Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

膣洗浄を利用したげっ歯類の強烈なサイクルモニタリング:通常のサイクルのようなものはありません

Published: August 30, 2021 doi: 10.3791/62884
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2
1Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, 2Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

Summary

この研究は、雌ラットを含む実験計画において考慮すべき重要な要因を詳述している。より大きな意味では、これらのデータはスティグマを軽減し、より包括的な診断および介入ツールの開発を支援するのに役立ちます。

Abstract

現在の方法論は、雌のスプレイグ・ドーリー(SD)思春期ラットの発情周期を監視するための再現性があり、標準化され、費用対効果の高いアプローチを確立している。この研究は、ホルモンサイクルの複雑さと、信頼性が高く有効なモニタリング技術を構築するために必要な幅広い理解を示しています。主要な実験計画と手続き的要素の詳細な検討を通じて、サイクルとその基本原則のこの記述は、さらなる理解のための枠組みを提供し、将来の複製のための誤解を解体する。

この手順では、膣洗浄を用いたサンプル採取プロセスの概要とともに、発情前期、発情期、小胞体、およびジストラスの4段階モデルへのデータ分類のメカニズムについて説明します。これらの段階は、膣液の状態、存在する細胞型、細胞配置、および収集時の細胞量の4つの分類決定因子を利用する、新しい提案されたアプローチによって特徴付けられる。各段階のバリエーション、好ましいサンプルと好ましくないサンプル、周期性と非循環性の区別、および収集された分類コンポーネントのグラフィック描写は、データの効果的な解釈的および組織的実践とともに提示されます。全体として、これらのツールは定量化可能なデータ範囲を初めて公開することを可能にし、レプリケーション時の分類係数の標準化につながります。

Introduction

斬新な貢献
げっ歯類の発情周期は、健康の重要な指標として同定されています。しかし、研究者の無意識の偏見や女性の体に関する不正確な解釈は、科学界を妨げています。「発情」という言葉の語源そのものが、劣等感と否定性を意味します。エウリピデスはこの用語を「狂乱」または狂気、ホメロスはパニック、プラトンは不合理な衝動を表すために使用しました。この研究は、これらの原始的な視点が現在の科学界にどのように影響するかを強調し、新しいモザイクパラダイム(以前に研究された方法の更新された組み合わせ、より包括的なアプローチの範囲を拡大した)を通じてこれらの懸念に対処します。

標準化された包括的なモニタリング手法はなく、データ解釈の実践が不明瞭な可能性があるため、この手法の研究と使用はまず必要です。第二に、発情周期特性は研究されている個々のラットに依存するが、それらはしばしば普遍化される。第三に、ホルモンサイクルは日常的で有益なプロセスですが、「人間への翻訳」セクションで探求されている危険なスティグマに囲まれています。本研究は、(A)発情周期モニタリング手法を詳細に記述し、その結果がどのように解釈できるかを明らかにすること、(B)各周期の完全性と個性を維持する方法を概説すること、(C)根拠のない慣行を永続させる誤解に注意を喚起すること、の3つの方法でこれら3つの問題に取り組むことを目的とする。

この研究はまた、成人期のさまざまな行動的、解剖学的、生理学的症状に光を当てる重要な発達変化によって特徴付けられる思春期のラットに焦点を当てているという点でもユニークです1。共通のバイアスを解体しながら、研究不足の集団におけるホルモン周期を監視する標準化された実験計画を構築することは、信頼性が高く有効なホルモン相関2,3,4の発達と、状態依存性周期の中断の決定を可能にする5,6,7,8,9,10 .最終的に、これらの新規性は、さまざまなウェルネスの懸念の診断基準、治療、および介入を拡大するのに役立ちます。

基本的な定義と用途
発情周期は、エストラジオール、白水素化ホルモン(LH)、およびプロゲステロンの3つの振動する女性性ステロイドホルモンに応答して起こる動的生理学的プロセスの集まりである(図1A、B)。内分泌系と中枢神経系との間の相互作用は、サイクルを調節し、これは最も頻繁に4〜5日間持続し、性的成熟の開始から生殖老化および/または停止まで再発する。それはホルモンレベルに基づいて別々のカテゴリーに分けられます - 最も一般的には、円形に進行するダイストラス(DIE)、発情前勃起(PRO)、発情(EST)、およびメテストルス(MET)の4段階に分かれています。分割の数は、研究13の性質に応じて、3段階11から13段階12までの範囲であり得る。部門数が少ないほど、METをステージとして除外し、短期間の移行期間として分類することがよくあります。より多い数は、典型的には、腫瘍発生または自発的偽妊娠などの現象のより詳細な検査を可能にするサブセクションを含み、胚性着床を伴わない妊娠の生理学的状態12、14、15。

この研究では、膣管の構成要素を通して段階が同定され、存在する細胞型、細胞配置、および細胞量の3つの分類決定因子が命名された(図2A-D)。この研究では膣液の状態はモニターされなかったが、第4の分類成分としてそれを含めることが推奨される。膣液の検査に関するさらなる情報は、参照リスト16に見出すことができる。分類成分は、現代の発情サイクルモニタリングで推奨される主要な技術である膣洗浄を介して細胞を抽出することによって調べることができます。各段階内の詳細な生理学的プロセスはこの研究の範囲外であるが、より多くの情報は文献17で見つけることができる。

この発情周期モニタリング技術の使用および継続的な開発は、性ステロイドホルモンと心血管系18、内分泌系8、および中枢神経系19、20、21などの身体系の機能との間の接続に根ざしている。同時に、雌のげっ歯類が関与している場合、発情サイクルモニタリングは必ずしも必要ではないかもしれません22,23,24,25。むしろ、性差が特定の研究分野で報告されているかどうかを最初に検討することが重要ですが、これは公開されたレビュー22,23でさらに調査することができます。発情サイクルモニタリングは、幅広い研究調査において不可欠ですが、雌のげっ歯類を実験に含めることの障害と見なされるべきではありません。この手法は複雑で時間がかかるように見えるかもしれませんが、治験責任医師によっては、手順自体の完了に15分もかからず、費用対効果が高い場合があります。全体として、科学的研究に女性のげっ歯類を含めることは、これらの開発が主に男性の身体テンプレートに基づいているため、身体系、様々な状態および病理、および一般的な健康の理解に有利である。

げっ歯類の普遍的なパラメータと自然変動
標準サイクルパターンの定義、比較・分析のためのパラメータ設定、異常や外れ値の検出には、「典型的」と見られる側面の範囲を設定する必要があります。同時に、各ラットのサイクルは一意であり、動物の系統、生理学的プロセス、および環境条件に基づく逸脱が予想されることを認識することも重要です。実際、発情周期の最も「正常な」側面の1つは変動性です。これは、3-38日26,27の範囲で、全サイクル長で見られます。32-34日から数週間28,29,30までの範囲の性的成熟の年齢;非循環的と考えられるもの11、及び分類行列式パターン11、13とする。全体として、発情サイクルの普遍的なテンプレートはなく、それを科学界と一般市民の両方に翻訳することは、実験プロセスの重要な部分です。

実験の時期と発達年齢
この変動性の原理を認識することは、信頼性が高く有効な実験計画の構築に役立ちます。例えば、発情性サイクリングモニタリングの開始は、ラットの解剖学的および生理学的発達に依存しており、これは環境的および生理学的要因に基づいて変化する。モニタリングは、膣管の内部部分につながる外陰部に囲まれた外部膣オリフィスである膣開口部(VO)の発達まで開始できない(図3A-D)。VOはしばしば32歳から34日の間に完全に発達するが、それは各被験者に個別化されたままであり、その過程について多くは不明のままである。この開口部は、エストラジオール31の増加、視床下部-下垂体-卵巣軸32の成熟、およびラットにおける最初の排卵17、33、34、35に関連している性的成熟の開始を特定するために使用されてきた。しかしながら、最近の刊行物は、それが不利な環境におけるホルモンおよび発達的発生から切り離される可能性があり31、性的成熟33ではなくエストラジオールレベルの変化を表す可能性があるため、生殖発達の間接的なマーカーにすぎないことを見出した33。したがって、VOのみに頼って発育年齢を決定し、発情周期モニタリング36の修飾子としてではなく、第1EST段階の出現および上皮細胞30の角化を利用して性的成熟の開始をマークすることが推奨される。

体重は、げっ歯類30,37の青年期の発達年齢と著しく相関しており、したがって、この期間の発達年齢の決定にも役立つ可能性がある。この現象に関連する提案されたメカニズムには、成長ホルモンなどの生殖発達に必要なホルモンの刺激、および食欲調節因子であるレプチンによる視床下部 - 下垂体副腎(HPA)軸の阻害が含まれる30。しかし、種間およびベンダー提供者間でラット間に見られる大きな差異のために、この尺度を発達年齢の唯一の指標として使用することは推奨されない38。VOおよび体重の発達に見られる変動性は、全体的な実験プロセスにおける概念の重要性を例示する。

人間への翻訳:文化的および科学的背景
動物とヒトの生殖研究の翻訳関係は双方向である。動物ベースの研究の結果は、ヒトのプロセスがどのように評価され、アプローチされ、分析されるかに影響を与える39。人間の生殖器系とそれに関連するプロセスの認識は、動物がどのように研究されるかに影響を与えます。実際、この分野におけるさらなる研究のための最も大きな兆候の1つは、科学的プロセスに影響を与えるホルモンサイクルに関連する偏った社会文化的信念に由来しています。これらの慣習の多くは、月経を議論することに対する一般的な文化的嫌悪感から派生しており、それは十分に実証された知識のデータギャップをもたらしました40,41。これには、棚の高さやスマートフォンのサイズから、警察のボディアーマーのフィッティングや見逃したがん診断42まで、軽微なものから致命的なものまで、さまざまな結果があります。

月経が非衛生的で破壊的で有毒であるという記述は、尊敬されるテキスト、メディア、辞書、医学の教えに見られるが、科学出版物によって保存されている。これは、ホルモン周期の不正確で偏った記述、生殖器系を神経内分泌の対応物および環境の影響から隔離すること、および「妊娠の失敗」としての周期の完了の還元主義的視点によって起こる43,44。これは、ホルモンサイクルに影響を与える外部変数の省略、解剖学的発達のみに基づいて開始とエンドポイントの決定、循環的ではなく線形のサイクル進行の測定など、不健全な実験的実践の作成につながります。社会文化的要因と生物学的結果との間には直接的な相関関係があるにもかかわらず、科学文献ではあまり考慮されていません。より包括的な出版物43,44,45の検査を通じて、研究者はこれらのスティグマを解体し、より信頼性が高く有効な実験計画を作成することができます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

