Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Мониторинг эстрального цикла грызунов с использованием вагинального лаважа: нет такой вещи, как нормальный цикл

Published: August 30, 2021 doi: 10.3791/62884
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2
1Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, 2Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

Summary

В этом исследовании подробно описываются важнейшие факторы, которые следует учитывать в экспериментальных проектах с участием самок крыс. В более широком смысле эти данные служат снижению стигмы и помогают в разработке более инклюзивных диагностических и интервенционных инструментов.

Abstract

Нынешняя методология устанавливает воспроизводимый, стандартизированный и экономически эффективный подход к мониторингу эстрального цикла самок крыс-подростков Sprague Dawley (SD). Это исследование демонстрирует сложность гормональных циклов и широкий спектр понимания, необходимого для построения надежной и достоверной техники мониторинга. Благодаря углубленному изучению основных экспериментальных и процедурных элементов это описание цикла и его основополагающих принципов обеспечивает основу для дальнейшего понимания и деконструирует заблуждения для будущего воспроизведения.

Наряду с описанием процесса сбора образцов с использованием влагалищного лаважа, процедура описывает механизм категоризации данных в четырехступенчатую модель проэструса, течки, метеструса и диэструса. Эти стадии характеризуются новым предлагаемым подходом, использующим 4 категоризирующих детерминанты состояния влагалищной жидкости, типа (типов) клеток, расположения клеток и количества клеток во время сбора. Вариации каждого этапа, благоприятные и неблагоприятные выборки, различие между цикличностью и ацикличностью, а также графические изображения собранных компонентов категоризации представлены наряду с эффективной интерпретационной и организационной практикой данных. В целом, эти инструменты позволяют впервые публиковать поддающиеся количественной оценке диапазоны данных, что приводит к стандартизации коэффициентов категоризации при репликации.

Introduction

Новые вклады
Эстральный цикл грызунов был идентифицирован как важный показатель хорошего самочувствия. Однако бессознательные предубеждения исследователей и неточные интерпретации относительно женского тела мешают научному сообществу. Сама этимология слова «эструс» подразумевает чувство неполноценности и негатива. Еврипид использовал этот термин для описания «безумия» или безумия, Гомер для описания паники, а Платон для описания иррационального влечения. Это исследование подчеркивает, как эти первобытные перспективы влияют на современное научное сообщество и решают эти проблемы с помощью новой мозаичной парадигмы — обновленной комбинации ранее изученных методов, расширенных по охвату для более комплексного подхода.

Изучение и использование этого метода необходимы, во-первых, поскольку не существует стандартизированного и всеобъемлющего метода мониторинга, а практика интерпретации данных может быть неясной. Во-вторых, хотя характеристики эстрального цикла зависят от отдельных изучаемых крыс, они часто универсализируются. В-третьих, хотя гормональные циклы являются рутинными и полезными процессами, они окружены опасной стигмой, исследуемой в разделе «Перевод на людей». Это исследование направлено на решение этих трех проблем тремя способами: (А) путем описания углубленной техники мониторинга эстрального цикла и уточнения того, как результаты могут быть интерпретированы, (В) путем изложения методов, которые поддерживают целостность и индивидуальность каждого цикла, и (В) путем привлечения внимания к заблуждениям, которые увековечивают необоснованную практику.

Это исследование также уникально в своем фокусе на крысах-подростках, период, отмеченный критическими изменениями в развитии, которые проливают свет на различные поведенческие, анатомические и физиологические проявления во взрослом возрасте1. Построение стандартизированной экспериментальной конструкции для мониторинга гормональных циклов в недостаточно изученной популяции при одновременной деконструкции общих предубеждений позволит разработать надежные и достоверные гормональные корреляции 2,3,4 и определить зависящие от состояния нарушения цикла 5,6,7,8,9,10 . В конечном счете, эти новинки служат для расширения диагностических критериев, методов лечения и вмешательств различных проблем здоровья.

Основные определения и виды использования
Эстрозный цикл представляет собой совокупность динамических физиологических процессов, которые происходят в ответ на три колеблющихся женских половых стероидных гормона: эстрадиол, лейтеинизирующий гормон (ЛГ) и прогестерон (рисунок 1А, В). Взаимодействия между эндокринной и центральной нервной системой регулируют цикл, который чаще всего сохраняется в течение 4-5 дней и повторяется с начала полового созревания до репродуктивного старения и / или прекращения. Он делится на отдельные категории в зависимости от уровня гормонов - чаще всего на 4 стадии диэструса (DIE), проэструса (PRO), течки (EST) и метеструса (MET), которые прогрессируют по кругу. Количество делений может варьироваться от 3стадий 11 до 13 стадий12, в зависимости от характера исследования13. Меньшее число делений часто исключает НДПИ как стадию и классифицирует ее как кратковременный переходный период. Большее число обычно включает подразделы, которые позволяют более внимательно изучить такие явления, как развитие опухоли или спонтанная псевдоберемень, физиологическое состояние беременности без эмбриональной имплантации 12,14,15.

В этом исследовании стадии были идентифицированы через компоненты влагалищного канала, названные 3 категоризирующими детерминантами - тип (типы) клеток присутствуют, расположение клеток и количество клеток (рисунок 2A-D). Хотя состояние влагалищной жидкости не контролировалось в этом исследовании, рекомендуется включить ее в качестве четвертого категоризирующего компонента. Дополнительную информацию об исследовании влагалищной жидкости можно найти в списке литературы16. Компоненты категоризации могут быть исследованы путем извлечения клеток с помощью вагинального лаважа, основного метода, рекомендуемого в современном мониторинге эстрального цикла. В то время как углубленные физиологические процессы на каждом этапе выходят за рамки данного исследования, более подробную информацию можно найти в литературе17.

Использование и дальнейшее развитие этого метода мониторинга эстрального цикла коренится в связях между половыми стероидными гормонами и функцией систем организма, таких как сердечно-сосудистая система18, эндокринная система8 и центральная нервная система 19,20,21. В то же время мониторинг эстрального цикла не всегда может быть необходим, когда участвуют самки грызунов 22,23,24,25. Скорее, важно сначала рассмотреть, были ли зарегистрированы половые различия в конкретной области исследования, которые могут быть дополнительно изучены в опубликованных обзорах22,23. Хотя мониторинг эстрального цикла имеет жизненно важное значение в широком спектре исследовательских исследований, его не следует рассматривать как препятствие для включения самок грызунов в эксперименты. Хотя этот метод может показаться сложным и трудоемким, сама процедура может занять менее 15 минут, в зависимости от исследователя, и является экономически эффективной. В целом, включение самок грызунов в научные исследования выгодно для понимания систем организма, различных состояний и патологий, а также общего самочувствия, поскольку эти разработки были в основном основаны на шаблоне мужского тела.

Универсальные параметры и естественные изменчивости у грызунов
Установление диапазонов для аспектов, рассматриваемых как «типичные», необходимо для определения стандартных моделей циклов, задания параметров для сравнительных и аналитических целей и выявления аномалий и выбросов. В то же время важно также признать, что цикл каждой крысы уникален, и ожидаются отклонения, основанные на штамме животных, физиологических процессах и условиях окружающей среды. На самом деле, одним из самых «нормальных» аспектов эстрального цикла является изменчивость. Это видно по общей продолжительности цикла, с диапазоном 3-38 дней26,27; возраст полового созревания, который может варьироваться от 32-34 дней до нескольких недель 28,29,30; то, что считается ациклическим11, и категоризация детерминантных паттернов11,13. В целом, не существует универсального шаблона для эстрального цикла, и перевод его как для научного сообщества, так и для широкой общественности является важной частью экспериментального процесса.

Экспериментальные временные точки и возраст развития
Признание этого принципа изменчивости помогает в построении надежного и обоснованного экспериментального проекта. Например, начало мониторинга эструсного цикла зависит от анатомического и физиологического развития крыс, которое варьируется в зависимости от экологических и физиологических факторов. Мониторинг не может начаться до развития влагалищного отверстия (VO), которое представляет собой наружное влагалищное отверстие, окруженное вульвой, которая ведет во внутреннюю часть вагинального канала (рисунок 3A-D). В то время как VO часто полностью развивается в возрасте от 32 до 34 дней, он остается индивидуализированным для каждого субъекта, и многое в этом процессе остается неизвестным. Это отверстие было использовано для выявления начала полового созревания, которое было связано с увеличением эстрадиола31, созреванием гипоталамо-гипофизарно-яичниковой оси32 и первой овуляцией у крыс 17,33,34,35. Тем не менее, недавние публикации показали, что он является лишь косвенным маркером репродуктивного развития, поскольку он может стать несвязанным с гормональными явлениями и явлениями развития в неблагоприятных условиях31 и может представлять изменения в уровнях эстрадиола, а не половое созревание33. Поэтому рекомендуется не полагаться исключительно на VO для определения возраста развития и в качестве квалификатора для мониторинга эстрального цикла36, но также использовать появление первой стадии EST и ороговение эпителиальных клеток30, чтобы отметить начало полового созревания.

Масса тела заметно коррелирует с возрастом развития в подростковом периоде у грызунов30,37 и поэтому также может помочь в определении возраста развития в этот период. Предложенные механизмы, связанные с этим явлением, включают стимуляцию гормонов, необходимых для репродуктивного развития, таких как гормон роста, и ингибирование гипоталамо-гипофизарной надпочечниковой оси (HPA) регулятором аппетита, лептином30. Тем не менее, не рекомендуется использовать этот показатель в качестве единственного показателя возраста развития из-за большой разницы, наблюдаемой между крысами между видами и поставщикамипоставщиков 38. Изменчивость, наблюдаемая в развитии VO и массы тела, иллюстрирует важность концепции в общем экспериментальном процессе.

Перевод на человека: культурный и научный контекст
Трансляционная связь репродуктивных исследований животных и человека является двунаправленной. Результаты исследований на животных влияют на то, как оцениваются, подходят и анализируются человеческие процессы39. Восприятие репродуктивной системы человека и связанных с ней процессов влияет на то, как изучаются животные. На самом деле, одним из самых громких указаний для дальнейших исследований в этой области являются предвзятые социокультурные убеждения, связанные с гормональными циклами, которые влияют на научный процесс. Многие из этих условностей проистекают из общего культурного отвращения к обсуждению менструации, что привело к пробелу в данных в хорошо обоснованных знаниях40,41. Это имеет спектр последствий, которые варьируются от незначительных до смертельных — от высоты стеллажей и размера смартфона до полицейской установки бронежилетов и пропущенных диагнозов рака42.

Описание менструации как антисанитарной, разрушительной и токсичной, которую можно увидеть в почитаемых текстах, средствах массовой информации, словарях и медицинских учениях, сохраняется научными публикациями. Это происходит из-за неточных и предвзятых описаний гормональных циклов, изоляции репродуктивной системы от ее нейроэндокринных аналогов и влияний окружающей среды, а также редукционистской перспективы завершения цикла как «неспособности забеременеть»43,44. Это приводит к созданию необоснованных экспериментальных практик, таких как отсутствие внешних переменных, которые влияют на гормональные циклы, определение начальных и конечных точек, основанных исключительно на анатомических разработках, и измерение продвижения цикла линейным, а не круговым образом. Несмотря на прямую корреляцию между социокультурными факторами и биологическими последствиями, она не часто рассматривается в научной литературе. Изучая более целостные публикации 43,44,45, исследователи могут деконструировать эти стигмы и создавать более надежные и валидные экспериментальные проекты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы обработки и процедуры, изложенные в этом протоколе, соответствуют руководящим принципам по уходу за животными и их использованию Национальными институтами здравоохранения (NIH) и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Пеппердайна и Комитетом по исследованиям животных канцлера UCLA (ARC).

