dia. Durante a fase PRO, as células SNE foram frequentemente dispostas em fios com numerosas células empilhadas umas nas outras (Figura 5B1) ou um pouco de células dispostas em aglomerados menores (Figura 5B2). A Figura 5B3 exemplifica uma amostra PRO com a característica de agrupamento de folhas de células SNE que se sobrepõem e formam barras que poderiam ser confundidas com as barras de queratina compostas de células AKE presentes no estágio EST. Para distinguir os dois, é importante identificar o domínio das células SNE em células PRO e de AKE em EST.

A Figura 5C1,2 demonstra o típico agrupamento e desembolso aleatório de células AKE vistas em EST, com a primeira incluindo numerosas células e a segunda um número moderado. Núcleos fantasmas, formações de barras de queratina e bactérias frequentemente coletadas durante esta fase são vistas nesses exemplos. As células SNE foram às vezes representadas durante a fase EST (Figura 5C1) como remanescentes da fase PRO anterior. O estágio final do EST, quando as células SNE começam a emergir à medida que o sujeito se move em direção ao MET, é frequentemente confundido com o estágio PRO. Para distinguir os dois, é importante levar em conta o tamanho nuclear. Em geral, as células nucleadas de PRO têm uma maior razão N:C. A amostra mostrada na Figura 5C3 apresentou um arranjo semelhante a uma vertente de numerosas células AKE que não foi vista como uma característica do estágio EST. Isso demonstra que cada animal é único, que podem ocorrer desvios dos critérios, e que os determinantes de categorização devem ser examinados em combinação.

Para distinguir entre EST e PRO quando as células SNE estão presentes, veram-se que uma menor razão N:C ocorreu nessas células durante o estágio EST. Para distinguir as barras de queratina presentes no EST das formadas pela sobreposição ou rolamento das células SNE no estágio PRO (Figura 5B3) e aquelas formadas por células epiteliais em decomposição na transição do MET (Figura 6D1), é importante identificar o tipo de célula dominante, o arranjo e a quantidade para distinguir o estágio que está sendo representado. Por fim, a Figura 5D1,2 exemplifica a combinação de todos os tipos de células presentes no desembolso aleatório representando o estágio MET. Além das inúmeras células presentes nesses exemplos, era comum coletar uma maior quantidade de detritos durante esta fase (Figura 5D2) devido à decomposição das células epiteliais após o EST e a transição para o DIE com uma dominância de LEUs que funcionam para limpar o canal vaginal das células epiteliais. A Figura 5D2 também mostra como o MET pode ser distinguido do DIE por sua maior concentração de células epiteliais e a presença de barras de queratina. No geral, essas representações retratam o amplo espectro que existe dentro de cada etapa e não são abrangentes.

Representações das 4 fases de transição são mostradas na Figura 6. Embora este estudo tenha categorizado amostras em transição como uma das 4 etapas do ciclo estrous, é importante identificar adequadamente as fases de transição. Na transição do DIE para o PRO (Figura 6A), houve muitas vezes uma diminuição geral no número de LEUs e um aumento no número de células SNE. As células LNE e AKE estavam às vezes presentes nesta transição, embora não em altas quantidades (Figura 6A1). A Figura 6A2-4 retrata o maior número de células SNE agrupadas e dispersas aleatoriamente que foram frequentemente coletadas durante esta transição, com um baixo número de LEUs dispersas aleatoriamente e uniformemente. No geral, ao distinguir-se de outras etapas de transição, foi importante notar o domínio das células SNE e o início de aglomerados e formações de fios vistos em PRO. Todos os exemplos na Figura 6A representam uma numerosa contagem de células, exceto a Figura 6A4, com um smidge. Na Figura 6B, a imagem mostra um exemplo de numerosas células SNE e AKE desajeitadas que são vistas na transição de PRO para EST.

Durante esta transição, as células SNE são vistas em números mais elevados com desembolsos menos agrupados e mais aleatórios de células AKE do que durante EST. A Figura 6C mostra o surgimento de AKE, SNE e LNE e a diminuição das células AKE na transição de EST para MET com um alto número de células. Os detritos presentes representam as células AKE em decomposição do estágio anterior de estrus frequentemente vistos em metestrus. Isso também é visto na fase final de transição, do MET ao DIE, onde as células epiteliais começaram a decair e produzir detritos (Figura 6D1,2), com numerosas células presentes no primeiro e um número moderado no segundo. Esses números mostram o fenômeno das LEUs aumentando em número para se tornar o tipo de célula dominante na transição para diestrus. Para o grupo monitorado por 20 dias (n = 3), foram coletados 12 dias de amostras de transição, com média de 4. Para o grupo monitorado por 10 dias (n = 3), foram coletados 9 dias em que foram coletadas amostras de transição, com média de 3.