このプロトコルで概説されているすべての取り扱いおよび手順方法は、国立衛生研究所(NIH)の動物の世話と使用のガイドラインと一致しており、ペパーダイン大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)とUCLA学長の動物研究委員会(ARC)によって承認されています。

1. 動物の世話と使用

  1. 雌ラットを、検出力分析による数で、および雄ラットがホイッテン効果またはより一貫したサイクリングを促進するように取得する46。既知のデータベース47における研究の目的に基づいてひずみを決定する。
    注:現在のデータは、共同研究の一環として、ペパーダイン大学とUCLAの両方の研究所にある雄SDラットの存在下での女性の思春期のSD国際遺伝子標準化プログラム(IGS)のデータを反映しています。これらのラットは28日齢で別々の群に到着し、発情周期の進行を10日または20日間モニターして、34日齢(7日間の馴化期間の後)から急性および慢性レベルの差を実証した。
  2. 取り扱い前に、輸送後の生理学的安定化のための検疫および/または順応期間を設け、新しい環境に適応させてください。
    注:3日間の最小期間が引用されており、7日間の期間が推奨されています48,49,50,51,52.全体として、これは輸送条件、動物の系統、および研究目的に依存します。
  3. ストレスが適切な生殖器系の機能を混乱させる可能性があるため、順応期間を使用してストレスが軽減されるようにする53。しかし、適度な量のストレスが動物の幸福に有益であるため、それを排除しようとすることによって過剰に補償しないでください51。
  4. 温度(68〜79°F、すなわち、20〜26°C)および湿度制御(30〜70%)の環境において、ビバリウムまたは実験室管理者に連絡し、これらの特徴を確保することによって、宿主ラットを宿主ラットとする。当社ホームページに掲載されている栄養成分を含む水と固形飼料を 自由自在 に配布し、週に1回ケージクリーニングを行います。
    注:この研究では、ラットは19インチ x 10インチ x 8インチの透明な再利用可能なプラスチックケージで性別で区切られた2人のグループに収容され、週に1回交換されたコーンコブ寝具にアクセスできました。温度は70°F、湿度は35〜79%に維持され、平均62%であった。
  5. 生物学的応答の交替を引き起こす可能性のある低い相対湿度レベルおよび極端な温度の証拠について、尾およびつま先のリングテールまたは虚血性壊死の発症をチェックする。
    注:温度と湿度は、生殖器系、性的成熟、および発情周期性54,55,56,57,58にとって重要です。
  6. 時間制御された明暗システムに作用する実験室空間全体に等量の光源を堆積させることによって、ハウジング空間全体で適切でバランスの取れた照明を確保します。
    注:ここでは、06:00-18:00 hからライトが点灯した12:12-hの明暗サイクルは、2,550ルーメンのリニアLED電球によって制御されていました。
  7. 動物の色素沈着、年齢、ひずみ、性別、ホルモン状態の変化に基づいて52のルクス要件に従ってください。
    注:研究者が収集された細胞サンプルを分類すると、一貫した照明により、適切な視覚的検出と信頼性の高いステージングが可能になります59。光の持続時間と強度は、生殖器系、性的成熟、および発情サイクリングに直接関係しています54,55,56,57,60,61。

2. 装置・実験準備

  1. 分類決定要因( 図2Aを参照)を確認します:発情周期の各段階を識別する方法と、顕微鏡とカメラ機器を操作する方法。
  2. 監視対象の各被験者が性的成熟に達し、VO、体重、年齢などの発達の適切な指標を示していることを確認してください。ラットの体重を量り、正確な比較のために毎日同じ時間にVOについて調べ、承認された取り扱い方法でそれらを転送します。動物が以前の体重の20%以上を失った場合は、大学付属の獣医師に相談してください。
    注:VOは、 図3に示すように、尿道開口部に尾側、肛門に頭蓋骨のままであり、両者の間に位置する。
  3. これらの要因はひずみに依存するため、サプライヤーに仕様を確認し、ラボ62に固有の環境要因を考慮してください。
    注:一般に、これは生後32〜34日とSDラットの平均体重75〜150グラム63 の範囲の間に起こり、以前は膜状の鞘で覆われていた円形の開口部によって示される。
  4. 監視対象のラットのグループに適したサンプル収集期間を選択して、過渡的なサンプルの収集を防止します。まず、1日を通して2つまたは3つの異なる時点で数匹の動物をサンプリングして、ほとんどのサイクルステージが存在する時間を決定します(例えば、異なる動物については12:00時間、13:00時間、および14:00時間でサンプリングします)。一貫性のある信頼性の高いステージングのために、毎日同時に膣洗浄を完了します。
    注:12:00から14:00までの時間がすべてのステージをキャプチャするのに最適なと報告されています。この研究では、発情周期モニタリングは12:00〜14:00時間の間に行われ、圧縮スタイルのホールドで処理されました(ステップ3.4を参照)。他の実験的介入(例えば、行動条件付け、投薬)に対する発情周期モニタリングタイミングの重要性は、研究の発展分野であり、さらに探求することができる11。発情周期モニタリングの持続時間を決定することは研究に依存しており、公表された研究11,33でさらに探求することができる。
  5. 顕微鏡から保護カバーを取り外し、保護カメラのレンズカバーを取り外し、顕微鏡の接眼レンズの上にレンズを置いて、カメラをコンピュータに取り付けます。
  6. 次に、コンピューターで事前に選択したソフトウェアを開きます。このスタディで選択したソフトウェアを使用するには、画面の左側にあるUSBに接続されているカメラを[カメラリスト]というラベルの付いたタブで選択します。USBカメラがコンピュータに正しく接続されていることを確認します。正しく接続されていない場合は、[カメラリスト]というラベルの付いたタブの下に[デバイスなし]と表示されます。
  7. タブの下でUSBカメラを選択したら、ベースにある顕微鏡ライトスイッチをオンにします。
  8. セルサンプル写真用に指定されたフォルダをコンピュータ上に作成します。データが収集される個別の日ごとに、イメージが取得される前に事前に準備されたファイルフォルダを作成します。
  9. 機器を準備したら、被験者のケージを保管場所から取り出し、サンプル採取ステーションに持ち込みます。

3. 膣細胞の採取

  1. 使い捨てシリンジを取り出し、各シリンジに0.2mLの滅菌0.9%NaClを充填します。気泡が存在する場合は、すべての気泡がシリンジの開いた先端に達するまでバレルシリンジを静かにフリックし、空気を排出します。気泡がまだ存在する場合は、溶液をNaClレセプタクルに戻し、何もなくなるまで補充します。
    メモ: フリックしすぎると、より多くの気泡が形成されることがあります。
  2. 各シリンジをプラスチックラッピングに戻して、シリンジの先端をラッピングの密封部分の内側にして、滅菌フィールドを維持します。
  3. ケージを開き、尾の付け根または体の幹のいずれかで被験者を静かに持ち上げ、他の人が出ないようにケージの蓋を閉めます。個人の嗜好や動物の反応などから、以下のものから開催方法を選択してください。
  4. 思春期のラットには、被験者の鼻を地面に向け、被験者を胸の上部領域に当てて、圧縮スタイルのホールドを使用します。綿棒を開始する前に、被写体が動きを妨げるのに十分な圧縮状態になっているが、貨物室で快適で安全であることを確認してください。シリンジを挿入する前に尾を静かに曲げることによって、被験者の膣管を露出させる。
  5. 成体ラットには、動物の前足をケージの上部または側面のいずれかに置き、尾と後肢を第1指と第2指の間に緩やかに保持して拘束し、親指を自由にしてシリンジ64を操作できるようにして、成体ラットには後肢リフトを使用する。
  6. 動物が取り扱いと監視に順応するのを待ちます。動物を優しく、しかもしっかりと扱って、過剰なストレスを軽減し、噛むなどの攻撃性から研究者を保護します。
    注:モニタリングの最初の数日間は、動物がそれぞれの状態に順応するにつれて、望ましい結果をもたらさない場合があります。馴化期間中に体重を収集するために動物を取り扱うことは、この移行33を助けることができる。
  7. 人差し指と中指でシリンジをしっかりと保持しながら、シリンジの先端(2mm以下)を膣管に平行な角度で挿入します。プランジャーを内側に押し込んで、NaCl をゆっくりと運河に排出します。シリンジを運河にさらに挿入しないでください, そうすることは発情サイクルを混乱させる可能性があるため、.
  8. シリンジのプランジャーを上皮ライニングから引き離す(上向きに)ことによって、膣管からNaClを抽出する。このプロセス中に被験者をホールドに保持することが困難な場合は、NaCl抽出を試みる前に、短い休息期間の間、それらをケージに戻してください。
  9. 細胞サンプルが収集されたら、被験者をケージに戻して、すべてのサンプルが顕微鏡下で評価される前に、各動物についてこの手順を繰り返します。
    注:あるいは、次の動物に移る前に、各サンプルを収集して評価することもできます。動物は、サンプルを分類できない場合、2回目の洗浄が必要な場合があります。最初のコレクションからの同じ注射器は、容器内の生理食塩水に直接接触せず、同じ動物に対してのみ再利用することができます。