1. Уход за животными и их использование

  1. Приобретайте самок крыс, в количестве в соответствии с анализом мощности, и самцов крыс, чтобы способствовать эффекту Уиттена или более последовательному циклу46. Определить штамм исходя из цели исследования в известных базах данных47.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Текущие данные отражают данные о женском подростковом SD International Genetic Standardization Program (IGS) в присутствии самцов крыс SD, расположенных как в лабораториях Университета Пеппердайна, так и в лабораториях UCLA в рамках совместного исследования. Эти крысы прибыли в отдельные группы в возрасте 28 дней, и прогрессирование эстрального цикла контролировалось в течение 10 или 20 дней, чтобы продемонстрировать различия в остром и хроническом уровнях, начиная с 34-дневного возраста (после 7-дневного периода акклиматизации).
  2. Перед обработкой предусмотреть карантин и/или период акклиматизации для физиологической стабилизации после транспортировки и адаптации к новой среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Был указан 3-дневный минимальный период, а рекомендуемый 7-дневный период составляет 48,49,50,51,52. В целом, это зависит от условий транспортировки, штамма животных и целей исследования.
  3. Убедитесь, что стресс уменьшается с использованием акклиматизационного периода, так как стресс может нарушить правильное функционирование репродуктивной системы53. Тем не менее, не перекомпенсируйте, пытаясь устранить его, так как умеренное количество стресса полезно для благополучия животных51.
  4. Крысы-хозяева в температурной (68-79 ° F, то есть 20-26 ° C) и контролируемой влажности (30-70%) среде, связавшись с виварием или менеджерами лаборатории и обеспечив эти особенности. Раздавайте воду и чау ad libitum с питательными компонентами, перечисленными на сайте компании, и чистите клетки раз в неделю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании крысы были размещены в группах по 2 человека, разделенных по полу в прозрачных многоразовых пластиковых клетках размером 19 дюймов x 10 x 8 дюймов, и имели доступ к подстилке из кукурузного початка, которая менялась один раз в неделю. Температура поддерживалась на уровне 70 ° F и влажность на уровне 35-79%, в среднем 62%.
  5. Проверьте наличие развития кольцехвостого или ишемического некроза хвоста и пальцев ног на наличие низких уровней относительной влажности и экстремальных температур, которые могут вызвать чередование биологических реакций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура и влажность важны для репродуктивной системы, полового созревания и эстральной цикличности 54,55,56,57,58.
  6. Обеспечьте надлежащее и сбалансированное освещение по всему пространству корпуса, оседая равное количество источников света по всему лабораторному пространству, которые действуют на контролируемую временем систему свет: темнота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь цикл 12:12-h light:dark, с включенным светом с 06:00-18:00 ч, управлялся линейными светодиодными лампами с яркостью 2 550 люмен.
  7. Соблюдайте требования люкса, предоставленные52 на основе вариаций пигментации животных, возраста, штамма, пола и гормонального статуса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда исследователи классифицируют собранные образцы клеток, последовательное освещение позволит обеспечить надлежащее визуальное обнаружение и надежное определение59. Продолжительность и интенсивность света напрямую связаны с репродуктивной системой, половым созреванием и эстральным циклом 54,55,56,57,60,61.

2. Оборудование и подготовка экспериментов

  1. Рассмотрим детерминанты категоризации (см. рисунок 2A): как идентифицировать каждую стадию эстрального цикла и как управлять микроскопом и оборудованием камеры.
  2. Убедитесь, что каждый субъект, подлежащий наблюдению, достиг полового созревания и показал соответствующие показатели развития — VO, массу тела и возраст. Взвешивайте крыс и исследуйте их на предмет VO между собой в одно и то же время каждый день для точных сравнений и передавайте их с помощью утвержденного метода обработки. Проконсультируйтесь с университетским ветеринаром, если животное теряет более 20% от своей предыдущей массы тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: VO остается каудальным к отверстию уретры и черепным к анусу, расположенным между ними, как показано на рисунке 3.
  3. Поскольку эти факторы зависят от деформации, проконсультируйтесь с поставщиком о спецификациях и рассмотрите факторы окружающей среды, характерные для лаборатории62.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, это происходит в возрасте 32-34 дней и средней массы тела в диапазоне от 75-150 граммов63 для крыс SD и обозначено кругловидным отверстием, ранее покрытым мембранной оболочкой.
  4. Выберите период сбора проб, подходящий для группы крыс, находящихся под наблюдением, чтобы предотвратить сбор переходных образцов. Во-первых, отбирайте несколько животных в 2 или 3 разных временных точках в течение дня, чтобы определить время, в котором присутствует большинство стадий цикла (например, отбор проб в 12:00 часов, 13:00 часов и 14:00 часов для разных животных). Завершайте промывание влагалища в одно и то же время каждый день для последовательной и надежной постановки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сообщалось, что часы между 12:00 и 14:00 лучше всего подходят для захвата всех этапов. В этом исследовании мониторинг эстрального цикла происходил между 12:00 и 14:00 ч, обрабатывался с помощью удержания в стиле сжатия (см. шаг 3.4). Важность мониторинга эстрального цикла по сравнению с другими экспериментальными вмешательствами (например, поведенческим обусловливанием, лекарствами) является развивающейся областью исследований и может быть дополнительно изучена11. Определение продолжительности мониторинга эстрального цикла зависит от исследования и может быть дополнительно изучено в опубликованных исследованиях 11,33.
  5. Снимите защитную крышку с микроскопа и прикрепите камеру к компьютеру, сняв защитную крышку объектива камеры и поместив объектив над окуляром микроскопа.
  6. Затем откройте предварительно выбранное программное обеспечение на компьютере. Чтобы использовать программное обеспечение, выбранное в этом исследовании, выберите камеру, подключенную к USB-накопителю, расположенную в левой части экрана, на вкладке Список камер. Убедитесь, что USB-камера правильно подключена к компьютеру, который будет читать Нет устройства под вкладкой Список камер, если нет.
  7. После того, как USB-камера была выбрана под вкладкой, включите выключатель света микроскопа, расположенный на основании.
  8. Создайте папку на компьютере, предназначенную для фотографий образцов ячеек. Создайте папку с файлами для каждого отдельного дня сбора данных, предварительно подготовленную перед съемкой изображений.
  9. Подготовив оборудование, извлеките клетку субъекта из места хранения и доставьте ее на станцию сбора проб.

3. Коллекция вагинальных клеток

  1. Достаньте одноразовый шприц и наполните каждый из шприцев 0,2 мл стерильного 0,9% NaCl. Если пузырьки воздуха присутствуют, осторожно проведите шприцем ствола до тех пор, пока все пузырьки воздуха не достигнут открытого кончика шприца, и вытолкните воздух. Если пузырьки воздуха все еще присутствуют, выталкивайте раствор обратно в сосуд NaCl и заправляйте его до тех пор, пока его не станет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное мерцание может привести к образованию большего количества пузырьков воздуха.
  2. Верните каждый шприц в полиэтиленовую пленку для поддержания стерильного поля, с наконечником шприца внутри герметичной части упаковки.
  3. Откройте клетку и осторожно поднимите предмет либо за основание хвоста, либо за туловище тела, закрыв крышку клетки, чтобы другие не выходили. Выберите метод удержания из перечисленных ниже на основе личных предпочтений и реакции животных.
  4. Используйте компрессионное удержание для крыс-подростков, поместив объект против верхней части груди, при этом нос субъекта направлен вниз на землю. Перед началом мазка убедитесь, что предмет достаточно сжат, чтобы предотвратить движение, но удобен и безопасен в трюме. Обнажите влагалищный канал субъекта, осторожно согнув хвост перед введением шприца.
  5. Используйте подтяжку задних ног для взрослых крыс, поместив передние лапы животного либо на верхнюю, либо на боковую часть клетки, в то время как хвост и задние конечности удерживаются мягким удержанием между первым и вторым пальцами, оставляя большой палец свободным для управления шприцем64.
  6. Позвольте животным акклиматизироваться к обращению и мониторингу. Обращайтесь с животными осторожно, но надежно, чтобы уменьшить избыточный стресс и защитить исследователя от агрессии, такой как укусы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первые несколько дней мониторинга могут не дать желаемых результатов, поскольку животные приспосабливаются к своим условиям. Обращение с животными для сбора массы тела в течение акклиматизационного периода может помочь этому переходу33.
  7. Удерживая шприц неподвижно указательным и средним пальцем, вставьте кончик шприца (не более 2 мм) под углом, параллельным вагинальному каналу. Медленно выталкивайте NaCl в канал, толкая поршень внутрь. Не вставляйте шприц дальше в канал, так как это может нарушить эстральный цикл.
  8. Извлеките NaCl из влагалищного канала, оттянув поршень шприца от эпителиальной оболочки (вверх). Если во время этого процесса возникают трудности с удержанием предмета, поместите его обратно в клетку на короткий период отдыха, прежде чем пытаться извлечь NaCl.
  9. После того, как образец клетки был собран, поместите субъекта обратно в клетку и повторите эту процедуру для каждого животного, прежде чем все образцы будут оценены под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, каждый образец может быть собран и оценен, прежде чем перейти к следующему животному. Животному может потребоваться повторное промывание, если образец не может быть классифицирован. Тот же шприц из первоначального сбора может быть использован повторно, если он не контактирует с физиологическим раствором непосредственно в контейнере и только для того же животного.

4. Оценка образца

  1. Начните категоризацию с изучения извлеченного образца влагалищной жидкости. Запишите вязкость как вязкую или невязкую, а окраску как непрозрачную или прозрачную в описанном документе или другой системе регистрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола может быть выполнен во время сбора пробы или позже.
  2. Вытолкните 2-3 капли жидкости на предметное стекло микроскопа и поместите закрывающее стекло микроскопа поверх слайда. Поместите покровное стекло на предметное стекло микроскопа от верхней части слайда к низу или с одной стороны слайда на другую, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Если возможно, оставьте примерно половину собранного образца в шприце, если требуется дальнейшее исследование, и предотвратите попадание избыточного количества жидкости на слайд.
  3. Найдите собранные клетки, перемещая слайд микроскопа по сцене. Если клеток слишком мало или большое количество мусора, выталкивайте оставшуюся жидкость на новый слайд и повторно исследуйте. Если количество образца, оставленного в шприце, недостаточно, или если вторая капля представляет аналогичные проблемы, возьмите другой образец у субъекта, прежде чем пытаться определить стадию эстрального цикла.
  4. После того, как ячейки были найдены и перед прикосновением к компьютеру или клавиатуре компьютера, снимите одну перчатку, чтобы предотвратить загрязнение клавиатуры.
  5. Получите изображения образцов клеток, нажав на функцию с надписью Snap в левой части панели программного обеспечения.
  6. Затем сохраните файл, нажав « Сохранить как » под значком «Файл» в левом верхнем углу страницы. Сохраните фотографию в предварительно помеченной папке на компьютере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример шаблона этикетки: используется #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective объектив.
  7. Сделайте более одной фотографии на каждом объективе, если в каждом кадре не так много ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры меток для нескольких изображений: #1_01/09/2021_EST_4x1 и #1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. Повторите процедуру для каждого собранного образца под несколькими объективами. Включите, по меньшей мере, одну меньшую объективацию, такую как 4x, и, по меньшей мере, одну большую объективацию, такую как 20x.
  9. Загрузите изображения на общий диск / папку или внешний жесткий диск, чтобы все участвующие исследователи имели доступ к файлам, и были доступны резервные копии.