A Figura 7 representa coleções de amostras de células desfavoráveis, a maioria das quais justificava lavages repetidas. A Figura 7A1 mostra uma massa de células escânneas coletadas devido a uma inserção e extração inadequadas da seringa, fazendo com que células escânsas sejam aspiradas da parede do canal vaginal. Essas células podem ser distinguidas de células epiteliais ou LEUs agrupadas devido à alta densidade e compactação da massa e suas bordas distintas. A Figura 7B representa uma coleção de detritos, onde ou nenhuma célula foi extraída, o plano de foco está incorreto, ou o slide não foi totalmente escaneado para células. Os detritos podem ser distinguidos das células através da familiaridade com os tipos de células e o tamanho pequeno muitas vezes distinto e desajeitado. Esses detritos geralmente provêm de roupas de cama animal, cabelo ou decomposição celular. A Figura 7C mostra um slide que contém uma contagem de células abaixo de um smidge. Embora as baixas contagens de células tenham sido comumente vistas durante o met tardio e o DIE precoce, isso representa slides que têm poucas células para categorizar com precisão em um estágio.

A Figura 7D mostra dois exemplos da solução de extração de NaCl combinada com fluido vaginal do canal no slide do microscópio. Na primeira imagem, Figura 7D1, o fluido estava presente e fora de foco, obstruindo a capacidade de categorizar com precisão. Na Figura 7D2, o fluido foi espalhado pelo escorregador em círculos coesos ao lado das LEUs. Embora este exemplo não exija uma lavagem de lavagem repetida devido à alta presença celular, é importante considerar a quantidade de fluido colocado no slide e a colocação do slide da tampa do microscópio para evitar manchas. No geral, essas imagens enfatizam a importância de capturar imagens representativas de qualidade para uma categorização adequada. Isso inclui considerar a forma de extração celular, o plano de foco e o conteúdo da imagem digitalizando cada slide antes de capturar uma imagem.

Após categorizar cada animal nos grupos experimentais, é comum gráfico as progressões de estágio em uma barra ou gráfico de linha. Isso permite que os pesquisadores examinem o padrão geral do ciclo e identifiquem quando o animal apresenta uma progressão irregular dos estágios estrous, conhecido como aciclicidade. As amostras podem então ser analisadas pelo comprimento do ciclo e pelo padrão de progressão do estágio nesta ferramenta de análise. Mostrado na Figura 8A,B, este conceito inclui a atribuição de barras de alturas variadas, no caso deste estudo, às etapas individuais e à tradução dos dados registrados (Figura 4B) através do eixo x. Nestes exemplos, MET e DIE são representados pelo mais baixo, PRO pelo meio e EST pelas alturas mais altas do bar. Devido à curta duração do estágio MET, ele é combinado com o estágio DIE em uma barra. Embora existam diferentes métodos de medição de conclusão de ciclo, é comum contar um ciclo completo como o movimento de um EST para outro¹¹. No entanto, isso não reflete uma conclusão de ciclo, mas uma duração de estágio EST de 2 dias quando há etapas est consecutivas.

A Figura 8A reflete os dados de um rato que progride através de uma progressão consistente e repetitiva através de MET/DIE, PRO e EST. Além disso, este rato caiu dentro da faixa de ciclos de 4 a 5 dias em um comprimento médio de 4.375. Cada etapa não excede as faixas padronizadas de comprimento, com uma média de 1,0625 dias gastos no EST, uma avaliação típica para acicllicidade. Se os dados extraídos seguem esse padrão de EST para EST com regularidade, isso confirma não apenas que os níveis hormonais do sujeito permaneceram dentro de faixas aceitáveis, mas também que o procedimento foi realizado sem interromper significativamente a natureza cíclica do processo. Por fim, este rato completou 16 ciclos, determinados contando o número de barras EST para EST.

A Figura 8B representa tipos comuns de aciclicidade, incluindo estágios estendidos (vistos como EXT) e não registrados. Esta figura também destaca a importância de examinar tanto o padrão do ciclo quanto o comprimento e número de dias gastos em cada etapa. Especificamente, neste exemplo, enquanto o comprimento médio do ciclo e o número de dias no EST se enquadram dentro dos parâmetros delineados, o padrão de ciclo de progressão do estágio revelou anormalidades. Por isso, é importante examinar o ciclo estrous de forma abrangente. Ambos os estágios DIE estendido (rotulado como Ext Diest) e EST (rotulado como Ext Est) foram registrados ao longo dos ciclos mostrados na figura, e houve vários ciclos onde o estágio PRO não foi gravado. Este exemplo também demonstra a importância de examinar o número de estágios consecutivos vistos, que estão fora das faixas típicas, em vez de examinar apenas o comprimento médio do ciclo e dos dias no EST, que se enquadram em faixas típicas.

As causas e correlações desses exemplos podem incluir fatores como anormalidades fisiológicas (tumores, pseudopregnação, estresse prolongado), condições ambientais prejudiciais (iluminação prolongada, exposição a produtos químicos tóxicos, habitação solitária), tempo inadequado de coleta de amostras, erro do pesquisador (coleta de amostras ruim, captura de imagem, encenação inadequada), fenômenos relacionados à idade (irregularidade comum vista na adolescência e senescência reprodutiva) ou desvios exclusivos para a específica animal. Para separar o erro do pesquisador ou o tempo inadequado da coleta de amostras e anormalidades físicas ou fenômenos relacionados à idade, é útil examinar os 4 componentes categorizadores com mais detalhes. Isso pode auxiliar na determinação das possíveis causas de irregularidades ou, em um sentido mais amplo, poderia ser utilizado em estudos que estão estudando as características do ciclo estrous mais de perto.