4. サンプル評価

  1. 抽出した膣液サンプルを調べることによって分類を開始します。粘度を粘性または非粘性のいずれかとして記録し、着色を不透明または透明として説明文書または他の記録システムに記録する。
    メモ: プロトコルのこのセクションは、サンプル収集時以降に実行できます。
  2. 2〜3滴の液体を顕微鏡スライド上に排出し、スライドの上に顕微鏡カバーガラスを置きます。気泡の形成を防ぐために、スライドの上部から下部へ、またはスライドの一方の側から他方の側へ、顕微鏡スライド上のカバーガラスを置きます。可能であれば、さらなる検査が必要な場合は、回収したサンプルの約半分をシリンジに残し、過剰な量の流体がスライド上に置かれるのを防ぎます。
  3. 顕微鏡スライドをステージ上で動かして、収集された細胞を見つけます。細胞が少なすぎる場合や破片の量が多い場合は、残りの液体を新しいスライドに排出して再検査してください。シリンジに残っているサンプルの量が不足している場合、または2滴目が同様の問題を示している場合は、発情サイクル段階の特定を試みる前に、被験者から別のサンプルを収集してください。
  4. セルの位置が決まったら、コンピュータまたはコンピュータのキーボードに触れる前に、キーボードを汚さないように手袋を 1 つ取り外します。
  5. ソフトウェアパネルの左側にある 「スナップ 」というラベルの付いた機能をクリックして、セルサンプルの画像を取得します。
  6. 次に、ページの左上隅にある[ファイル]アイコンの下にある[ 名前を付けて保存 ]をクリックして ファイル を保存します。コンピューター上のラベルの付いたフォルダーの下に写真を保存します。
    メモ: ラベルテンプレートの例: 使用#subjectnumber_date collected_estrous stage_objectiveレンズ。
  7. 各フレーム内に多くのセルがない場合は、各対物レンズで複数の写真を撮ります。
    メモ: 複数の画像のラベルの例: #1_01/09/2021_EST_4x1 および #1_01/09/2021_EST_4x2。
  8. 複数の対物レンズの下で収集したサンプルごとに手順を繰り返します。少なくとも 1 つの小さな客観化 (4x など) と、少なくとも 1 つの大きな客観化 (20x など) を含めます。
  9. 画像を共有ドライブ/フォルダまたは外付けハードドライブにアップロードして、関係するすべての研究者がファイルにアクセスでき、バックアップコピーが利用可能になるようにします。

5. ステージの分類

  1. 撮影した写真と記録用紙を同時に表示するようにコンピュータ画面を設定します(図 4A-C)。
    メモ: これにより、収集されたサンプルの表示中にドキュメントを表示できます。プロトコルのこの部分は、サンプル収集時以降に完了することができる。
  2. サンプル中に存在する細胞型を特定します。ステップ 5.2.1 から 5.2.4 にリストされている 4 つのオプションから基準を使用して選択し、その結果を記録します。
    1. 無肛門切開角化上皮(AKE)/角化上皮細胞
      1. 図2Bと図5Cに見られるように、ギザギザまたは角張ったエッジの細胞を探します.これは、核がないにもかかわらず、核がかつて存在していた場所を表す細胞内の明るい丸い領域(核幽霊)を示す可能性があります。20倍以上の高倍率を使用して、有核細胞と無核細胞などを区別する。
      2. 必要に応じて、細胞の角化部分または角化部分(核を欠き、ケラチンで満たされた細胞の薄い層)を区別するために、より高い倍率を使用します。
        注:ギザギザの外観に加えて、これらはまた、ケラチンバーとして知られているギザギザの細長い構造を作成し、折り畳んだり分解したりする方法によって区別することができます。
    2. 大型有核上皮(LNE)細胞
      1. 不規則な境界線、ギザギザの境界線、または角度のある境界線で囲まれた、通常は丸い形から多角形のセルを探します。
      2. 図2Bおよび図5D1,2に見られるように、それらの核が死または劣化中の細胞の核におけるクロマチンの不可逆的凝縮に関連して、無傷から縮退またはピコンティックに至るまで、さまざまな形態をとる可能性があることを観察する。これらの核は、細胞内の細胞質よりも少ないスペースを占め、小さな上皮細胞よりも核対細胞質(N:C)比が低いことに注意してください。より高い倍率で見ることができる細胞質顆粒を探してください13。
    3. 白血球(LEU)/好中球/多形核細胞
      1. 細胞が成熟するにつれて消失する多葉核を持つこれらのコンパクトな球状細胞(したがって、多形核細胞として知られている)を探してください(図2B および 図5A)。より高い倍率(例えば、40倍)を使用して、多葉性核を観察することができる。
        注:収集および調製時に、これらの細胞は凝縮、折り畳み、または破裂することがあります。
    4. 小有核上皮(SNE)細胞
      1. 上記の好中球よりも大きいこれらの丸い楕円形の細胞を探してください。
      2. これらの非角化上皮細胞(図2B)の丸い核を観察し、細胞内の細胞質よりも大きな空間を占有し、大きな上皮細胞に対してより高いN:C比を作り出します。
        注: 収集および準備時に、これらのセルが折り畳まれたり重なったりして、 図 5B1 に示すように、ひもまたは棒に似た形状になることがあります。
  3. サンプル中に存在する細胞が、各客観化に対してどのように編成されているかを調べます。4x などの下部の客観化を使用して、セル配置全体の代表的なビューを表示します。細胞が凝集しているか(C)、均等に分散しているか(ED)、ランダムに分散しているか(RD)を記録し( 図4C参照)、各細胞タイプの特定の組織に注意してください(例えば、小さな有核上皮細胞が凝集し、好中球が均等に分布しています)。
  4. 次に、総細胞量(スミッジ、中程度、多数)と個々の細胞量(存在する各細胞タイプの割合)を視覚的に推定して記録します。
    注: スミッジは、サンプルの分類を決定するために使用できるセルの最小数を表し、多数は、スライド上のスペースのすべてではないにしても、ほとんどを占めるか、または互いに積み重ねられている無数のセルの存在を表し、適度な数のセルは比較的平均的なセル数を表します(図 5A-D および図 6A-D の例を参照)。
  5. 「異常」カテゴリの特定の被験者に典型的なリストされた基準または側面のいずれかからの逸脱があるかどうかに注意し、必要に応じて獣医師に相談してください。
  6. どの発情周期段階がサンプルに提示されているかを判断し、分類成分と以下の説明を使用します。
    1. 死ぬ
      1. LEUは、DIEの開始時に凝集した形で配置され、後期段階ではより分散した、優勢または唯一の細胞型として存在する。
        注: 図6D1に示すように、DIEに移行している間、上皮細胞が分解し始めると、細胞の量が減少することがあります。同時に、LEUの数は増加し始め、最初は凝集して配置され、時間の経過とともに分散する傾向があります。
      2. 細胞の総量は比較的少なく、ほとんどの場合、DIE期間の後期、2日目または3日目に行われる可能性があることに注意してください。
      3. この段階で存在する可能性のある大量の粘液を観察し、LEUの濃縮鎖として提示します(図5A1)。PROへの移行の後期段階でLEUに付随するSNE細胞の小さな凝集塊または細胞鎖を探してください(図5A1,2)。
      4. DIEに移行し、完全に移行し、DIEから移行するときの膣液の粘性および不透明な外観を観察します。
        注: この段階の平均所要時間は、4 日間のサイクルでは 48 時間、場合によっては 5 日間のサイクルでは 72 時間です。
    2. プロ
      1. 優勢な細胞としてSNE細胞を探し、LEU、LNE、および/またはAKE細胞は、少ない数で見ることができます。この段階では、通常、クラスター、シート、またはストランドに配置されたSNE細胞の粒状の外観を観察するために、高い客観化を使用します(図5B1,2)。
      2. DIEからPROに移行する際の膣液の粘性および不透明な外観、およびPRO段階に完全に移行すると、それが非粘性で透明になる様子を観察します(ラットの平均持続時間は14時間)。
    3. ティッカー
      1. AKE細胞の優位性、ESTにおけるSNE細胞の減少、およびESTが続くにつれて細胞の数とサイズの増加を探してください11,13。
      2. AKE細胞のしばしばクラスター化された配置の際立った特徴に注意してください、ケラチンバーの形で、またはゴースト核を含む、PROからMETへの移行(図6B)およびMETへの移行においてよりランダムに分散する可能性がある(図6C)。
      3. ラットがESTに移行し、完全に移行し、ESTから移行するにつれて期待できる特徴的な非粘性で透明な膣液を観察します。
        注: EST の進行には、多くの多様化が含まれます (図 5C および 図 6B、C)。この段階は、通常、4日間のサイクルで平均24時間、または5日間のサイクルでおそらく48時間発生します。
    4. 会った
      1. ラットがMETに移行しつつあるため、チャネル内の細胞比率の点で優勢であるか、LEUs11,13と同等の割合に近いSNEおよびLNE細胞の数が多いことを探します。さらに、MET内の破片の量と、ESTに続いて上皮細胞が崩壊してDIEに移動することによる他の段階よりも転移に注意してください。
      2. すべての細胞型が様々な量で見られるので、一貫した配置の欠如を観察してください(図5D1-3)。しかし、初期段階で上皮細胞の近くでパッキングまたは凝集しているLEUを探し、DIEに移行するときに凝集した配置に戻る可能性があります。
      3. この段階での膣液の非粘性で透明な外観と、DIEに移行しながらより粘性があり不透明な外観に変化するのを観察します。
        注:この段階の平均持続時間は6-8時間です。
  7. 被験者が移動しているステージの遷移中のサンプルにラベルを付け、遷移を括弧内にラベル付けして、これらがいつ収集されたかを追跡します。これらの4つの段階とその遷移を区別する方法の詳細については、 代表的な結果を参照してください。
    メモ: 収集されたサンプルは静的であり、サイクルは動的であるため、スライドはステージ間の遷移を示す場合があります(図 6A-D を参照)。
  8. モニタリングフェーズが完了するまで、各動物についてこのプロセスを完了します。
  9. 11日目(45日齢)または21日目(55日齢)のいずれかに、ギロチン断頭前にラットを5%イソフルランおよび2%酸素で安楽死させる。これらの時点は、研究の性質によって異なる場合があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

現在のデータは、雄SDラットの存在下での女性の思春期のSD国際遺伝子標準化プログラム(IGS)のデータを反映しています。これらの動物は、共同研究の一環としてペパーダイン大学とUCLAの両方の研究所にありました。図5は、4サイクル段階の複数のバリエーションを示しています。図5A1は、いくつかの細胞型が存在するダイストラスサンプルとして同定された。この例は、上皮細胞の数が多いサンプルが、LEUの優位性など、他の分類成分の適格性を満たす場合に、ダイストラスとして適格であることを示しています。このサンプルはまた、この段階でしばしば見られるLEUsを構成する粘液鎖配置を実証し、これはPRO段階で見られるSNE細胞からなる鎖に類似している。DIE段階の粘液鎖とSNE細胞からなるPRO段階に現れる鎖を区別するには、LEUの優位性を同定することが重要です。図5A2,3は、しばしば観察される細胞配置の進行、すなわちDIE段階の後の期間に収集されたサンプルにおいて、ランダム(RD)または支払い(ED)を収集して移動するLEUの初期凝集を示しています。具体的には、図5A2は多数の細胞が存在するDIEサンプルであった。これは、LEUsが多数の上皮細胞(図5A1,2)を伴い得ることを反映しており、LEUの優勢およびケラチンバーの不在によって小脳細胞と区別される。対照的に、図5A3は、低い総細胞数(スミッジ)が、2日目または3日目など、DIE段階の後期段階で一般的に見られたことを示しています。PRO段階では、SNE細胞はしばしばストランドに配置され、多数の細胞が互いに積み重ねられ(図5 B1)、または細胞のスミッジがより小さな凝集塊に配置された(図5B2)。図5B3は、EST段階に存在するAKE細胞からなるケラチンバーと混同される可能性のあるバーを形成し、重なり合うSNE細胞の特徴的なシート状の凝集を有するPROサンプルを例示している。両者を区別するためには、PROにおけるSNE細胞およびESTにおけるAKE細胞の優位性を同定することが重要です。