5. Категоризация этапов

  1. Настройте экран компьютера для одновременного просмотра сделанных фотографий и листа записи (рисунок 4A-C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит получить документацию при просмотре собранного образца. Эта часть протокола может быть завершена во время сбора пробы или позже.
  2. Определите, какие типы ячеек присутствуют в образце. Выберите один из четырех вариантов, перечисленных в шагах 5.2.1-5.2.4, используя критерии, и запишите результаты.
    1. Ануклеированные ороговевшие эпителиальные (AKE)/ороговевшие эпителиальные клетки
      1. Ищите зубчатые или угловатые клетки, как показано на рисунках 2B и 5C, которые, несмотря на отсутствие ядер, могут показывать легкие круглые области (ядерные призраки) внутри клетки, которые представляют, где когда-то присутствовало ядро. Используйте более высокое увеличение, такое как 20x и выше, чтобы дифференцировать такие ядерные и ануклеированные клетки.
      2. При желании используйте более высокое увеличение, чтобы различить ороговевшую или ороговевшую часть клетки — тонкий слой клеток, лишенных ядер и заполненных кератином.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к их зубчатому внешнему виду, их также можно отличить по тому, как они могут складываться или разбираться, создавая зубчатые и удлиненные структуры, известные как кератиновые стержни.
    2. Крупные ядро эпителиальных (LNE) клеток
      1. Ищите эти типично круглые или полигональные ячейки, заключенные в неправильные, зубчатые или угловые границы.
      2. Наблюдайте, как их ядра могут принимать различные формы, начиная от интактных до дегенеративных или пиконтических, связанных с необратимой конденсацией хроматина в ядре клетки, подвергающейся смерти или ухудшению, как показано на рисунке 2B и рисунке 5D1,2. Обратите внимание на то, что эти ядра занимают меньше места, чем цитоплазма внутри клетки, с более низким соотношением ядерных к цитоплазматическим (N: C), чем маленькие эпителиальные клетки. Обратите внимание на цитоплазматические гранулы, которые можно увидеть при более высоких увеличениях13.
    3. Лейкоциты (НОУ)/нейтрофилы/полиморфноядерные клетки
      1. Ищите эти компактные сферические клетки с многодольчатыми ядрами (следовательно, известные как полиморфноядерные клетки), которые исчезают по мере созревания клетки (рисунок 2B и рисунок 5A). Более высокое увеличение (например, 40x) может быть использовано для наблюдения многодольчатых ядер.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе и подготовке эти клетки могут конденсироваться, складываться или разрываться.
    4. Малые ядро эпителиальных (SNE) клеток
      1. Обратите внимание на эти круглые и овальные клетки, которые больше, чем нейтрофилы, описанные выше.
      2. Наблюдайте за круглыми ядрами этих некератинизированных эпителиальных клеток (рисунок 2B), которые занимают большее количество пространства, чем цитоплазма внутри клетки, создавая более высокое соотношение N:C относительно крупных эпителиальных клеток.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора и подготовки эти ячейки могут складываться или перекрываться, чтобы создать форму, похожую на строку или полосу, как показано на рисунке 5B1.
  3. Изучите, как ячейки, присутствующие в образце, организованы для каждой объективации. Используйте более низкую объективацию, например 4x, чтобы просмотреть репрезентативное представление общего расположения ячеек. Запишите, слипаются ли клетки вместе (C), равномерно диспергированы (ED) или случайно диспергированы (RD) (см. Рисунок 4C), и обратите внимание на специфическую организацию каждого типа клеток (например, небольшие ядерные эпителиальные клетки слипаются, а нейтрофилы равномерно распределены).
  4. Затем визуально оцените и запишите общее количество клеток (небольшое, умеренное, многочисленное) и отдельные количества клеток (процент от каждого присутствующего типа клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Smidge представляет наименьшее количество присутствующих ячеек, которые могут быть использованы для определения категоризации образцов, многочисленные представляют собой наличие бесчисленного количества ячеек, которые либо составляют большинство, если не все пространство на слайде, либо укладываются друг на друга, а умеренное количество ячеек представляет собой сравнительно среднее количество ячеек (примеры, показанные на рисунке 5A-D и рисунке 6A-D).
  5. Обратите внимание, есть ли какие-либо отклонения от перечисленных критериев или аспектов, которые типичны для конкретного субъекта в категории «аномалии», и проконсультируйтесь с ветеринаром, если это необходимо.
  6. Определите, какая стадия эстрального цикла представлена в выборке, используя компоненты категоризации и описания ниже.
    1. Умирать
      1. Ищите НОУ как доминирующий или единственный присутствующий тип клеток, расположенный слипшимся образом в начале DIE, но более рассеянный на поздних стадиях.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При переходе в DIE количество клеток может уменьшаться по мере того, как эпителиальные клетки начинают разрушаться, как показано на рисунке 6D1. В то же время количество НОУ начинает увеличиваться, и они, как правило, изначально располагаются в слипанном виде и рассеиваются со временем.
      2. Обратите внимание, что общее количество клеток может быть сравнительно низким, чаще всего на поздних стадиях периода ДИЭ, на второй или третий день.
      3. Обратите внимание на большое количество слизи, которая может присутствовать на этой стадии, которая проявляется в виде концентрированных нитей НОУ (рисунок 5A1). Обратите внимание на небольшие сгустки или клеточные нити клеток SNE, сопровождающие НОУ во время поздних фаз перехода к PRO (рисунок 5A1,2).
      4. Наблюдайте за вязким и непрозрачным внешним видом влагалищной жидкости при переходе внутрь, полном переходе внутрь и выходе из ДИЭ.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя продолжительность этой стадии составляет 48 ч в течение 4-дневного цикла и, возможно, 72 ч в течение 5-дневного цикла.
    2. Профессионал
      1. Ищите клетки SNE в качестве доминирующих клеток и клетки LEU, LNE и / или AKE, которые можно увидеть в небольшом количестве. Используйте высокую объективацию для наблюдения за зернистым внешним видом клеток SNE, которые обычно расположены в кластерах, листах или нитях на этом этапе (рисунок 5B1,2).
      2. Наблюдать за вязким и непрозрачным внешним видом влагалищной жидкости при переходе из DIE в PRO, и как она становится невясткой и прозрачной после полного перехода в стадию PRO (средняя продолжительность 14 ч у крыс).
    3. Эст
      1. Ищите доминирование клеток AKE, уменьшение клеток SNE в EST и увеличение количества и размера клеток, поскольку EST продолжается11,13.
      2. Обратите внимание на отличительную особенность часто кластеризованного расположения клеток AKE, в виде кератиновых стержней или содержащих призрачные ядра, которые могут стать более хаотично рассеянными при переходе от PRO (рисунок 6B) к MET (рисунок 6C).
      3. Наблюдайте за характерной невязкой и прозрачной вагинальной жидкостью, которую можно ожидать, когда крысы переходят в EST, полностью переходят в НЕЕ и выходят из нее.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Прогрессия EST включает в себя значительную диверсификацию (рисунок 5C и рисунок 6B, C). Стадия обычно происходит в среднем в течение 24 часов в 4-дневном цикле или, возможно, 48 часов в 5-дневном цикле.
    4. Встреченный
      1. Ищите большее количество клеток SNE и LNE, поскольку крыса переходит в MET, либо доминирующую с точки зрения доли клеток в канале, либо близкую к равной пропорции к НОУ11,13. Кроме того, обратите внимание на большее количество мусора в MET и переходах, чем на других стадиях из-за распада эпителиальных клеток после EST и перемещения в DIE.
      2. Наблюдают за отсутствием последовательного расположения, так как все типы клеток видны и в различных количествах (рисунок 5D1-3). Тем не менее, ищите НОУ, которые упакованы или сгруппированы в непосредственной близости от эпителиальных клеток на начальных стадиях, которые могут вернуться к слипшемуся расположению при переходе в DIE.
      3. Наблюдайте за невястистым и прозрачным внешним видом влагалищной жидкости на этой стадии и изменением на более вязкий и непрозрачный вид при переходе в DIE.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя продолжительность этого этапа составляет 6-8 ч.
  7. Маркировка образцов в переходах со стадией, к которой движется субъект, с переходом в скобках, чтобы отслеживать, когда они собраны. Дополнительную информацию о том, как различать эти 4 этапа и их переходы, можно найти в Репрезентативных результатах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку собранные образцы статичны, а цикл динамичен, на слайдах могут быть изображены переходы между этапами (см. рисунок 6A-D).
  8. Завершите этот процесс для каждого животного до тех пор, пока не будет завершен этап мониторинга.
  9. В любой день 11 (45-дневный возраст) или 21-дневный (55-дневный возраст) усыплите крыс 5% изофлурана и 2% кислорода перед обезглавливанием гильотины. Эти временные точки могут варьироваться в зависимости от характера исследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Текущие данные отражают данные о женском подростковом SD International Genetic Standardization Program (IGS) в присутствии самцов крыс SD. Эти животные были обнаружены как в лабораториях Университета Пеппердайна, так и в лабораториях UCLA в рамках совместного исследования. На рисунке 5 представлены множественные вариации 4 этапов цикла. Рисунок 5A1 был идентифицирован как образец диэструса с несколькими типами клеток. В этом примере показано, что образцы с большим количеством эпителиальных клеток квалифицируются как диэстры, когда они соответствуют другим классификационным характеристикам компонентов, таким как доминирование НОУ. Этот образец также продемонстрировал расположение слизистых нитей, состоящих из НОУ, часто наблюдаемое на этой стадии, которое напоминает нити, состоящие из клеток SNE, наблюдаемых на стадии PRO. Чтобы отличить слизистую нить на стадии DIE от нитей, которые появляются на стадии PRO, состоящей из клеток SNE, важно определить доминирование НОУ. На рисунке 5A2,3 показана часто наблюдаемая прогрессия расположения клеток — первоначальное слипание НОУ, которые собираются и перемещаются к случайному (RD) или даже распределению (ED) в образцах, собранных в более поздние периоды стадии DIE. В частности, рисунок 5A2 представлял собой образец DIE с многочисленными присутствующими клетками. Это отражает то, как НОУ могут также сопровождаться большим количеством эпителиальных клеток (рисунок 5А1,2), отличающихся от метеструса доминированием НОУ и отсутствием кератиновых стержней. Напротив, рисунок 5A3 показывает, что низкое общее количество клеток (smidge) обычно наблюдалось во время более поздней фазы стадии DIE, например, во второй или третий день. На стадии PRO клетки SNE часто располагались в нити с многочисленными клетками, уложенными друг на друга (рисунок 5B1) или небольшим количеством клеток, расположенных в более мелкие сгустки (рисунок 5B2). Рисунок 5B3 иллюстрирует образец PRO с характерным листообразным сгустком клеток SNE, которые перекрываются и образуют полосы, которые можно спутать с кератиновыми стержнями, состоящими из клеток AKE, присутствующих на стадии EST. Чтобы различить их, важно определить доминирование клеток SNE в PRO и клеток AKE в EST.

Рисунок 5C1,2 демонстрирует типичное слипание и случайную выплату клеток AKE, наблюдаемых в EST, причем первые включают многочисленные ячейки, а вторые - умеренное количество. Призрачные ядра, кератиновые стержневые образования и бактерии, часто собранные на этой стадии, видны в этих примерах. Клетки SNE иногда представлялись на стадии EST (рисунок 5C1) как остатки предыдущей стадии PRO. Поздняя стадия EST, когда клетки SNE начинают появляться по мере продвижения субъекта к MET, часто ошибочно принимается за стадию PRO. Чтобы провести различие между ними, важно учитывать ядерный размер. В целом, ядерные клетки PRO имеют более высокое соотношение N:C. Образец, показанный на рисунке 5C3 , представлял собой нитевидное расположение многочисленных клеток AKE, которое не рассматривалось как характеристика стадии EST. Это показывает, что каждое животное уникально, что могут возникать отклонения от критериев и что детерминанты категоризации должны быть исследованы в комбинации.

Чтобы различать EST и PRO, когда присутствуют клетки SNE, было замечено, что более низкое соотношение N: C произошло в этих клетках на стадии EST. Чтобы отличить кератиновые стержни, присутствующие в EST, от тех, которые образуются в результате перекрытия или сворачивания клеток SNE на стадии PRO (рисунок 5B3) и тех, которые образуются в результате распадающихся эпителиальных клеток при переходе от MET (рисунок 6D1), важно определить тип доминирующей клетки, расположение и количество, чтобы различить представленную стадию. Наконец, рисунок 5D1,2 иллюстрирует комбинацию всех типов клеток, присутствующих в случайной выплате, представляющей стадию MET. В дополнение к многочисленным клеткам, присутствующим в этих примерах, было распространено собирать большее количество мусора на этой стадии (рисунок 5D2) из-за распада эпителиальных клеток после EST и перехода в DIE с доминированием НОУ, которые функционируют для очистки влагалищного канала от эпителиальных клеток. На рисунке 5D2 также показано, как MET можно отличить от DIE по его более высокой концентрации эпителиальных клеток и наличию кератиновых батончиков. В целом, эти представления изображают широкий спектр, который существует на каждом этапе и является неисчерпаемым.

Представления 4 переходных фаз показаны на рисунке 6. Хотя это исследование классифицировало образцы в переходном периоде как одну из 4 стадий эстрального цикла, по-прежнему важно правильно определить переходные фазы. При переходе от DIE к PRO (рисунок 6A) часто наблюдалось общее уменьшение количества НОУ и увеличение числа клеток SNE. Клетки LNE и AKE иногда присутствовали в этом переходе, хотя и не в больших количествах (рисунок 6A1). На рисунке 6A2-4 показано большее количество слипшихся и случайно рассредоточенных клеток SNE, которые часто собирались во время этого перехода, с низким количеством случайно и равномерно рассредоточенных НОУ. В целом, при различении от других переходных стадий важно было отметить доминирование клеток SNE и начало образований сгустков и нитей, наблюдаемых при PRO. Все примеры на рисунке 6A представляют собой большое количество ячеек, за исключением рисунка 6A4 с небольшим количеством ячеек. На рисунке 6B показан пример многочисленных слипшихся ячеек SNE и AKE, которые видны при переходе от PRO к EST.

Во время этого перехода клетки SNE, как видно, находятся в большем количестве с менее сгруппированными и более случайными распределениями клеток AKE, чем во время EST. Рисунок 6C показывает появление AKE, SNE и LNE и уменьшение клеток AKE при переходе от EST к MET с большим количеством клеток. Присутствующий мусор представляет собой распадающиеся клетки AKE от предыдущей стадии течки, часто наблюдаемой у метеструса. Это также наблюдается на заключительной стадии перехода, от MET к DIE, где эпителиальные клетки начали распадаться и производить мусор (рисунок 6D1,2), с многочисленными клетками, присутствующими в первом и умеренным количеством во втором. Эти цифры показывают феномен увеличения количества НОУ, чтобы стать доминирующим типом клеток при переходе к диеструсу. Для группы, контролируемой в течение 20 дней (n = 3), было 12 дней, когда были собраны переходные образцы, в среднем 4. Для группы, контролируемой в течение 10 дней (n = 3), было 9 дней, когда были собраны переходные образцы, в среднем 3.

На рисунке 7 представлены неблагоприятные сборы образцов клеток, большинство из которых требовали повторных промываний. На рисунке 7A1 показана масса плоских клеток, собранных из-за неправильного введения и извлечения шприца, в результате чего плоские клетки отсасываются от стенки влагалищного канала. Эти клетки можно отличить от слипшихся эпителиальных клеток или НОУ благодаря высокой плотности и компактности массы и ее отличительным границам. Рисунок 7В представляет собой совокупность обломков, где либо не было извлечено клеток, либо плоскость фокусировки неверна, либо слайд не был полностью отсканирован на наличие ячеек. Мусор можно отличить от клеток благодаря знакомству с типами клеток и часто отличительным небольшим размером и слипанием. Этот мусор часто происходит от подстилки животных, волос или распада клеток. На рисунке 7C показан слайд, содержащий количество ячеек, которое находится ниже smidge. В то время как низкое количество клеток обычно наблюдалось во время позднего MET и раннего DIE, это представляет собой слайды, которые имеют слишком мало клеток, чтобы точно классифицировать их в стадию.

На рисунке 7D показаны два примера экстракционного раствора NaCl в сочетании с вагинальной жидкостью из канала на предметном стекле микроскопа. На первом изображении, рисунке 7D1, жидкость присутствовала и не фокусировалась, препятствуя способности точно классифицировать. На рисунке 7D2 жидкость была распределена по слайду по сплоченным кругам рядом с НОУ. Хотя этот пример не требует повторного промывания из-за высокого присутствия клеток, важно учитывать количество жидкости, помещенной на слайд, и размещение предметного стекла микроскопа для предотвращения мазков. В целом, эти изображения подчеркивают важность захвата качественных репрезентативных изображений для правильной категоризации. Это включает в себя рассмотрение способа извлечения ячеек, плоскости фокусировки и содержимого изображения путем сканирования каждого слайда перед захватом изображения.

После категоризации каждого животного в экспериментальной группе (группах) обычно строят график прогрессии стадии на гистограмме или линейном графике. Это позволяет исследователям изучить общую картину цикла и определить, когда животное представляет нерегулярную прогрессию эстрозных стадий, известную как ацикличность. Затем образцы могут быть проанализированы по длине цикла и схеме прогрессии стадии в этом инструменте анализа. Показанная на рисунке 8A, B, эта концепция включает в себя назначение стержней различной высоты, в случае этого исследования, отдельным этапам и перевод записанных данных (рисунок 4B) по оси X. В этих примерах MET и DIE представлены самым низким, PRO - серединой, а EST - самой высокой высотой бруса. Из-за короткой продолжительности стадии MET она объединяется со стадией DIE в один бар. Хотя существуют различные методы измерения завершения цикла, обычно один полный цикл считается движением от одного EST к другому11. Однако это отражает не завершение цикла, а продолжительность 2-дневного этапа EST, когда есть последовательные этапы EST.

Рисунок 8А отражает данные крысы, которая прогрессирует через последовательную и повторяющуюся прогрессию через MET/DIE, PRO и EST. Кроме того, эта крыса попала в диапазон от 4 до 5-дневных циклов при средней длине 4,375. Каждый этап не превышает стандартизированных диапазонов длины, в среднем 1,0625 дня, проведенных в EST, типичная оценка ацикличности. Если извлеченные данные следуют этой схеме от EST до EST с регулярностью, это подтверждает не только то, что уровни гормонов субъекта оставались в допустимых диапазонах, но и то, что процедура была проведена без существенного прерывания циклического характера процесса. Наконец, эта крыса выполнила 16 циклов, определяемых путем подсчета количества полос EST до EST.

На рисунке 8B представлены распространенные типы ацикличности, включая расширенные (рассматриваемые как EXT) и незарегистрированные стадии. Эта цифра также подчеркивает важность изучения как структуры цикла, так и продолжительности и количества дней, проведенных на каждом этапе. В частности, в этом примере, в то время как средняя продолжительность цикла и количество дней в EST подпадают под очерченные параметры, циклическая картина прогрессирования стадии выявила аномалии. Поэтому важно всесторонне изучить эстрозный цикл. Обе расширенные стадии DIE (обозначенные как Ext Diest) и EST (помеченные как Ext Est) были записаны на протяжении циклов, показанных на рисунке, и было несколько циклов, где стадия PRO не была записана. Этот пример также демонстрирует важность изучения количества наблюдаемых последовательных этапов, которые выходят за пределы типичных диапазонов, а не только изучения средней длины цикла и дней в EST, которые попадают в типичные диапазоны.

Причины и корреляции этих примеров могут включать такие факторы, как физиологические аномалии (опухоли, псевдобеременность, длительный стресс), вредные условия окружающей среды (длительное освещение, воздействие токсичных химических веществ, одиночный сбор), неправильное время сбора образцов, ошибка исследователя (плохой сбор образцов, захват изображений, неправильное стадирование), возрастные явления (общая нерегулярность, наблюдаемая в подростковом и репродуктивном старении) или отклонения, уникальные для конкретного конкретного животное. Чтобы отделить ошибку исследователя или неправильное время сбора образцов от физических аномалий или возрастных явлений, полезно более подробно изучить 4 компонента категоризации. Это может помочь в определении возможных причин нарушений или, в более широком смысле, может быть использовано в исследованиях, которые более тщательно изучают характеристики эстрального цикла.

Рисунок 9 иллюстрирует этот более тщательный анализ путем включения общих и отдельных количеств ячеек на оси Y, типов ячеек, представленных различными цветами заливки полос, и расположения ячеек, представленных различными шаблонами заливки полос, отобразившимися на протяжении всего периода мониторинга. Этот метод анализа позволил более подробно изучить общее количество завершенных циклов, продолжительность каждого цикла, прогрессию стадии и категоризацию компонентов для каждой отдельной крысы. Рисунок 9А представляет крысу, которая имела меньшее, чем в среднем, количество циклов, в общей сложности 3 полных цикла за 10 дней мониторинга - два 3-дневных цикла и один 5-дневный цикл (в среднем 3,67). Нерегулярность, наблюдаемая в прогрессировании стадии с 50% дней, включала одну или несколько незарегистрированных стадий, а 30% собранных образцов находились в переходном периоде - день 2 как MET-DIE, день 5 как EST-MET и день 8 как переход PRO-DIE. Это могло быть связано с неправильными сроками сбора образцов, ошибкой исследователя, возрастным явлением или уникальными отклонениями. Дальнейший мониторинг мог бы обеспечить ясность в отношении того, какие из них применяются.

Типичные доминантные расположения, типы клеток, а также индивидуальные и общие количества клеток были замечены на каждом из зарегистрированных этапов. На стадиях EST были замечены небольшие (25% образцов), умеренные (25% образцов) и многочисленные (50% образцов) слипшиеся клетки AKE с меньшим присутствием КЛЕТОК LEU, SNE и LNE. На одной захваченной стадии MET присутствовала комбинация многочисленных случайно дисперсных НОУ (50%), клеток AKE (20%), LNE (15%) и SNE (15%). Для стадий DIE было замечено небольшое (50% образцов) и многочисленное (50% образцов) количество случайно диспергированных, равномерно диспергированных, и комбинация доминирующих НОУ вперемежку с ячейками AKE, LNE и SNE. На одной собранной стадии PRO присутствовала частица случайно дисперсных НОУ (60% присутствующих клеток) и клеток SNE (40% присутствующих клеток), которые находились в комбинации расположений, представляя собой переход от DIE к PRO.

На рисунке 9B представленная крыса имела в общей сложности 3 полных цикла с 4-дневной моделью цикла. Собранные образцы не представляли собой последовательную прогрессию стадии с длительным периодом DIE (дни 6-9) и 5 другими случаями незарегистрированных стадий (2 незарегистрированные стадии MET, 2 незаписанные стадии PRO и 1 незаписанная стадия EST). Поскольку только 20% образцов находились в переходном периоде (день 3 как DIE-PRO, день 5 как EST-MET, день 18 как MET-DIE и день 19 как DIE-PRO), и только 3 стадии не были зарегистрированы за пределами стадии MET и длительного периода DIE, был сделан вывод о том, что сроки сбора проб были подходящими для этого конкретного животного. Поскольку последние 10 дней наблюдения включали упорядоченное прогрессирование через 4 стадии, первоначальные нарушения могут быть отнесены к подростковому возрасту. Более увеличенная продолжительность мониторинга (20 дней) позволила сделать такой вывод.

Изучение категоризирующих компонентов выявило типичные диапазоны. Стадии EST отражали доминирование умеренного (50% образцов) к многочисленному количеству (50% образцов) сгруппированных клеток AKE с меньшим количеством КЛЕТОК LEU, SNE и LNE. В собранных образцах МЕТ наблюдалось сочетание умеренных (33,33% образцов) с многочисленными (66,67% образцов) случайно диспергированными и слипшимися НОУ (с количественным диапазоном 10-90%), слипшимися SNE (0-30%), случайно диспергированными LNE (0-10%) и сгруппированными и случайно диспергированными ячейками AKE (10-90%). Стадии DIE отражали доминирование от умеренного (20%) до многочисленного (80% образцов) количества равномерно диспергированных, случайно диспергированных и слипшихся НОУ (диапазон 50-100%) в присутствии как случайно диспергированных клеток AKE, так и SNE. Стадии PRO были идентифицированы доминированием небольшого (3,33% образцов) и многочисленных (66,67% образцов) количества случайно дисперсных и слипшихся клеток SNE (10-99%) в присутствии клеток НОУ, AKE и LNE.

Другим вариантом анализа извлеченных данных является создание профилей эстрального цикла путем включения ранее описанных элементов — общих и отдельных количеств ячеек на оси Y, типов ячеек, представленных различными цветами заливки полос, и расположения ячеек, представленных различными шаблонами заливки полос, отобразившимися в течение всего периода мониторинга для каждого этапа цикла. Это может быть выполнено на крысу или в среднем на всю группу. Целью этого инструмента анализа является изучение тенденций категоризации компонентов на каждом этапе, что помогает всему научному сообществу в характеристике различий компонентов категоризации, характерных для категоризации этапов эструсного цикла. На рисунке 10A1 10-дневный профиль DIE показал доминирование умеренного (50% образцов) и многочисленного (50% образцов) количества равномерно диспергированных НОУ (в среднем 78,25%) наряду с меньшим количеством клеток SNE, AKE и LNE. На рисунке 10A2 20-дневный профиль диеструса продемонстрировал доминирование умеренного (20% образцов) и многочисленного (80% образцов) количества равномерно дисперсных, слипшихся и случайно дисперсных НОУ (в среднем 82%, присутствующих за все 10 дней) наряду с меньшим количеством клеток AKE и SNE.

Стадия PRO, показанная на рисунке 10B1 , показала доминирование умеренного числа случайно дисперсных клеток SNE (60%) в присутствии НОУ и клеток AKE. 20-дневный профиль стадии PRO на рисунке 10B2 показал доминирование небольшого количества (33,33% образцов) и большого (66,67% образцов) количества комбинации компоновок и случайно дисперсных клеток SNE (в среднем 66,33%, присутствующих во всех 3 образцах) наряду с НОУ и ячейками AKE. 10-дневный профиль EST, показанный на рисунке 10C1 , продемонстрировал доминирование умеренного (50% образцов) или многочисленного (50% образцов) количества клеток AKE (в среднем 80% за 2 присутствующих дня) в комбинации механизмов, наряду с меньшим количеством клеток НОУ, SNE и LNE. На рисунке 10C2 20-дневный профиль EST продемонстрировал доминирование умеренных (75% образцов) или большого количества (15% образцов) числа случайно дисперсных AKE (в среднем 57,5% за 4 присутствующих дня) клеток или клеток в комбинации компоновок, наряду с меньшим количеством клеток LEU, SNE и LNE.

10-дневный профиль стадии MET на рисунке 10D1 включал многочисленные случайно диспергированные LEUs (50%), клетки AKE (20%) и SNE (30%) клетки. 20-дневный профиль стадии MET на рисунке 10D2 показал умеренное (3,33% образцов) или многочисленное (6,667% образцов) количество НОУ (в среднем 50% во всех 3 образцах), SNE (в среднем 15%, присутствующее во всех 3 образцах), клетки AKE (с 23,33% в 3 присутствующих образцах), клетки LNE (в среднем 15% во всех 2 присутствующих образцах). Половина НОУ были случайным образом рассредоточены (1 выборка), а остальные 50% представляли собой комбинацию механизмов (1 выборка). Две трети клеток SNE были случайным образом рассеяны при наличии, в то время как остальные 33,33% были в комбинации расположений при наличии (1 из 3 образцов). Наконец, 66,67% клеток AKE были сгруппированы в присутствующих образцах (2 дня), в то время как остальные 33,33% были в комбинации договоренностей (1 день). В таблицу 1 включены числовые средние детерминант категоризации из двух групп. В то время как данные на рисунке 9A, B и рисунке 10A-D включают информацию о категоризирующих детерминантах от отдельных животных, эти таблицы включают средние значения для стадии течки в качестве примера. При воспроизведении в других лабораториях эти параметры могут стать стандартом для идентификации стадий. Это, в свою очередь, может снизить уровень субъективности, в настоящее время участвующей в процессе постановки.

Статистика
В целом, есть несколько параметров, которые следует учитывать при интерпретации характеристик цикла, хотя отсутствует консенсус в отношении того, что считается «ненормальным», и отклонения являются типичными. Goldman et al. определяют «регулярный» как 4-5-дневный цикл с 24-48 ч EST и 48-72 ч DIE стадии11. Отклонение от этих параметров может быть связано с различными факторами, включая одну или несколько физиологических аномалий, неправильное время сбора или первоначальную ацикличность, часто испытываемую крысами-подростками по мере созревания уровня гормонов. В дополнение к консультациям с лабораторным ветеринаром, обеспечению периода сбора проб для обеспечения надлежащих сроков и мониторингу животных после подросткового возраста для установления сравнительной временной шкалы, статистический анализ может быть полезен для отнесения причинно-следственной связи и / или корреляции к любым аномалиям. После характеристики циклов по категориям (например, последовательным и ненормальным), анализ хи-квадрата может помочь в сравнении групп. Кроме того, компоненты категоризации или общие характеристики цикла могут быть сопоставлены после вмешательства с использованием дисперсионного анализа (ANOVA)11. Однако такие отклонения могут не быть биологически значимыми, как обсуждается во введении, и поэтому необходимо учитывать экспериментальный контекст.

Figure 1
Рисунок 1: Гормональная ритмичность на стадиях эстрального цикла. (А) Различные уровни половых стероидных гормонов во время основных стадий эстрального цикла изложены и обобщены. Стадия прогрессирования начинается и заканчивается метеструсом, чтобы продемонстрировать уровень гормонов и круговое прогрессирование процесса. Адаптировано из внешнего источника11. (B) Поток половых стероидных гормонов из центральной нервной системы в репродуктивную систему через кровоток. Видно, что уровни гормонов повышаются за счет сигналов от гипоталамуса и гипофиза через гонадотропин-рилизинг-гормон (GrH или LHRH) и комбинацию фолликулостимулирующего гормона и лютеинизирующего гормона соответственно. Сюда входят как положительные, так и отрицательные петли обратной связи в зависимости от концентрации эстрадиола и прогестерона. Информация17 и изображения, прослеженные из внешних источников 65,66,67. Аббревиатура: LHRH = лютеинизирующий гормон-рилизинг-гормон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Измеренные детерминанты классификации эстрального цикла. (A) Здесь перечислены компоненты, используемые при постановке собранных образцов клеток, и доминирующие компоненты для каждого этапа. Важно помнить, что это общие параметры и ожидаемые отличия. (B) Вот доминирующие типы клеток, присутствующие на каждой стадии. Хотя это общие деления, каждый тип клеток можно найти на всех стадиях. (C) Здесь представлены типы расположения клеток, обнаруженные в этом исследовании. (D) Изображение здесь отражает типичные количества клеток, присутствующие на каждой из 4 стадий эстрального цикла, причем объем квадранта представляет собой приблизительные количества клеток. Получено из внешнего источника13 и ранее адаптировано68. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Вагинальное отверстие у крыс Sprague Dawley. (A) Анатомическая ориентация неразвитых наружных гениталий и влагалищных отверстий, которые ведут во влагалищный канал по отношению к уретральному отверстию. (B) Визуальное представление незастроенной области, обозначенной стрелкой. (C) Анатомическая ориентация развитых наружных гениталий и влагалищного отверстия по отношению к отверстию уретры, обычно происходящая в возрасте около 34 дней. (D) Соответствующее визуальное представление развитого района, очерченного на изображении А. Все данные получены из внешнего источника29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Шаблон записи данных категоризации детерминант. (A) Один из вариантов записи данных; включает описания детерминант категоризации. Это должно использоваться ежедневно, по одному на каждую крысу, находящуюся под наблюдением. (B) Этот шаблон является вариантом ввода данных с упрощенной записью категоризационных детерминант и идентификацией крыс. Это позволяет вводить заметки в таблицу данных во второй категоризации PRO. Цвет в верхней строке отражает цвет, присвоенный представленной экспериментальной группе, что помогает отличить одну группу от другой. с) еще один вариант шаблона; включает в себя все категоризирующие детерминанты и может быть изменен на основе личных предпочтений или целей исследования. Сокращения: AKE = ануклеированный ороговевший эпителиальный; НОУ = лейкоциты; LNE = крупноядерный эпителий; SNE = малый ядровый эпителий; C = слипшийся; ED = равномерно рассредоточенный; RD = случайно рассредоточенный; COM = комбинированный; SMD = smidge; MOD = умеренный; ЧИСЛО = многочисленные; EXE = упражнение; SED = сидячий; Est = течка; Die = диеструс; met-die = переход метеструс-диеструс; Pro = proestrus; pro-Est = переход проэструс-течка; ** = пример качества, который может быть полезен в публикации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Стадийная категоризация детерминантных вариаций. (A) Эта серия изображений изображает различные примеры стадии диэструса. На первом изображении (A1) изображено отложение слизи, представленное нитями концентрированных НОУ, с эпителиальными клетками, присутствующими в случайных выделениях. Это пример важности использования как 4-кратного, так и 10-кратного увеличения. Это 4-кратное увеличение похоже на прядь proestrus, но при ближайшем рассмотрении в 10x демонстрирует доминирование НОУ. Второе изображение (A2) изображает то, что часто наблюдалось на стадиях диэструса - доминирование НОУ, наблюдаемое вместе с слипшимся расположением эпителиальных клеток: клеток SNE, LNE и AKE. Последнее изображение в этой серии (A3) отражает случайную выплату НОУ, часто наблюдаемую в фазе диструса посреди капель влагалищной и солевой жидкости. (B) В этой серии изображений изображены различные примеры стадии proestrus. На первом изображении (B1) изображено слипающееся расположение клеток SNE в нити. Второе изображение (B2) отражает слайд с меньшим общим количеством ячеек и скоплением ячеек SNE. На третьем изображении (B3) изображено общее слипание и более случайная выплата ячеек SNE и низкое количество НОУ и клеток AKE. (C) В этой серии изображений изображены различные примеры стадии течки. На первом изображении (C1) изображено общее слипание клеток AKE с кератиновыми стержневыми образованиями в присутствии клеток SNE. На втором изображении (C2) показано слипание клеток AKE с призрачными ядрами и бактериями. Последнее изображение (C3) представляет собой нитевидное расположение клеток AKE. (D) Эта серия изображений изображает различные примеры стадии метеструса. На первом изображении (D1) изображено случайное распределение и слипание НОУ, клеток SNE, клеток AKE и клеток LNE в присутствии обломков. Второе изображение (D2) отражает все типы клеток, присутствующих в комковатом расположении, наряду с кератиновыми батончиками. Последнее изображение (D3) показывает более полное расположение присутствующих клеток НОУ, SNE, AKE и LNE. Эти цифры, взятые при 4-кратной (A1, A2, B2, B3, D1 и D3) или 10-кратной (A3, C1, C2, C3 и D2) объективации, были увеличены, чтобы обеспечить улучшенную визуализацию компонентов категоризации. Шкала стержней = 100 мкм. Для справки по размеру; Клетки AKE имеют диаметр приблизительно 40-52 мкм, НОУ приблизительно 10 мкм, клетки LNE 36-40 мкм и клетки SNE приблизительно 25-32 мкм16. Сокращения: SNE = малоядерный эпителиальный; LNE = крупноядерный эпителий; AKE = ануклеированный ороговевший эпителиальный; LEUs = лейкоциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Образцы переходных стадий. (A) В этой серии изображений показаны примеры перехода между стадиями DIE и PRO. На первом изображении (A1) показаны большие скопления и случайная выплата КЛЕТОК LEU, SNE, LNE и AKE. Второе изображение (A2) включает в себя большую массу слипшихся НОУ и SNE с вкраплениями нитей НОУ. Третье изображение (A3) включает в себя скопления и даже выплаты НОУ и небольшое количество SNE. На четвертом и последнем изображении (A4) изображены как сгруппированные, так и случайно распределенные ячейки SNE и НОУ. (B) На этом изображении показан пример перехода между стадиями PRO и EST с слипанием ячеек SNE и AKE. (C) На этом изображении изображено скопление и случайное распределение клеток AKE, SNE и LNE, наблюдаемых посреди обломков, чтобы представить переход от EST к MET. (D) На первом изображении (D1) показан пример перехода между стадиями MET и DIE, при этом распадающиеся эпителиальные клетки сопровождают увеличение НОУ. На втором изображении (D2) изображены клетки AKE в присутствии ранее описанных слипшихся НОУ и SNE-клеток. Эти цифры, взятые при 4-кратном (A1, A2, A3, B и C) или 10-кратном (A4, D1 и D2) увеличении, были увеличены, чтобы обеспечить улучшенную визуализацию компонентов категоризации. Шкала брусков = 100 м. Для сравнения размеров ячейки AKE имеют диаметр приблизительно 40-52 мкм, НОУ приблизительно 10 мкм, клетки LNE 36-40 мкм и клетки SNE приблизительно 25-32 мкм16. Сокращения: AKE = ануклеированный ороговевший эпителиальный; НОУ = лейкоциты; LNE = крупноядерный эпителий; SNE = малый ядровый эпителий; C = слипшийся; EST = течка; DIE = диеструс; PRO = proestrus; МЕТ = метеструс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Неблагоприятные коллекции образцов клеток. (A) На этих двух изображениях плоские клетки отсасывались из стенки вагинального канала в дополнение к случайно дисперсным НОУ. (B) Это изображение включает в себя небольшое количество мусора, где клетки были либо не видны, либо не собраны. (C) В этом примере было замечено общее низкое количество клеток. (D) На этих двух изображениях (D1 и D2) раствор экстракции хлорида натрия (NaCl) и вагинальная жидкость были замечены и распределены по слайдам микроскопа. Эти цифры, взятые при 4-кратном (A1, A2 и D1) или 10-кратном (B, C и D2) увеличении, были увеличены, чтобы обеспечить улучшенную визуализацию компонентов категоризации. Шкала стержней = 100 мкм. Для сравнения размеров ячейки AKE имеют диаметр приблизительно 40-52 мкм, НОУ приблизительно 10 мкм, клетки LNE 36-40 мкм и клетки SNE приблизительно 25-32 мкм16. Сокращения: AKE = ануклеированный ороговевший эпителиальный; НОУ = лейкоциты; LNE = крупноядерный эпителий; SNE = малый ядровый эпителий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Выборка регулярных и нерегулярных циклических паттернов. (А) Это изображение отражает в общей сложности 16 полных циклов, которые прогрессируют через повторяющуюся и последовательную картину, отражая регулярные колебания половых стероидных гормонов. В пределах этого диестр представлен самым низким, проэструс — серединой, а течка представлена планкой на самой высокой высоте. Эти данные анализируются путем отслеживания дней между стадиями течки, причем каждая течка-течка представляет собой один полный цикл. Эти данные отражают данные самок крыс, содержащихся в UCLA. (B) Это изображение представляет собой теоретическую комбинацию различных ациклических паттернов 22 крыс. Расширенная течка может быть замечена с несколькими повторяющимися днями баров на полной высоте, расширенный диеструс, наблюдаемый с несколькими повторяющимися днями самой низкой высоты стержня, и отсутствие циклической картины прогрессирования от диэструса до метеструса. Сокращения: Est = течка; Диест/Ди = диеструс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Индивидуальные детерминанты категоризации. (A) Эта гистограмма с накоплением отражает каждый компонент инструментов, используемых для классификации отдельных образцов, собранных в стадии эструсной выборки. Здесь субъект, который наблюдался в течение 10 дней, показывает различные типы клеток, количества и расположение. Это ожидается для подросткового возраста, так как гормональный фон обычно не становится постоянным или не регуляризируется до совершеннолетия. (B) Здесь представлен эструсный профиль для животного, которое находилось под наблюдением в течение 20 дней. Подобные нарушения можно увидеть и здесь, где субъект оставался в диеструсе в течение 4 дней против типичных 1-2. Эти данные представляют 6 самок крыс, содержащихся в Университете Пеппердайна. Сокращения: AKE = ануклеированный ороговевший эпителиальный; НОУ = лейкоциты; LNE = крупноядерный эпителий; SNE = малый ядровый эпителий; C = слипшийся; ED = равномерно рассредоточенный; RD = случайно рассредоточенный; COM = комбинированный; SMD = smidge; MOD = умеренный; ЧИСЛО = многочисленные; EXE = упражнение; SED = сидячий; Est = течка; Die = диеструс; Pro = proestrus; Мет = метеструс.

Figure 10
Рисунок 10: Профили стадий. (A) В этом разделе показаны детерминантные данные категоризации для отдельных крыс в течение каждого дня, классифицируемые как диеструс. Первое изображение (A1) представляет данные, собранные в течение 10 дней, а второе (A2) в течение 20 дней. (B) В этом разделе представлены данные по отдельным крысам в течение каждого дня, классифицируемым как proestrus. Первое изображение (B1) представляет данные, собранные в течение 10 дней, а второе (B2) в течение 20 дней. (C) Это отображает данные для отдельных крыс в течение каждого дня, идентифицированного как стадия течки. Первое изображение (C1) представляет данные, собранные в течение 10 дней, а второе (C2) в течение 20 дней. (D) В этом разделе серии представлены данные о компонентах категоризации для отдельных крыс в течение каждого дня, идентифицированного как стадия метеструса. Первое изображение (D1) представляет данные, собранные в течение 10 дней, а второе (D2) в течение 20 дней. Данные в этих цифрах отражают данные 6 самок крыс, содержащихся в Университете Пеппердайна. Сокращения: AKE = ануклеированный ороговевший эпителиальный; НОУ = лейкоциты; LNE = крупноядерный эпителий; SNE = малый ядровый эпителий; C = слипшийся; ED = равномерно рассредоточенный; RD = случайно рассредоточенный; COM = комбинированный; SMD = smidge; MOD = умеренный; ЧИСЛО = многочисленные; EXE = упражнение; SED = сидячий; Est = течка; Die = диеструс; Pro = proestrus; Мет = метеструс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

EST: 10 дней Продолжительность (дней) АКЕ (%) НОУ (%) ЛНЭ (%) SNE (%) Общее количество ячеек (%)
3 88 2.78 1.89 7.33 МОД: 44.44 ЧИСЛО: 44.44 SMD: 11.11
Диапазоны 2–4 70–100 0–10 0–17 0–20 Шмидж – многочисленный
Аранжировка С: 50
ЭД: 0
РД: 50		 С: 0
ЭД: 0
РД: 100		 С: 0
ЭД: 0
РД: 100		 С: 50
ЭД: 0
РД: 50
EST: 20 дней Продолжительность (дней) АКЕ (%) НОУ (%) ЛНЭ (%) SNE (%) Общее количество ячеек (%)
4 71.92 5.5 2.92 19.67 МОД: 50 ЧИСЛО: 50 SMD: 0
Диапазоны 4–4 10–100 0–20 0–20 0–80 Шмидж – многочисленный
Аранжировка С: 60
ЭД: 6.67
РД: 33.33		 С: 0
Ред.: 12.5
РД: 87.5		 С: 33,33
ЭД: 0
РД: 66.67		 С: 44,44
ЭД: 0
РД: 55.56

Таблица 1: Выборка детерминанта средней стадии. В этих таблицах показаны средние значения для детерминант категоризации и обзор для всех собранных этапов EST. Верхняя таблица отражает средние значения для всех животных, контролируемых в течение 10 дней, а нижняя таблица - в течение 20 дней. Это включает в себя продолжительность эстрального цикла, типы и проценты клеток, а также расположение клеток и процент каждого расположения, наблюдаемое для каждого типа клеток. Эти данные отражают данные 6 самок крыс, содержащихся в Университете Пеппердайна. Сокращения: AKE = ануклеированный ороговевший эпителиальный; НОУ = лейкоциты; LNE = крупноядерный эпителий; SNE = малый ядровый эпителий; C = слипшийся; ED = равномерно рассредоточенный; RD = случайно рассредоточенный; EST = течка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ключевые шаги и важные соображения
Некоторые критические шаги в предоставленном протоколе требуют акцента, особенно в коллекции вагинальных клеток. Во время экстракции влагалищной жидкости обеспечение надлежащего угла и глубины введения шприца является ключом к получению удовлетворительных результатов и, в конечном счете, предотвращению раздражения, травмы или стимуляции шейки матки животного. Стимуляция шейки матки может быть одним из источников индукции псевдобеременности, о чем свидетельствуют 12-14 дней лейкоцитарного влагалищного мазка11. Во время фазы оценки микроскопа важно сосредоточиться на визуальной плоскости, отображающей собранные клетки влагалища. Это завершается идентификацией одной или двух ячеек и настройкой визуализации до тех пор, пока не будет достигнут фокус.

После этого захват репрезентативных изображений вагинальных клеток для постановки происходит путем сканирования всего слайда микроскопа. Это гарантирует, что полученные изображения отражают точное изображение того, что собрано и присутствует во влагалищном канале животных. Перед категоризацией необходимо ознакомиться с детерминантами категоризации, такими как различение типов клеток и различных преобразований, которыми может обладать каждый тип клеток. Рекомендуется, чтобы каждый участник прошел надлежащую подготовку и практиковал идентификацию этапов с помощью заранее подготовленных практических слайдов.

Чтобы уменьшить количество предвзятости и субъективности, вовлеченных в процесс, рекомендуется включить двух участников в фазу категоризации, оба остаются слепыми к назначениям группы лечения, зная ранее зарегистрированные идентификаторы стадий для каждого животного. Назначение двух участников для категоризации образцов позволяет проводить конференции и снижать субъективность идентификации. Однако, если участники должны классифицировать выборки отдельно, рекомендуется предусмотреть начальный период сотрудничества для повышения надежности межрейтинговых экспертов по мере развития экспертных знаний. Система вторичного обследования может быть использована для предотвращения противоречивых результатов, таких как обмен наборами данных после категоризации и использование фотографий для подтверждения первоначальных оценок.

Ограничения и изменения
Ограничения нынешней методики включают продолжительность жизнеспособности. Из-за травмы или раздражения, которые могут сопровождать повторное введение шприца, длительный и повторяющийся мониторинг не согласуется с надлежащим уходом и использованием животных. Поэтому при выполнении продольного исследования может потребоваться модифицировать процедуру, уменьшив частоту промывания. Например, вместо того, чтобы контролировать каждое животное один раз в день, крыс можно разделить на группы, контролируемые в разные дни в течение недели. Второе ограничение включает в себя отсутствие окрашивания образца в описанном процессе без разделения клеточных компонентов по цвету, что создает большую зависимость от детерминант категоризации, перечисленных в протоколе выше.

Кроме того, в рамках таких детерминант категоризации существуют элементы субъективности, которые могут ограничивать точную репликацию. В частности, процент количества клеток в собранных образцах основан на личных оценках. Модификации в этом отношении могут включать разработку математического алгоритма для количественной оценки отдельных типов клеток. Альтернативные модификации могут включать количество образцов, помещенных на один слайд микроскопа, которое может быть увеличено в зависимости от размера слайда и крышки. Дальнейшие ограничения могут включать отсутствие данных о вагинальной жидкости в этом исследовании - модификация будущих исследований может включать запись условий вагинальной жидкости, собранной в качестве вклада в категоризацию стадий. Дополнительные модификации протокола могут включать использование другой изотонической жидкости для экстракции клеток, которая будет давать те же результаты, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор13. Наконец, при применении этой процедуры к крысам разного возраста или штамма могут потребоваться такие модификации, как методы обращения с животными, из-за размера тела или уровня активности. Это может включать в себя методзахвата 69 и метод Forelimb Crisscross64 для взрослых и метод одно- и двуручного сдерживания64 , используемый для молодых крыс.

Альтернативные методы
По сравнению с альтернативными методами мониторинга эстрального цикла, промывание влагалища уникально своей точностью, количеством производимой информации, минимальной инвазивностью и низкими сопутствующими затратами. Гистологическое исследование матки и яичников может быть использовано для выявления стадий цикла, но является более навязчивым и не позволяет проводить постоянный мониторинг. Хотя измерение уровня половых стероидных гормонов помогает контролировать эстрозный цикл, оно требует сбора крови и не позволяет характеризовать уникальный профиль клеточной или вагинальной жидкости каждого субъекта. Поскольку развитие наружных гениталий косвенно коррелирует с уровнем половых стероидных гормонов, осмотр влагалищного отверстия может дать информацию о половом созревании. Кроме того, окраска ткани, уровень влажности, размер и отек влагалищного отверстия коррелируют с стадиями эстрального цикла70. Тем не менее, точная физиология, приводящая к открытию вагинального канала у крыс, еще не полностью сообщена. Недавние публикации показали, что это лишь косвенный маркер репродуктивного развития и не всегда совпадает с опушением31,34. Биохимический анализ образцов мочи является экономически эффективным и легко проводимым, но не допускает специфичности и надежности других методов71. Поэтому он не так надежен или действителен, как исследование клеток, присутствующих во влагалищном канале.

Кроме того, измерение электрического импеданса использовалось для мониторинга эстрального цикла и является менее физически раздражающим, чем жидкое лаваж. Однако этот метод не предоставляет столько информации о компонентах категоризации. Это устройство специально разработано для оптимизации сроков преднамеренного спаривания, измеряя, когда уровень половых стероидных гормонов является самым высоким 72,73,74. Кроме того, сообщалось, что этот метод эффективен для различения EST и nonEST, но ограничен в своей способности контролировать эстрозный цикл за пределами этого75. В целом, этот метод, как сообщается, является ненадежным, не всегда экономически эффективным и не часто используется в литературе, что приводит к отсутствию сопоставимых данных74. Хотя вагинальный тампон наиболее похож на лаваж в информации, которую он предоставляет, он включает в себя повышенный риск раздражения или травмы, поскольку он требует контакта с подкладкой вагинального канала непосредственно для извлечения клеток. Наконец, хотя окрашивание слайдов микроскопа может обеспечить более резкий контраст между типами клеток и обеспечить сохранение образца, это более трудоемкое и дорогостоящее усилие, чем мокрое крепление53. В целом, каждый метод мониторинга имеет свои ограничения и преимущества, и было бы полезно использовать комбинацию этих методов для получения всестороннего обследования эстрального цикла грызунов.

Приложений
По-прежнему важно рассматривать текущее исследование в контексте широкого научного сообщества и широкой общественности. Эта методология может быть использована в любом проекте, который включает в себя изучение самок животных - не только в рамках исследований, посвященных преднамеренному разведению, чтобы исключить животных, которые имеют аномалии и / или функцию гипоталамо-гипофизарно-яичниковой оси, но и для принципиального понимания в группах лечения. Более конкретно, эта процедура оказывает влияние в рамках i) фармакологических исследований, поскольку различные лекарства и химические вещества нарушают или изменяют репродуктивный тракт и эстральный цикл 11,27,76; ii) неврологические исследования, такие как те, которые сосредоточены на черепно-мозговых травмах, познании или дегенеративных расстройствах, обусловленных взаимодействием между половыми стероидными гормонами и нервной системой77; iii) исследование системы кровообращения за счет рецепторов половых стероидных гормонов, расположенных на миоцитах, и последующих взаимодействий77; iv) исследования, связанные с ростом костей38; на эндокринную систему 11,78; и v) другие нерепродуктивные исследования3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Это исследование было проведено в рамках финансируемого NIH сотрудничества между Центром исследований черепно-мозговых травм Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (BIRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera AmScope Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5 https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV&
keywords=usb+camera+for+microscope&
qid=1572477663&s=industrial
&sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel Fischer Scientific 14-815-526 https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8 NEWCO 93009 https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass Fischer Scientific 12-553-7A https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses Fischer Scientific 12-553-464 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply Fischer Scientific 06-666 https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001  NEWCO Specialty and LabDiet 5012 https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm Grainger 36UX10 https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_
LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7
zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4
cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696
!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id=
CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW
1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ
Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo
Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc=
PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9% Live Action Safety ABB079830939 https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies BH Supplies ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821 https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7&
keywords=1ml+sterile+syringe&qid=
1572478649&s=industrial
&sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa=
ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy
PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm
VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ
yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy
eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM
0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h
bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja
1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2
xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen Allentown LV40326013 https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad Medline EAN: 0480196288558
 Global Trade Identification Number: 40080196288558		 https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853&
sr=8-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell and Tissue Research. 354 (1), 99-106 (2013).
  2. Camacho-Arroyo, I., Montor, J. M. Beyond reproductive effects of sex steroids. MiniReviews in Medicinal Chemistry. 12 (11), 1037-1039 (2012).
  3. Shah, S. I. A. Systemic non-reproductive effects of sex steroids in adult males and females. Human Physiology. 44, 83-87 (2018).
  4. Wierman, M. E. Sex steroid effects at target tissues: mechanisms of action. Advances in Physiology Education. 31 (1), 26-33 (2007).
  5. An, G., et al. Pathophysiological changes in female rats with estrous cycle disorder induced by long-term heat stress. BioMed Research International. 2020, 4701563 (2020).
  6. Donato, J., et al. The ventral premammillary nucleus links fasting-induced changes in leptin levels and coordinated luteinizing hormone secretion. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5240-5250 (2009).
  7. Fortress, A. M., Avcu, P., Wagner, A. K., Dixon, C. E., Pang, K. Experimental traumatic brain injury results in estrous cycle disruption, neurobehavioral deficits, and impaired GSK3β/β-catenin signaling in female rats. Experimental Neurology. 315, 42-51 (2019).
  8. Hatsuta, M., et al. Effects of hypothyroidism on the estrous cycle and reproductive hormones in mature female rats. European Journal of Pharmacology. 486 (3), 343-348 (2004).
  9. Jaini, R., Altuntas, C. Z., Loya, M. G., Tuohy, V. K. Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 279, 71-74 (2015).
  10. Tropp, J., Markus, E. J. Effects of mild food deprivation on the estrous cycle of rats. Physiology and Behavior. 73 (4), 553-559 (2001).
  11. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Research. Part B, Developmental and Reproductive Toxicology. 80 (2), 84-97 (2007).
  12. Thung, P. J., Boot, L. M., Muhlbock, O. Senile changes in the oestrous cycle and in ovarian structure in some inbred strains of mice. Acta Endocrinologica. 23 (1), 8-32 (1956).
  13. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  14. Bosch, L. Biochemical and endocrinological studies of normal and neoplastic tissue: The metabolism of estrogen-producing ovarian tumors and other malignancies in the mouse. , Available from: https://www.translatetheweb.com/?from=nl&to=en&ref=SERP&dl=en&rr=UC&a=https%3a%2f%2frepository.tudelft.nl%2fislandora%2fobject%2fuuid%253A8776d58a-6695-4a38-99ca-0abf607480f0 109-111 (2021).
  15. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta Physiologica Pharmacologica Neerlandica. 4 (3), 442-444 (1955).
  16. Paccola, C., Resende, C., Stumpp, T., Miraglia, S., Cipriano, I. The rat estrous cycle revisited: a quantitative and qualitative analysis. Animal Reproduction. 10 (4), 677-683 (2013).
  17. Knobil, E., Neill, J. D. Puberty in the rat. The Physiology of Reproduction. , Raven Press Ltd. New York. 363-409 (1994).
  18. Schallmayer, S., Hughes, B. M. Impact of oral contraception and neuroticism on cardiovascular stress reactivity across the menstrual cycle. Psychology, Health & Medicine. 15 (1), 105-115 (2010).
  19. Barreto-Cordero, L. M., et al. Cyclic changes and actions of progesterone andallopregnanolone on cognition and hippocampal basal (stratum oriens) dendritic spinesof female rats. Behavioural Brain Research. 379, 112355 (2020).
  20. de Zambotti, M., Trinder, J., Colrain, I. M., Baker, F. C. Menstrual cycle-related variation in autonomic nervous system functioning in women in the early menopausal transition with and without insomnia disorder. Psychoneuroendocrinology. 75, 44-51 (2017).
  21. Maghool, F., Khaksari, M., Khachki, A. S. Differences in brain edema and intracranial pressure following traumatic brain injury across the estrous cycle: Involvement of female sex steroid hormones. Brain Research. 1497, 61-72 (2013).
  22. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex as a biological variable: Who, what, when, why, and how. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 386-396 (2017).
  23. Becker, J. B., Prendergast, B. J., Liang, J. W. Female rats are not more variable than male rats: a meta-analysis of neuroscience studies. Biology of Sex Differences. 7, 34 (2016).
  24. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  25. Joel, D., McCarthy, M. M. Incorporating sex as a biological variable in neuropsychiatric research: where are we now and where should we be. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 379-385 (2017).
  26. Long, J. A., Evans, H. M. The oestrous cycle in the rat and its associated phenomena. Memoirs of the University of California. 6, 1 (1922).
  27. Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
  28. Lenschow, C., Sigl-Glöckner, J., Brecht, M. Development of rat female genital cortex and control of female puberty by sexual touch. PLoS Biology. 15 (9), 2001283 (2017).
  29. Lewis, E. M., Barnett, J. F., Freshwater, L., Hoberman, A. M., Christian, M. S. Sexual maturation data for Crl Sprague-Dawley rats: Criteria and confounding factors. Drug and Chemistry Toxicology. 25 (4), 437-458 (2002).
  30. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 24 (4), 417-463 (2000).
  31. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: the puberty ovarian maturation score (pub-score). Scientific Reports. 7, 46381 (2017).
  32. da Silva Faria, T., da Fonte Ramos, C., Sampaio, F. J. Puberty onset in the female offspring of rats submitted to protein or energy restricted diet during lactation. Journal of Nutritional Biochemistry. 15 (2), 123-127 (2004).
  33. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. 48 (1), 1 (2009).
  34. Engelbregt, M. J., et al. Delayed first cycle in intrauterine growth-retarded and postnatally undernourished female rats: follicular growth and ovulation after stimulation with pregnant mare serum gonadotropin at first cycle. Journal of Endocrinology. 173 (2), 297-304 (2002).
  35. Pescovitz, O. H., Walvoord, E. C. When puberty is precocious: Scientific and clinical aspects. , Humana Press. (2007).
  36. USEPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. Standard Evaluation Procedure Test Guidelines 890.1450: Pubertal development and thyroid function in intact juvenile/peripubertal female rats assay. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/final_890.1450_female_pubertal_assay_sep_8.24.11.pdf (2011).
  37. Kennedy, G. G., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. Journal of Physiology. 166 (2), 408-418 (1963).
  38. Sengupta, S., Arshad, M., Sharma, S., Dubey, M., Singh, M. M. Attainment of peak bone mass and bone turnover rate in relation to estrous cycle, pregnancy and lactation in colony-bred Sprague-Dawley rats: Suitability for studies on pathophysiology of bone and therapeutic measures for its management. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 94 (5), 421-429 (2005).
  39. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
  40. Koff, E., Rierdan, J., Stubbs, M. L. Conceptions and misconceptions of the menstrual cycle. Women & Health. 16 (3-4), 119-136 (1990).
  41. Sahay, N. Myths and misconceptions about menstruation: A study of adolescent school girls of Delhi. Journal of Women's Health and Development. 3 (3), 154-169 (2020).
  42. Criado-Perez, C. The deadly truth about a world built for men - from stab vests to car crashes. , Available from: https://www.theguardian.com/lifeandstyle/2019/feb/23/truth-world-built-for-men-car-crashes (2019).
  43. Chrisler, J. C. The menstrual cycle in a biopsychosocial context. Women's Psychology. Psychology of Women: A Handbook of Issues and Theories. Denmark, F. L., Paludi, M. A. , Praeger Publishers/Greenwood Publishing Group. 193-232 (2008).
  44. Rea, H. H. Re-cycling the menstrual cycle: A multidisciplinary reinterpretation of menstruation. , Available from: https://scholarworks.wmich.edu/masters_theses/3942 (1998).
  45. Sato, J., Nasu, M., Tsuchitani, M. Comparative histopathology of the estrous or menstrual cycle in laboratory animals. Journal of Toxicologic Pathology. 29 (3), 155-162 (2016).
  46. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
  47. Smith, J. R., et al. The year of the rat: The Rat Genome Database at 20: a multi-species knowledgebase and analysis platform. Nucleic Acids Research. 48 (1), 731-742 (2020).
  48. Capdevila, S., Giral, M., Ruiz de la Torre, J. L., Russell, R. J., Kramer, K. Acclimatization of rats after ground transportation to a new animal facility. Laboratory Animals. 41 (2), 255-261 (2007).
  49. Conour, L., Murray, K., Brown, M. Preparation of animals for research-issues to consider for rodents and rabbits. ILAR journal. 47 (4), 283-293 (2006).
  50. National Academies Press (US) Committee on Guidelines for the Humane Transportation of Laboratory Animals. Guidelines for the Humane Transportation of Research Animals. National Academies Press. , (2006).
  51. Obernier, J., Baldwin, R. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR Journal. 47 (4), 364-369 (2006).
  52. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. US) . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. , National Academies Press. US. (2011).
  53. Pantier, L. K., Li, J., Christian, C. A. Estrous cycle monitoring in mice with rapid data visualization and analysis. Bio-protocol. 9 (17), 1-17 (2019).
  54. Cohen, I., Mann, D. Seasonal changes associated with puberty in female rats: effect of photoperiod and ACTH administration. Biology of Reproduction. 20 (4), 757-776 (1979).
  55. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J Mice: I. cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
  56. Pennycuik, P. R. Seasonal changes in reproductive productivity, growth rate, and food intake in mice exposed to different regimens of day length and environmental temperature. Australian Journal of Biological Sciences. 25 (3), 627-635 (1972).
  57. Piacsek, B. E., Hautzinger, G. M. Effects of duration, intensity and spectrum of light exposure on sexual maturation time of female rats. Biology of Reproduction. 10 (3), 380-387 (1974).
  58. Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of the estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
  59. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  60. Campbell, C., Schwartz, N. The impact of constant light on the estrous cycle of the rat. Endocrinology. 106 (4), 1230-1238 (1980).
  61. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Osterburg, H. H., Finch, C. E. Altered profiles of estradiol and progesterone associated with prolonged estrous cycles and persistent vaginal cornification in aging C578L/6J mice. Biology of Reproduction. 24 (4), 784-794 (1981).
  62. Rivest, R. W. Sexual maturation in female rats: Hereditary, developmental and environmental aspects. Experientia. 47 (10), 1026-1038 (1991).
  63. Charles River Laboratories. CD® (Sprague Dawley) IGS Rat. Charles River Laboratories. , Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-sd-igs-rat?region=3611 (2021).
  64. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. JoVE. , (2020).
  65. Circulatory System. Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021).
  66. Urogenital System. n.d.). Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_urogenital.html (2021).
  67. Kiernan, J. A. Anatomical foundations of neuroscience: Mini-atlas of rat's brain. Anatomy and Cell Biology 9535b. , University of Western Ontario. Available from: https://instruct.uwo.ca/anatomy/530/535downs.htm (2008).
  68. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7 (4), 1-5 (2012).
  69. Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  70. Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
  71. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6 (5), (2020).
  72. Bartos, L. Vaginal impedance measurement used for mating in the rat. Laboratory Animals. 11 (1), 53-55 (1977).
  73. Belozertseva, I. V., Merkulov, D. D., Vilitis, O. E., Skryabin, B. V. Instrumental method for determining the stages of the estrous cycle in small laboratory rodents. Laboratory Animals for Scientific Research. (4), (2018).
  74. Ramos, S. D., Lee, J. M., Peuler, J. D. An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 667-670 (2001).
  75. Singletary, S. J., et al. Lack of correlation of vaginal impedance measurements with hormone levels in the rat. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (6), 37-42 (2005).
  76. Bretveld, R. W., Thomas, C. M., Scheepers, P. T., et al. Pesticide exposure: the hormonal function of the female reproductive system disrupted. Reproductive Biology Endocrinology. 4 (30), (2006).
  77. MacDonald, J. K., Pyle, W. G., Reitz, C. J., Howlett, S. E. Cardiac contraction, calcium transients, and myofilament calcium sensitivity fluctuate with the estrous cycle in young adult female mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 306 (7), 938-953 (2014).
  78. Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).

Tags

Биология Выпуск 174 женщина подросток Sprague Dawley крыса половые стероидные гормоны эстральный цикл вагинальное лаважирование
Мониторинг эстрального цикла грызунов с использованием вагинального лаважа: нет такой вещи, как нормальный цикл
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robert, H., Ferguson, L., Reins, O., … More

Robert, H., Ferguson, L., Reins, O., Greco, T., Prins, M. L., Folkerts, M. Rodent Estrous Cycle Monitoring Utilizing Vaginal Lavage: No Such Thing As a Normal Cycle. J. Vis. Exp. (174), e62884, doi:10.3791/62884 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter