Knaagdier Estrous Cycle Monitoring met behulp van vaginale lavage: niet zoiets als een normale cyclus

Summary

Deze studie beschrijft de cruciale factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij experimentele ontwerpen met vrouwelijke ratten. In bredere zin dienen deze gegevens om stigma te verminderen en te helpen bij de ontwikkeling van meer inclusieve diagnostische en interventietools.

Abstract

De huidige methodologie stelt een reproduceerbare, gestandaardiseerde en kosteneffectieve aanpak vast voor het monitoren van de oestruscyclus van vrouwelijke Sprague Dawley (SD) adolescente ratten. Deze studie toont de complexiteit van hormonale cycli en het brede spectrum van begrip dat nodig is om een betrouwbare en geldige monitoringtechniek te construeren. Door middel van een diepgaand onderzoek van de belangrijkste experimentele ontwerp- en procedurele elementen, biedt deze beschrijving van de cyclus en de fundamentele principes ervan een kader voor verder begrip en deconstrueert misvattingen voor toekomstige replicatie.

Samen met een overzicht van het monsterverzamelingsproces met behulp van vaginale lavage, beschrijft de procedure het mechanisme van gegevenscategorisatie in het viertrapsmodel van proestrus, oestrus, metestrus en diestrus. Deze stadia worden gekenmerkt door een nieuwe voorgestelde aanpak, waarbij gebruik wordt gemaakt van de 4 categoriserende determinanten van vaginale vloeistofconditie, aanwezige celtype (s), celschikking en celhoeveelheid op het moment van verzameling. Variaties van elke fase, gunstige en ongunstige steekproeven, het onderscheid tussen cycliciteit en acycliciteit en grafische afbeeldingen van de verzamelde categoriserende componenten worden gepresenteerd naast effectieve interpretatieve en organisatorische praktijken van de gegevens. Over het algemeen maken deze tools het mogelijk om voor het eerst kwantificeerbare gegevensbereiken te publiceren, wat leidt tot de standaardisatie van categorisatiefactoren bij replicatie.

Introduction

Nieuwe bijdragen
De oestruscyclus van knaagdieren is geïdentificeerd als een essentiële indicator van welzijn. Onbewuste vooroordelen van onderzoekers en onnauwkeurige interpretaties met betrekking tot het vrouwelijk lichaam belemmeren echter de wetenschappelijke gemeenschap. De etymologie van het woord "oestrus" impliceert een gevoel van minderwaardigheid en negativiteit. Euripides gebruikte de term om een "razernij" of waanzin te beschrijven, Homerus om paniek te beschrijven en Plato om een irrationele drift te beschrijven. Deze studie benadrukt hoe deze oerperspectieven de huidige wetenschappelijke gemeenschap beïnvloeden en pakt deze zorgen aan door middel van een nieuw mozaïekparadigma - een bijgewerkte combinatie van eerder bestudeerde methoden, uitgebreid in reikwijdte voor een meer omvattende benadering.

De studie en het gebruik van deze techniek zijn ten eerste noodzakelijk, omdat er geen gestandaardiseerde en uitgebreide monitoringtechniek is en gegevensinterpretatiepraktijken onduidelijk kunnen zijn. Ten tweede, hoewel oestruscycluskenmerken afhankelijk zijn van individuele ratten die worden bestudeerd, zijn ze vaak universeel. Ten derde, hoewel hormonale cycli routinematige en nuttige processen zijn, worden ze omgeven door gevaarlijk stigma dat wordt onderzocht in de sectie 'Vertaling naar mensen'. Deze studie heeft tot doel deze drie problemen op drie manieren aan te pakken- (A) door een diepgaande oestruscyclusmonitoringtechniek te beschrijven en te verduidelijken hoe de resultaten kunnen worden geïnterpreteerd, (B) door methoden te schetsen die de integriteit en individualiteit van elke cyclus behouden, en (C) door de aandacht te vestigen op misvattingen die ongefundeerde praktijken in stand houden.

Deze studie is ook uniek in zijn focus op adolescente ratten, een periode die wordt gekenmerkt door cruciale ontwikkelingsveranderingen die licht werpen op verschillende gedrags-, anatomische en fysiologische manifestaties op volwassen leeftijd¹. Het bouwen van een gestandaardiseerd experimenteel ontwerp om hormonale cycli in een onderbelichte populatie te monitoren en tegelijkertijd gemeenschappelijke vooroordelen te deconstrueren, zal de ontwikkeling van betrouwbare en geldige hormonale correlaties ^2,3,4 en de bepaling van conditieafhankelijke cyclusverstoringen mogelijk maken 5,6,7,8,9,10 . Uiteindelijk dienen deze nieuwigheden om diagnostische criteria, behandelingen en interventies van verschillende welzijnsproblemen uit te breiden.

Fundamentele definities en toepassingen
De oestruscyclus is een verzameling dynamische fysiologische processen die optreden als reactie op de drie oscillerende vrouwelijke geslachtssteroïde hormonen: oestradiol, leuteiniserend hormoon (LH) en progesteron (figuur 1A, B). Interacties tussen het endocriene en centrale zenuwstelsel reguleren de cyclus, die meestal 4-5 dagen aanhoudt en terugkeert vanaf het begin van seksuele rijping tot reproductieve senescentie en / of stopzetting. Het is verdeeld in afzonderlijke categorieën op basis van hormoonspiegels - meestal in de 4 stadia van diestrus (DIE), proestrus (PRO), oestrus (EST) en metestrus (MET), die op een circulaire manier vorderen. Het aantal divisies kan variëren van 3 fasen¹¹ tot 13 fasen¹², afhankelijk van de aard van het onderzoek¹³. Het lagere aantal divisies sluit met als fase vaak uit en classificeert het als een kortdurende overgangsperiode. Het hogere aantal omvat meestal subsecties die een nadere inspectie mogelijk maken van verschijnselen zoals tumorontwikkeling of spontane pseudozwangerschap, de fysiologische toestand van zwangerschap zonder embryonale implantatie 12,14,15.

In deze studie werden de stadia geïdentificeerd door componenten van het vaginale kanaal, genaamd de 3 categoriserende determinanten - aanwezige celtype (s), celschikking en celhoeveelheid (figuur 2A-D). Hoewel de toestand van de vaginale vloeistof niet werd gecontroleerd in deze studie, wordt aanbevolen om het op te nemen als een vierde categoriserende component. Meer informatie over het onderzoeken van de vaginale vloeistof is te vinden in de referentielijst¹⁶. De categoriserende componenten kunnen worden onderzocht door cellen te extraheren via vaginale lavage, de primaire techniek die wordt aanbevolen in de hedendaagse oestruscyclusmonitoring. Hoewel de diepgaande fysiologische processen binnen elke fase buiten het bestek van deze studie vallen, is meer informatie te vinden in de literatuur¹⁷.

Het gebruik en de verdere ontwikkeling van deze oestruscyclusmonitoringtechniek is geworteld in de verbanden tussen geslachtssteroïde hormonen en de functie van lichaamssystemen zoals het cardiovasculaire systeem¹⁸, endocriene systeem⁸ en het centrale zenuwstelsel 19,20,21. Tegelijkertijd is oestruscyclusmonitoring niet altijd nodig wanneer vrouwelijke knaagdieren ^22,23,24,25 betrokken zijn. Integendeel, het is belangrijk om eerst te overwegen of sekseverschillen zijn gemeld in het specifieke studiegebied, dat verder kan worden onderzocht in gepubliceerde beoordelingen^22,23. Hoewel estrouscyclusmonitoring van vitaal belang is in een breed spectrum van onderzoeken, moet het niet worden gezien als een obstakel voor het opnemen van vrouwelijke knaagdieren in experimenten. Hoewel deze techniek complex en tijdrovend kan lijken, kan de procedure zelf minder dan 15 minuten duren om te voltooien, afhankelijk van de onderzoeker, en is kosteneffectief. Over het algemeen is de opname van vrouwelijke knaagdieren in wetenschappelijke studies gunstig voor het begrip van lichaamssystemen, verschillende aandoeningen en pathologieën en algemeen welzijn, omdat deze ontwikkelingen voornamelijk zijn gebaseerd op de mannelijke lichaamssjabloon.

Universele parameters en natuurlijke variabiliteiten bij het knaagdier
Het vaststellen van bereiken voor aspecten die als "typisch" worden beschouwd, is noodzakelijk om standaardcycluspatronen te definiëren, parameters in te stellen voor vergelijkende en analytische doeleinden en afwijkingen en uitschieters te detecteren. Tegelijkertijd is het ook belangrijk om te erkennen dat de cyclus van elke rat uniek is en dat afwijkingen op basis van dierlijke stam, fysiologische processen en omgevingsomstandigheden worden verwacht. In feite is een van de meest "normale" aspecten van de oestruscyclus variabiliteit. Dit is te zien in de totale cycluslengte, met een bereik van 3-38 dagen^26,27; de leeftijd van seksuele rijping die kan variëren van 32-34 dagen tot meerdere weken 28,29,30; wat wordt beschouwd als acyclisch¹¹, en de categoriserende determinante patronen^11,13. Over het algemeen is er geen universeel sjabloon voor de oestruscyclus, en het vertalen daarvan naar zowel de wetenschappelijke gemeenschap als het grote publiek is een belangrijk onderdeel van het experimentele proces.

Experimentele tijdspunten en ontwikkelingsleeftijd
Het herkennen van dit principe van variabiliteit helpt bij het bouwen van een betrouwbaar en geldig experimenteel ontwerp. Het begin van oestruscyclusmonitoring is bijvoorbeeld afhankelijk van de anatomische en fysiologische ontwikkeling van de ratten, die varieert op basis van omgevings- en fysiologische factoren. Monitoring kan niet beginnen tot de ontwikkeling van de vaginale opening (VO), de externe vaginale opening omringd door de vulva die naar het inwendige deel van het vaginale kanaal leidt (figuur 3A-D). Hoewel de VO zich vaak volledig ontwikkelt tussen de leeftijd van 32 en 34 dagen, blijft het geïndividualiseerd voor elk onderwerp en veel over het proces blijft onbekend. Deze opening is gebruikt om het begin van seksuele rijping te identificeren, wat in verband is gebracht met de toename van oestradiol³¹, de rijping van de hypothalamus-hypofyse-ovariële as³² en de eerste ovulatie bij ratten 17,33,34,35. Recente publicaties hebben echter aangetoond dat het slechts een indirecte marker van reproductieve ontwikkeling is, omdat het kan worden losgekoppeld van hormonale en ontwikkelingsgebeurtenissen in ongunstige omgevingen³¹ en veranderingen in oestradiolniveaus kan vertegenwoordigen in plaats van seksuele rijping³³. Daarom wordt aanbevolen om niet alleen op de VO te vertrouwen om de ontwikkelingsleeftijd te bepalen en als een kwalificatie voor oestruscyclusmonitoring³⁶, maar ook om het uiterlijk van de eerste EST-fase en de cornificatie van de epitheelcellen³⁰ te gebruiken om het begin van seksuele rijping te markeren.