図5C1,2は、ESTに見られるAKE細胞の典型的な凝集およびランダム支払いを示しており、前者は多数の細胞を含み、後者は中程度の数を含む。これらの実施例では、幽霊核、ケラチンバーの形成、およびこの段階でしばしば収集される細菌が見られる。SNE細胞は、EST段階(図5C1)の間に、前のPRO段階の残骸として表されたことがある。被験者がMETに向かって移動するにつれてSNE細胞が出現し始める後期EST段階は、しばしばPRO段階と間違われる。この2つを区別するには、核の大きさを考慮に入れることが重要です。一般に、PROの有核細胞はより高いN:C比を有する。図5に示すサンプルC3は、EST段階の特徴として見られなかった多数のAKE細胞の鎖状配列を提示した。これは、各動物が一意であること、基準からの逸脱が生じる可能性があること、および分類決定要因が組み合わせて検査されるべきであることを示しています。

SNE細胞が存在する場合にESTとPROを区別するために、EST段階でこれらの細胞においてより低いN:C比が生じたことがわかった。EST中に存在するケラチンバーを、PRO段階におけるSNE細胞の重なりまたは転動によって形成されるもの(図5B3)およびMETからの移行において上皮細胞の崩壊によって形成されるもの(図6D1)と区別するためには、優勢な細胞型、配置、および量を特定して、表されている段階を区別することが重要である。最後に、図5D1,2は、MET段階を表すランダム支払い中に存在するすべての細胞型の組み合わせを例示する。これらの実施例に存在する多数の細胞に加えて、EST後の上皮細胞の崩壊および上皮細胞の膣管をクリアする機能するLEUの優勢を伴うDIEへの移行のために、この段階でより多くの量の破片を収集することが一般的であった(図5D2)。図5D2はまた、上皮細胞の高濃度化とケラチンバーの存在によってMETがDIEとどのように区別できるかを示しています。全体として、これらの表現は、各段階内に存在する広いスペクトルを表しており、網羅的ではありません。

4つの遷移相の表現を図6に示す。この研究では、転移中のサンプルを4つの発情サイクル段階の1つとして分類しましたが、移行段階を適切に特定することは依然として重要です。DIEからPROへの移行(図6A)では、LEUの数が全体的に減少し、SNE細胞の数が増加することが多かった。LNEおよびAKE細胞は、この移行において、多量ではないが、時折存在していた(図6A1)。図6A2-4は、この移行中にしばしば収集された凝集およびランダムに分散したSNE細胞の数が多く、ランダムかつ均等に分散したLEUの数が少ないことを示しています。全体として、他の移行段階と区別する場合、SNE細胞の優位性およびPROに見られる凝集塊および鎖形成の開始に注意することが重要であった。図6Aのすべての例は、図6A4を除く多数のセル数を表しており、スミッジを有する。図6Bにおいて、画像は、PROからESTへの移行において見られる多数の凝集SNEおよびAKE細胞の例を示す。

この移行中、SNE細胞は、EST中よりもAKE細胞の凝集が少なく、よりランダムな支払いで、より多くの数にあることが見られる。 図6Cは、AKE、SNE、およびLNEの出現と、ESTからMETへの移行におけるAKE細胞の減少を示す。存在する破片は、小腸でよく見られる以前の発情期からの崩壊したAKE細胞を表す。これは、上皮細胞が崩壊して破片を産生し始めたMETからDIEへの最終移行段階(図6D1,2)にも見られ、前者には多数の細胞が存在し、後者では中程度の数が存在する。これらの数字は、ダイストラスへの移行においてLEUの数が増加して支配的な細胞型になるという現象を示しています。20日間モニターした群(n = 3)では、転移サンプルが収集された12日間があり、平均は4であった。10日間モニターした群(n = 3)では、転移サンプルが収集された日数は9日あり、平均は3であった。

図7は好ましくない細胞サンプルの収集を表しており、その大部分は繰り返し洗浄を正当化していました。 図7A1 は、不適切なシリンジの挿入および抽出のために収集された扁平上皮細胞の塊を示し、扁平上皮細胞が膣管壁から吸引される原因となる。これらの細胞は、塊およびその独特の境界の高密度およびコンパクト性のために、凝集した上皮細胞またはLEUと区別することができる。 図7B は、細胞が抽出されなかったか、焦点面が正しくないか、またはスライドが細胞を完全にスキャンしなかった破片の集まりを表しています。破片は、細胞型に精通し、しばしば特徴的な小さなサイズおよび凝集塊に精通していることによって、細胞と区別することができる。この破片は、多くの場合、動物の寝具、髪の毛、または細胞の腐敗に起因します。 図 7C は、スミッジの下にあるセル数を含むスライドを示しています。MET後期および早期DIEでは細胞数が少ないことが一般的に見られましたが、これはステージに正確に分類するには細胞が少なすぎるスライドを表しています。

図7D は、顕微鏡スライド上の運河からの膣液と組み合わせたNaCl抽出溶液の2つの例を示す。最初の画像である 図7D1では、流体が存在し、焦点が合っておらず、正確に分類する能力を妨げていました。 図7D2では、流体はLEUとともに凝集円状にスライド全体に広がっていた。この例では、細胞の存在が大きいため、洗浄を繰り返す必要はありませんが、塗抹標本を防ぐために、スライド上に置かれた流体の量と顕微鏡カバースライドの配置を考慮することが重要です。全体として、これらの画像は、適切な分類のために高品質の代表画像をキャプチャすることの重要性を強調しています。これには、画像をキャプチャする前に、細胞抽出の方法、焦点面、および各スライドをスキャンして画像の内容を考慮することが含まれます。

実験群の各動物を分類した後、ステージの進行を棒グラフまたは折れ線グラフでグラフ化するのが一般的です。これにより、研究者は全体的なサイクルパターンを調べ、動物が非循環性として知られる発情期の不規則な進行を示す時期を特定することができます。サンプルは、この分析ツールのサイクル長とステージ進行パターンによって分析できます。図 8A、Bに示すこの概念には、この研究の場合、さまざまな高さのバーを個々のステージに割り当て、記録されたデータ(図4B)をx軸にわたって変換することが含まれます。これらの例では、METとDIEは最も低いバーの高さ、PROは中央、ESTは最も高いバーの高さで表されます。METステージの持続時間が短いため、DIEステージと1つのバーに組み合わされます。サイクル完了を測定する方法はさまざまですが、1つの完全なサイクルを1つのESTから別のESTへの移動としてカウントするのが一般的です。ただし、これはサイクルの完了ではなく、連続する EST ステージがある場合の 2 日間の EST ステージ期間を反映しています。

図8Aは 、MET/DIE、PRO、およびESTを通じて一貫して反復的な進行を進行するラットからのデータを反映しています。さらに、このラットは4.375の平均長さで4〜5日のサイクルの範囲内に収まりました。各段階は標準化された長さの範囲を超えず、ESTで平均1.0625日が費やされ、非循環性の典型的な評価である。抽出されたデータがESTからESTへの規則性のあるこのパターンに従う場合、これは被験者のホルモンレベルが許容範囲内にとどまったことを確認するだけでなく、プロセスの周期的性質を著しく中断することなく手順が実施されたことも確認する。最後に、このラットは、ESTからESTバーの数を数えることによって決定される16サイクルを完了した。

図8B は、拡張(EXTとして見られる)および未記録の段階を含む、一般的なタイプの非循環性を表す。この図はまた、サイクルパターンと各段階で費やされた長さと日数の両方を調べることの重要性を強調しています。具体的には、この例では、ESTにおける平均サイクル長および日数が概説されたパラメータ内に収まる一方で、ステージ進行のサイクルパターンは異常を明らかにした。したがって、発情周期を総合的に調べることが重要です。拡張DIE (Ext Diestとラベル付けされた) および EST ( Ext Est とラベル付けされた) ステージは、図に示すサイクル全体を通じて記録され、PRO ステージが記録されていない複数のサイクルがありました。この例は、典型的な範囲内にあるESTのサイクルの平均長さと日数だけを調べるのではなく、典型的な範囲外にある連続した段階の数を調べることの重要性も示しています。

これらの例の原因と相関関係には、生理学的異常(腫瘍、偽妊娠、長期ストレス)、有害な環境条件(長時間の照明、有毒化学物質への曝露、孤独な住居)、サンプル収集の不適切なタイミング、研究者のエラー(不十分なサンプル収集、画像キャプチャ、不適切なステージング)、加齢関連現象(青年期および生殖老化に見られる一般的な不規則性)、または特定のものに固有の偏差などの要因が含まれます。 動物。研究者のミスや不適切なタイミングのサンプル採取と、身体的な異常や加齢現象を分けるには、4つの分類成分をより詳細に調べると便利です。これは、不規則性の考えられる原因を特定するのに役立ち、より広い意味では、発情サイクル特性をより詳細に研究している研究に利用することができる。

図9は、Y軸に合計セル量と個々のセル量、異なるバー塗りつぶし色で表されるセルタイプ、および異なるバー塗りつぶしパターンで表されるセル配置を、合計監視期間にわたってグラフ化することによって、このより詳細な検査を示しています。この分析方法により、完了したサイクルの総数、各サイクルの長さ、ステージの進行、および個々のラットごとにより詳細に分類成分を調べることができました。 図9A は、平均よりも少ないサイクル数を有するラットを表し、モニターされた10日間に合計3回のフルサイクル(2回の3日間サイクルおよび1回の5日間サイクル(平均3.67回)を有する)。ステージ進行に見られる不規則性は、50%の日で、1つ以上の未記録のステージと、収集されたサンプルの30%が移行中であること(2日目はMET-DIEとして、5日目はEST-METとして、8日目はPRO-DIE転移)であった。これは、サンプル収集のタイミングが不適切であること、研究者のエラー、加齢に関連する現象、または固有の偏差が原因である可能性があります。さらなる監視は、どちらが適用されたかについての明確さを提供することができた。