A Figura 9 ilustra esta inspeção mais minuciosa, incluindo quantidades totais e individuais de células no eixo y, tipos de células(s) representados por diferentes cores de preenchimento de barras e arranjos de células representados por diferentes padrões de preenchimento de barras, gráficos ao longo do período total de monitoramento. Este método de análise permitiu o exame do número total de ciclos concluídos, o comprimento de cada ciclo, a progressão do estágio e os componentes categorizadores em maior detalhe para cada rato individual. A Figura 9A representa um rato que teve um número inferior à média de ciclos, com um total de 3 ciclos completos nos 10 dias monitorados-dois ciclos de 3 dias e um ciclo de 5 dias (média de 3,67). A irregularidade observada na progressão de estágio com 50% dos dias incluiu um ou mais estágios não registrados e 30% das amostras coletadas em transição — dia 2 como MET-DIE, dia 5 como EST-MET e dia 8 como transição PRO-DIE. Isso pode ter sido devido ao tempo inadequado da coleta de amostras, erro do pesquisador, um fenômeno relacionado à idade ou desvios únicos. Um monitoramento adicional poderia ter dado clareza sobre a aplicação.

Os arranjos dominantes típicos, os tipos celulares e as quantidades individuais e totais de células foram observados em cada um dos estágios registrados. Nos estágios EST, foram vistas células AKE agrupadas de smidge (25% das amostras), moderadas (25% das amostras) e numerosas (50% das amostras) agrupadas, com menor presença de LEUs, SNE e células LNE. No único estágio MET capturado, uma combinação de numerosas LEUs dispersas aleatoriamente (50%), células AKE (20%), LNE (15%) e SNE (15%) estavam presentes. Para os estágios de DIE, foi observada uma quantidade de smidge (50% das amostras) e numerosas (50% das amostras) de células dispersas aleatoriamente, uniformemente dispersas, e uma combinação de LEUs dominantes foi vista intercalada com células AKE, LNE e SNE. No único estágio PRO coletado, estavam presentes um pouco de LEUs dispersas aleatoriamente (60% das células presentes) e células SNE (40% das células presentes), que estavam em uma combinação de arranjos, representando uma transição do DIE para o PRO.

Na Figura 9B, o rato representado tinha um total de 3 ciclos completos, com um padrão de ciclo de 4 dias. As amostras coletadas não representaram uma progressão de estágio consistente, com um período de DIE estendido (dias 6-9) e 5 outras instâncias de estágios não registrados (2 estágios MET não registrados, 2 estágios PRO não registrados e 1 estágio EST não gravado). Como apenas 20% das amostras estavam em transição (dia 3 como DIE-PRO, dia 5 como EST-MET, dia 18 como MET-DIE, e dia 19 como DIE-PRO), e apenas 3 estágios não foram registrados fora da fase MET e o período die prolongado, concluiu-se que o tempo de coleta da amostra era apropriado para este animal específico. Como os últimos 10 dias monitorados incluíram uma progressão ordenada através das 4 etapas, as irregularidades iniciais poderiam ser atribuídas à idade do adolescente. Quanto mais tempo de monitoramento (20 dias) permitiu que essa conclusão ocorresse.

O exame dos componentes de categorização revelou faixas típicas. Os estágios EST refletiram uma dominância de uma quantidade moderada (50% das amostras) a uma quantidade numerosa (50% das amostras) de células AKE agrupadas com menos LEUs, SNE e células LNE. Nas amostras met coletadas, houve uma combinação de LEUs moderadas (33,33% de amostras) a numerosas (66,67% das amostras) leus dispersas aleatoriamente e agrupadas (com uma faixa de quantidade de 10-90%), SNE agrupada (0-30%), LNE dispersa aleatoriamente (0-10%) e células AKE agrupadas e dispersas aleatoriamente (10-90%). Os estágios do DIE refletiram uma dominância de uma quantidade moderada (20%) para uma quantidade numerosa (80% de amostras) de LEUs dispersas uniformemente, dispersas aleatoriamente e agrupadas (faixa de 50-100%) na presença de células AKE e SNE dispersas aleatoriamente. Os estágios PRO foram identificados pelo domínio de uma quantidade de smidge (3,33% das amostras) e numerosas (66,67% das amostras) de células SNE dispersas aleatoriamente e agrupadas (10-99%) na presença de células LEUs, AKE e LNE.

Outra opção ao analisar os dados extraídos é a criação de perfis de ciclo estrous, incluindo os elementos descritos anteriormente — quantidades totais e individuais de células no eixo y, tipos de células(s) representados por diferentes cores de preenchimento de barras e arranjos celulares(s) representados por diferentes padrões de preenchimento de barras, grafados ao longo do período total de monitoramento para cada estágio de ciclo. Isso pode ser concluído por rato ou médias de todo o grupo. O objetivo desta ferramenta de análise é examinar as tendências de componentes categorizados por etapa, o que auxilia a comunidade científica global na caracterização das distinções de componentes categorizadores específicas das categorizações do estágio de ciclo estrous. Na Figura 10A1, o perfil DIE de 10 dias apresentou dominância de uma quantidade moderada (50% de amostras) e numerosa (50% das amostras) de LEUs uniformemente dispersas (média de 78,25%) ao lado de menos células SNE, AKE e LNE. Na Figura 10A2, o perfil diestrus de 20 dias apresentou domínio de uma quantidade moderada (20% de amostras) e numerosa (80% das amostras) de LEUs dispersas uniformemente, desajeitadas e dispersas aleatoriamente (média de 82% como presente em todos os 10 dias) ao lado de um menor número de células AKE e SNE.

O estágio PRO exibido na Figura 10B1 exibiu um domínio de um número moderado de células SNE dispersas aleatoriamente (60%) na presença de LEUs e células AKE. O perfil de estágio PRO de 20 dias na Figura 10B2 mostrou um domínio de um smidge (33,33% das amostras) e uma numerosa (66,67% das amostras) de uma combinação de arranjos e células SNE dispersas aleatoriamente (média de 66,33% como presente em todas as 3 amostras) células ao lado de células LEUs e AKE. O perfil EST de 10 dias visto na Figura 10C1 apresentou domínio de uma quantidade moderada (50% de amostras) ou uma quantidade numerosa (50% de amostras) de células AKE (média de 80% para os 2 dias presentes) em uma combinação de arranjos, ao lado de um menor número de LEUs, SNE e células LNE. Na Figura 10C2, o perfil EST de 20 dias apresentou domínio de células moderadas (75% das amostras) ou uma numerosa quantidade (15% de amostras) de células AKE dispersas aleatoriamente (média de 57,5% para os 4 dias presentes) ou aquelas em uma combinação de arranjos, ao lado de um menor número de leus, SNE e células LNE.

O perfil de estágio met de 10 dias na Figura 10D1 incluiu numerosas LEUs dispersas aleatoriamente (50%), células AKE (20%) e células SNE (30%) O perfil de estágio MET de 20 dias na Figura 10D2 apresentou uma quantidade moderada (3,33% das amostras) ou uma numerosa (6.667% das amostras) de LEUs (média de 50% em todas as 6 3 amostras), SNE (média de 15% como presente em todas as 3 amostras), células AKE (com 23,33% nas 3 amostras presentes), células LNE (média de 15% em todas as 2 amostras presentes). Metade das LEUs foram dispersas aleatoriamente (1 amostra) e os 50% restantes foram uma combinação de arranjos (1 amostra). Dois terços das células SNE foram dispersadas aleatoriamente quando presentes, enquanto os 33,33% restantes estavam em uma combinação de arranjos quando presentes (1 de 3 amostras). Por fim, 66,67% das células AKE foram agrupadas nas amostras presentes (2 dias), enquanto as 33,33% restantes estavam em uma combinação de arranjos (1 dia). A Tabela 1 inclui as médias numéricas dos determinantes categorizadores dos dois grupos. Embora os dados da Figura 9A,B e Figura 10A-D incluam informações sobre os determinantes categorizadores de animais individuais, essas tabelas incluem médias para o estágio estrus como exemplo. Quando reproduzidos em outros laboratórios, esses parâmetros podem se tornar o padrão de identificação de estágio. Isso, por sua vez, poderia diminuir o nível de subjetividade atualmente envolvido no processo de encenação.

Estatística
Em geral, há alguns parâmetros a serem considerados na interpretação das características do ciclo, embora haja falta de consenso sobre o que é considerado "anormal", e os desvios são típicos. Goldman et al. identificam "regular" como um ciclo de 4-5 dias com 24-48 h EST e 48-72 h DIE estágios¹¹. A divergência desses parâmetros pode ser devido a vários fatores, incluindo uma ou mais anormalidades fisiológicas, tempo de coleta inadequado ou a aciclicidade inicial frequentemente experimentada por ratos adolescentes à medida que os níveis hormonais amadurecem. Além de consultar o veterinário de laboratório, possibilitar um período de coleta experimental para garantir o tempo adequado, e monitorar animais após a adolescência para estabelecer um cronograma comparativo, análises estatísticas podem ser úteis para atribuir causalidade e/ou correlação a quaisquer anormalidades. Depois de caracterizar os ciclos em categorias (por exemplo, consistentes e anormais), uma análise qui-quadrado pode auxiliar na comparação dos grupos. Além disso, os componentes categorizadores ou características gerais do ciclo podem ser comparados após a intervenção utilizando a análise de variância (ANOVA)¹¹. No entanto, tais desvios podem não ser biologicamente significativos, como discutido na introdução, e, portanto, o contexto experimental deve ser considerado.

Figura 1: Ritmética hormonal em estágios de ciclo estrous. (A) Os diferentes níveis hormonais de esteroides sexuais durante os estágios proeminentes do ciclo estrous são delineados e resumidos. A progressão do estágio começa e termina com metestrus para demonstrar os níveis hormonais de construção e a progressão circular do processo. Adaptado de uma fonte externa¹¹. (B) Fluxo de hormônios esteroides sexuais do sistema nervoso central para o sistema reprodutivo através da corrente sanguínea. Vê-se que os níveis hormonais são aumentados através de sinais do hipotálamo e da glândula pituitária através de hormônio liberador de gonadotropina (GrH ou LHRH) e a combinação de hormônio estimulante do folículo e hormônio luteinizador, respectivamente. Isso inclui loops de feedback positivos e negativos, dependendo da concentração de estradiol e progesterona. Informações¹⁷ e imagens rastreadas a partir de fontes externas 65,66,67. Abreviação: LHRH = hormônio luteinizador de liberação hormonal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ciclo estrous categorizando determinantes medidos. (A) Listados aqui estão os componentes utilizados na realização das amostras de células coletadas e os componentes dominantes para cada estágio. É importante lembrar que estes são parâmetros gerais e são esperadas diferenças. (B) Aqui estão os tipos de células dominantes presentes em cada estágio. Embora sejam divisões gerais, cada tipo de célula pode ser encontrada em todos os estágios. (C) Apresentados aqui estão os tipos de arranjo celular encontrados neste estudo. (D) A imagem aqui reflete as quantidades típicas de células presentes em cada um dos 4 estágios do ciclo estrous, com o volume do quadrante representando as quantidades aproximadas das células. Originado de uma fonte externa¹³ e previamente adaptado⁶⁸. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Abertura vaginal em ratos Sprague Dawley. (A) Orientação anatômica da genitália externa não desenvolvida e abertura vaginal que levam ao canal vaginal em relação à abertura uretral. (B) Representação visual da área não desenvolvida, marcada por uma seta. (C) Orientação anatômica da genitália externa desenvolvida e orifício vaginal em relação à abertura uretral, normalmente ocorrendo em torno de 34 dias de idade. (D) Representação visual correspondente da área desenvolvida descrita na imagem A. Todos os números são provenientes de uma fonte externa²⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Categorizar determinantes modelo de registro de dados. (A) Uma opção para registro de dados; inclui descrições de categorizar determinantes. Isso deve ser usado diariamente, um para cada rato monitorado. (B) Este modelo é uma opção para entrada de dados, com um registro simplificado dos determinantes categorizadores e identificação de ratos. Isso permite que as notas sejam inseridas na folha de dados na segunda categorização PRO. A cor na linha superior reflete a cor atribuída ao grupo experimental representado, o que ajuda a distinguir um grupo do outro. (C) Outra opção de modelo; inclui todos os determinantes categorizadores e pode ser modificado com base na preferência pessoal ou objetivos do estudo. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizada anucleada; LEU = leucócitos; LNE = grande epitelial nucleado; SNE = pequena epitelia nucleada; C = desajeitado; ED = uniformemente disperso; RD = dispersa aleatoriamente; COM = combinado; SMD = smidge; MOD = moderado; NUM = numerosos; EXE = exercício; SED = sedentário; Est = estrus; Morrer = diestrus; met-die = transição metestrus-diestrus; Pro = proestrus; pro-Est = transição proestrus-estrus; ** = exemplo de qualidade que pode ser útil em uma publicação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Variações determinantes de categorização de palco. (A) Esta série de imagens retrata vários exemplos do estágio diestrus. A primeira imagem (A1) retrata um depósito de muco representado por fios de LEUs concentradas, com células epiteliais presentes em desembolsos aleatórios. Este é um exemplo da importância de utilizar tanto a ampliação de 4x quanto 10x. Esta ampliação 4x parece semelhante a uma cadeia de proestrus, mas após uma inspeção mais próxima em 10x, exibe um domínio das LEUs. A segunda imagem (A2) retrata o que era frequentemente visto em estágios diestrus - um domínio de LEUs visto ao lado de um arranjo desajeitado de células epiteliais: células SNE, LNE e AKE. A última imagem desta série (A3) reflete um desembolso aleatório de LEUs, muitas vezes visto dentro da fase diestrus no meio de gotículas de fluido vaginal e salino. (B) Esta série de imagens retrata vários exemplos do estágio proestrus. A primeira imagem (B1) retrata um arranjo desajeitado de células SNE em fios. A segunda imagem (B2) reflete um slide com uma contagem total menor de células e um agrupamento de células SNE. A terceira imagem (B3) retrata o agrupamento comum e o desembolso mais aleatório de células SNE e baixo número de LEUs e células AKE. (C) Esta série de imagens retrata vários exemplos do estágio estrus. A primeira imagem (C1) retrata um arranjo comum de aglomerados de células AKE, com formações de barras de queratina, na presença de células SNE. A segunda imagem (C2) apresenta o agrupamento de células AKE com núcleos fantasmas e bactérias. A última imagem (C3) apresenta um arranjo semelhante a uma linha de células AKE. (D) Esta série de imagens retrata vários exemplos do estágio metestrus. A primeira imagem (D1) retrata o desembolso aleatório e a aglomeração de LEUs, células SNE, células AKE e células LNE na presença de detritos. A segunda imagem (D2) reflete todos os tipos de células presentes em um arranjo de aglomerados, ao lado de barras de queratina. A última imagem (D3) mostra um arranjo mais abrangente das células LEUs, SNE, AKE e LNE presentes. Esses números, obtidos em 4x (A1, A2, B2, B3, D1 e D3) ou 10x (A3, C1, C2, C3 e D2), foram ampliados para permitir maior visualização dos componentes de categorização. Barras de escala = 100 μm. Para referência de tamanho; As células AKE têm um diâmetro de aproximadamente 40-52 μm, LEUs de aproximadamente 10 μm, células LNE de 36-40 μm, e células SNE de aproximadamente 25-32 μm¹⁶. Abreviaturas: SNE = pequena epitelia nucleada; LNE = grande epitelial nucleado; AKE = epitelial queratinizada anucleada; LEUs = leucócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Amostras de estágio de transição. (A) Esta série de imagens mostra exemplos da transição entre as etapas DIE e PRO. A primeira imagem (A1) apresenta grandes aglomerados e desembolso aleatório de células LEU, SNE, LNE e AKE. A segunda imagem (A2) inclui uma grande massa de LEUs e SNE com fios intercalados de LEUs. A terceira imagem (A3) inclui aglomerados e até desembolsos de LEUs e uma pequena quantidade de SNEs. A quarta e última imagem (A4) retrata células SNE e LEUs desembolsadas desajeitadas e aleatórias. (B) Esta imagem retrata um exemplo da transição entre os estágios PRO e EST com o agrupamento de células SNE e AKE. (C) Esta imagem retrata o desembolso clumping e aleatório das células AKE, SNE e LNE vistas no meio de detritos para representar a transição de EST para MET. (D) A primeira imagem (D1) retrata um exemplo da transição entre os estágios MET e DIE, com células epiteliais em decomposição acompanhando um aumento nas LEUs. A segunda imagem (D2) retrata células AKE na presença de LEUs e células SNE descritas anteriormente. Esses números, obtidos na ampliação de 4x (A1, A2, A3, B e C) ou 10x (A4, D1 e D2), foram ampliados para permitir maior visualização dos componentes de categorização. Barras de escala = 100 m. Para referência de tamanho, as células AKE têm um diâmetro de aproximadamente 40-52 μm, LEUs de aproximadamente 10 μm, células LNE de 36-40 μm e células SNE de aproximadamente 25-32 μm¹⁶. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizada anucleada; LEUs = leucócitos; LNE = grande epitelial nucleado; SNE = pequena epitelia nucleada; C = desajeitado; EST = estrus; DIE = diestrus; PRO = proestrus; MET = metestrus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Coleções de amostras de células desfavoráveis. (A) Nessas duas imagens, as células escânneas foram aspiradas da parede do canal vaginal, além de LEUs dispersas aleatoriamente. (B) Esta imagem inclui uma baixa quantidade de detritos, onde as células não foram vistas ou não coletadas. (C) Neste exemplo, foi observada uma contagem total de células baixas. (D) Nessas duas imagens (D1 e D2), a solução de extração de cloreto de sódio (NaCl) e o fluido vaginal foram vistos e espalhados por todos os slides do microscópio. Esses números, obtidos na ampliação de 4x (A1, A2 e D1) ou 10x (B, C e D2), foram ampliados para permitir maior visualização dos componentes de categorização. Barras de escala = 100 μm. Para referência de tamanho, as células AKE têm um diâmetro de aproximadamente 40-52 μm, LEUs de aproximadamente 10 μm, células LNE de 36-40 μm e células SNE de aproximadamente 25-32 μm¹⁶. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizada anucleada; LEUs = leucócitos; LNE = grande epitelial nucleado; SNE = pequena epitelial nucleada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Amostra regular e irregular de padrão de ciclismo. (A) Esta imagem reflete um total de 16 ciclos completos que progridem através de um padrão repetitivo e consistente, refletindo a oscilação regular dos hormônios esteroides sexuais. Dentro disso, diestrus é representado pelo mais baixo, proestrus pelo meio, e estrus é representado pelo bar na altura mais alta. Esses dados são analisados por meio do rastreamento dos dias entre os estágios de estrus, com cada estrus representando um ciclo completo. Esses dados refletem dados das ratos fêmeas abrigadas na UCLA. (B) Esta imagem representa uma combinação teórica de vários padrões acclíclicos de 22 ratos. Estrus estendidos podem ser vistos com vários dias repetitivos de barras a toda a altura, diestrus estendidos vistos com vários dias repetitivos da altura mais baixa da barra, e a ausência do padrão cíclico de progressão de diestrus através de metestrus. Abreviaturas: Est = estrus; Diest/Die = diestrus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Determinantes de categorização individual. (A) Este gráfico de barras empilhado reflete cada componente das ferramentas utilizadas para categorizar amostras individuais coletadas nos estágios da amostra estrous. Aqui, um assunto que foi monitorado por 10 dias mostra uma variedade de tipos de células, quantidades e arranjos. Isso é esperado para animais adolescentes, pois os níveis hormonais normalmente não se tornam consistentes ou regularizam até a idade adulta. (B) Aqui, é apresentado um perfil estrous para um animal que foi monitorado por 20 dias. Irregularidades semelhantes podem ser vistas aqui, onde o sujeito permaneceu em diestrus por 4 dias contra o típico 1-2. Esses dados representam as 6 ratos fêmeas abrigadas na Universidade Pepperdine. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizada anucleada; LEU = leucócitos; LNE = grande epitelial nucleado; SNE = pequena epitelia nucleada; C = desajeitado; ED = uniformemente disperso; RD = dispersa aleatoriamente; COM = combinado; SMD = smidge; MOD = moderado; NUM = numerosos; EXE = exercício ; SED = sedentário; Est = estrus; Morrer = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus.

Figura 10: Perfis de estágio. (A) Esta seção retrata os dados determinantes categorizadores para ratos individuais durante todos os dias categorizados como diestrus. A primeira imagem (A1) representa dados coletados ao longo de 10 dias e a segunda (A2) por 20 dias. (B) Esta seção retrata dados de ratos individuais durante todos os dias categorizados como proestrus. A primeira imagem (B1) representa dados coletados ao longo de 10 dias e a segunda (B2) por 20 dias. (C) Isso retrata dados de ratos individuais durante todos os dias identificados como estrus estágio. A primeira imagem (C1) representa dados coletados ao longo de 10 dias e a segunda (C2) por 20 dias. (D) Esta seção da série retrata os dados de componentes categorizadores para ratos individuais durante todos os dias identificados como estágio de metestrus. A primeira imagem (D1) representa dados coletados durante um período de 10 dias e o segundo (D2) por 20 dias. Os dados desses números refletem o de 6 ratos fêmeas alojados na Universidade pepperdine. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizada anucleada; LEU = leucócitos; LNE = grande epitelial nucleado; SNE = pequena epitelia nucleada; C = desajeitado; ED = uniformemente disperso; RD = dispersa aleatoriamente; COM = combinado; SMD = smidge; MOD = moderado; NUM = numerosos; EXE = exercício ; SED = sedentário; Est = estrus; Morrer = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

EST: 10 dias	Duração (dias)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	SNE (%)	Contagem total de células (%)
	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44.44 NUM: 44.44 SMD: 11.11
Intervalos	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge-numerosos
	Arranjo	C: 50 ED: 0 RD: 50	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 50 ED: 0 RD: 50
EST: 20 dias	Duração (dias)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	SNE (%)	Contagem total de células (%)
	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 NUM: 50 SMD: 0
Intervalos	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge-numerosos
	Arranjo	C: 60 ED: 6.67 RD: 33.33	C: 0 ED: 12,5 RD: 87,5	C: 33.33 ED: 0 RD: 66,67	C: 44,44 ED: 0 RD: 55.56

Tabela 1: Amostra determinante média do estágio. Essas tabelas retratam as médias dos determinantes categorizadores e a visão geral de todas as etapas EST coletadas. A tabela superior reflete as médias para todos os animais monitorados por 10 dias e a tabela inferior por 20 dias. Isso inclui a duração do ciclo estrous, os tipos e percentagens das células e os arranjos celulares e a porcentagem de cada arranjo visto para cada tipo de célula. Esses dados refletem dados de 6 ratos mulheres abrigadas na Universidade pepperdine. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizada anucleada; LEU = leucócitos; LNE = grande epitelial nucleado; SNE = pequena epitelia nucleada; C = desajeitado; ED = uniformemente disperso; RD = dispersa aleatoriamente; EST = estrus.

Discussion

Principais passos e considerações importantes
Certas etapas críticas no protocolo fornecido requerem ênfase, especialmente dentro da coleta de células vaginais. Durante a extração do fluido vaginal, garantir o ângulo adequado e a profundidade da inserção da seringa é fundamental para produzir resultados satisfatórios e, em última instância, prevenir irritação, lesão ou estimulação cervical ao animal. A estimulação do colo do útero pode ser uma fonte de indução de pseudopregnação, indicada por 12-14 dias de uma mancha vaginal somente leucócito¹¹. Durante a fase de avaliação do microscópio, é crucial focar no plano visual que exibe as células vaginais coletadas. Isso é concluído identificando uma ou duas células e ajustando a visualização até que o foco seja alcançado.

Na sequência, a captura de imagens representativas das células vaginais para encenação ocorre escaneando a totalidade do slide do microscópio. Isso garante que as imagens capturadas reflitam um retrato preciso do que é coletado e presente no canal vaginal dos animais. Antes da categorização, é necessária familiaridade com os determinantes categorizadores, como distinguir os tipos celulares e as várias transformações que cada tipo de célula pode possuir. Recomenda-se que cada participante seja devidamente treinado e pratique a identificação do estágio por meio de slides de prática pré-preparados.

Para diminuir a quantidade de viés e subjetividade envolvida no processo, recomenda-se incluir dois participantes na fase de categorização, ambos permanecendo cegos às atribuições do grupo de tratamento, sabendo as identificações de estágio previamente registradas para cada animal. Atribuir dois participantes à categorização das amostras permite conferência e diminuição da subjetividade nas identificações. No entanto, se os participantes quiserem categorizar as amostras separadamente, recomenda-se que haja um período inicial de colaboração para aumentar a confiabilidade entre taxas à medida que a perícia é desenvolvida. Um sistema de exame secundário pode ser empregado para evitar achados inconsistentes, como a troca de conjuntos de dados após a categorização e a utilização das fotos para confirmar as avaliações iniciais.

Limitações e modificações
As limitações da técnica atual incluem a duração da viabilidade. Devido à lesão ou irritação que possa acompanhar a inserção repetitiva de uma seringa, o monitoramento prolongado e recorrente não se alinha com os cuidados adequados e o uso dos animais. Portanto, ao realizar um estudo longitudinal, pode ser necessário modificar o procedimento diminuindo a frequência da lavagem. Por exemplo, em vez de monitorar cada animal uma vez por dia, os ratos poderiam ser divididos em grupos monitorados em dias diferentes ao longo da semana. Uma segunda limitação envolve a ausência de coloração amostral no processo delineado, sem separação de componentes celulares por cor, criando maior dependência dos determinantes de categorização listados no protocolo acima.

Além disso, dentro de tais determinantes de categorização, há elementos de subjetividade que poderiam limitar a replicação precisa. Especificamente, as porcentagens de quantidade celular dentro das amostras coletadas são baseadas em estimativas pessoais. Modificações nesse sentido podem incluir o desenvolvimento de um algoritmo matemático para quantificar os tipos de células individuais presentes. Modificações alternativas podem incluir o número de amostras depositadas em um slide de microscópio, que poderia ser aumentado dependendo do tamanho do slide e da tampa. Outras limitações podem incluir a falta de dados de fluidos vaginais neste estudo — uma modificação de estudos futuros pode incluir o registro das condições do fluido vaginal coletado como contribuição para a categorização do estágio. Modificações adicionais do protocolo poderiam incluir a utilização de outro fluido isotônico para extração celular, que produziria os mesmos resultados, como o soro fisiológico^{tamponado com} fosfato 13. Por fim, ao aplicar este procedimento a ratos de diferentes idades ou cepas, modificações como técnicas de manejo animal podem ser necessárias devido ao tamanho do corpo ou nível de atividade. Isso pode incluir o método de apreensão⁶⁹ e o Forelimb Crisscross⁶⁴ métodos para adultos e o método de Contenção^{64 de mãos e} uma e duas mãos utilizados para ratos mais jovens.

Métodos alternativos
Comparado aos métodos alternativos de monitoramento do ciclo estrous, o lavage vaginal é único em sua precisão, quantidade de informações produzidas, invasividade mínima e baixos custos associados. O exame histológico do útero e ovários pode ser utilizado para identificar estágios de ciclo, mas é mais intrusivo e não permite monitoramento contínuo. Ao medir os níveis hormonais de esteroides sexuais auxilia no monitoramento do ciclo estrous, requer coleta de sangue e não permite a caracterização do perfil exclusivo de fluido celular ou vaginal de cada sujeito. Como o desenvolvimento da genitália externa está indiretamente correlacionado com os níveis hormonais de esteroides sexuais, o exame da abertura vaginal pode fornecer informações sobre o amadurecimento sexual. Além disso, a coloração do tecido, nível de umidade, tamanho e inchaço da abertura vaginal foi correlacionada com os estágios de ciclo estrous⁷⁰. No entanto, a fisiologia precisa que leva à abertura do canal vaginal em ratos ainda não foi totalmente relatada. Publicações recentes descobriram que este é apenas um marcador indireto do desenvolvimento reprodutivo e nem sempre se alinha com a pubescência^31,34. A análise bioquímica das amostras de urina é econômica e facilmente conduzida, mas não permite a especificidade e confiabilidade de outros métodos⁷¹. Portanto, não é tão confiável ou válido quanto examinar as células presentes no canal vaginal.

Além disso, a medição da impedância elétrica tem sido utilizada para monitorar o ciclo estrous e é menos irritante fisicamente do que a lavagem líquida. No entanto, este método não fornece tanta informação sobre os componentes categorizadores. Este dispositivo foi projetado especificamente para otimizar o tempo de acasalamento intencional, medindo quando os níveis hormonais de esteroides sexuais são mais altos 72,73,74. Além disso, foi relatado que este método é eficaz para distinguir entre EST e nonEST, mas é limitado em sua capacidade de monitorar o ciclo estrous fora desse⁷⁵. No geral, este método tem sido relatado como não confiável, nem sempre econômico, e não é frequentemente utilizado na literatura levando à falta de dados^{comparáveis 74}. Embora o cotonete vaginal seja mais semelhante ao lavage nas informações que fornece, inclui um risco aumentado de irritação ou lesão, pois requer contato com o revestimento do canal vaginal diretamente para recuperar as células. Por fim, enquanto a coloração dos slides do microscópio pode fornecer um contraste mais acentuado entre os tipos celulares e permitir a preservação da amostra, é um esforço mais demorado e caro do que o montagem molhada⁵³. No geral, cada técnica de monitoramento tem suas limitações e vantagens, e pode ser benéfico utilizar uma combinação desses métodos para receber um exame abrangente do ciclo estrous de roedores.

Aplicativos
É importante ver o presente estudo no contexto da maior comunidade científica e do público em geral. Essa metodologia pode ser utilizada em qualquer projeto que envolva examinar animais do sexo feminino — não apenas dentro de estudos com foco na reprodução intencional, para excluir animais que apresentam anormalidades e/ou a função do eixo hipotalâmico-pituitário-ovário, mas também para os principais insights dentro dos grupos de tratamento. Mais especificamente, esse procedimento é impactante dentro de i) estudos farmacológicos, pois vários medicamentos e produtos químicos interrompem ou alteram o trato reprodutivo e o ciclo estrous 11,27,76; ii) estudos neurológicos, como aqueles focados em lesões cerebrais traumáticas, cognição ou distúrbios degenerativos, devido a interações entre hormônios esteroides sexuais e o sistema nervoso⁷⁷; iii) pesquisa do sistema circulatório devido aos receptores hormonais esteroides sexuais localizados em miócitos e as interações subsequentes⁷⁷; iv) pesquisa relacionada ao crescimento ósseo³⁸; ao sistema endócrino^11,78; e v) outros estudos não reprodutivos³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4