Het lichaamsgewicht is met name gecorreleerd met de ontwikkelingsleeftijd tijdens de adolescentieperiode bij knaagdieren^30,37 en kan daarom ook helpen bij het bepalen van de ontwikkelingsleeftijd in deze periode. Voorgestelde mechanismen die verband houden met dit fenomeen omvatten de stimulatie van hormonen die nodig zijn voor de voortplantingsontwikkeling, zoals groeihormoon, en de remming van de hypothalamus-hypofyse bijnier (HPA) -as door de eetlustregulator, leptine³⁰. Het wordt echter niet aanbevolen om deze maatregel te gebruiken als de enige indicator van ontwikkelingsleeftijd vanwege de grote variatie tussen ratten tussen soorten en leveranciers³⁸. De variabiliteit die wordt gezien in de ontwikkeling van de VO en het lichaamsgewicht illustreren het belang van het concept in het algehele experimentele proces.

Vertaling naar de mens: culturele en wetenschappelijke contexten
De translationele relatie van dier-op-mens voortplantingsstudies is bidirectioneel. De resultaten van dierstudies beïnvloeden hoe de menselijke processen worden beoordeeld, benaderd en geanalyseerd³⁹. De perceptie van het menselijke voortplantingssysteem en de bijbehorende processen beïnvloeden hoe dieren worden bestudeerd. In feite komt een van de luidste aanwijzingen voor verder onderzoek op dit gebied voort uit bevooroordeelde sociaal-culturele overtuigingen met betrekking tot hormonale cycli die het wetenschappelijke proces beïnvloeden. Veel van deze conventies zijn afgeleid van een algemene culturele afkeer van het bespreken van menstruatie, wat heeft geleid tot een datakloof in goed onderbouwde kennis ^40,41. Dit heeft een spectrum van gevolgen die zich uitstrekken van klein tot dodelijk - van plankhoogte en smartphonegrootte tot het passen van kogelvrije vesten door de politie en gemiste kankerdiagnoses⁴².

De beschrijving van menstruatie als onhygiënisch, destructief en giftig - gezien in gerespecteerde teksten, media, woordenboeken en medische leringen - wordt bewaard door wetenschappelijke publicaties. Dit gebeurt door onnauwkeurige en bevooroordeelde beschrijvingen van hormonale cycli, de isolatie van het voortplantingssysteem van zijn neuro-endocriene tegenhangers en omgevingsinvloeden, en het reductionistische perspectief van de voltooiing van een cyclus als een 'falen om zwanger te ^worden'43,44. Dit leidt tot het creëren van ondeugdelijke experimentele praktijken, zoals het weglaten van externe variabelen die hormonale cycli beïnvloeden, het bepalen van start en eindpunten uitsluitend op basis van anatomische ontwikkelingen en het meten van cyclusvoortgang op een lineaire in plaats van circulaire manier. Ondanks de directe correlatie tussen sociaal-culturele factoren en biologische gevolgen, wordt het niet vaak overwogen in de wetenschappelijke literatuur. Door de inspectie van meer holistische publicaties 43,44,45, kunnen onderzoekers deze stigma's deconstrueren en betrouwbaardere en valide experimentele ontwerpen maken.

Protocol

Alle behandelings- en proceduremethoden die in dit protocol worden beschreven, komen overeen met de richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik van de National Institutes of Health (NIH) en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Pepperdine University en de UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC).

1. Verzorging en gebruik van dieren

1. Verkrijg vrouwelijke ratten, in aantallen volgens krachtanalyse, en mannelijke ratten om het Whitten-effect of meer consistente cyclus^{te bevorderen 46}. Bepaal de stam op basis van het doel van het onderzoek in bekende databases⁴⁷.
   OPMERKING: De huidige gegevens weerspiegelen die van vrouwelijke adolescenten SD International Genetic Standardization Program (IGS) in de aanwezigheid van mannelijke SD-ratten in zowel Pepperdine University als UCLA-laboratoria als onderdeel van een gezamenlijke studie. Deze ratten arriveerden in afzonderlijke groepen op de leeftijd van 28 dagen en de progressie van de oestruscyclus werd gedurende 10 of 20 dagen gevolgd om verschillen op acute en chronische niveaus aan te tonen, beginnend op de leeftijd van 34 dagen (na een acclimatisatieperiode van 7 dagen).
2. Houd voordat u ermee omgaat rekening met een quarantaine en / of een acclimatisatieperiode voor fysiologische stabilisatie na transport en aanpassing aan de nieuwe omgeving.
   OPMERKING: Er is een minimumperiode van 3 dagen genoemd, met een aanbevolen periode van 7 dagen 48,49,50,51,52. Over het algemeen is dit afhankelijk van de transportomstandigheden, de dierlijke stam en de onderzoeksdoelstellingen.
3. Zorg ervoor dat stress wordt verminderd met het gebruik van een acclimatisatieperiode, omdat stress een goede werking van het voortplantingssysteem kan verstoren⁵³. Overcompenseer echter niet door te proberen het te elimineren, omdat een matige hoeveelheid stress gunstig is voor het welzijn van de dieren⁵¹.
4. Host ratten in een temperatuur- (68-79 ° F, d.w.z. 20-26 ° C) en vochtigheidsgecontroleerde (30-70%) omgeving door contact op te nemen met de vivarium- of laboratoriummanagers en deze functies te waarborgen. Distribueer water en chow ad libitum met voedingscomponenten die op de website van het bedrijf worden vermeld en maak eenmaal per week kooien schoon.
   OPMERKING: In deze studie werden de ratten gehuisvest in groepen van 2 gescheiden door geslacht in 19 "x 10" x 8 "doorzichtig herbruikbare plastic kooien en hadden ze toegang tot maïskolf beddengoed dat eenmaal per week werd vervangen. De temperatuur werd gehandhaafd op 70 ° F en de luchtvochtigheid op 35-79%, met een gemiddelde van 62%.
5. Controleer op de ontwikkeling van ringstaart of ischemische necrose van de staart en tenen op bewijs van lage relatieve vochtigheidsniveaus en extreme temperaturen, die de afwisseling van biologische reacties kunnen veroorzaken.
   OPMERKING: Temperatuur en vochtigheid zijn belangrijk voor het voortplantingssysteem, seksuele rijping en oestrus cycliciteit 54,55,56,57,58.
6. Zorg voor een goede en uitgebalanceerde verlichting in de hele behuizing door gelijke hoeveelheden lichtbronnen in de laboratoriumruimte af te zetten die werken op een tijdgestuurd licht:donker-systeem.
   OPMERKING: Hier werd een 12:12-h light:dark-cyclus, met lichten aan van 06:00-18:00 uur, bestuurd door lineaire LED-lampen van 2.550 lumen.
7. Volg lux-vereisten⁵² op basis van variaties van de pigmentatie, leeftijd, stam, geslacht en hormonale status van dieren.
   OPMERKING: Wanneer onderzoekers de verzamelde celmonsters categoriseren, zorgt consistente verlichting voor een goede visuele detectie en betrouwbare enscenering⁵⁹. De duur en intensiteit van het licht zijn direct gerelateerd aan het voortplantingssysteem, seksuele rijping en oestruscyclus 54,55,56,57,60,61.

2. Uitrusting en experimentvoorbereiding

1. Bekijk de categoriserende determinanten (zie figuur 2A): hoe elke fase van de oestruscyclus te identificeren en hoe de microscoop en camera-apparatuur te bedienen.
2. Zorg ervoor dat elk te controleren onderwerp seksuele rijping heeft bereikt en de juiste indicatoren van ontwikkeling vertoont - VO, lichaamsgewicht en leeftijd. Weeg de ratten en onderzoek ze elke dag op hetzelfde tijdstip op VO voor nauwkeurige vergelijkingen en breng ze over met een goedgekeurde behandelingsmethode. Raadpleeg de aan de universiteit gelieerde dierenarts als een dier meer dan 20% van zijn vorige lichaamsgewicht verliest.
   OPMERKING: De VO blijft caudaal voor de urethrale opening en craniaal voor de anus, gelegen tussen de twee, zoals afgebeeld in figuur 3.
3. Aangezien deze factoren afhankelijk zijn van de stam, neemt u contact op met de leverancier voor specificaties en houdt u rekening met omgevingsfactoren die specifiek zijn voor het laboratorium⁶².
   OPMERKING: Over het algemeen zal dit gebeuren tussen de leeftijd van 32-34 dagen en een gemiddeld lichaamsgewicht variërend van 75-150 gram⁶³ voor SD-ratten en wordt aangegeven door een cirkelvormige opening die eerder werd bedekt door een vliezige schede.
4. Selecteer een bemonsteringsperiode die geschikt is voor de groep ratten die wordt gecontroleerd om te voorkomen dat overgangsmonsters worden verzameld. Bemonster eerst een paar dieren op 2 of 3 verschillende tijdstippen gedurende de dag om de tijd te bepalen waarop de meeste cyclusstadia aanwezig zijn (bijvoorbeeld bemonstering om 12:00 uur, 13:00 uur en 14:00 uur voor verschillende dieren). Voltooi de vaginale lavage elke dag op hetzelfde tijdstip voor een consistente en betrouwbare stadiëring.
   OPMERKING: Er is gemeld dat de uren tussen 12:00 en 14:00 uur het beste zijn voor het vastleggen van alle etappes. In dit onderzoek vond estrouscyclusmonitoring plaats tussen 12:00 en 14:00 uur, afgehandeld met de compressie-achtige hold (zie stap 3.4). Het belang van de timing van oestruscyclusmonitoring ten opzichte van andere experimentele interventies (bijv. Gedragsconditionering, medicatie) is een zich ontwikkelend onderzoeksgebied en kan verder worden onderzocht¹¹. Het bepalen van de duur van de oestruscyclusmonitoring is studieafhankelijk en kan verder worden onderzocht in gepubliceerde studies^11,33.
5. Verwijder de beschermkap van de microscoop en bevestig de camera aan de computer door de beschermklep van de cameralens te verwijderen en de lens over het oculair van de microscoop te plaatsen.
6. Open vervolgens de vooraf geselecteerde software op de computer. Als u de software wilt gebruiken die in dit onderzoek is geselecteerd, selecteert u de camera die is aangesloten op de USB aan de linkerkant van het scherm, onder het tabblad Cameralijst. Zorg ervoor dat de USB-camera correct is aangesloten op de computer, die Geen apparaat leest op het tabblad Met het label Cameralijst, zo niet.
7. Zodra de USB-camera onder het tabblad is geselecteerd, schakelt u de microscooplichtschakelaar op de basis in.
8. Maak een map op de computer die is aangewezen voor de voorbeeldfoto's van de cel. Maak een bestandsmap voor elke afzonderlijke dag dat gegevens worden verzameld, voorbereid voordat afbeeldingen worden gemaakt.
9. Met de apparatuur voorbereid, haalt u de kooi van de proefpersoon uit de wachtplaats en brengt u deze naar het monsterverzamelstation.

3. Verzameling van vaginale cellen

1. Haal een wegwerpspuit op en vul elk van de spuiten met 0,2 ml steriele 0,9% NaCl. Als er luchtbellen aanwezig zijn, veeg dan voorzichtig met de vatspuit totdat alle luchtbellen de open punt van de spuit hebben bereikt en verdrijf de lucht. Als er nog luchtbellen aanwezig zijn, verdrijft u de oplossing terug in de NaCl-recipiënt en vult u deze bij totdat er geen luchtbellen zijn.
   OPMERKING: Overmatig vegen kan leiden tot de vorming van meer luchtbellen.
2. Breng elke spuit terug naar de plastic verpakking om een steriel veld te behouden, met de punt van de spuit in het verzegelde gedeelte van de verpakking.
3. Open de kooi en til het onderwerp voorzichtig op aan de basis van de staart of de romp van het lichaam, waarbij het deksel van de kooi wordt gesloten om te voorkomen dat anderen naar buiten gaan. Selecteer een houderijmethode uit de onderstaande methoden op basis van persoonlijke voorkeur en dierlijke respons.
4. Gebruik de compressie-achtige hold voor adolescente ratten door het onderwerp tegen het bovenste borstgebied te plaatsen, waarbij de neus van de proefpersoon naar de grond wijst. Voordat u met het wattenstaafje begint, moet u ervoor zorgen dat het onderwerp voldoende is samengedrukt om beweging te voorkomen, maar comfortabel en veilig in het ruim ligt. Stel het vaginale kanaal van de proefpersoon bloot door de staart voorzichtig te buigen voordat u de spuit inbrengt.
5. Gebruik de Hind Leg Lift voor volwassen ratten door de voorpoten van het dier aan de bovenkant of zijkant van de kooi te plaatsen, terwijl de staart en achterpoten worden vastgehouden met een zachte houdgreep tussen de eerste en tweede vinger, waardoor de duim vrij blijft om de spuit te bedienen⁶⁴.
6. Laat de dieren wennen aan de hantering en monitoring. Behandel de dieren voorzichtig maar veilig om overtollige stress te verminderen en de onderzoeker te beschermen tegen agressie zoals bijten.
   OPMERKING: De eerste paar dagen van monitoring leveren mogelijk niet de gewenste resultaten op omdat de dieren aan hun omstandigheden wennen. Het hanteren van de dieren om lichaamsgewichten te verzamelen tijdens de acclimatisatieperiode kan deze overgang helpen³³.
7. Terwijl u de spuit stabiel houdt met de wijsvinger en middelvinger, plaatst u de punt van de spuit (niet meer dan 2 mm) in een hoek parallel aan het vaginale kanaal. Verdrijft de NaCl langzaam in het kanaal door de zuiger naar binnen te duwen. Steek de spuit niet verder in het kanaal, omdat dit de oestruscyclus kan verstoren.
8. Haal de NaCl uit het vaginale kanaal door de zuiger van de spuit weg te trekken van de epitheliale voering (naar boven). Als het moeilijk is om het onderwerp tijdens dit proces in het ruim te houden, plaats ze dan terug in de kooi voor een korte rustperiode voordat je NaCl-extractie probeert.
9. Zodra het celmonster is verzameld, plaatst u het onderwerp terug in de kooi en herhaalt u deze procedure voor elk dier voordat alle monsters onder de microscoop worden geëvalueerd.
   OPMERKING: Als alternatief kan elk monster worden verzameld en geëvalueerd voordat het naar het volgende dier gaat. Een dier kan een tweede lavage nodig hebben als het monster niet kan worden gecategoriseerd. Dezelfde spuit uit de eerste collectie kan worden hergebruikt als deze niet rechtstreeks in de container in contact komt met de zoutoplossing en alleen voor hetzelfde dier.

4. Evaluatie van een steekproef

1. Begin de categorisatie door het vaginale vloeistofmonster te onderzoeken dat is geëxtraheerd. Noteer de viscositeit als viskeus of niet-viskeus en de kleuring als ondoorzichtig of transparant op het beschrijvingsdocument of een ander registratiesysteem.
   OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol kan worden uitgevoerd op het moment van monsterverzameling of later.
2. Verwijder 2-3 druppels van de vloeistof op een microscoopglaasje en plaats een microscoopdekselglas bovenop de dia. Plaats het afdekglas op de microscoopglaasje van de bovenkant van de dia naar de bodem of van de ene kant van de dia naar de andere om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Laat indien mogelijk ongeveer de helft van het verzamelde monster in de spuit als verder onderzoek nodig is en om te voorkomen dat een teveel aan vocht op de dia wordt geplaatst.
3. Lokaliseer de verzamelde cellen door de microscoopglaas over het podium te bewegen. Als er te weinig cellen of een grote hoeveelheid puin zijn, verdrijft u de resterende vloeistof op een nieuwe dia en onderzoekt u deze opnieuw. Als de hoeveelheid monster in de spuit onvoldoende is, of als de tweede druppel vergelijkbare problemen vertoont, verzamel dan een ander monster van de proefpersoon voordat u probeert de oestruscyclusfase te identificeren.
4. Zodra de cellen zijn gelokaliseerd en voordat u de computer of het toetsenbord van de computer aanraakt, verwijdert u de ene handschoen om te voorkomen dat het toetsenbord bevuilt.
5. Verkrijg afbeeldingen van de celmonsters door te klikken op de functie met het label Snap aan de linkerkant van het softwarepaneel.
6. Sla het bestand vervolgens op door op Opslaan als te klikken onder het pictogram Bestand in de linkerbovenhoek van de pagina. Sla de foto op in een vooraf gelabelde map op de computer.
   OPMERKING: Voorbeeld labelsjabloon: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective gebruikte lens.
7. Maak meer dan één foto bij elke objectieflens als er niet veel cellen in elk frame zijn.
   OPMERKING: Voorbeeldlabels voor meerdere afbeeldingen: #1_01/09/2021_EST_4x1 en #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Herhaal de procedure voor elk verzameld monster onder meerdere objectieven. Neem ten minste één kleinere objectivering op, zoals 4x, en ten minste één grotere objectivering, zoals 20x.
9. Upload de afbeeldingen naar een gedeelde schijf / map of een externe harde schijf, zodat alle betrokken onderzoekers toegang hebben tot de bestanden en er back-upkopieën beschikbaar zijn.

5. Fase categorisatie

1. Stel het computerscherm in om tegelijkertijd de gemaakte foto's en het opnameblad te bekijken (figuur 4A-C).
   OPMERKING: Hierdoor kan de documentatie plaatsvinden tijdens het bekijken van het verzamelde monster. Dit deel van het protocol kan worden voltooid op het moment van monsterverzameling of later.
2. Bepaal welke celtypen in het voorbeeld aanwezig zijn. Kies uit de vier opties in stap 5.2.1-5.2.4 met behulp van de criteria en noteer de bevindingen.
   1. Geanucleeerde verhoornde epitheelcellen (AKE)/verhoornde epitheelcellen
      1. Zoek naar gekartelde of hoekige cellen, zoals te zien in figuur 2B en figuur 5C, die ondanks het ontbreken van kernen lichtronde gebieden (kerngeesten) in de cel kunnen vertonen die vertegenwoordigen waar een kern ooit aanwezig was. Gebruik een hogere vergroting, zoals 20x en hoger, om onderscheid te maken tussen dergelijke nucleated en anucleated cellen.
      2. Gebruik een hogere vergroting om het verhoornde of verhoornde deel van de cel te onderscheiden - een dunne laag cellen zonder kernen en gevuld met keratine - indien gewenst.
         OPMERKING: Naast hun grillige uiterlijk, kunnen deze ook worden onderscheiden door hoe ze kunnen vouwen of demonteren, waardoor gekartelde en langwerpige structuren ontstaan die bekend staan als keratinestaven.
   2. Grote nucleated epitheliale (LNE) cellen
      1. Zoek naar deze typisch ronde tot veelhoekige cellen omhuld door onregelmatige, gekartelde of hoekige randen.
      2. Observeer hoe hun kernen verschillende vormen kunnen aannemen, variërend van intact tot gedegenereerd of pykontisch, met betrekking tot de onomkeerbare condensatie van chromatine in de kern van een cel die sterft of verslechtert, zoals te zien is in figuur 2B en figuur 5D1,2. Let op hoe deze kernen minder ruimte innemen dan het cytoplasma in de cel, met een lagere nucleaire tot cytoplasmatische (N: C) verhouding dan de kleine epitheelcellen. Kijk uit voor cytoplasmatische korrels die te zien zijn bij hogere vergrotingen¹³.
   3. Leukocyten (LEUs)/neutrofielen/polymorfonucleaire cellen
      1. Zoek naar deze compacte, bolvormige cellen met multilobulated kernen (vandaar bekend als polymorfonucleaire cellen), die verdwijnen naarmate de cel volwassen wordt (figuur 2B en figuur 5A). Hogere vergroting (bijv. 40x) kan worden gebruikt om de multilobulated kernen te observeren.
         OPMERKING: Bij het verzamelen en bereiden kunnen deze cellen condenseren, vouwen of scheuren.
   4. Kleine nucleated epitheliale (SNE) cellen
      1. Kijk uit voor deze ronde tot ovaalvormige cellen die groter zijn dan de hierboven beschreven neutrofielen.
      2. Observeer de ronde kernen van deze niet-gekeratiniseerde epitheelcellen (figuur 2B), die een grotere hoeveelheid ruimte innemen dan het cytoplasma in de cel, waardoor een hogere N: C-verhouding ontstaat ten opzichte van grote epitheelcellen.
         OPMERKING: Bij het verzamelen en voorbereiden kunnen deze cellen zich vouwen of overlappen om een vorm te creëren die lijkt op een tekenreeks of balk, zoals weergegeven in figuur 5B1.
3. Onderzoek hoe de cellen in het monster zijn georganiseerd voor elke objectivering. Gebruik de onderste objectivering, zoals 4x, om een representatieve weergave van de algehele celindeling weer te geven. Noteer of de cellen samengeklonterd (C), gelijkmatig gedispergeerd (ED) of willekeurig gedispergeerd (RD) zijn (zie figuur 4C) en noteer de specifieke organisatie van elk celtype (bijvoorbeeld kleine epitheelcellen met kernen zijn samengeklonterd en neutrofielen zijn gelijkmatig verdeeld).
4. Schat vervolgens visueel de totale celhoeveelheid (een smidge, matig, talrijk) en de individuele celhoeveelheden (percentage van elk aanwezig celtype).
   OPMERKING: Een smidge vertegenwoordigt het kleinste aantal aanwezige cellen dat kan worden gebruikt om de steekproefcategorisatie te bepalen, talrijke vertegenwoordigt de aanwezigheid van een ontelbaar aantal cellen die ofwel de meeste, zo niet alle ruimte op de dia vertegenwoordigen of op elkaar zijn gestapeld, en een matig aantal cellen vertegenwoordigt een relatief gemiddeld aantal cellen (voorbeelden gezien in figuur 5A-D en figuur 6A-D).
5. Noteer of er afwijkingen zijn van de vermelde criteria of aspecten die typisch zijn voor het specifieke onderwerp in de categorie 'afwijkingen' en raadpleeg indien nodig een dierenarts.
6. Bepaal welke oestruscyclusfase in het voorbeeld wordt gepresenteerd met behulp van de categoriserende componenten en de onderstaande beschrijvingen.
   1. Sterven
      1. Zoek naar LEUs als het dominante of enige aanwezige celtype, gerangschikt op een samengeklonterde manier aan het begin van DIE, maar meer verspreid in late stadia.
         OPMERKING: Tijdens de overgang naar DIE kan de hoeveelheid cellen afnemen naarmate de epitheelcellen beginnen af te breken, zoals te zien is in figuur 6D1. Tegelijkertijd begint het aantal LEUs toe te nemen en hebben ze de neiging om in eerste instantie op een samengeklonterde manier te worden gerangschikt en zich in de loop van de tijd te verspreiden.
      2. Merk op dat de totale hoeveelheid cellen relatief laag kan zijn, meestal in de latere stadia van de DIE-periode, op de tweede of derde dag.
      3. Let op de grote hoeveelheid slijm die in deze fase aanwezig kan zijn, die zich presenteert als geconcentreerde strengen LEUs (figuur 5A1). Let op kleine klonten of cellulaire strengen SNE-cellen die de LEUs vergezellen tijdens late fasen in de overgang naar PRO (figuur 5A1,2).
      4. Observeer het stroperige en ondoorzichtige uiterlijk van de vaginale vloeistof bij de overgang naar, volledig overgegaan in en overgang uit DIE.
         OPMERKING: De gemiddelde duur van deze fase is 48 uur tijdens een cyclus van 4 dagen en mogelijk 72 uur tijdens een cyclus van 5 dagen.
   2. PRO
      1. Zoek naar SNE-cellen als de dominante cellen en naar LEUs, LNE en / of AKE-cellen die in lage aantallen kunnen worden gezien. Gebruik hoge objectivering om het granulaire uiterlijk van de SNE-cellen waar te nemen die in deze fase doorgaans in clusters, vellen of strengen zijn gerangschikt (figuur 5B1,2).
      2. Observeer het stroperige en ondoorzichtige uiterlijk van de vaginale vloeistof bij het verplaatsen van DIE naar PRO, en hoe het niet-visueel en transparant wordt zodra het volledig is overgegaan in het PRO-stadium (gemiddelde duur van 14 uur bij ratten).
   3. Est
      1. Zoek naar dominantie van AKE-cellen, een afname van de SNE-cellen in EST en een toename van het aantal en de grootte van cellen naarmate EST^11,13 blijft.
      2. Noteer het onderscheidende kenmerk van de vaak geclusterde rangschikking van AKE-cellen, in de vorm van keratinestaven of met spookkernen, die meer willekeurig kunnen worden verspreid in de overgang van PRO (figuur 6B) en naar MET (figuur 6C).
      3. Observeer de karakteristieke niet-visuele en transparante vaginale vloeistof, die kan worden verwacht als de ratten overgaan in, volledig overgegaan in en overgegaan uit EST.
         OPMERKING: De progressie van EST omvat veel diversificatie (figuur 5C en figuur 6B, C). De fase komt meestal voor gemiddeld 24 uur in een cyclus van 4 dagen of mogelijk 48 uur in een cyclus van 5 dagen.
   4. Ontmoette
      1. Zoek naar hogere aantallen SNE- en LNE-cellen terwijl de rat overgaat in MET, hetzij dominant in termen van celverhouding binnen het kanaal of bijna gelijke verhouding tot de LEUs^11,13. Noteer verder de grotere hoeveelheid puin in MET en de overgangen dan in andere stadia als gevolg van het epitheelcelverval na EST en het overgaan naar DIE.
      2. Let op het gebrek aan consistente rangschikking zoals alle celtypen worden gezien en in verschillende hoeveelheden (figuur 5D1-3). Zoek echter naar de LEUs die in de beginfasen in de epitheelcellen zijn verpakt of samengeklonterd in de buurt van de epitheelcellen die kunnen terugkeren naar de samengeklonterde opstelling bij de overgang naar DIE.
      3. Observeer het niet-visuele en transparante uiterlijk van de vaginale vloeistof in deze fase en de verandering naar een meer viskeus en ondoorzichtig uiterlijk tijdens het bewegen in DIE.
         OPMERKING: De gemiddelde duur van deze fase is 6-8 uur.
7. Label voorbeelden in overgangen met het stadium waar het onderwerp naartoe beweegt, met de overgang tussen haakjes om bij te houden wanneer deze worden verzameld. Meer informatie over hoe onderscheid te maken tussen deze 4 fasen en hun overgangen is te vinden in de representatieve resultaten.
   OPMERKING: Aangezien de verzamelde monsters statisch zijn en de cyclus dynamisch, kunnen de dia's overgangen tussen fasen weergeven (zie figuur 6A-D).
8. Voltooi dit proces voor elk dier totdat de monitoringfase is voltooid.
9. Op dag 11 (45 dagen oud) of 21 (55 dagen oud), euthanaseer de ratten met 5% isofluraan en 2% zuurstof voor een guillotine onthoofding. Deze tijdstippen kunnen variëren afhankelijk van de aard van het onderzoek.

Representative Results

De huidige gegevens weerspiegelen die van vrouwelijke adolescente SD International Genetic Standardization Program (IGS) in aanwezigheid van mannelijke SD-ratten. Deze dieren werden gelokaliseerd in zowel Pepperdine University als UCLA-laboratoria als onderdeel van een gezamenlijke studie. Figuur 5 toont meerdere variaties van de 4 cyclusfasen. Figuur 5A1 werd geïdentificeerd als een diestrusmonster met verschillende aanwezige celtypen. Dit voorbeeld toont aan dat monsters met een groter aantal epitheelcellen kwalificeren als diestrus wanneer ze voldoen aan de andere categoriserende componentkwalificaties, zoals een dominantie van LEUs. Dit monster toonde ook de slijmstrengschikking samengestelde LEA's die vaak in deze fase worden gezien, die lijkt op de strengen bestaande uit SNE-cellen die in het PRO-stadium worden gezien. Om een slijmstreng in het DIE-stadium te onderscheiden van de strengen die voorkomen in het PRO-stadium dat bestaat uit SNE-cellen, is het belangrijk om de dominantie van LEUs te identificeren. Figuur 5A2,3 toont een progressie van de celindeling die vaak wordt waargenomen - een eerste samenklontering van de LEUs die verzamelen en verplaatsen naar een willekeurige (RD) of zelfs uitbetaling (ED) in monsters die zijn verzameld in latere perioden van de DIE-fase. Figuur 5A2 was met name een DIE-monster met talrijke cellen. Dit weerspiegelt hoe de LEUs ook vergezeld kunnen gaan van een groot aantal epitheelcellen (figuur 5A1,2), onderscheiden van metestrus door een dominantie van LEUs en de afwezigheid van keratinestaven. Figuur 5A3 laat daarentegen zien dat een laag totaal aantal cellen (een smidge) vaak werd gezien tijdens de latere fase van het DIE-stadium, zoals tijdens de tweede of derde dag. Tijdens het PRO-stadium werden de SNE-cellen vaak gerangschikt in strengen met talrijke cellen op elkaar gestapeld (figuur 5B1) of een smidge van cellen gerangschikt in kleinere klonten (figuur 5B2). Figuur 5B3 illustreert een PRO-monster met de karakteristieke bladachtige klontering van SNE-cellen die elkaar overlappen en staven vormen die kunnen worden verward met de keratinestaven die zijn samengesteld uit AKE-cellen die aanwezig zijn in de EST-fase. Om de twee te onderscheiden, is het belangrijk om de dominantie van SNE-cellen in PRO en van AKE-cellen in EST te identificeren.

Figuur 5C1,2 toont de typische samenklontering en willekeurige uitbetaling van AKE-cellen gezien in EST, waarbij de eerste talrijke cellen omvat en de laatste een matig aantal. Spookkernen, keratine staafformaties en bacteriën die vaak tijdens deze fase worden verzameld, worden in deze voorbeelden gezien. SNE-cellen werden tijdens het EST-stadium (figuur 5C1) soms weergegeven als overblijfselen van het vorige PRO-stadium. Het late EST-stadium, wanneer SNE-cellen beginnen te verschijnen als het onderwerp naar MET beweegt, wordt vaak verward met het PRO-stadium. Om de twee te onderscheiden, is het belangrijk om rekening te houden met de nucleaire grootte. Over het algemeen hebben de nucleated cellen van PRO een hogere N:C ratio. Het monster in figuur 5C3 toonde een strengachtige rangschikking van talrijke AKE-cellen die niet werd gezien als een kenmerk van het EST-stadium. Dit toont aan dat elk dier uniek is, dat afwijkingen van de criteria kunnen optreden en dat de categoriserende determinanten in combinatie moeten worden onderzocht.

Om onderscheid te maken tussen EST en PRO wanneer SNE-cellen aanwezig zijn, werd gezien dat een lagere N: C-verhouding optrad in deze cellen tijdens het EST-stadium. Om de keratinestaven in EST te onderscheiden van die gevormd door het overlappen of rollen van SNE-cellen in het PRO-stadium (figuur 5B3) en die gevormd door rottende epitheelcellen in de overgang van MET (figuur 6D1), is het belangrijk om het dominante celtype, de rangschikking en de hoeveelheid te identificeren om het stadium te onderscheiden dat wordt weergegeven. Ten slotte illustreert figuur 5D1,2 de combinatie van alle celtypen die aanwezig zijn in de willekeurige uitbetaling die de MET-fase vertegenwoordigt. Naast de talrijke cellen die in deze voorbeelden aanwezig zijn, was het gebruikelijk om tijdens deze fase een grotere hoeveelheid puin te verzamelen (figuur 5D2) als gevolg van het verval van epitheelcellen na EST en de overgang naar DIE met een dominantie van LEUs die functioneren om het vaginale kanaal van epitheelcellen te zuiveren. Figuur 5D2 laat ook zien hoe MET van DIE kan worden onderscheiden door de hogere concentratie epitheelcellen en de aanwezigheid van keratinestaven. Over het algemeen geven deze representaties het brede spectrum weer dat binnen elke fase bestaat en zijn ze niet uitputtend.

Representaties van de 4 overgangsfasen zijn weergegeven in figuur 6. Hoewel deze studie steekproeven in overgang heeft gecategoriseerd als een van de 4 oestruscyclusstadia, blijft het belangrijk om de overgangsfasen goed te identificeren. Bij de overgang van DIE naar PRO (figuur 6A) was er vaak een algehele afname van het aantal LEUs en een toename van het aantal SNE-cellen. LNE- en AKE-cellen waren soms aanwezig in deze overgang, maar niet in grote hoeveelheden (figuur 6A1). Figuur 6A2-4 toont het hogere aantal samengeklonterde en willekeurig gedispergeerde SNE-cellen die vaak tijdens deze overgang werden verzameld, met een laag aantal willekeurig en gelijkmatig verspreide EEA's. Over het algemeen was het bij het onderscheiden van andere overgangsfasen belangrijk om de dominantie van SNE-cellen en het begin van klonten en strengformaties in PRO op te merken. Alle voorbeelden in figuur 6A vertegenwoordigen een groot aantal cellen, behalve figuur 6A4, met een smidge. In figuur 6B toont de afbeelding een voorbeeld van talrijke samengeklonterde SNE- en AKE-cellen die te zien zijn in de overgang van PRO naar EST.

Tijdens deze overgang worden SNE-cellen in hogere aantallen gezien met minder samengeklonterde en meer willekeurige uitbetalingen van AKE-cellen dan tijdens EST. Figuur 6C toont de opkomst van AKE, SNE en LNE en de afname van AKE-cellen in de overgang van EST naar MET met een groot aantal cellen. Het aanwezige puin vertegenwoordigt de rottende AKE-cellen uit het vorige oestrusstadium dat vaak wordt gezien bij metestrus. Dit is ook te zien in de laatste overgangsfase, van MET naar DIE, waar de epitheelcellen begonnen te vervallen en puin begonnen te produceren (figuur 6D1,2), met talrijke cellen aanwezig in de eerste en een matig aantal in de laatste. Deze cijfers tonen het fenomeen van LEUs die in aantal toenemen om het dominante celtype te worden in de overgang naar diestrus. Voor de groep die gedurende 20 dagen (n = 3) werd gevolgd, waren er 12 dagen waarin overgangsmonsters werden verzameld, met een gemiddelde van 4. Voor de groep die gedurende 10 dagen (n = 3) werd gevolgd, waren er 9 dagen waarin overgangsmonsters werden verzameld, met een gemiddelde van 3.

Figuur 7 geeft ongunstige celmonsterverzamelingen weer, waarvan een meerderheid herhaalde lavages rechtvaardigde. Figuur 7A1 toont een massa plaveiselcellen die zijn verzameld als gevolg van een onjuiste injectie en extractie van spuiten, waardoor plaveiselcellen van de vaginale kanaalwand worden afgezogen. Deze cellen kunnen worden onderscheiden van samengeklonterde epitheelcellen of LEUs vanwege de hoge dichtheid en compactheid van de massa en de onderscheidende randen. Figuur 7B vertegenwoordigt een verzameling puin, waarbij ofwel geen cellen zijn geëxtraheerd, het focusvlak onjuist is of de dia niet volledig is gescand op cellen. Puin kan worden onderscheiden van cellen door bekendheid met de celtypen en de vaak kenmerkende kleine omvang en klontering. Dit puin komt vaak voort uit dierlijk beddengoed, haar of celverval. Figuur 7C toont een dia met een celtelling die lager is dan een smidge. Hoewel lage celtellingen vaak werden gezien tijdens late MET en vroege DIE, vertegenwoordigt dit dia's die te weinig cellen hebben om nauwkeurig in een stadium te categoriseren.

Figuur 7D toont twee voorbeelden van de NaCl-extractieoplossing in combinatie met vaginaal vocht uit het kanaal op de microscoopglaasje. In de eerste afbeelding, figuur 7D1, was de vloeistof aanwezig en onscherp, waardoor het vermogen om nauwkeurig te categoriseren werd belemmerd. In figuur 7D2 werd de vloeistof in samenhangende cirkels langs de LEUs over de glijbaan verspreid. Hoewel dit voorbeeld geen herhaling van lavage vereist vanwege de hoge aanwezigheid van cellen, is het belangrijk om rekening te houden met de hoeveelheid vloeistof die op de dia wordt geplaatst en de plaatsing van de microscoopdekselglaas om uitstrijkjes te voorkomen. Over het algemeen benadrukken deze afbeeldingen het belang van het vastleggen van representatieve afbeeldingen van hoge kwaliteit voor een goede categorisatie. Dit omvat het overwegen van de manier van celextractie, het scherpstelvlak en de inhoud van de afbeelding door elke dia te scannen voordat een afbeelding wordt vastgelegd.

Na het categoriseren van elk dier in de experimentele groep (en), is het gebruikelijk om de stadiumprogressies in een staaf- of lijngrafiek in kaart te brengen. Dit stelt onderzoekers in staat om het algemene cycluspatroon te onderzoeken en te identificeren wanneer het dier een onregelmatige progressie van de oestrusstadia vertoont, bekend als acycliciteit. De monsters kunnen vervolgens worden geanalyseerd aan de hand van de cycluslengte en het stadiumprogressiepatroon in deze analysetool. Dit concept, dat in figuur 8A,B wordt weergegeven, omvat het toewijzen van staven van verschillende hoogten, in het geval van dit onderzoek, aan de afzonderlijke fasen en het vertalen van de geregistreerde gegevens (figuur 4B) over de x-as. In deze voorbeelden worden MET en DIE weergegeven door de laagste, PRO door het midden en EST door de hoogste staafhoogten. Vanwege de korte duur van de MET-fase wordt deze gecombineerd met de DIE-fase in één balk. Hoewel er verschillende methoden zijn om cyclusvoltooiingen te meten, is het gebruikelijk om één volledige cyclus te tellen als de beweging van de ene EST naar de andere¹¹. Dit weerspiegelt echter geen cyclusvoltooiing, maar een EST-faseduur van 2 dagen wanneer er opeenvolgende EST-fasen zijn.

Figuur 8A geeft gegevens weer van een rat die een consistente en repetitieve progressie doorloopt via MET/DIE, PRO en EST. Bovendien viel deze rat binnen het bereik van 4- tot 5-daagse cycli met een gemiddelde lengte van 4,375. Elke fase overschrijdt de gestandaardiseerde lengtebereiken niet, met een gemiddelde van 1,0625 dagen doorgebracht in EST, een typische evaluatie voor acycliciteit. Als de geëxtraheerde gegevens dit patroon van EST tot EST met regelmaat volgen, bevestigt dit niet alleen dat de hormoonspiegels van de proefpersoon binnen aanvaardbare marges bleven, maar ook dat de procedure werd uitgevoerd zonder het cyclische karakter van het proces aanzienlijk te onderbreken. Ten slotte voltooide deze rat 16 cycli, bepaald door het aantal EST tot EST-staven te tellen.

Figuur 8B geeft veelvoorkomende soorten acycliciteit weer, waaronder uitgebreide (gezien als EXT) en niet-geregistreerde stadia. Deze figuur benadrukt ook het belang van het onderzoeken van zowel het cycluspatroon als de lengte en het aantal dagen dat in elke fase wordt doorgebracht. Specifiek, in dit voorbeeld, terwijl de gemiddelde cycluslengte en het aantal dagen in EST binnen geschetste parameters vallen, onthulde het cycluspatroon van stadiumprogressie afwijkingen. Daarom is het belangrijk om de oestruscyclus uitgebreid te onderzoeken. Zowel uitgebreide DIE (gelabeld als Ext Diest) als EST (gelabeld als Ext Est) stadia werden geregistreerd gedurende de cycli die in de figuur worden weergegeven, en er waren meerdere cycli waarbij het PRO-stadium niet werd geregistreerd. Dit voorbeeld toont ook het belang aan van het onderzoeken van het aantal opeenvolgende stadia dat wordt gezien, die buiten de typische bereiken vallen, in plaats van alleen de gemiddelde lengte van de cyclus en dagen in EST te onderzoeken, die binnen typische bereiken vallen.

De oorzaken en correlaties van deze voorbeelden kunnen factoren omvatten zoals fysiologische afwijkingen (tumoren, pseudozwangerschap, langdurige stress), schadelijke omgevingsomstandigheden (langdurige verlichting, blootstelling aan giftige chemicaliën, solitaire huisvesting), onjuiste timing van monsterverzameling, fouten van onderzoekers (slechte monsterverzameling, beeldopname, onjuiste stadiëring), leeftijdsgerelateerde verschijnselen (veel voorkomende onregelmatigheid gezien in de adolescentie en reproductieve senescentie), of afwijkingen die uniek zijn voor de specifieke dier. Om fouten van onderzoekers of onjuiste timing van monsterverzameling en fysieke afwijkingen of leeftijdsgerelateerde verschijnselen te scheiden, is het nuttig om de 4 categoriserende componenten in meer detail te onderzoeken. Dit kan helpen bij het bepalen van de mogelijke oorzaken van onregelmatigheden of, in bredere zin, kan worden gebruikt in studies die de oestruscycluskenmerken nader bestuderen.

Figuur 9 illustreert deze nadere inspectie door het opnemen van totale en individuele celhoeveelheden op de y-as, celtype(n) vertegenwoordigd door verschillende staafvulkleuren en celschikking(en) vertegenwoordigd door verschillende staafvulpatronen, weergegeven over de totale monitoringperiode. Deze analysemethode maakte het mogelijk om het totale aantal voltooide cycli, de lengte van elke cyclus, de voortgang van de fase en de categoriserende componenten in meer detail voor elke individuele rat te onderzoeken. Figuur 9A stelt een rat voor die een lager dan gemiddeld aantal cycli had, met een totaal van 3 volledige cycli in de 10 dagen bewaakte - twee 3-daagse cycli en één 5-daagse cyclus (gemiddeld 3,67). De onregelmatigheid die werd gezien in de faseprogressie met 50% van de dagen omvatte een of meer niet-geregistreerde stadia en 30% van de verzamelde monsters in overgang - dag 2 als een MET-DIE, dag 5 als een EST-MET en dag 8 als een PRO-DIE-overgang. Dit kan te wijten zijn geweest aan de onjuiste timing van monsterverzameling, fouten van onderzoekers, een leeftijdsgebonden fenomeen of unieke afwijkingen. Verdere monitoring had duidelijkheid kunnen verschaffen over welke van toepassing was.

De typische dominante arrangementen, celtypen en individuele en totale celhoeveelheden werden gezien binnen elk van de geregistreerde stadia. Binnen de EST-stadia werden een smidge (25% van de monsters), matige (25% van de monsters) en talrijke (50% van de monsters) samengeklonterde AKE-cellen gezien, met een lagere aanwezigheid van LEUs-, SNE- en LNE-cellen. In het ene met-stadium dat werd vastgelegd, was een combinatie van talrijke willekeurig gedispergeerde LEUs (50%), AKE-cellen (20%), LNE (15%) en SNE (15%) cellen aanwezig. Voor de DIE-stadia werd een smidge (50% van de monsters) en een talrijke (50% van de monsters) hoeveelheid willekeurig verspreid, gelijkmatig gedispergeerd en een combinatie van dominante LEUs afgewisseld met AKE-, LNE- en SNE-cellen gezien. In het ene verzamelde PRO-stadium was een smidge van willekeurig gedispergeerde LEUs (60% van de aanwezige cellen) en SNE-cellen (40% van de aanwezige cellen), die zich in een combinatie van arrangementen bevonden, aanwezig, wat een overgang van DIE naar PRO vertegenwoordigt.

In figuur 9B had de vertegenwoordigde rat in totaal 3 volledige cycli, met een cycluspatroon van 4 dagen. De verzamelde monsters vertegenwoordigden geen consistente stadiumprogressie, met een verlengde DIE-periode (dagen 6-9) en 5 andere gevallen van niet-opgenomen stadia (2 niet-geregistreerde MET-fasen, 2 niet-geregistreerde PRO-fasen en 1 niet-opgenomen EST-fase). Aangezien slechts 20% van de monsters in overgang was (dag 3 als DIE-PRO, dag 5 als EST-MET, dag 18 als MET-DIE en dag 19 als DIE-PRO), en slechts 3 fasen niet werden geregistreerd buiten de MET-fase en de verlengde DIE-periode, werd geconcludeerd dat de timing van de monsterverzameling geschikt was voor dit specifieke dier. Aangezien de laatste 10 gecontroleerde dagen een bestelde progressie door de 4 stadia omvatten, konden de initiële onregelmatigheden worden toegeschreven aan de adolescente leeftijd. De meer verhoogde monitoringduur (20 dagen) maakte deze conclusie mogelijk.

Het onderzoek van de categoriserende componenten onthulde typische bereiken. De EST-stadia weerspiegelden een dominantie van een matige (50% van de monsters) tot een talrijke hoeveelheid (50% van de monsters) van samengeklonterde AKE-cellen met minder LEUs-, SNE- en LNE-cellen. In de verzamelde MET-monsters was er een combinatie van een matige (33,33% van de monsters) tot talrijke (66,67% van de monsters) willekeurig gedispergeerde en samengeklonterde LEUs (met een hoeveelheidsbereik van 10-90%), samengeklonterde SNE (0-30%), willekeurig gedispergeerde LNE (0-10%) en samengeklonterde en willekeurig gedispergeerde AKE-cellen (10-90%). De DIE-stadia weerspiegelden een dominantie van een matige (20%) tot een talrijke (80% van de monsters) hoeveelheid gelijkmatig gedispergeerde, willekeurig verspreide en samengeklonterde LEUs (bereik van 50-100%) in aanwezigheid van zowel willekeurig verspreide AKE- als SNE-cellen. De PRO-stadia werden geïdentificeerd door de dominantie van een smidge (3,33% van de monsters) en talrijke (66,67% van de monsters) hoeveelheid willekeurig gedispergeerde en samengeklonterde SNE (10-99%) cellen in aanwezigheid van LEUs, AKE en LNE-cellen.

Een andere optie bij het analyseren van de geëxtraheerde gegevens is het maken van oestruscyclusprofielen door de eerder beschreven elementen op te nemen: totale en individuele celhoeveelheden op de y-as, celtype(n) vertegenwoordigd door verschillende vulkleuren van de staaf en celindeling(en) vertegenwoordigd door verschillende staafvulpatronen, weergegeven over de totale bewakingsperiode voor elke cyclusfase. Dit kan per rat of gemiddelden van de hele groep worden ingevuld. Het doel van deze analysetool is om de categoriserende componenttrends per fase te onderzoeken, wat de algehele wetenschappelijke gemeenschap helpt bij het karakteriseren van de categoriserende componentonderscheiden die specifiek zijn voor de categorisaties van de oestruscyclusfase. In figuur 10A1 vertoonde het 10-daagse DIE-profiel een dominantie van een matige (50% van de monsters) en talrijke (50% van de monsters) hoeveelheid gelijkmatig gedispergeerde EEA's (gemiddeld 78,25%) naast minder SNE-, AKE- en LNE-cellen. In figuur 10A2 vertoonde het 20-daagse diestrusprofiel een dominantie van een matige (20% van de monsters) en talrijke (80% van de monsters) hoeveelheid gelijkmatig gedispergeerde, samengeklonterde en willekeurig verspreide LEUs (gemiddeld 82% zoals aanwezig in alle 10 dagen) naast een lager aantal AKE- en SNE-cellen.

Het PRO-stadium in figuur 10B1 vertoonde een dominantie van een matig aantal willekeurig gedispergeerde SNE-cellen (60%) in aanwezigheid van LEUs en AKE-cellen. Het 20-daagse PRO-stadiumprofiel in figuur 10B2 toonde een dominantie van een smidge (33,33% van de monsters) en een talrijke (66,67% van de monsters) hoeveelheid van een combinatie van arrangementen en willekeurig gedispergeerde SNE (gemiddeld 66,33% zoals aanwezig in alle 3 de monsters) cellen naast LEUs en AKE-cellen. Het 10-daagse EST-profiel in figuur 10C1 vertoonde een dominantie van een matige (50% van de monsters) of een talrijke (50% van de monsters) hoeveelheid AKE-cellen (gemiddeld 80% voor de 2 aanwezige dagen) in een combinatie van arrangementen, naast een lager aantal LEUs-, SNE- en LNE-cellen. In figuur 10C2 vertoonde het 20-daagse EST-profiel een dominantie van matige (75% van de monsters) of een talrijke hoeveelheid (15% van de monsters) aantal willekeurig verspreide AKE (gemiddeld 57,5% voor de 4 aanwezige dagen) cellen of cellen in een combinatie van arrangementen, naast een lager aantal LEUs-, SNE- en LNE-cellen.

Het 10-daagse MET-stadiumprofiel in figuur 10D1 omvatte talrijke willekeurig gedispergeerde LEUs (50%), AKE (20%) cellen en SNE (30%) cellen. Het 20-daagse MET-faseprofiel in figuur 10D2 vertoonde een matige (3,33% van de monsters) of een talrijke (6,667% van de monsters) hoeveelheid LEUs (gemiddeld 50% in alle 3 monsters), SNE (gemiddeld 15% zoals aanwezig in alle 3 monsters), AKE-cellen (met 23,33% in de 3 aanwezige monsters), LNE-cellen (gemiddeld 15% in alle 2 aanwezige monsters). De helft van de LEUs was aselect verdeeld (1 steekproef) en de resterende 50% was een combinatie van arrangementen (1 steekproef). Tweederde van de SNE-cellen was willekeurig gedispergeerd wanneer aanwezig, terwijl de resterende 33,33% zich in een combinatie van arrangementen bevond wanneer aanwezig (1 van de 3 monsters). Ten slotte werd 66,67% van de AKE-cellen samengeklonterd in de aanwezige monsters (2 dagen), terwijl de resterende 33,33% in een combinatie van arrangementen (1 dag) was. Tabel 1 bevat de numerieke gemiddelden van de categoriserende determinanten uit de twee groepen. Terwijl de gegevens in figuur 9A, B en figuur 10A-D informatie bevatten over de categoriserende determinanten van individuele dieren, bevatten deze tabellen gemiddelden voor het oestrusstadium als voorbeeld. Wanneer ze in andere laboratoria worden gereproduceerd, kunnen deze parameters de standaard worden voor podiumidentificatie. Dit zou op zijn beurt het niveau van subjectiviteit dat momenteel betrokken is bij het ensceneringsproces kunnen verminderen.

Statistiek
Over het algemeen zijn er een paar parameters waarmee rekening moet worden gehouden bij het interpreteren van de cycluskenmerken, hoewel er een gebrek aan consensus is over wat als "abnormaal" wordt beschouwd en afwijkingen typisch zijn. Goldman et al. identificeren "regulier" als een cyclus van 4-5 dagen met 24-48 h EST en 48-72 h DIE stadia¹¹. Afwijking van deze parameters kan te wijten zijn aan verschillende factoren, waaronder een of meer fysiologische afwijkingen, onjuiste timing van de verzameling of de initiële acycliciteit die vaak door adolescente ratten wordt ervaren naarmate de hormoonspiegels volwassen worden. Naast het raadplegen van de laboratoriumdierenarts, het mogelijk maken van een proefverzamelingsperiode om de juiste timing te garanderen en het monitoren van dieren na de adolescentie om een vergelijkende tijdlijn vast te stellen, kunnen statistische analyses nuttig zijn om oorzakelijk verband en / of correlatie toe te schrijven aan eventuele afwijkingen. Na het karakteriseren van de cycli in categorieën (bijvoorbeeld consistent en abnormaal), kan een chi-kwadraatanalyse helpen bij het vergelijken van de groepen. Bovendien kunnen de categoriserende componenten of algemene cycluskenmerken na interventie worden vergeleken met behulp van variantieanalyse (ANOVA)¹¹. Dergelijke afwijkingen kunnen echter niet biologisch zinvol zijn, zoals besproken in de inleiding, en daarom moet de experimentele context worden overwogen.

Figuur 1: Hormoonritmiek in oestruscyclusstadia. (A) De verschillende geslachtssteroïde hormoonspiegels tijdens de prominente oestruscyclusstadia worden geschetst en samengevat. De faseprogressie begint en eindigt met metestrus om de bouwhormoonspiegels en de circulaire progressie van het proces aan te tonen. Aangepast van een externe bron¹¹. (B) Stroom van geslacht steroïde hormonen van het centrale zenuwstelsel naar het voortplantingssysteem via de bloedbaan. Er wordt gezien dat de hormoonspiegels worden verhoogd door signalen van de hypothalamus en hypofyse via respectievelijk gonadotrofine-releasing hormoon (GrH of LHRH) en de combinatie van follikelstimulerend hormoon en luteïniserend hormoon. Dit omvat zowel positieve als negatieve feedbacklussen, afhankelijk van de concentratie van estradiol en progesteron. Informatie¹⁷ en afbeeldingen getraceerd uit externe bronnen 65,66,67. Afkorting: LHRH = luteïniserend hormoon-releasing hormoon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Estrous cyclus categoriserende determinanten gemeten. (A) Hier worden de componenten vermeld die worden gebruikt bij het ensceneren van de verzamelde celmonsters en de dominante componenten voor elke fase. Het is belangrijk om te onthouden dat dit algemene parameters zijn en dat er verschillen worden verwacht. (B) Hier zijn de dominante celtypen aanwezig in elke fase. Hoewel dit algemene delingen zijn, kan elk celtype in alle stadia worden gevonden. (C) Hier worden de celschikkingstypen weergegeven die in dit onderzoek zijn gevonden. (D) De afbeelding hier weerspiegelt de typische celhoeveelheden die aanwezig zijn in elk van de 4 oestruscyclusstadia, waarbij het kwadrantvolume de geschatte celhoeveelheden vertegenwoordigt. Afkomstig van een externe bron¹³ en eerder aangepast⁶⁸. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Vaginale opening bij Sprague Dawley-ratten. (A) Anatomische oriëntatie van de onontwikkelde uitwendige genitaliën en vaginale opening die leiden naar het vaginale kanaal in relatie tot de urethrale opening. (B) Visuele weergave van het onbebouwde gebied, gemarkeerd met een pijl. (C) Anatomische oriëntatie van de ontwikkelde uitwendige genitaliën en vaginale opening in relatie tot de urethrale opening, meestal optredend rond de leeftijd van 34 dagen. (D) Overeenkomstige visuele weergave van het ontwikkelde gebied zoals beschreven in afbeelding A. Alle cijfers zijn afkomstig van een externe bron²⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Categoriseren van determinanten data recording template. (A) Een optie voor data recording; bevat beschrijvingen van categoriserende determinanten. Dit moet dagelijks worden gebruikt, één voor elke rat die wordt gecontroleerd. (B) Dit sjabloon is een optie voor gegevensinvoer, met een vereenvoudigde registratie van de categoriserende determinanten en rattenidentificatie. Hierdoor kunnen notities worden ingevoerd in het gegevensblad in de tweede PRO-categorisatie. De kleur op de bovenste rij weerspiegelt de kleur die is toegewezen aan de vertegenwoordigde experimentele groep, waardoor de ene groep van de andere kan worden onderscheiden. (C) Een andere sjabloonoptie; omvat alle categoriserende determinanten en kan worden gewijzigd op basis van persoonlijke voorkeur of doelstellingen van het onderzoek. Afkortingen: AKE = geanucleeerd verhoornd epitheel; LEU = leukocyten; LNE = epitheel met grote kernen; SNE = epitheel met kleine kernen; C = samengeklonterd; ED = gelijkmatig verspreid; RD = willekeurig verspreid; COM = gecombineerd; SMD = smidge; MOD = matig; NUM = talrijk; EXE = oefening; SED = sedentair; Est = oestrus; Die = diestrus; met-die = metestrus-diestrus overgang; Pro = proestrus; pro-Est = proestrus-oestrus overgang; ** = kwaliteitsvoorbeeld dat nuttig kan zijn in een publicatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Fase-categoriserende determinante variaties. (A) Deze reeks afbeeldingen toont verschillende voorbeelden van de diestrus-fase. De eerste afbeelding (A1) toont een afzetting van slijm vertegenwoordigd door strengen van geconcentreerde LEUs, met epitheelcellen aanwezig in willekeurige uitbetalingen. Dit is een voorbeeld van het belang van het gebruik van zowel de 4x als de 10x vergroting. Deze 4x vergroting lijkt op een proestrusstreng, maar vertoont bij nadere inspectie bij 10x een dominantie van LEUs. De tweede afbeelding (A2) toont wat vaak werd gezien in diestrus-stadia - een dominantie van LEUs gezien naast een samengeklonterde opstelling van epitheelcellen: SNE-, LNE- en AKE-cellen. De laatste afbeelding in deze serie (A3) weerspiegelt een willekeurige uitbetaling van LEUs, vaak gezien binnen de diestrus-fase in het midden van vaginale en zoute vloeistofdruppels. (B) Deze serie afbeeldingen toont verschillende voorbeelden van het proestrusstadium. De eerste afbeelding (B1) toont een samenklontering van SNE-cellen in strengen. De tweede afbeelding (B2) weerspiegelt een dia met een lager totaal aantal cellen en een samenklontering van SNE-cellen. De derde afbeelding (B3) toont de gemeenschappelijke samenklontering en meer willekeurige uitbetaling van SNE-cellen en lage aantallen LEUs en AKE-cellen. (C) Deze serie afbeeldingen toont verschillende voorbeelden van het oestrusstadium. De eerste afbeelding (C1) toont een gemeenschappelijke klonterende opstelling van AKE-cellen, met keratinestaafformaties, in aanwezigheid van SNE-cellen. De tweede afbeelding (C2) toont het samenklonteren van AKE-cellen met spookkernen en bacteriën. De laatste afbeelding (C3) toont een strengachtige rangschikking van AKE-cellen. (D) Deze serie afbeeldingen toont verschillende voorbeelden van het metestrusstadium. De eerste afbeelding (D1) toont de willekeurige uitbetaling en samenklontering van LEUs, SNE-cellen, AKE-cellen en LNE-cellen in aanwezigheid van puin. De tweede afbeelding (D2) weerspiegelt alle celtypen die aanwezig zijn in een klonterende opstelling, naast keratinestaven. De laatste afbeelding (D3) toont een uitgebreidere rangschikking van de aanwezige LEUs-, SNE-, AKE- en LNE-cellen. Deze cijfers, genomen met 4x (A1, A2, B2, B3, D1 en D3) of 10x (A3, C1, C2, C3 en D2) objectivering, zijn ingezoomd om een betere visualisatie van de categorisatiecomponenten mogelijk te maken. Schaalstaven = 100 μm. Voor maatreferentie; AKE-cellen hebben een diameter van ongeveer 40-52 μm, LEUs van ongeveer 10 μm, LNE-cellen van 36-40 μm en SNE-cellen van ongeveer 25-32 μm¹⁶. Afkortingen: SNE = small nucleated epithelial; LNE = epitheel met grote kernen; AKE = geanucleeerd verhoornd epitheel; LEUs = leukocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Voorbeelden van overgangsfasen. (A) Deze reeks afbeeldingen toont voorbeelden van de overgang tussen de DIE- en PRO-fasen. De eerste afbeelding (A1) toont grote klonten en willekeurige uitbetaling van LEUs, SNE, LNE en AKE-cellen. De tweede afbeelding (A2) bevat een grote massa samengeklonterde LEUs en SNE met afgewisselde strengen LEUs. De derde afbeelding (A3) bevat klonten en zelfs uitbetalingen van EEA's en een kleine hoeveelheid SNE's. De vierde en laatste afbeelding (A4) toont zowel samengeklonterde als willekeurig uitbetaalde SNE-cellen en LEUs. (B) Deze afbeelding toont een voorbeeld van de overgang tussen PRO- en EST-stadia met het samenklonteren van SNE- en AKE-cellen. (C) Deze afbeelding toont de samenklontering en willekeurige uitbetaling van AKE-, SNE- en LNE-cellen te midden van puin om de overgang van EST naar MET weer te geven. (D) De eerste afbeelding (D1) toont een voorbeeld van de overgang tussen MET- en DIE-stadia, waarbij rottende epitheelcellen gepaard gaan met een toename van LEUs. De tweede afbeelding (D2) toont AKE-cellen in de aanwezigheid van samengeklonterde LEUs en SNE-cellen die eerder zijn beschreven. Deze cijfers, genomen met de vergroting van 4x (A1, A2, A3, B en C) of 10x (A4, D1 en D2), zijn ingezoomd om een betere visualisatie van de categorisatiecomponenten mogelijk te maken. Schaalbalken = 100 m. Voor groottereferentie hebben AKE-cellen een diameter van ongeveer 40-52 μm, LEUs van ongeveer 10 μm, LNE-cellen van 36-40 μm en SNE-cellen van ongeveer 25-32 μm¹⁶. Afkortingen: AKE = geanucleeerd verhoornd epitheel; LEUs = leukocyten; LNE = epitheel met grote kernen; SNE = epitheel met kleine kernen; C = samengeklonterd; EST = oestrus; DIE = diestrus; PRO = proestrus; MET = metestrus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Ongunstige celmonsterverzamelingen. (A) In deze twee afbeeldingen werden plaveiselcellen uit de vaginale kanaalwand gezogen, naast willekeurig verspreide LEUs. (B) Deze afbeelding bevat een lage hoeveelheid puin, waar cellen niet werden gezien of niet werden verzameld. (C) In dit voorbeeld werd een totaal laag aantal cellen gezien. (D) Op deze twee afbeeldingen (D1 en D2) werden de natriumchloride (NaCl) extractieoplossing en vaginaal vocht gezien en verspreid over de microscoopglaasjes. Deze cijfers, genomen bij de vergroting van 4x (A1, A2 en D1) of 10x (B, C en D2), zijn ingezoomd om een betere visualisatie van de categorisatiecomponenten mogelijk te maken. Schaalstaven = 100 μm. Voor groottereferentie hebben AKE-cellen een diameter van ongeveer 40-52 μm, LEUs van ongeveer 10 μm, LNE-cellen van 36-40 μm en SNE-cellen van ongeveer 25-32 μm¹⁶. Afkortingen: AKE = geanucleeerd verhoornd epitheel; LEUs = leukocyten; LNE = epitheel met grote kernen; SNE = klein nucleated epitheliaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Regelmatig en onregelmatig fietspatroonmonster. (A) Deze afbeelding weerspiegelt in totaal 16 volledige cycli die een repetitief en consistent patroon doorlopen, wat de regelmatige oscillatie van geslachtssteroïde hormonen weerspiegelt. Hierin wordt diestrus vertegenwoordigd door de laagste, proestrus door het midden en oestrus wordt vertegenwoordigd door de balk op de hoogste hoogte. Deze gegevens worden geanalyseerd door de dagen tussen oestrusstadia bij te houden, waarbij elke oestrus-tot-oestrus één volledige cyclus vertegenwoordigt. Deze gegevens weerspiegelen gegevens van de vrouwelijke ratten die in UCLA zijn gehuisvest. (B) Deze afbeelding vertegenwoordigt een theoretische combinatie van verschillende acyclische patronen van 22 ratten. Uitgebreide oestrus kan worden gezien met meerdere repetitieve dagen van staven op volledige hoogte, verlengde diestrus gezien met meerdere repetitieve dagen van de laagste staafhoogte, en de afwezigheid van het cyclische patroon van progressie van diestrus door metestrus. Afkortingen: Est = oestrus; Diest/Die = diestrus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Individuele categoriserende determinanten. (A) Dit gestapelde staafdiagram weerspiegelt elk onderdeel van de gereedschappen die worden gebruikt om individuele monsters te categoriseren die zijn verzameld in de oestrische steekproefstadia. Hier toont een onderwerp dat gedurende 10 dagen werd gevolgd een verscheidenheid aan celtypen, hoeveelheden en arrangementen. Dit wordt verwacht voor adolescente dieren, omdat hormonale niveaus meestal niet consistent worden of regulariseren tot de volwassenheid. (B) Hier wordt een oestrusprofiel gepresenteerd voor een dier dat gedurende 20 dagen is gecontroleerd. Soortgelijke onregelmatigheden zijn hier te zien, waarbij het onderwerp 4 dagen in diestrus bleef versus de typische 1-2. Deze gegevens vertegenwoordigen de 6 vrouwelijke ratten die zijn gehuisvest op Pepperdine University. Afkortingen: AKE = geanucleeerd verhoornd epitheel; LEU = leukocyten; LNE = epitheel met grote kernen; SNE = epitheel met kleine kernen; C = samengeklonterd; ED = gelijkmatig verspreid; RD = willekeurig verspreid; COM = gecombineerd; SMD = smidge; MOD = matig; NUM = talrijk; EXE = oefening ; SED = sedentair; Est = oestrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus.

Figuur 10: Stadiumprofielen. (A) Deze sectie toont de categoriserende determinante gegevens voor individuele ratten gedurende elke dag gecategoriseerd als diestrus. De eerste afbeelding (A1) vertegenwoordigt gegevens die gedurende 10 dagen zijn verzameld en de tweede (A2) gedurende 20 dagen. (B) Deze sectie toont gegevens voor individuele ratten gedurende elke dag gecategoriseerd als proestrus. De eerste afbeelding (B1) vertegenwoordigt gegevens die gedurende 10 dagen zijn verzameld en de tweede (B2) gedurende 20 dagen. (C) Dit geeft gegevens weer voor individuele ratten gedurende elke dag die worden geïdentificeerd als oestrusstadium. De eerste afbeelding (C1) vertegenwoordigt gegevens die gedurende 10 dagen zijn verzameld en de tweede (C2) gedurende 20 dagen. (D) Dit deel van de serie toont de categoriserende componentgegevens voor individuele ratten gedurende elke dag geïdentificeerd als metestrusstadium. De eerste afbeelding (D1) vertegenwoordigt gegevens die zijn verzameld over een periode van 10 dagen en de tweede (D2) gedurende 20 dagen. De gegevens in deze cijfers weerspiegelen die van 6 vrouwelijke ratten gehuisvest aan de Pepperdine University. Afkortingen: AKE = geanucleeerd verhoornd epitheel; LEU = leukocyten; LNE = epitheel met grote kernen; SNE = epitheel met kleine kernen; C = samengeklonterd; ED = gelijkmatig verspreid; RD = willekeurig verspreid; COM = gecombineerd; SMD = smidge; MOD = matig; NUM = talrijk; EXE = oefening ; SED = sedentair; Est = oestrus; Die = diestrus; Pro = proestrus; Met = metestrus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

EST: 10 dagen	Duur (dagen)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	GND (%)	Totaal aantal cellen (%)
	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44.44 NUM: 44.44 SMD: 11.11
Bereiken	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge-talrijk
	Regeling	C: 50 ED: 0 RD: 50	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 50 ED: 0 RD: 50
EST: 20 dagen	Duur (dagen)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	GND (%)	Totaal aantal cellen (%)
	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 NUM: 50 SMD: 0
Bereiken	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge-talrijk
	Regeling	C: 60 ED: 6,67 RD: 33,33	C: 0 ED: 12,5 RD: 87,5	C: 33,33 ED: 0 RD: 66,67	C: 44,44 ED: 0 RD: 55,56

Tabel 1: Gemiddelde steekproef van stadiumdeterminanten. Deze tabellen geven de gemiddelden weer voor de categoriserende determinanten en het overzicht voor alle verzamelde EST-fasen. De bovenste tabel geeft de gemiddelden weer voor alle dieren die gedurende 10 dagen zijn gecontroleerd en de onderste tabel voor 20 dagen. Dit omvat de duur van de oestruscyclus, de celtypen en -percentages en celarrangementen en het percentage van elke rangschikking dat voor elk celtype wordt gezien. Deze gegevens weerspiegelen gegevens van 6 vrouwelijke ratten gehuisvest aan de Pepperdine University. Afkortingen: AKE = geanucleeerd verhoornd epitheel; LEU = leukocyten; LNE = epitheel met grote kernen; SNE = epitheel met kleine kernen; C = samengeklonterd; ED = gelijkmatig verspreid; RD = willekeurig verspreid; EST = oestrus.

Discussion

Belangrijkste stappen en belangrijke overwegingen
Bepaalde kritische stappen in het verstrekte protocol vereisen nadruk, vooral binnen de verzameling vaginale cellen. Tijdens de vaginale vloeistofextractie is het zorgen voor de juiste hoek en diepte van het inbrengen van de spuit de sleutel tot het produceren van bevredigende resultaten en uiteindelijk het voorkomen van irritatie, letsel of cervicale stimulatie van het dier. De stimulatie van de baarmoederhals kan een bron van pseudozwaartekrachtinductie zijn, aangegeven door 12-14 dagen van een vaginaal uitstrijkje met alleen leukocyten¹¹. Tijdens de microscoopevaluatiefase is het cruciaal om je te concentreren op het visuele vlak dat de verzamelde vaginale cellen weergeeft. Dit wordt voltooid door een of twee cellen te identificeren en de visualisatie aan te passen totdat de focus is bereikt.

Hierna vindt het vastleggen van representatieve beelden van de vaginale cellen voor stadiëring plaats door het geheel van de microscoopglaas te scannen. Dit zorgt ervoor dat de vastgelegde beelden een nauwkeurige weergave geven van wat er wordt verzameld en aanwezig is in het vaginale kanaal van de dieren. Vóór categorisatie is bekendheid met de categoriserende determinanten noodzakelijk, zoals het onderscheiden van de celtypen en de verschillende transformaties die elk celtype kan bezitten. Het wordt aanbevolen dat elke deelnemer goed is opgeleid en fase-identificatie oefent door middel van voorbereide oefendia's.

Om de hoeveelheid bias en subjectiviteit die bij het proces betrokken is te verminderen, wordt aanbevolen om twee deelnemers in de categorisatiefase op te nemen, die beide blind blijven voor de toewijzingen van de behandelingsgroep terwijl ze eerder geregistreerde fase-identificaties voor elk dier kennen. Het toewijzen van twee deelnemers om monsters te categoriseren, zorgt voor conferentie en een afname van de subjectiviteit in de identificaties. Als de deelnemers echter afzonderlijk monsters moeten categoriseren, wordt aanbevolen dat er een eerste samenwerkingsperiode is om de betrouwbaarheid van de inter-rater te vergroten naarmate expertise wordt ontwikkeld. Een secundair examensysteem kan worden gebruikt om inconsistente bevindingen te voorkomen, zoals het uitwisselen van datasets na categorisatie en het gebruik van de foto's om de eerste beoordelingen te bevestigen.

Beperkingen en wijzigingen
Beperkingen van de huidige techniek zijn onder meer de duur van de levensvatbaarheid. Vanwege de verwonding of irritatie die gepaard kan gaan met het herhaaldelijk inbrengen van een spuit, is langdurige en terugkerende controle niet afgestemd op de juiste zorg en het juiste gebruik van dieren. Daarom kan het bij het uitvoeren van een longitudinaal onderzoek nodig zijn om de procedure te wijzigen door de frequentie van de lavage te verlagen. In plaats van elk dier eenmaal per dag te volgen, kunnen de ratten bijvoorbeeld worden verdeeld in groepen die op verschillende dagen gedurende de week worden gevolgd. Een tweede beperking betreft de afwezigheid van monsterkleuring in het geschetste proces, zonder scheiding van cellulaire componenten op kleur, waardoor een grotere afhankelijkheid ontstaat van de categorisatiedeterminanten die in het bovenstaande protocol worden vermeld.

Bovendien zijn er binnen dergelijke categorisatiedeterminanten elementen van subjectiviteit die nauwkeurige replicatie kunnen beperken. In het bijzonder zijn de celhoeveelheidspercentages in de verzamelde monsters gebaseerd op persoonlijke schattingen. Wijzigingen in dit verband kunnen het ontwikkelen van een wiskundig algoritme omvatten om de aanwezige individuele celtypen te kwantificeren. Alternatieve aanpassingen kunnen het aantal monsters omvatten dat op één microscoopglaasje wordt gedeponeerd, dat kan worden verhoogd afhankelijk van de grootte van de dia en de afdekking. Verdere beperkingen kunnen het gebrek aan vaginale vloeistofgegevens in deze studie omvatten - een wijziging van toekomstige studies zou kunnen bestaan uit het vastleggen van de omstandigheden van het vaginale vocht dat is verzameld als een bijdrage aan stadiumcategorisatie. Aanvullende wijzigingen van het protocol kunnen het gebruik van een andere isotone vloeistof voor celextractie omvatten, wat dezelfde resultaten zou opleveren, zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing¹³. Ten slotte kunnen bij het toepassen van deze procedure op ratten van verschillende leeftijden of stammen aanpassingen zoals technieken voor het hanteren van dieren nodig zijn vanwege de lichaamsgrootte of het activiteitsniveau. Dit kan de grijpmethode⁶⁹ en de Forelimb Crisscross^64-methoden voor volwassenen en de Een- en Tweehandige Restraint^64-methode omvatten die wordt gebruikt voor jongere ratten.

Alternatieve methoden
In vergelijking met alternatieve methoden voor oestruscyclusmonitoring is de vaginale lavage uniek in zijn nauwkeurigheid, hoeveelheid geproduceerde informatie, minimale invasiviteit en lage bijbehorende kosten. Het histologisch onderzoek van de baarmoeder en eierstokken kan worden gebruikt om cyclusstadia te identificeren, maar is opdringeriger en maakt geen continue monitoring mogelijk. Terwijl het meten van de geslachtssteroïde hormoonspiegels helpt bij het bewaken van de oestruscyclus, vereist het bloedafname en staat het geen karakterisering toe van het unieke cellulaire of vaginale vloeistofprofiel van elk onderwerp. Aangezien de ontwikkeling van externe genitaliën indirect gecorreleerd is met geslachtssteroïde hormoonspiegels, kan het onderzoek van de vaginale opening informatie geven over seksuele rijping. Bovendien is de kleuring van het weefsel, het vochtgehalte, de grootte en de zwelling van de vaginale opening gecorreleerd met de oestruscyclusstadia⁷⁰. De precieze fysiologie die leidt tot het openen van het vaginale kanaal bij ratten moet echter nog volledig worden gerapporteerd. Recente publicaties hebben aangetoond dat dit slechts een indirecte marker is van reproductieve ontwikkeling en niet altijd overeenkomt met puberteit ^31,34. De biochemische analyse van urinemonsters is kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren, maar houdt geen rekening met de specificiteit en betrouwbaarheid van andere methoden⁷¹. Daarom is het niet zo betrouwbaar of geldig als het onderzoeken van de cellen die aanwezig zijn in het vaginale kanaal.

Bovendien is de meting van elektrische impedantie gebruikt om de oestruscyclus te bewaken en is deze minder fysiek irriterend dan de vloeibare lavage. Deze methode biedt echter niet zoveel informatie over de categoriserende componenten. Dit apparaat is speciaal ontworpen om de timing van opzettelijke paring te optimaliseren, waarbij wordt gemeten wanneer de geslachtssteroïdhormoonspiegels het hoogst zijn ^72,73,74. Bovendien is gemeld dat deze methode effectief is om onderscheid te maken tussen EST en niet-EST, maar beperkt is in zijn vermogen om de oestruscyclus buiten die⁷⁵ te volgen. Over het algemeen is gemeld dat deze methode onbetrouwbaar is, niet altijd kosteneffectief en niet vaak wordt gebruikt in de literatuur, wat leidt tot een gebrek aan vergelijkbare gegevens⁷⁴. Hoewel het vaginale wattenstaafje het meest lijkt op de lavage in de informatie die het biedt, bevat het een verhoogd risico op irritatie of letsel, omdat het rechtstreeks contact moet maken met de bekleding van het vaginale kanaal om cellen op te halen. Ten slotte, terwijl het kleuren van de microscoopglaasjes een scherper contrast tussen celtypen kan bieden en het behoud van monsters mogelijk maakt, is het een meer tijdrovende en kostbare onderneming dan de natte houder⁵³. Over het algemeen heeft elke monitoringtechniek zijn beperkingen en voordelen, en het kan nuttig zijn om een combinatie van deze methoden te gebruiken om een uitgebreid onderzoek van de oestruscyclus van knaagdieren te ontvangen.

Toepassingen
Het blijft belangrijk om de huidige studie te zien in de context van de grotere wetenschappelijke gemeenschap en het grote publiek. Deze methodologie kan worden gebruikt in elk project waarbij vrouwelijke dieren worden onderzocht - niet alleen binnen studies die zich richten op opzettelijk fokken, om dieren uit te sluiten die afwijkingen vertonen en / of de functie van de hypothalamus-hypofyse-ovariële as, maar ook voor belangrijke inzichten binnen behandelingsgroepen. Meer specifiek is deze procedure van invloed binnen i) farmacologische studies, omdat verschillende medicijnen en chemicaliën het voortplantingskanaal en de oestruscyclus verstoren of veranderen 11,27,76; ii) neurologische studies, zoals die gericht op traumatisch hersenletsel, cognitie of degeneratieve aandoeningen, als gevolg van interacties tussen geslachtssteroïdhormonen en het zenuwstelsel⁷⁷; iii) onderzoek naar de bloedsomloop als gevolg van geslachtssteroïde hormoonreceptoren op myocyten en de daaropvolgende interacties⁷⁷; iv) onderzoek met betrekking tot botgroei³⁸; naar het endocriene systeem^11,78; en v) andere niet-productieve studies³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4