典型的な優勢な配置、細胞型、および個々の細胞量および総細胞量は、記録された各段階内で見られた。EST段階では、スミッジ(サンプルの25%)、中等度(サンプルの25%)、および多数の(サンプルの50%)凝集したAKE細胞が見られ、LEU、SNE、およびLNE細胞の存在は低かった。捕捉された1つのMET段階では、多数のランダムに分散したLEU(50%)、AKE細胞(20%)、LNE(15%)、およびSNE(15%)細胞の組み合わせが存在した。DIE段階では、ランダムに分散し、均等に分散し、優勢なLEUの組み合わせのスミッジ(サンプルの50%)および多数の量(サンプルの50%)が、AKE、LNE、およびSNE細胞に散在しているのが見られた。収集された1つのPRO段階では、ランダムに分散したLEU(存在する細胞の60%)およびSNE細胞(存在する細胞の40%)のスミッジが存在し、これらは配置の組み合わせであり、DIEからPROへの移行を表していた。

図9Bにおいて、表されたラットは、4日間のサイクルパターンを有する、合計3つの完全なサイクルを有していた。収集されたサンプルは、DIE期間が延長され(6〜9日目)、および未記録ステージの他の5つのインスタンス(2つの未記録METステージ、2つの未記録PROステージ、および1つの未記録のESTステージ)で、一貫したステージ進行を表していませんでした。サンプルのわずか20%が移行中であり(3日目をDIE-PROとして、5日目をEST-METとして、18日目をMET-DIEとして、および19日目をDIE-PROとして)、MET段階および長期のDIE期間外では3段階のみが記録されなかったため、サンプル収集のタイミングはこの特定の動物にとって適切であると結論付けられた。過去10日間監視された4段階の秩序ある進行が含まれていたため、初期の不規則性は青年期に起因する可能性があります。監視期間(20日)が長くなるほど、この結論が発生することができました。

分類成分の調査により、典型的な範囲が明らかになりました。EST段階は、中等度(サンプルの50%)から、LEU、SNE、LNE細胞が少ない凝集したAKE細胞の多数(サンプルの50%)の優位性を反映していました。収集されたMETサンプルでは、中程度(サンプルの33.33%)から多数の(サンプルの66.67%)ランダムに分散および凝集したLEU(10〜90%の量範囲)、凝集したSNE(0〜30%)、ランダムに分散したLNE(0〜10%)、および凝集およびランダムに分散したAKE細胞(10〜90%)の組み合わせがあった。DIE段階は、ランダムに分散したAKE細胞とSNE細胞の両方の存在下で、均一に分散し、ランダムに分散し、凝集したLEU(50〜100%の範囲)の多数の(サンプルの80%)量に対して、中等度(20%)の優位性を反映していました。PRO段階は、LEU、AKE、およびLNE細胞の存在下でのスミッジ(サンプルの3.33%)および多数の(サンプルの66.67%)量のランダムに分散および凝集したSNE(10〜99%)細胞の優位性によって同定された。

抽出されたデータを分析する場合のもう1つの選択肢は、前述の要素(y軸上の合計および個々の細胞量、異なるバー塗りつぶし色で表される細胞タイプ、および異なるバー塗りつぶしパターンで表されるセル配置)を、各サイクルステージの合計監視期間にわたってグラフ化することによって、発情サイクルプロファイルを作成することです。これは、ラットごとまたはグループ全体の平均ごとに完了することができます。この分析ツールの目的は、段階ごとの成分の分類傾向を調べることであり、発情周期段階の分類に固有の分類成分の区別を特徴付ける際に科学コミュニティ全体を支援します。図10 A1では、10日間のDIEプロファイルは、SNE、AKE、およびLNE細胞の減少とともに、均等に分散したLEU(平均78.25%)の中程度(サンプルの50%)および多数の量(サンプルの50%)の優位性を示しました。図10A2において、20日間のダイストラスプロファイルは、より少数のAKEおよびSNE細胞とともに、中等度(サンプルの20%)および多数の(サンプルの80%)量の均等に分散、凝集、およびランダムに分散されたLEU(10日すべてに存在する平均82%)の優位性を示した。

図10 B1に示されたPROステージは、LEUおよびAKE細胞の存在下で、中程度の数のランダムに分散したSNE細胞(60%)の優位性を示した。図10B2の20日間のPROステージプロファイルは、LEUおよびAKE細胞と並んで、配置およびランダムに分散したSNE(3つのサンプルすべてに存在する平均66.33%)細胞の組み合わせのスミッジ(サンプルの33.33%)および多数の量(サンプルの66.67%)の優位性を示した。図10に見られる10日間のESTプロファイルC1は、より少ない数のLEU、SNE、およびLNE細胞とともに、配置の組み合わせにおいて、中等度(サンプルの50%)または多数の(サンプルの50%)量のAKE細胞(存在する2日間の平均80%)の優位性を示した。図10 C2において、20日間のESTプロファイルは、中等度(サンプルの75%)または多数の量(サンプルの15%)数のランダムに分散されたAKE細胞(存在する4日間の平均57.5%)または配置の組み合わせの細胞の優位性を示し、LEU、SNE、およびLNE細胞の数が少ない。

図10 D1の10日間のMETステージプロファイルには、ランダムに分散した多数のLEU(50%)、AKE細胞(20%)、およびSNE(30%)細胞が含まれていました。図10 D2の20日間のMETステージプロファイルは、中程度(サンプルの3.33%)または多数の量(サンプルの6.667%)のLEU(3つのサンプルすべてで平均50%)、SNE(3つのサンプルすべてで平均15%)、AKE細胞(存在する3つのサンプルで23.33%)、LNE細胞(存在する2つのサンプルすべてで平均15%)を示しました。LEUの半分はランダムに分散し(1サンプル)、残りの50%は配置の組み合わせ(1サンプル)でした。SNE細胞の3分の2は、存在する場合にランダムに分散していたが、残りの33.33%は、存在する場合の配置の組み合わせであった(3サンプル中1サンプル)。最後に、AKE細胞の66.67%が、存在するサンプル(2日間)で凝集し、残りの33.33%が配置の組み合わせ(1日間)であった。表1には、2つのグループからの分類式の数値平均が含まれています。図9A、Bおよび図10A-Dのデータには、個々の動物からの分類決定因子に関する情報が含まれていますが、これらの表には例として発情期の平均が含まれています。他の研究室で再現すると、これらのパラメータはステージ識別の標準になる可能性があります。これにより、ステージングプロセスに現在関与している主観性のレベルが低下する可能性があります。

統計学
一般に、サイクル特性を解釈する際に考慮すべきパラメータはいくつかありますが、「異常」と見なされるものに関するコンセンサスが不足しており、偏差が典型的です。Goldmanらは、「レギュラー」を24-48時間ESTおよび48-72時間DIEステージ11の4-5日サイクルとして同定した。これらのパラメータからの乖離は、1つ以上の生理学的異常、不適切な収集タイミング、またはホルモンレベルが成熟するにつれて思春期のラットがしばしば経験する初期非循環性を含む様々な要因に起因する可能性がある。実験用獣医師に相談し、適切なタイミングを確保するために試験収集期間を有効にし、思春期を過ぎた動物を監視して比較タイムラインを確立することに加えて、統計分析は因果関係および/または相関関係を異常に帰すのに役立ちます。サイクルをカテゴリ(例えば、一貫性と異常)に特徴付けた後、カイ二乗分析はグループの比較を助けることができる。さらに、分類成分または一般的なサイクル特性は、分散分析(ANOVA)11を使用して介入後を比較することができます。しかし、そのような偏差は、序論で議論したように生物学的に意味をなさないかもしれないので、実験的文脈を考慮しなければならない。

Figure 1
図1:発情周期段階におけるホルモンリズミカル性(A)顕著な発情周期段階における性ステロイドホルモンレベルの変化を概説し、要約する。段階の進行は、構築ホルモンレベルとプロセスの循環進行を実証するために、小テストで始まり、終わります。外部ソース11から適合される。(B)性ステロイドホルモンが中枢神経系から血流を介して生殖器系へ流れる。ホルモンレベルは、視床下部および下垂体からの信号を介して、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GrHまたはLHRH)および卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンの組み合わせを介してそれぞれ増加することがわかる。これには、エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度に依存する正および負のフィードバックループの両方が含まれる。情報17および外部ソースからトレースされた画像65,66,67。略語: LHRH = 黄体形成ホルモン放出ホルモン.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:測定されたエストロウスサイクル分類行列式。 (A)ここにリストされているのは、収集された細胞サンプルをステージングする際に使用される成分と、各ステージの優勢な成分です。これらは一般的なパラメータであり、違いが予想されることを覚えておくことが重要です。(B)各段階に存在する優勢な細胞型を以下に示します。これらは一般的な分裂ですが、各細胞型はすべての段階にあります。(C)ここに提示されるのは、この研究で見出された細胞配置タイプである。(D)ここでの画像は、4つの発情周期段階のそれぞれに存在する典型的な細胞量を反映しており、象限体積はおおよその細胞量を表す。外部ソース13 から供給され、以前に適応された68。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:Sprague Dawleyラットの膣 開口部(A)尿道開口部に関連して膣管につながる未発達の外性器および膣開口部の解剖学的配向。(B)矢印でマークされた未開発領域の視覚的表現。(c)尿道開口部に関連して発達した外性器および膣オリフィスの解剖学的配向は、典型的には34日齢頃に生じる。(d)画像 Aに概説された現像領域の対応する視覚的表現。全ての図は外部情報源29から出典とする。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:行列式データ記録テンプレートの分類 (A)データ記録のための1つのオプション。には、行列式の分類に関する説明が含まれています。これは、毎日使用されるように、モニターされたラットごとに1つずつである。(B)このテンプレートはデータ入力のオプションであり、カテゴリ化行列式とラット識別の簡単な記録を備えています。これにより、2 番目の PRO 分類でメモをデータシートに入力できます。一番上の行の色は、表されている実験グループに割り当てられた色を反映しており、あるグループを別のグループと区別するのに役立ちます。(C)別のテンプレートオプション。すべての分類決定要因を含み、研究の個人的な好みや目的に基づいて変更することができます。略語:AKE=無肸部角化上皮;LEU = 白血球;LNE = 大きな有核上皮;SNE = 小さな有核上皮;C = 凝集;ED = 均一に分散;RD = ランダムに分散;COM = 組み合わせ;SMD = スミッジ;MOD = 中程度;NUM = 多数;EXE = 運動;SED = 座りがち;Est = 発情;Die = diestrus;met-die = metestrus-diestrus transition;プロ = 初出乳;pro-Est = 前発情 - 発情遷移;** = パブリケーションに役立つ可能性のある品質の例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:段階分類式行列式変動(A)この一連の画像は、ディエストラス段階のさまざまな例を示しています。最初の画像(A1)は、濃縮LEUの鎖によって表される粘液の沈着物を描いており、上皮細胞はランダムな支払いで存在する。これは、倍率4倍と10倍倍の両方を利用することの重要性の一例です。この4倍の倍率は、発情前鎖に似ていますが、10倍で詳しく検査すると、LEUの優位性が表示されます。2番目の画像(A2)は、ダイストラス期によく見られたもの、すなわち上皮細胞(SNE、LNE、およびAKE細胞)の凝集した配置とともに見られるLEUの優位性を描いています。このシリーズの最後の画像(A3)は、膣液滴と生理食塩水滴の真っ只中のダイストラス期によく見られるLEUのランダムな支払いを反映しています。(B)この一連の画像は、発情期期の様々な例を描いている。第1の画像(B1)は、SNE細胞の鎖への凝集配置を描いている。2 番目の画像 (B2) は、総細胞数が少なく、SNE 細胞の凝集塊を持つスライドを反映しています。3番目の画像(B3)は、SNE細胞の一般的な凝集とよりランダムな支払い、およびLEUおよびAKE細胞の数が少ないことを示しています。(C)この一連の画像は、発情期の様々な例を描いている。最初の画像(C1)は、SNE細胞の存在下でのケラチンバー形成を伴うAKE細胞の一般的な凝集配置を描いている。2番目の画像(C2)は、ゴースト核と細菌を持つAKE細胞の凝集を示しています。最後の画像(C3)は、AKE細胞の鎖状配列を提示する。(D)この一連の画像は、メテストラス段階の様々な例を描いている。最初の画像(D1)は、破片の存在下でのLEU、SNE細胞、AKE細胞、LNE細胞のランダムな支払いと凝集を示しています。2番目の画像(D2)は、ケラチンバーと並んで、凝集した配置で存在するすべての細胞型を反映しています。最後の画像(D3)は、存在するLEO、SNE、AKE、およびLNEセルのより包括的な配置を示しています。これらの数値は、4 倍 (A1、A2、B2、B3、D1、および D3) または 10 倍 (A3、C1、C2、C3、および D2) の客観化のいずれかで撮影され、分類コンポーネントの視覚化を強化できるようにズームインされています。スケールバー = 100 μm。サイズ参照用。AKE細胞の直径は約40~52μm、LEUは約10μm、LNE細胞は36~40μm、SNE細胞は約25~32μmである16。略語:SNE=小さな有核上皮;LNE = 大きな有核上皮;AKE=無肛門痢角化上皮;LEUs = 白血球。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:移行期のサンプル。(A)この一連の画像は、DIE段階とPRO段階の間の遷移の例を示しています。最初の画像 (A1) は、LEU、SNE、LNE、および AKE セルの大きな凝集塊とランダムな支払いを示しています。2番目の画像(A2)は、凝集したLEUの大きな塊と、LEUの鎖が散在するSNEを含む。3 番目の画像 (A3) には、LEU の塊や支払い、さらには少量の SNE も含まれています。4番目と最後の画像(A4)は、凝集したSNE細胞とLEUがランダムに支払われたSNE細胞とLEUの両方を示しています。(B)この画像は、SNE細胞およびAKE細胞の凝集を伴うPRO段階およびEST段階間の遷移の例を描いている。(C)この画像は、ESTからMETへの移行を表すために、破片の真っ只中に見られるAKE、SNE、およびLNEセルの凝集とランダムな支払いを示しています。(D)最初の画像(D1)は、MET段階とDIE段階の間の遷移の例を示しており、LEUの増加に伴う上皮細胞の崩壊を伴う。第2の画像(D2)は、先に記載した凝集LEUsおよびSNE細胞の存在下でのAKE細胞を描写する。これらの数値は、4倍(A1、A2、A3、B、およびC)または10倍(A4、D1、およびD2)の倍率で撮影され、分類コンポーネントの視覚化を増やすためにズームインされています。スケールバー = 100 m。サイズ基準として、AKEセルの直径は約40〜52μm、LEUは約10μm、LNEセルは36〜40μm、SNEセルは約25〜32μmです。略語:AKE=無肸部角化上皮;LEUs = 白血球;LNE = 大きな有核上皮;SNE = 小さな有核上皮;C = 凝集;EST = 発情;DIE = diestrus;PRO = 初出乳;MET = メテストラス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
(A)これら2つの画像では、ランダムに分散したLEUに加えて、扁平上皮細胞が膣管壁から吸引された。(B)この画像には、細胞が見られなかったか、または収集されなかった破片の量が少ない。(c)本実施例では、総細胞数が低いことがみられた。(D)これら2つの画像(D1およびD2)では、塩化ナトリウム(NaCl)抽出溶液および膣液が顕微鏡スライド全体に広がり、見られた。これらの数値は、4倍(A1、A2、およびD1)または10倍(B、C、およびD2)の倍率で撮影され、分類コンポーネントの視覚化が強化されるようにズームインされています。スケールバー = 100 μm。サイズ基準として、AKEセルの直径は約40〜52μm、LEUは約10μm、LNEセルは36〜40μm、SNEセルは約25〜32μmです。略語:AKE=無肸部角化上皮;LEUs = 白血球;LNE = 大きな有核上皮;SNE = 小さな有核上皮。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:規則的および不規則なサイクルパターンサンプル(A)この画像は、性ステロイドホルモンの規則的な振動を反映して、反復的で一貫したパターンを介して進行する合計16の完全なサイクルを反映している。この中で、発情期は最も低いもの、発情期は中央、発情期は最も高い高さの棒で表されます。これらのデータは、発情期間の日数を追跡することによって分析され、各発情から発情までは1つの完全なサイクルを表す。これらのデータは、UCLAで飼育されている雌ラットのデータを反映しています。(B)この画像は、22匹のラットの様々な非循環パターンの理論的組み合わせを表す。拡張発情は、全高でのバーの複数の反復日、最も低いバーの高さの複数の反復日で見られる拡張ダイストラス、およびダイストラスからメステラスを通る進行の周期的なパターンの欠如で見ることができます。略語: Est = estrus;Diest/Die = diestrus.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図 9: 個々の分類行列式。 (A) この積み上げ棒グラフは、収集された個々のサンプルを発情性サンプルステージに分類するために使用するツールの各コンポーネントを反映しています。ここで、10日間モニターされた被験者は、様々な細胞タイプ、量、および配置を示す。これは、ホルモンレベルが典型的には成人期まで一貫していないか、または規則化されないので、思春期の動物のために予想される。(B)ここでは、20日間モニターした動物について発情プロファイルを提示する。同様の不規則性がここで見ることができ、被験者は典型的な1-2に対して4日間diestrusにとどまった。これらのデータは、ペパーダイン大学で飼育された6匹の雌ラットを表しています。略語:AKE=無肸部角化上皮;LEU = 白血球;LNE = 大きな有核上皮;SNE = 小さな有核上皮;C = 凝集;ED = 均一に分散;RD = ランダムに分散;COM = 組み合わせ;SMD = スミッジ;MOD = 中程度;NUM = 多数;EXE = 運動 ;SED = 座りがち;Est = 発情;Die = diestrus;プロ = 初出乳;Met = metestrus.

Figure 10
図10:ステージプロファイル (A)このセクションでは、ダイストラスとして分類された毎日の個々のラットの行列式データを分類する。最初の画像 (A1) は 10 日間にわたって収集されたデータを表し、2 番目の画像 (A2) は 20 日間にわたって収集されたデータを表します。(B)このセクションは、初出乳として分類される毎日の個々のラットのデータを示す。最初の画像 (B1) は 10 日間にわたって収集されたデータを表し、2 番目の画像 (B2) は 20 日間にわたって収集されたデータを表します。(C)これは、発情期として同定された毎日の個々のラットのデータを示す。最初の画像 (C1) は 10 日間にわたって収集されたデータを表し、2 番目の画像 (C2) は 20 日間にわたって収集されたデータを表します。(D)シリーズのこのセクションは、メテストラス段階として識別される毎日における個々のラットの成分データを分類する。最初の画像 (D1) は 10 日間にわたって収集されたデータを表し、2 番目の画像 (D2) は 20 日間にわたって収集されたデータを表します。これらの図のデータは、ペパーダイン大学で飼育されている6匹の雌ラットのデータを反映しています。略語:AKE=無肸部角化上皮;LEU = 白血球;LNE = 大きな有核上皮;SNE = 小さな有核上皮;C = 凝集;ED = 均一に分散;RD = ランダムに分散;COM = 組み合わせ;SMD = スミッジ;MOD = 中程度;NUM = 多数;EXE = 運動 ;SED = 座りがち;Est = 発情;Die = diestrus;プロ = 初出乳;Met = metestrus. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

東部標準時: 10 日間 期間 (日) AKE(%) ロイ (%) LNE (%) SNE (%) 総セル数(%)
3 88 2.78 1.89 7.33 国防省: 44.44 数字: 44.44 SMD: 11.11
範囲 2–4 70–100 0–10 0–17 0–20 スミッジ - 多数
配置 C: 50
編集: 0
RD: 50		 C: 0
編集: 0
RD: 100		 C: 0
編集: 0
RD: 100		 C: 50
編集: 0
RD: 50
東部標準時:20日間 期間 (日) AKE(%) ロイ (%) LNE (%) SNE (%) 総セル数(%)
4 71.92 5.5 2.92 19.67 国防省: 50 番号: 50 SMD: 0
範囲 4–4 10–100 0–20 0–20 0–80 スミッジ - 多数
配置 C: 60
編集結果: 6.67
RD: 33.33		 C: 0
編集日時: 12.5
RD: 87.5		 C: 33.33
編集: 0
RD: 66.67		 C: 44.44
編集: 0
RD: 55.56

表1:平均段階決定要因サンプル。 これらの表は、カテゴリ化決定要因の平均と、収集されたすべてのESTステージの概要を示しています。上の表は10日間モニターされたすべての動物の平均を反映し、下の表は20日間モニターされました。これには、発情周期の持続時間、細胞型および百分率、ならびに細胞配置および各細胞型について見られる各配置の割合が含まれる。これらのデータは、ペパーダイン大学で飼育されている6匹の雌ラットのデータを反映しています。略語:AKE=無肸部角化上皮;LEU = 白血球;LNE = 大きな有核上皮;SNE = 小さな有核上皮;C = 凝集;ED = 均一に分散;RD = ランダムに分散;EST = 発情。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

重要な手順と重要な考慮事項
提供されたプロトコルにおける特定の重要なステップは、特に膣細胞の集合内で、強調を必要とする。膣液抽出中、シリンジ挿入の適切な角度と深さを確保することは、満足のいく結果を生み出し、最終的に動物への刺激、傷害、または子宮頸部刺激を防止するための鍵です。子宮頸部の刺激は、白血球のみの膣塗抹標本11の12〜14日目によって示される偽妊娠誘発の1つの源であり得る。顕微鏡評価段階では、収集された膣細胞を表示する視覚面に焦点を当てることが重要です。これは、1 つまたは 2 つのセルを識別し、フォーカスが達成されるまで視覚化を調整することによって完了します。

これに続いて、ステージングのための膣細胞の代表的な画像のキャプチャは、顕微鏡スライドの全体をスキャンすることによって起こる。これにより、キャプチャされた画像は、動物の膣管に収集され、存在するものの正確な描写を反映することが保証されます。分類の前に、細胞型や各細胞型が持つことができるさまざまな形質転換を区別するなど、分類決定要因に精通している必要があります。各参加者は適切に訓練され、事前に準備された練習スライドを通して段階的な識別を練習することをお勧めします。

プロセスに関与するバイアスと主観の量を減らすために、各動物の以前に記録されたステージ識別を知りながら、両方とも治療群の割り当てに盲目のまま、分類段階に2人の参加者を含めることが推奨される。サンプルを分類するために2人の参加者を割り当てることで、会議が可能になり、識別の主観性が低下する可能性があります。ただし、参加者がサンプルを別々に分類する場合は、専門知識が開発されるにつれて、評価者間の信頼性を高めるために、最初のコラボレーション期間を設けることをお勧めします。二次審査制度を採用して、分類後のデータセットの交換や、写真を活用して初期評価を確認するなど、不整合な所見を防ぐことができます。

制限と変更
現在の技術の限界には、生存期間が含まれる。注射器の反復挿入に伴う可能性のある怪我や刺激のために、長期的かつ反復的なモニタリングは、動物の適切なケアおよび使用と一致しない。したがって、縦断的研究を行う場合、洗浄の頻度を減らして手順を修正する必要があるかもしれない。例えば、各動物を1日1回監視するのではなく、ラットを週を通して異なる日に監視するグループに分けることができる。第2の制限は、概説されたプロセスにサンプル染色がなく、色による細胞成分の分離がなく、上記のプロトコルにリストされている分類決定因子への依存度が高まることです。

さらに、このような分類決定要因の中には、正確な複製を制限する可能性のある主観性の要素があります。具体的には、収集されたサンプル内の細胞量の割合は、個人の推定に基づいています。この点に関する修正は、存在する個々の細胞型を定量化するための数学的アルゴリズムの開発を含み得る。別の修正には、1つの顕微鏡スライド上に堆積したサンプルの数が含まれ、スライドおよびカバーのサイズに応じて増加させることができる。さらなる制限には、この研究における膣液データの欠如が含まれる可能性があり、将来の研究の修正には、段階分類への寄与として収集された膣液の状態を記録することが含まれる可能性がある。プロトコルのさらなる修正は、細胞抽出のための別の等張流体の利用を含み得、これは、リン酸緩衝生理食塩水13のような、同じ結果をもたらすであろう。最後に、この手順を異なる年齢または系統のラットに適用する場合、体の大きさまたは活動レベルのために動物取り扱い技術などの修正が必要な場合がある。これには、成体のための把持方法69および前肢クリスクロス64法、ならびに若年ラットのために利用される片手および両手拘束64法が含まれ得る。

代替方法
発情周期モニタリングの代替方法と比較して、膣洗浄は、その精度、生成される情報量、最小限の侵襲性、および低い関連コストにおいてユニークです。子宮および卵巣の組織学的検査は、サイクル段階を識別するために利用することができるが、より侵入的であり、継続的なモニタリングを可能にしない。性ステロイドホルモンレベルを測定することは発情周期のモニタリングに役立ちますが、採血が必要であり、各被験者のユニークな細胞または膣液プロファイルの特性評価はできません。外性器の発達は性ステロイドホルモンレベルと間接的に相関しているので、膣口の検査は性的成熟に関する情報を提供することができる。さらに、組織の着色、水分のレベル、サイズ、および膣口の腫脹は、発情サイクル段階70と相関している。しかし、ラットの膣管の開口につながる正確な生理学はまだ完全に報告されていない。最近の出版物は、これが生殖発達の間接的なマーカーに過ぎず、必ずしも思春期と一致するとは限らないことを発見しました31,34。尿サンプルの生化学的分析は、費用対効果が高く、容易に実施されるが、他の方法の特異性および信頼性を許容しない71。したがって、それは膣管に存在する細胞を検査するほど信頼性または有効ではない。

さらに、電気インピーダンスの測定は発情周期を監視するために利用されており、液体洗浄よりも物理的に刺激が少ない。ただし、この方法では、分類するコンポーネントに関する情報はそれほど多くありません。このデバイスは、特に意図的な交配のタイミングを最適化するように設計されており、性ステロイドホルモンレベルが最も高い72、73、74のときを測定します。さらに、この方法はESTと非ESTを区別するのに有効であるが、その75の外側の発情周期を監視する能力には限界があることが報告されている。全体として、この方法は信頼性が低く、必ずしも費用対効果が高いとは限らず、文献ではあまり利用されず、比較可能なデータの欠如につながると報告されている74。膣綿棒は、それが提供する情報において洗浄に最も類似しているが、細胞を回収するために膣管の内層に直接接触する必要があるため、刺激または傷害のリスクが高まる。最後に、顕微鏡スライドを染色することは、細胞型間のより鮮明なコントラストを提供し、サンプル保存を可能にするかもしれないが、ウェットマウント53よりも時間と費用のかかる努力である。全体として、各モニタリング技術には限界と利点があり、これらの方法の組み合わせを利用してげっ歯類の発情サイクルの包括的な検査を受けることは有益であり得る。

アプリケーション
現在の研究を、より大きな科学界と一般市民の文脈で見ることは依然として重要である。この方法論は、意図的な繁殖に焦点を当てた研究だけでなく、異常を呈する動物、および/または視床下部 - 下垂体 - 卵巣軸の機能を排除するために、雌動物を調べることを含むあらゆるプロジェクトで利用することができ、治療群内の主要な洞察のためにも利用できる。より具体的には、この手順は、様々な薬物および化学物質が生殖管および発情サイクルを破壊または変更するため、i)薬理学的研究内で影響が大きい11,27,76;ii)性ステロイドホルモンと神経系との間の相互作用に起因する外傷性脳損傷、認知、または変性障害に焦点を当てたものなどの神経学的研究77;iii)筋細胞上に位置する性ステロイドホルモン受容体およびその後の相互作用による循環器系研究77;iv)骨成長に関する研究38;内分泌系に11,78;v)他の非生殖研究3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgments

この研究は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校脳損傷研究センター(BIRC)のNIH資金提供による共同研究を通じて実施されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera AmScope Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5 https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV&
keywords=usb+camera+for+microscope&
qid=1572477663&s=industrial
&sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel Fischer Scientific 14-815-526 https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8 NEWCO 93009 https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass Fischer Scientific 12-553-7A https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses Fischer Scientific 12-553-464 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply Fischer Scientific 06-666 https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001  NEWCO Specialty and LabDiet 5012 https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm Grainger 36UX10 https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_
LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7
zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4
cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696
!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id=
CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW
1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ
Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo
Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc=
PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9% Live Action Safety ABB079830939 https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies BH Supplies ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821 https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7&
keywords=1ml+sterile+syringe&qid=
1572478649&s=industrial
&sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa=
ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy
PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm
VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ
yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy
eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM
0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h
bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja
1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2
xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen Allentown LV40326013 https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad Medline EAN: 0480196288558
 Global Trade Identification Number: 40080196288558		 https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853&
sr=8-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell and Tissue Research. 354 (1), 99-106 (2013).
  2. Camacho-Arroyo, I., Montor, J. M. Beyond reproductive effects of sex steroids. MiniReviews in Medicinal Chemistry. 12 (11), 1037-1039 (2012).
  3. Shah, S. I. A. Systemic non-reproductive effects of sex steroids in adult males and females. Human Physiology. 44, 83-87 (2018).
  4. Wierman, M. E. Sex steroid effects at target tissues: mechanisms of action. Advances in Physiology Education. 31 (1), 26-33 (2007).
  5. An, G., et al. Pathophysiological changes in female rats with estrous cycle disorder induced by long-term heat stress. BioMed Research International. 2020, 4701563 (2020).
  6. Donato, J., et al. The ventral premammillary nucleus links fasting-induced changes in leptin levels and coordinated luteinizing hormone secretion. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5240-5250 (2009).
  7. Fortress, A. M., Avcu, P., Wagner, A. K., Dixon, C. E., Pang, K. Experimental traumatic brain injury results in estrous cycle disruption, neurobehavioral deficits, and impaired GSK3β/β-catenin signaling in female rats. Experimental Neurology. 315, 42-51 (2019).
  8. Hatsuta, M., et al. Effects of hypothyroidism on the estrous cycle and reproductive hormones in mature female rats. European Journal of Pharmacology. 486 (3), 343-348 (2004).
  9. Jaini, R., Altuntas, C. Z., Loya, M. G., Tuohy, V. K. Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 279, 71-74 (2015).
  10. Tropp, J., Markus, E. J. Effects of mild food deprivation on the estrous cycle of rats. Physiology and Behavior. 73 (4), 553-559 (2001).
  11. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Research. Part B, Developmental and Reproductive Toxicology. 80 (2), 84-97 (2007).
  12. Thung, P. J., Boot, L. M., Muhlbock, O. Senile changes in the oestrous cycle and in ovarian structure in some inbred strains of mice. Acta Endocrinologica. 23 (1), 8-32 (1956).
  13. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  14. Bosch, L. Biochemical and endocrinological studies of normal and neoplastic tissue: The metabolism of estrogen-producing ovarian tumors and other malignancies in the mouse. , Available from: https://www.translatetheweb.com/?from=nl&to=en&ref=SERP&dl=en&rr=UC&a=https%3a%2f%2frepository.tudelft.nl%2fislandora%2fobject%2fuuid%253A8776d58a-6695-4a38-99ca-0abf607480f0 109-111 (2021).
  15. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta Physiologica Pharmacologica Neerlandica. 4 (3), 442-444 (1955).
  16. Paccola, C., Resende, C., Stumpp, T., Miraglia, S., Cipriano, I. The rat estrous cycle revisited: a quantitative and qualitative analysis. Animal Reproduction. 10 (4), 677-683 (2013).
  17. Knobil, E., Neill, J. D. Puberty in the rat. The Physiology of Reproduction. , Raven Press Ltd. New York. 363-409 (1994).
  18. Schallmayer, S., Hughes, B. M. Impact of oral contraception and neuroticism on cardiovascular stress reactivity across the menstrual cycle. Psychology, Health & Medicine. 15 (1), 105-115 (2010).
  19. Barreto-Cordero, L. M., et al. Cyclic changes and actions of progesterone andallopregnanolone on cognition and hippocampal basal (stratum oriens) dendritic spinesof female rats. Behavioural Brain Research. 379, 112355 (2020).
  20. de Zambotti, M., Trinder, J., Colrain, I. M., Baker, F. C. Menstrual cycle-related variation in autonomic nervous system functioning in women in the early menopausal transition with and without insomnia disorder. Psychoneuroendocrinology. 75, 44-51 (2017).
  21. Maghool, F., Khaksari, M., Khachki, A. S. Differences in brain edema and intracranial pressure following traumatic brain injury across the estrous cycle: Involvement of female sex steroid hormones. Brain Research. 1497, 61-72 (2013).
  22. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex as a biological variable: Who, what, when, why, and how. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 386-396 (2017).
  23. Becker, J. B., Prendergast, B. J., Liang, J. W. Female rats are not more variable than male rats: a meta-analysis of neuroscience studies. Biology of Sex Differences. 7, 34 (2016).
  24. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  25. Joel, D., McCarthy, M. M. Incorporating sex as a biological variable in neuropsychiatric research: where are we now and where should we be. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 379-385 (2017).
  26. Long, J. A., Evans, H. M. The oestrous cycle in the rat and its associated phenomena. Memoirs of the University of California. 6, 1 (1922).
  27. Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
  28. Lenschow, C., Sigl-Glöckner, J., Brecht, M. Development of rat female genital cortex and control of female puberty by sexual touch. PLoS Biology. 15 (9), 2001283 (2017).
  29. Lewis, E. M., Barnett, J. F., Freshwater, L., Hoberman, A. M., Christian, M. S. Sexual maturation data for Crl Sprague-Dawley rats: Criteria and confounding factors. Drug and Chemistry Toxicology. 25 (4), 437-458 (2002).
  30. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 24 (4), 417-463 (2000).
  31. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: the puberty ovarian maturation score (pub-score). Scientific Reports. 7, 46381 (2017).
  32. da Silva Faria, T., da Fonte Ramos, C., Sampaio, F. J. Puberty onset in the female offspring of rats submitted to protein or energy restricted diet during lactation. Journal of Nutritional Biochemistry. 15 (2), 123-127 (2004).
  33. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. 48 (1), 1 (2009).
  34. Engelbregt, M. J., et al. Delayed first cycle in intrauterine growth-retarded and postnatally undernourished female rats: follicular growth and ovulation after stimulation with pregnant mare serum gonadotropin at first cycle. Journal of Endocrinology. 173 (2), 297-304 (2002).
  35. Pescovitz, O. H., Walvoord, E. C. When puberty is precocious: Scientific and clinical aspects. , Humana Press. (2007).
  36. USEPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. Standard Evaluation Procedure Test Guidelines 890.1450: Pubertal development and thyroid function in intact juvenile/peripubertal female rats assay. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/final_890.1450_female_pubertal_assay_sep_8.24.11.pdf (2011).
  37. Kennedy, G. G., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. Journal of Physiology. 166 (2), 408-418 (1963).
  38. Sengupta, S., Arshad, M., Sharma, S., Dubey, M., Singh, M. M. Attainment of peak bone mass and bone turnover rate in relation to estrous cycle, pregnancy and lactation in colony-bred Sprague-Dawley rats: Suitability for studies on pathophysiology of bone and therapeutic measures for its management. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 94 (5), 421-429 (2005).
  39. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
  40. Koff, E., Rierdan, J., Stubbs, M. L. Conceptions and misconceptions of the menstrual cycle. Women & Health. 16 (3-4), 119-136 (1990).
  41. Sahay, N. Myths and misconceptions about menstruation: A study of adolescent school girls of Delhi. Journal of Women's Health and Development. 3 (3), 154-169 (2020).
  42. Criado-Perez, C. The deadly truth about a world built for men - from stab vests to car crashes. , Available from: https://www.theguardian.com/lifeandstyle/2019/feb/23/truth-world-built-for-men-car-crashes (2019).
  43. Chrisler, J. C. The menstrual cycle in a biopsychosocial context. Women's Psychology. Psychology of Women: A Handbook of Issues and Theories. Denmark, F. L., Paludi, M. A. , Praeger Publishers/Greenwood Publishing Group. 193-232 (2008).
  44. Rea, H. H. Re-cycling the menstrual cycle: A multidisciplinary reinterpretation of menstruation. , Available from: https://scholarworks.wmich.edu/masters_theses/3942 (1998).
  45. Sato, J., Nasu, M., Tsuchitani, M. Comparative histopathology of the estrous or menstrual cycle in laboratory animals. Journal of Toxicologic Pathology. 29 (3), 155-162 (2016).
  46. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
  47. Smith, J. R., et al. The year of the rat: The Rat Genome Database at 20: a multi-species knowledgebase and analysis platform. Nucleic Acids Research. 48 (1), 731-742 (2020).
  48. Capdevila, S., Giral, M., Ruiz de la Torre, J. L., Russell, R. J., Kramer, K. Acclimatization of rats after ground transportation to a new animal facility. Laboratory Animals. 41 (2), 255-261 (2007).
  49. Conour, L., Murray, K., Brown, M. Preparation of animals for research-issues to consider for rodents and rabbits. ILAR journal. 47 (4), 283-293 (2006).
  50. National Academies Press (US) Committee on Guidelines for the Humane Transportation of Laboratory Animals. Guidelines for the Humane Transportation of Research Animals. National Academies Press. , (2006).
  51. Obernier, J., Baldwin, R. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR Journal. 47 (4), 364-369 (2006).
  52. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. US) . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. , National Academies Press. US. (2011).
  53. Pantier, L. K., Li, J., Christian, C. A. Estrous cycle monitoring in mice with rapid data visualization and analysis. Bio-protocol. 9 (17), 1-17 (2019).
  54. Cohen, I., Mann, D. Seasonal changes associated with puberty in female rats: effect of photoperiod and ACTH administration. Biology of Reproduction. 20 (4), 757-776 (1979).
  55. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J Mice: I. cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
  56. Pennycuik, P. R. Seasonal changes in reproductive productivity, growth rate, and food intake in mice exposed to different regimens of day length and environmental temperature. Australian Journal of Biological Sciences. 25 (3), 627-635 (1972).
  57. Piacsek, B. E., Hautzinger, G. M. Effects of duration, intensity and spectrum of light exposure on sexual maturation time of female rats. Biology of Reproduction. 10 (3), 380-387 (1974).
  58. Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of the estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
  59. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  60. Campbell, C., Schwartz, N. The impact of constant light on the estrous cycle of the rat. Endocrinology. 106 (4), 1230-1238 (1980).
  61. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Osterburg, H. H., Finch, C. E. Altered profiles of estradiol and progesterone associated with prolonged estrous cycles and persistent vaginal cornification in aging C578L/6J mice. Biology of Reproduction. 24 (4), 784-794 (1981).
  62. Rivest, R. W. Sexual maturation in female rats: Hereditary, developmental and environmental aspects. Experientia. 47 (10), 1026-1038 (1991).
  63. Charles River Laboratories. CD® (Sprague Dawley) IGS Rat. Charles River Laboratories. , Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-sd-igs-rat?region=3611 (2021).
  64. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. JoVE. , (2020).
  65. Circulatory System. Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021).
  66. Urogenital System. n.d.). Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_urogenital.html (2021).
  67. Kiernan, J. A. Anatomical foundations of neuroscience: Mini-atlas of rat's brain. Anatomy and Cell Biology 9535b. , University of Western Ontario. Available from: https://instruct.uwo.ca/anatomy/530/535downs.htm (2008).
  68. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7 (4), 1-5 (2012).
  69. Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  70. Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
  71. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6 (5), (2020).
  72. Bartos, L. Vaginal impedance measurement used for mating in the rat. Laboratory Animals. 11 (1), 53-55 (1977).
  73. Belozertseva, I. V., Merkulov, D. D., Vilitis, O. E., Skryabin, B. V. Instrumental method for determining the stages of the estrous cycle in small laboratory rodents. Laboratory Animals for Scientific Research. (4), (2018).
  74. Ramos, S. D., Lee, J. M., Peuler, J. D. An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 667-670 (2001).
  75. Singletary, S. J., et al. Lack of correlation of vaginal impedance measurements with hormone levels in the rat. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (6), 37-42 (2005).
  76. Bretveld, R. W., Thomas, C. M., Scheepers, P. T., et al. Pesticide exposure: the hormonal function of the female reproductive system disrupted. Reproductive Biology Endocrinology. 4 (30), (2006).
  77. MacDonald, J. K., Pyle, W. G., Reitz, C. J., Howlett, S. E. Cardiac contraction, calcium transients, and myofilament calcium sensitivity fluctuate with the estrous cycle in young adult female mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 306 (7), 938-953 (2014).
  78. Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).

Tags

生物学 第174号 女性 青年期 スプレイグ・ドーリー ラット 性ステロイドホルモン 発情周期 膣洗浄
膣洗浄を利用したげっ歯類の強烈なサイクルモニタリング:通常のサイクルのようなものはありません
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robert, H., Ferguson, L., Reins, O., … More

Robert, H., Ferguson, L., Reins, O., Greco, T., Prins, M. L., Folkerts, M. Rodent Estrous Cycle Monitoring Utilizing Vaginal Lavage: No Such Thing As a Normal Cycle. J. Vis. Exp. (174), e62884, doi:10.3791/62884 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter