Biology

Monitoraggio del ciclo estroso dei roditori che utilizza la lavanda vaginale: nessun ciclo normale

Published: August 30, 2021 doi: 10.3791/62884

Hannah Robert¹, Lindsay Ferguson¹, Olivia Reins², Tiffany Greco¹, Mayumi L. Prins¹, Michael Folkerts²

¹Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, ²Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

Summary

Questo studio descrive in dettaglio i fattori cruciali da considerare nei progetti sperimentali che coinvolgono ratti femmina. In un senso più ampio, questi dati servono a ridurre lo stigma e aiutano nello sviluppo di strumenti diagnostici e di intervento più inclusivi.

Abstract

L'attuale metodologia stabilisce un approccio riproducibile, standardizzato ed economico al monitoraggio del ciclo estrale delle femmine di ratto adolescente Sprague Dawley (SD). Questo studio dimostra la complessità dei cicli ormonali e l'ampio spettro di comprensione necessario per costruire una tecnica di monitoraggio affidabile e valida. Attraverso un esame approfondito dei principali elementi di progettazione sperimentale e procedurali, questa descrizione del ciclo e dei suoi principi fondamentali fornisce un quadro per un'ulteriore comprensione e decostruisce idee sbagliate per la replica futura.

Insieme a uno schema del processo di raccolta dei campioni che impiega la lavanda vaginale, la procedura descrive il meccanismo di categorizzazione dei dati nel modello a quattro stadi di proestro, estro, metestro e diestro. Queste fasi sono caratterizzate da un nuovo approccio proposto, utilizzando i 4 determinanti categorizzanti della condizione del fluido vaginale, del tipo o dei tipi di cellule presenti, della disposizione cellulare e della quantità cellulare al momento della raccolta. Variazioni di ogni fase, campioni favorevoli e sfavorevoli, la distinzione tra ciclicità e aciclicità e rappresentazioni grafiche delle componenti di categorizzazione raccolte sono presentate insieme a pratiche interpretative e organizzative efficaci dei dati. Nel complesso, questi strumenti consentono la pubblicazione di intervalli di dati quantificabili per la prima volta, portando alla standardizzazione dei fattori di categorizzazione al momento della replica.

Introduction

Nuovi contributi
Il ciclo estrale del roditore è stato identificato come un indicatore essenziale di benessere. Tuttavia, i pregiudizi inconsci degli investigatori e le interpretazioni imprecise riguardanti il corpo femminile ostacolano la comunità scientifica. L'etimologia stessa della parola "estrale" implica un senso di inferiorità e negatività. Euripide usò il termine per descrivere una "frenesia" o follia, Omero per descrivere il panico e Platone per descrivere una pulsione irrazionale. Questo studio evidenzia come queste prospettive primordiali influenzino l'attuale comunità scientifica e affronti queste preoccupazioni attraverso un nuovo paradigma a mosaico, una combinazione aggiornata di metodi precedentemente studiati, ampliati nella portata di un approccio più completo.

Lo studio e l'uso di questa tecnica sono necessari, in primo luogo, in quanto non esiste una tecnica di monitoraggio standardizzata e completa e le pratiche di interpretazione dei dati possono essere poco chiare. In secondo luogo, sebbene le caratteristiche del ciclo estrale dipendano dai singoli ratti studiati, sono spesso universalizzate. In terzo luogo, mentre i cicli ormonali sono processi di routine e benefici, sono circondati da uno stigma pericoloso esplorato nella sezione "Traduzione in esseri umani". Questo studio mira ad affrontare questi tre problemi in tre modi: (A) descrivendo una tecnica di monitoraggio del ciclo estrale approfondito e chiarendo come i risultati possono essere interpretati, (B) delineando metodi che mantengono l'integrità e l'individualità di ciascun ciclo e (C) richiamando l'attenzione su idee sbagliate che perpetuano pratiche non comprovate.

Questo studio è anche unico nel suo focus sui ratti adolescenti, un periodo segnato da cambiamenti cruciali dello sviluppo che fanno luce su varie manifestazioni comportamentali, anatomiche e fisiologiche nell'età adulta¹. Costruire un progetto sperimentale standardizzato per monitorare i cicli ormonali in una popolazione poco studiata mentre decostruisce i pregiudizi comuni consentirà lo sviluppo di correlazioni ormonali affidabili e valide ^2,3,4 e la determinazione delle interruzioni del ciclo dipendenti dalla condizione ^5,6,7,8,9,10 . In definitiva, queste novità servono ad espandere i criteri diagnostici, i trattamenti e gli interventi di vari problemi di benessere.

Definizioni e usi fondamentali
Il ciclo estrale è un insieme di processi fisiologici dinamici che si verificano in risposta ai tre ormoni steroidei sessuali femminili oscillanti: estradiolo, ormone leuteinizzante (LH) e progesterone (Figura 1A, B). Le interazioni tra il sistema endocrino e il sistema nervoso centrale regolano il ciclo, che il più delle volte persiste per 4-5 giorni e si ripresenta dall'inizio della maturazione sessuale fino alla senescenza riproduttiva e/o alla cessazione. È diviso in categorie separate in base ai livelli ormonali, più comunemente nei 4 stadi di diestro (DIE), proestro (PRO), estro (EST) e metestro (MET), che progrediscono in modo circolare. Il numero di divisioni può variare da 3 fasi¹¹ a 13 fasi¹², a seconda della natura dello studio¹³. Il minor numero di divisioni spesso esclude il MET come fase e lo classifica come un periodo di transizione di breve durata. Il numero più alto include tipicamente sottosezioni che consentono un'ispezione più ravvicinata di fenomeni come lo sviluppo tumorale o la pseudogravidanza spontanea, lo stato fisiologico della gravidanza senza impianto embrionale 12,14,15.

In questo studio, le fasi sono state identificate attraverso componenti del canale vaginale, denominati i 3 determinanti di categorizzazione: tipo di cellula presente, disposizione cellulare e quantità cellulare (Figura 2A-D). Mentre la condizione del liquido vaginale non è stata monitorata in questo studio, si raccomanda di includerlo come quarto componente di categorizzazione. Ulteriori informazioni sull'esame del liquido vaginale possono essere trovate nell'elenco di riferimento¹⁶. I componenti di categorizzazione possono essere esaminati estraendo le cellule tramite lavanda vaginale, la tecnica principale raccomandata nel moderno monitoraggio del ciclo estrale. Mentre i processi fisiologici approfonditi all'interno di ogni fase sono al di fuori dello scopo di questo studio, ulteriori informazioni possono essere trovate nella letteratura¹⁷.

L'uso e lo sviluppo continuo di questa tecnica di monitoraggio del ciclo estrale è radicato nelle connessioni tra gli ormoni steroidei sessuali e la funzione dei sistemi corporei come il sistema cardiovascolare¹⁸, il sistema endocrino⁸ e il sistema nervoso centrale 19,20,21. Allo stesso tempo, il monitoraggio del ciclo estrale potrebbe non essere sempre necessario quando sono coinvolte roditori femmine 22,23,24,25. Piuttosto, è importante prima considerare se le differenze di sesso sono state riportate nella specifica area di studio, che può essere ulteriormente esplorata nelle recensioni pubblicate^22,23. Sebbene il monitoraggio del ciclo estrale sia vitale in un ampio spettro di indagini di ricerca, non dovrebbe essere visto come un ostacolo all'inclusione di roditori di sesso femminile negli esperimenti. Mentre questa tecnica può sembrare complessa e dispendiosa in termini di tempo, la procedura stessa può richiedere meno di 15 minuti per essere completata, a seconda dello sperimentatore, ed è conveniente. Nel complesso, l'inclusione di roditori di sesso femminile negli studi scientifici è vantaggiosa per la comprensione dei sistemi corporei, di varie condizioni e patologie e del benessere generale, poiché questi sviluppi si sono basati principalmente sul modello del corpo maschile.

Parametri universali e variabilità naturali nel roditore
Stabilire intervalli per aspetti considerati "tipici" è necessario per definire modelli di ciclo standard, impostare parametri per scopi comparativi e analitici e rilevare anomalie e valori anomali. Allo stesso tempo, è anche importante riconoscere che il ciclo di ogni ratto è unico e sono previste deviazioni basate sul ceppo animale, sui processi fisiologici e sulle condizioni ambientali. In effetti, uno degli aspetti più "normali" del ciclo estrale è la variabilità. Questo si vede nella lunghezza totale del ciclo, con un intervallo di 3-38 giorni^26,27; l'età della maturazione sessuale che può variare da 32-34 giorni a più settimane 28,29,30; ciò che è considerato aciclico¹¹ e i modelli determinanti di categorizzazione^11,13. Nel complesso, non esiste un modello universale per il ciclo estrale e tradurlo sia per la comunità scientifica che per il pubblico in generale è una parte importante del processo sperimentale.

Timepoint sperimentali ed età evolutiva
Riconoscere questo principio di variabilità aiuta a costruire un progetto sperimentale affidabile e valido. Ad esempio, l'inizio del monitoraggio del ciclo estrale si basa sullo sviluppo anatomico e fisiologico dei ratti, che varia in base a fattori ambientali e fisiologici. Il monitoraggio non può iniziare fino allo sviluppo dell'apertura vaginale (VO), che è l'orifizio vaginale esterno circondato dalla vulva che porta alla porzione interna del canale vaginale (Figura 3A-D). Mentre il VO spesso si sviluppa completamente tra i 32 ei 34 giorni di età, rimane individualizzato per ciascun soggetto e molto del processo rimane sconosciuto. Questa apertura è stata utilizzata per identificare l'inizio della maturazione sessuale, che è stata collegata all'aumento dell'estradiolo³¹, alla maturazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-ovaio³² e alla prima ovulazione nei ratti 17,33,34,35. Tuttavia, recenti pubblicazioni hanno scoperto che è solo un marcatore indiretto dello sviluppo riproduttivo, in quanto può essere disaccoppiato da eventi ormonali e di sviluppo in ambienti sfavorevoli³¹ e può rappresentare cambiamenti nei livelli di estradiolo piuttosto che la maturazione sessuale³³. Pertanto, si raccomanda di non fare affidamento esclusivamente sul VO per determinare l'età evolutiva e come qualificatore per il monitoraggio del ciclo estrale³⁶, ma di utilizzare anche l'aspetto del primo stadio EST e la cornificazione delle cellule epiteliali³⁰ per segnare l'inizio della maturazione sessuale.

Il peso corporeo è notevolmente correlato all'età evolutiva durante il periodo adolescenziale nei roditori^30,37 e può quindi anche aiutare a determinare l'età evolutiva in questo periodo. I meccanismi proposti relativi a questo fenomeno includono la stimolazione degli ormoni necessari per lo sviluppo riproduttivo, come l'ormone della crescita, e l'inibizione dell'asse ipotalamo-ipofisi surrenale (HPA) da parte del regolatore dell'appetito, la leptina³⁰. Tuttavia, non è consigliabile utilizzare questa misura come unico indicatore dell'età evolutiva a causa della grande varianza osservata tra i ratti tra le specie e i fornitori³⁸. La variabilità osservata nello sviluppo del VO e del peso corporeo esemplifica l'importanza del concetto nel processo sperimentale complessivo.

Traduzione per l'uomo: contesti culturali e scientifici
La relazione traslazionale degli studi riproduttivi tra animali e umani è bidirezionale. I risultati di studi su animali influenzano il modo in cui i processi umani vengono valutati, avvicinati e analizzati³⁹. La percezione del sistema riproduttivo umano e dei suoi processi correlati influenza il modo in cui gli animali vengono studiati. In effetti, una delle indicazioni più forti per ulteriori ricerche in questo settore deriva da credenze socioculturali distorte relative ai cicli ormonali che influenzano il processo scientifico. Molte di queste convenzioni derivano da una generale avversione culturale a discutere delle mestruazioni, che ha portato a una lacuna di dati nella conoscenza ben documentata^40,41. Questo ha uno spettro di conseguenze che vanno da minori a letali: dall'altezza delle scaffalature e dalle dimensioni dello smartphone al montaggio dell'armatura del corpo di polizia e alle mancate diagnosi di cancro⁴².

La descrizione delle mestruazioni come insalubri, distruttive e tossiche – viste in testi venerati, media, dizionari e insegnamenti medici – è conservata da pubblicazioni scientifiche. Ciò avviene attraverso descrizioni imprecise e distorte dei cicli ormonali, l'isolamento del sistema riproduttivo dalle sue controparti neuroendocrine e dalle influenze ambientali, e la prospettiva riduzionista del completamento di un ciclo come un "fallimento nel concepire"^43,44. Ciò porta alla creazione di pratiche sperimentali non sane, come l'omissione di variabili esterne che influenzano i cicli ormonali, la determinazione di inizio e fine basati esclusivamente su sviluppi anatomici e la misurazione dell'avanzamento del ciclo in modo lineare piuttosto che circolare. Nonostante la correlazione diretta tra fattori socioculturali e conseguenze biologiche, non è spesso considerato nella letteratura scientifica. Attraverso l'ispezione di pubblicazioni più olistiche 43,44,45, i ricercatori possono decostruire questi stigmi e creare progetti sperimentali più affidabili e validi.

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Protocol

Tutti i metodi di manipolazione e procedura delineati in questo protocollo sono in linea con le linee guida per la cura e l'uso degli animali del National Institutes of Health (NIH) e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Pepperdine University e dal Comitato per la ricerca sugli animali del Cancelliere dell'UCLA (ARC).

1. Cura e uso degli animali

Acquisire ratti femmina, in numero secondo l'analisi di potenza, e ratti maschi per promuovere l'effetto Whitten o più coerente ciclismo⁴⁶. Determinare il ceppo in base all'obiettivo dello studio in banche dati note⁴⁷.
NOTA: I dati attuali riflettono quelli delle adolescenti SD International Genetic Standardization Program (IGS) in presenza di ratti SD maschi situati presso i laboratori della Pepperdine University e dell'UCLA come parte di uno studio collaborativo. Questi ratti sono arrivati in gruppi separati a 28 giorni di età e la progressione del ciclo estrale è stata monitorata per 10 o 20 giorni per dimostrare differenze sui livelli acuti e cronici, a partire dai 34 giorni di età (dopo un periodo di acclimatazione di 7 giorni).
Prima della manipolazione, prevedere una quarantena e/o un periodo di acclimatazione per la stabilizzazione fisiologica dopo il trasporto e l'adattamento al nuovo ambiente.
NOTA: è stato citato un periodo minimo di 3 giorni, con un periodo di 7 giorni raccomandato 48,49,50,51,52. Nel complesso, questo dipende dalle condizioni di trasporto, dal ceppo animale e dagli obiettivi di studio.
Assicurarsi che lo stress sia ridotto con l'uso di un periodo di acclimatazione, poiché lo stress può interrompere il corretto funzionamento del sistema^{riproduttivo 53}. Tuttavia, non sovracompensare tentando di eliminarlo, poiché una moderata quantità di stress è benefica per il benessere degli animali⁵¹.
I ratti ospitano in un ambiente a temperatura (68-79 ° F, cioè 20-26 ° C) e umidità controllata (30-70%) contattando il vivaio o i responsabili di laboratorio e garantendo queste caratteristiche. Distribuire acqua e chow ad libitum con i componenti nutritivi elencati sul sito web dell'azienda e la pulizia della gabbia una volta alla settimana.
NOTA: In questo studio, i ratti sono stati alloggiati in gruppi di 2 separati per sesso in gabbie di plastica riutilizzabili trasparenti da 19 "x 10" x 8" e hanno avuto accesso a letti di pannocchia di mais che venivano cambiati una volta alla settimana. La temperatura è stata mantenuta a 70 ° F e l'umidità al 35-79%, con una media del 62%.
Verificare lo sviluppo di coda ad anello o necrosi ischemica della coda e delle dita dei piedi per l'evidenza di bassi livelli di umidità relativa e temperature estreme, che possono causare l'alternanza di risposte biologiche.
NOTA: La temperatura e l'umidità sono importanti per il sistema riproduttivo, la maturazione sessuale e la ciclicità estrale 54,55,56,57,58.
Garantire un'illuminazione adeguata ed equilibrata in tutto lo spazio abitativo depositando uguali quantità di sorgenti luminose in tutto lo spazio di laboratorio che agiscono su un sistema di luce:buio controllato nel tempo.
NOTA: Qui, un ciclo di luce:buio di 12:12 ore, con luci accese dalle 06:00 alle 18:00, è stato controllato da lampadine a LED lineari da 2.550 lumen.
Seguire i requisiti di lusso forniti⁵² in base alle variazioni della pigmentazione, dell'età, del ceppo, del sesso e dello stato ormonale degli animali.
NOTA: quando i ricercatori classificano i campioni di cellule raccolti, un'illuminazione coerente consentirà un corretto rilevamento visivo e una messa in scena affidabile⁵⁹. La durata e l'intensità della luce sono direttamente correlate al sistema riproduttivo, alla maturazione sessuale e al ciclo estrale 54,55,56,57,60,61.

2. Attrezzatura e preparazione degli esperimenti

Rivedere i determinanti di categorizzazione (visti nella Figura 2A): come identificare ogni fase del ciclo estrale e come utilizzare il microscopio e l'apparecchiatura fotografica.
Assicurarsi che ogni soggetto da monitorare abbia raggiunto la maturazione sessuale e mostri indicatori appropriati di sviluppo: VO, peso corporeo ed età. Pesare i ratti ed esaminarli per IL VO tra alla stessa ora ogni giorno per confronti accurati e trasferirli con un metodo di manipolazione approvato. Consultare il veterinario affiliato all'università se un animale perde più del 20% del suo precedente peso corporeo.
NOTA: Il VO rimane caudale all'apertura uretrale e cranico all'ano, situato tra i due, come illustrato nella Figura 3.
Poiché questi fattori dipendono dalla deformazione, verificare con il fornitore le specifiche e considerare i fattori ambientali specifici del laboratorio⁶².
NOTA: In generale, ciò avverrà tra i 32-34 giorni di età e un peso corporeo medio che va dai 75-150 grammi⁶³ per i ratti SD ed è indicato da un'apertura di forma circolare precedentemente coperta da una guaina membranosa.
Selezionare un periodo di raccolta dei campioni appropriato per il gruppo di ratti monitorati per evitare la raccolta di campioni di transizione. In primo luogo, campionare alcuni animali in 2 o 3 diversi punti temporali durante il giorno per determinare l'ora in cui sono presenti la maggior parte delle fasi del ciclo (ad esempio, campionamento alle 12:00, alle 13:00 e alle 14:00 per animali diversi). Completare la lavanda vaginale alla stessa ora ogni giorno per una messa in scena coerente e affidabile.
NOTA: È stato riferito che le ore tra le 12:00 e le 14:00 h sono le migliori per catturare tutte le fasi. In questo studio, il monitoraggio del ciclo estrale si è verificato tra le 12:00 e le 14:00 h, gestito con la sospensione in stile compressione (vedere il punto 3.4). L'importanza dei tempi di monitoraggio del ciclo estrale rispetto ad altri interventi sperimentali (ad esempio, condizionamento comportamentale, farmaci) è un'area di ricerca in via di sviluppo e può essere ulteriormente esplorata¹¹. Determinare la durata del monitoraggio del ciclo estrale dipende dallo studio e può essere ulteriormente esplorato negli studi pubblicati^11,33.
Rimuovere il coperchio protettivo dal microscopio e collegare la fotocamera al computer rimuovendo il coperchio protettivo dell'obiettivo della fotocamera e posizionando l'obiettivo sopra l'oculare del microscopio.
Quindi, aprire il software preselezionato sul computer. Per utilizzare il software selezionato in questo studio, selezionare la fotocamera collegata all'USB situata sul lato sinistro dello schermo, sotto la scheda denominata Elenco fotocamere. Assicurarsi che la fotocamera USB sia collegata correttamente al computer, che leggerà Nessun dispositivo nella scheda Elenco fotocamere, in caso contrario.
Una volta selezionata la fotocamera USB sotto la scheda, accendere l'interruttore della luce del microscopio situato sulla base.
Creare una cartella sul computer designato per le foto di esempio di cella. Crea una cartella di file per ogni giorno separato in cui i dati vengono raccolti, preparati prima che le immagini vengano scattate.
Con l'attrezzatura preparata, recuperare la gabbia del soggetto dal suo luogo di detenzione e portarla alla stazione di raccolta dei campioni.

3. Raccolta di cellule vaginali

Recuperare una siringa monouso e riempire ciascuna delle siringhe con 0,2 mL di NaCl sterile allo 0,9%. Se sono presenti bolle d'aria, azionare delicatamente la siringa a botte fino a quando tutte le bolle d'aria hanno raggiunto la punta aperta della siringa ed espellere l'aria. Se sono ancora presenti bolle d'aria, espellere nuovamente la soluzione nel recipiente NaCl e ricaricare fino a quando non ce ne sono.
NOTA: un eccessivo scorrimento può causare la formazione di più bolle d'aria.
Riportare ogni siringa nell'involucro di plastica per mantenere un campo sterile, con la punta della siringa all'interno della parte sigillata dell'involucro.
Aprire la gabbia e sollevare delicatamente il soggetto dalla base della coda o dal tronco del corpo, chiudendo il coperchio della gabbia per impedire ad altri di uscire. Seleziona un metodo di detenzione tra quelli elencati di seguito in base alle preferenze personali e alla risposta degli animali.
Usa la presa in stile compressione per i ratti adolescenti posizionando il soggetto contro la regione superiore del torace, con il naso del soggetto rivolto verso il basso a terra. Prima di iniziare il tampone, assicurarsi che il soggetto sia compresso abbastanza da impedire il movimento ma sia comodo e sicuro nella stiva. Esporre il canale vaginale del soggetto flettendo delicatamente la coda prima di inserire la siringa.
Utilizzare il Hind Leg Lift per ratti adulti posizionando le zampe anteriori dell'animale sulla parte superiore o laterale della gabbia, mentre la coda e gli arti posteriori sono trattenuti con una leggera presa tra il primo e il secondo dito, lasciando il pollice libero per azionare la siringa⁶⁴.
Consentire agli animali di acclimatarsi alla manipolazione e al monitoraggio. Maneggiare gli animali delicatamente ma in modo sicuro per ridurre lo stress in eccesso e proteggere il ricercatore da aggressioni come mordere.
NOTA: I primi giorni di monitoraggio potrebbero non produrre i risultati desiderati poiché gli animali si acclimatano alle loro condizioni. Maneggiare gli animali per raccogliere pesi corporei durante il periodo di acclimatazione può aiutare questa transizione³³.
Tenendo ferma la siringa con l'indice e il dito medio, inserire la punta della siringa (non più di 2 mm) con un angolo parallelo al canale vaginale. Espellere lentamente il NaCl nel canale spingendo lo stantuffo verso l'interno. Non inserisca ulteriormente la siringa nel canale, poiché ciò potrebbe interrompere il ciclo estrale.
Estrarre il NaCl dal canale vaginale tirando lo stantuffo della siringa lontano dal rivestimento epiteliale (verso l'alto). Se c'è difficoltà a tenere il soggetto in stiva durante questo processo, rimetterlo nella gabbia per un breve periodo di riposo prima di tentare l'estrazione di NaCl.
Una volta che il campione cellulare è stato raccolto, rimettere il soggetto nella gabbia e ripetere questa procedura per ogni animale prima che tutti i campioni vengano valutati al microscopio.
NOTA: In alternativa, ogni campione può essere raccolto e valutato prima di passare all'animale successivo. Un animale può richiedere una seconda lavanda se il campione non può essere classificato. La stessa siringa della raccolta iniziale può essere riutilizzata se non contatta la soluzione salina direttamente nel contenitore e solo per lo stesso animale.

4. Valutazione del campione

Inizia la categorizzazione esaminando il campione di liquido vaginale estratto. Registrare la viscosità come viscosa o non viscosa e la colorazione come opaca o trasparente sul documento descrittivo o su un altro sistema di registrazione.
NOTA: questa sezione del protocollo può essere eseguita al momento della raccolta del campione o successivamente.
Espellere 2-3 gocce del fluido su un vetrino per microscopio e posizionare un vetro di copertura del microscopio sopra il vetrino. Posizionare il vetro di copertura sul vetrino del microscopio dalla parte superiore del vetrino verso il basso o da un lato del vetrino all'altro per evitare la formazione di bolle d'aria. Se possibile, lasciare circa la metà del campione raccolto nella siringa se è necessario un ulteriore esame e per evitare che una quantità eccessiva di liquido venga posizionata sul vetrino.
Individuare le cellule raccolte spostando il vetrino del microscopio attraverso il palco. Se ci sono troppo poche cellule o un'elevata quantità di detriti, espellere il fluido rimanente su un nuovo vetrino e riesaminare. Se la quantità di campione rimasta nella siringa è insufficiente, o se la seconda goccia presenta problemi simili, raccogliere un altro campione dal soggetto prima di tentare di identificare la fase del ciclo estrale.
Una volta individuate le celle e prima di toccare il computer o la tastiera del computer, rimuovere l'unico guanto per evitare di sporcare la tastiera.
Acquisisci le immagini dei campioni di cella facendo clic sulla funzione con l'etichetta Snap sul lato sinistro del pannello software.
Quindi, salva il file facendo clic su Salva con nome sotto l'icona File nell'angolo in alto a sinistra della pagina. Salva la foto in una cartella preetichettata sul computer.
NOTA: modello di etichetta di esempio: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective obiettivo utilizzato.
Scatta più di una foto su ogni obiettivo se non ci sono molte celle all'interno di ogni fotogramma.
NOTA: etichette di esempio per più immagini: #1_01/09/2021_EST_4x1 e #1_01/09/2021_EST_4x2.
Ripetere la procedura per ogni campione raccolto sotto più lenti obiettivo. Includi almeno un'oggettivazione più piccola, ad esempio 4x, e almeno un'oggettivazione più grande, ad esempio 20x.
Carica le immagini su un drive / cartella condivisa o su un disco rigido esterno in modo che tutti i ricercatori coinvolti abbiano accesso ai file e siano disponibili copie di backup.

5. Categorizzazione delle fasi

Impostare lo schermo del computer per visualizzare contemporaneamente le foto scattate e il foglio di registrazione (Figura 4A-C).
NOTA: in questo modo verrà visualizzata la documentazione durante la visualizzazione del campione raccolto. Questa parte del protocollo può essere completata al momento della raccolta del campione o successivamente.
Determinare quali tipi di celle sono presenti nel campione. Selezionare una delle quattro opzioni elencate nei passaggi 5.2.1-5.2.4 utilizzando i criteri e registrare i risultati.
1. Cellule epiteliali cheratinizzate anucleate (AKE)/cellule epiteliali cornificate
  1. Cerca le cellule frastagliate o a bordo angolare, come visto in Figura 2B e Figura 5C, che nonostante la mancanza di nuclei, possono mostrare aree rotonde chiare (fantasmi nucleari) all'interno della cellula che rappresentano dove un nucleo era una volta presente. Utilizzare un ingrandimento più elevato, come 20x e superiore, per distinguere tra tali cellule nucleate e anucleate.
  2. Usa un ingrandimento più elevato per distinguere la porzione cheratinizzata o cornificata della cellula, un sottile strato di cellule prive di nuclei e piene di cheratina, se lo desideri.
    NOTA: Oltre al loro aspetto frastagliato, questi possono anche essere distinti da come possono piegarsi o smontare, creando strutture frastagliate e allungate note come barre di cheratina.
2. Grandi cellule epiteliali nucleate (LNE)
  1. Cerca queste celle tipicamente di forma da rotonda a poligonale racchiuse da bordi irregolari, frastagliati o angolari.
  2. Osservare come i loro nuclei possono assumere varie forme, che vanno dall'intatto al degenerato o pykontic, relative alla condensazione irreversibile della cromatina nel nucleo di una cellula in fase di morte o deterioramento, come si vede in Figura 2B e Figura 5D1,2. Prendi nota di come questi nuclei occupano meno spazio del citoplasma all'interno della cellula, con un rapporto nucleare- citoplasmatico (N: C) inferiore rispetto alle piccole cellule epiteliali. Cerca i granuli citoplasmatici che possono essere visti a ingrandimenti più elevati¹³.
3. Leucociti (LEU)/neutrofili/cellule polimorfonucleate
  1. Cerca queste cellule sferiche compatte con nuclei multilobulati (quindi, noti come cellule polimorfonucleate), che svaniscono man mano che la cellula matura (Figura 2B e Figura 5A). Un ingrandimento più elevato (ad esempio, 40x) può essere utilizzato per osservare i nuclei multilobulati.
    NOTA: al momento della raccolta e della preparazione, queste cellule possono condensarsi, piegarsi o rompersi.
4. Piccole cellule epiteliali nucleate (SNE)
  1. Cerca queste cellule di forma da rotonda a ovale che sono più grandi dei neutrofili sopra descritti.
  2. Osservare i nuclei rotondi di queste cellule epiteliali non detinatenziate (Figura 2B), che occupano una maggiore quantità di spazio rispetto al citoplasma all'interno della cellula, creando un rapporto N:C più elevato rispetto alle grandi cellule epiteliali.
    NOTA: al momento della raccolta e della preparazione, queste celle possono piegarsi o sovrapporsi per creare una forma simile a una stringa o a una barra, come illustrato nella Figura 5B1.
Esaminare come sono organizzate le celle presenti nel campione per ogni oggettivazione. Utilizzare l'oggettivazione inferiore, ad esempio 4x, per visualizzare una vista rappresentativa della disposizione complessiva delle celle. Registrare se le cellule sono raggruppate insieme (C), uniformemente disperse (ED) o disperse casualmente (RD) (vedi Figura 4C) e notare l'organizzazione specifica di ciascun tipo di cellula (ad esempio, le piccole cellule epiteliali nucleate sono raggruppate e i neutrofili sono distribuiti uniformemente).
Successivamente, stimare visivamente e registrare la quantità totale di cellule (un po ', moderata, numerosa) e le singole quantità di cellule (percentuale di ciascun tipo di cellula presente).
NOTA: uno smidge rappresenta il minor numero di celle presenti che possono essere utilizzate per determinare la categorizzazione del campione, numerose rappresentano la presenza di un numero infinito di celle che rappresentano la maggior parte se non tutto lo spazio sulla diapositiva o sono impilate l'una sull'altra, e un numero moderato di celle rappresenta un numero relativamente medio di celle (esempi visti nella Figura 5A-D e nella Figura 6A-D).
Notare se ci sono deviazioni dai criteri elencati o dagli aspetti tipici del soggetto specifico nella categoria "anomalie" e consultare un veterinario, se necessario.
Determinare quale fase del ciclo estrale viene presentata nell'esempio utilizzando i componenti di categorizzazione e le descrizioni riportate di seguito.
1. Morire
  1. Cerca le LEU come il tipo di cellula dominante o unico presente, disposte in modo raggruppato all'inizio del DIE ma più disperse nelle fasi avanzate.
    NOTA: durante la transizione in DIE, la quantità di cellule può diminuire quando le cellule epiteliali iniziano a rompersi, come si vede nella Figura 6D1. Allo stesso tempo, il numero di LEU inizia ad aumentare e tendono ad essere disposti in modo raggruppato inizialmente e si disperdono nel tempo.
  2. Si noti che la quantità totale di cellule può essere relativamente bassa, il più delle volte nelle fasi successive del periodo DIE, il secondo o il terzo giorno.
  3. Osservare l'elevata quantità di muco che può essere presente in questa fase, che si presenta come filamenti concentrati di LEU (Figura 5A1). Cerca piccoli grumi o filamenti cellulari di cellule SNE che accompagnano le LEU durante le fasi tardive della transizione a PRO (Figura 5A1,2).
  4. Osservare l'aspetto viscoso e opaco del fluido vaginale durante la transizione in, completamente transizionato in e transizione fuori da DIE.
    NOTA: La durata media di questa fase è di 48 ore durante un ciclo di 4 giorni e possibilmente di 72 ore durante un ciclo di 5 giorni.
2. Pro
  1. Cerca le cellule SNE come cellule dominanti e le leU, LNE e / o cellule AKE che possono essere viste in numero basso. Utilizzare un'elevata oggettivazione per osservare l'aspetto granulare delle celle SNE che sono tipicamente disposte in cluster, fogli o filamenti durante questa fase (Figura 5B1,2).
  2. Osservare l'aspetto viscoso e opaco del fluido vaginale quando si passa da DIE a PRO, e come diventa non viscoso e trasparente una volta completamente trasferito allo stadio PRO (durata media di 14 ore nei ratti).
3. EST ·
  1. Cerca la dominanza delle cellule AKE, una diminuzione delle cellule SNE in EST e un aumento del numero e delle dimensioni delle cellule mentre EST continua^11,13.
  2. Prendere nota della caratteristica distintiva della disposizione spesso raggruppata delle cellule AKE, sotto forma di barre di cheratina o contenenti nuclei fantasma, che possono diventare più casualmente dispersi nella transizione da PRO (Figura 6B) e a MET (Figura 6C).
  3. Osserva il caratteristico fluido vaginale non viscoso e trasparente, che può essere previsto mentre i ratti stanno passando, completamente transizionati e transizionati fuori dall'EST.
    NOTA: La progressione dell'EST include molta diversificazione (Figura 5C e Figura 6B, C). Lo stadio si verifica in genere per una media di 24 ore in un ciclo di 4 giorni o forse 48 ore in un ciclo di 5 giorni.
4. Incontrato
  1. Cerca un numero maggiore di cellule SNE e LNE mentre il ratto sta passando a MET, dominante in termini di proporzione cellulare all'interno del canale o quasi uguale alla proporzione delle LEU^11,13. Inoltre, prendere nota della maggiore quantità di detriti in MET e delle transizioni rispetto ad altre fasi dovute al decadimento cellulare epiteliale dopo EST e spostamento in DIE.
  2. Osservare la mancanza di una disposizione coerente poiché tutti i tipi di cellule sono visti e in varie quantità (Figura 5D1-3). Tuttavia, cerca le LEU che sono imballate o raggruppate in prossimità delle cellule epiteliali nelle fasi iniziali che possono tornare alla disposizione raggruppata durante la transizione in DIE.
  3. Osserva l'aspetto non viscoso e trasparente del fluido vaginale in questa fase e il passaggio a un aspetto più viscoso e opaco mentre ti sposti in DIE.
    NOTA: La durata media di questa fase è di 6-8 ore.
Etichettare i campioni nelle transizioni con lo stadio verso cui il soggetto si sta muovendo, con la transizione tra parentesi per tracciare quando questi vengono raccolti. Ulteriori informazioni su come distinguere tra queste 4 fasi e le loro transizioni sono disponibili nei Risultati rappresentativi.
NOTA: poiché i campioni raccolti sono statici e il ciclo è dinamico, le diapositive possono rappresentare transizioni tra le fasi (viste nella Figura 6A-D).
Completare questo processo per ogni animale fino al completamento della fase di monitoraggio.
In entrambi i giorni 11 (45 giorni di età) o 21 (55 giorni di età), eutanasia i ratti con il 5% di isoflurano e il 2% di ossigeno prima di una decapitazione a ghigliottina. Questi punti temporali possono variare a seconda della natura dello studio.

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Representative Results

I dati attuali riflettono quelli delle femmine adolescenti SD International Genetic Standardization Program (IGS) in presenza di ratti SD maschi. Questi animali sono stati localizzati presso i laboratori della Pepperdine University e dell'UCLA come parte di uno studio collaborativo. La Figura 5 presenta molteplici varianti delle 4 fasi del ciclo. Figura 5A1 è stato identificato come un campione di diestro con diversi tipi di cellule presenti. Questo esempio dimostra che i campioni con un numero maggiore di cellule epiteliali si qualificano come diestro quando soddisfano le altre qualifiche dei componenti di categorizzazione, ad esempio una dominanza delle LEU. Questo campione ha anche dimostrato la disposizione del filamento di muco composta da LEU spesso osservate in questa fase, che assomiglia ai filamenti costituiti da cellule SNE osservate nello stadio PRO. Per distinguere un filamento di muco nello stadio DIE dai filamenti che appaiono nello stadio PRO costituito da cellule SNE, è importante identificare la dominanza delle LEU. La Figura 5A2,3 mostra una progressione della disposizione cellulare spesso osservata: un raggruppamento iniziale delle LEU che raccolgono e si spostano in un casuale (RD) o addirittura in un esborso (ED) in campioni raccolti in periodi successivi della fase DIE. In particolare, la Figura 5A2 era un campione DIE con numerose cellule presenti. Ciò riflette come le LEU possano anche essere accompagnate da un elevato numero di cellule epiteliali (Figura 5A1,2), distinte dal metestro da una dominanza delle LEU e dall'assenza di barre di cheratina. Al contrario, la Figura 5A3 dimostra che un basso numero totale di cellule (un po' di smidge) è stato comunemente osservato durante la fase successiva della fase DIE, ad esempio durante il secondo o il terzo giorno. Durante la fase PRO, le cellule SNE sono state spesso disposte in filamenti con numerose cellule impilate l'una sull'altra (Figura 5B1) o un po 'di cellule disposte in grumi più piccoli (Figura 5B2). La Figura 5B3 esemplifica un campione PRO con il caratteristico raggruppamento simile a un foglio di cellule SNE che si sovrappongono e formano barre che potrebbero essere confuse con le barre di cheratina composte da cellule AKE presenti nello stadio EST. Per distinguere i due, è importante identificare la dominanza delle cellule SNE in PRO e delle cellule AKE in EST.

La figura 5C1,2 mostra il tipico raggruppamento e l'esborso casuale delle cellule AKE osservate nell'EST, con il primo che include numerose cellule e il secondo un numero moderato. Nuclei fantasma, formazioni di barre di cheratina e batteri spesso raccolti durante questa fase sono visti in questi esempi. Le cellule SNE sono state talvolta rappresentate durante la fase EST (Figura 5C1) come resti del precedente stadio PRO. La fase EST tardiva, quando le cellule SNE iniziano ad emergere mentre il soggetto si sposta verso MET, viene spesso scambiata per la fase PRO. Per distinguere i due, è importante prendere in considerazione le dimensioni nucleari. In generale, le cellule nucleate di PRO hanno un rapporto N:C più elevato. Il campione mostrato nella Figura 5C3 presentava una disposizione a filamento di numerose celle AKE che non era vista come una caratteristica dello stadio EST. Ciò dimostra che ogni animale è unico, che possono verificarsi deviazioni dai criteri e che i determinanti di categorizzazione devono essere esaminati in combinazione.

Per distinguere tra EST e PRO quando sono presenti cellule SNE, si è visto che un rapporto N: C più basso si è verificato in queste cellule durante la fase EST. Per distinguere le barre di cheratina presenti in EST da quelle formate dalla sovrapposizione o dalla laminazione di cellule SNE nello stadio PRO (Figura 5B3) e quelle formate da cellule epiteliali in decomposizione nella transizione da MET (Figura 6D1), è importante identificare il tipo, la disposizione e la quantità di cellule dominanti per distinguere lo stadio rappresentato. Infine, la Figura 5D1,2 esemplifica la combinazione di tutti i tipi di cellule presenti nell'erogazione casuale che rappresenta lo stadio MET. Oltre alle numerose cellule presenti in questi esempi, era comune raccogliere una maggiore quantità di detriti durante questa fase (Figura 5D2) a causa del decadimento delle cellule epiteliali in seguito all'EST e alla transizione in DIE con una dominanza di LEU che funzionano per liberare il canale vaginale dalle cellule epiteliali. La Figura 5D2 mostra anche come il MET può essere distinto dal DIE per la sua maggiore concentrazione di cellule epiteliali e la presenza di barre di cheratina. Nel complesso, queste rappresentazioni raffigurano l'ampio spettro che esiste all'interno di ogni stadio e non sono esaustive.

Le rappresentazioni delle 4 fasi di transizione sono mostrate nella Figura 6. Mentre questo studio ha classificato i campioni in transizione come una delle 4 fasi del ciclo estrale, rimane importante identificare correttamente le fasi di transizione. Nella transizione da DIE a PRO (Figura 6A), c'è stata spesso una diminuzione complessiva del numero di LEU e un aumento del numero di cellule SNE. Le cellule LNE e AKE erano a volte presenti in questa transizione, anche se non in quantità elevate (Figura 6A1). Figura 6A2-4 raffigura il maggior numero di cellule SNE raggruppate e disperse casualmente che sono state spesso raccolte durante questa transizione, con un basso numero di LEU disperse in modo casuale e uniforme. Nel complesso, distinguendosi da altre fasi di transizione, è stato importante notare la dominanza delle cellule SNE e l'inizio di grumi e formazioni di filamenti osservati in PRO. Tutti gli esempi nella Figura 6A rappresentano un numero di celle numerose tranne la Figura 6A4, con uno smidge. Nella Figura 6B, l'immagine mostra un esempio di numerose celle SNE e AKE raggruppate che si vedono nella transizione da PRO a EST.

Durante questa transizione, si vede che le cellule SNE sono in numero maggiore con meno ammassati e più esborsi casuali di cellule AKE rispetto a durante EST. La Figura 6C mostra l'emergere di AKE, SNE e LNE e la diminuzione delle cellule AKE nella transizione da EST a MET con un numero elevato di cellule. I detriti presenti rappresentano le cellule AKE in decomposizione del precedente stadio di estro spesso viste nel metestro. Ciò si osserva anche nella fase finale di transizione, da MET a DIE, dove le cellule epiteliali hanno iniziato a decadere e produrre detriti (Figura 6D1,2), con numerose cellule presenti nella prima e un numero moderato nella seconda. Queste cifre mostrano il fenomeno delle LEU che aumentano di numero per diventare il tipo di cellula dominante nella transizione al diestro. Per il gruppo monitorato per 20 giorni (n = 3), ci sono stati 12 giorni in cui sono stati raccolti campioni di transizione, con una media di 4. Per il gruppo monitorato per 10 giorni (n = 3), ci sono stati 9 giorni in cui sono stati raccolti campioni di transizione, con una media di 3.

La Figura 7 rappresenta raccolte di campioni cellulari sfavorevoli, la maggior parte delle quali giustificava lavaggi ripetuti. La Figura 7A1 mostra una massa di cellule squamose raccolte a causa di un'inserzione e di un'estrazione improprie della siringa, che causa l'aspirazione delle cellule squamose dalla parete del canale vaginale. Queste cellule possono essere distinte dalle cellule epiteliali raggruppate o LEU a causa dell'alta densità e compattezza della massa e dei suoi bordi distintivi. La Figura 7B rappresenta una raccolta di detriti, in cui non sono state estratte cellule, il piano di messa a fuoco non è corretto o la diapositiva non è stata completamente scansionata per le celle. I detriti possono essere distinti dalle cellule attraverso la familiarità con i tipi di cellule e le piccole dimensioni e l'aggregazione spesso distintivi. Questi detriti spesso derivano da lettiere di animali, peli o decadimento cellulare. Nella Figura 7C viene illustrata una diapositiva che contiene un conteggio delle celle inferiore a uno smidge. Mentre un basso numero di cellule è stato comunemente osservato durante il MET tardivo e il DIE precoce, questo rappresenta diapositive che hanno troppo poche cellule per categorizzare accuratamente in uno stadio.

La Figura 7D mostra due esempi della soluzione di estrazione NaCl combinata con il liquido vaginale dal canale sul vetrino del microscopio. Nella prima immagine, Figura 7D1, il fluido era presente e sfocato, ostacolando la capacità di categorizzare con precisione. Nella Figura 7D2, il fluido era distribuito attraverso il vetrino in cerchi coesivi accanto alle LEU. Sebbene questo esempio non richieda un lavaggio ripetuto a causa dell'elevata presenza di cellule, è importante considerare la quantità di fluido posto sul vetrino e il posizionamento del vetrino di copertura del microscopio per prevenire strisci. Nel complesso, queste immagini sottolineano l'importanza di acquisire immagini rappresentative di qualità per una corretta categorizzazione. Ciò include considerare il modo di estrazione della cella, il piano di messa a fuoco e il contenuto dell'immagine eseguendo la scansione di ogni diapositiva prima di acquisire un'immagine.

Dopo aver classificato ogni animale nel gruppo o nei gruppi sperimentali, è comune rappresentare graficamente le progressioni dello stadio su un grafico a barre o a linee. Ciò consente ai ricercatori di esaminare il modello generale del ciclo e identificare quando l'animale presenta una progressione irregolare degli stadi estrali, nota come aciclicità. I campioni possono quindi essere analizzati in base alla lunghezza del ciclo e al modello di progressione dello stadio in questo strumento di analisi. Mostrato nella Figura 8A,B, questo concetto include l'assegnazione di barre di altezze variabili, nel caso di questo studio, alle singole fasi e la traduzione dei dati registrati (Figura 4B) attraverso l'asse x. In questi esempi, MET e DIE sono rappresentati dal più basso, PRO dal centro e EST dalle altezze delle barre più alte. A causa della breve durata della fase MET, è combinata con la fase DIE in un'unica barra. Sebbene esistano diversi metodi per misurare i completamenti del ciclo, è comune contare un ciclo completo come il movimento da un EST all'altro¹¹. Tuttavia, questo non riflette il completamento di un ciclo, ma una durata della fase EST di 2 giorni quando ci sono fasi EST consecutive.

La Figura 8A riflette i dati di un ratto che progredisce attraverso una progressione coerente e ripetitiva attraverso MET/DIE, PRO ed EST. Inoltre, questo ratto rientrava nell'intervallo dei cicli da 4 a 5 giorni con una durata media di 4.375. Ogni fase non supera gli intervalli standardizzati di lunghezza, con una media di 1.0625 giorni trascorsi in EST, una valutazione tipica per l'aciclicità. Se i dati estratti seguono questo modello da EST a EST con regolarità, ciò conferma non solo che i livelli ormonali del soggetto sono rimasti entro intervalli accettabili, ma anche che la procedura è stata condotta senza interrompere in modo significativo la natura ciclica del processo. Infine, questo ratto ha completato 16 cicli, determinati contando il numero di barre da EST a EST.

La Figura 8B rappresenta i tipi comuni di aciclicità, inclusi gli stadi estesi (visti come EXT) e non registrati. Questa cifra evidenzia anche l'importanza di esaminare sia il modello del ciclo che la durata e il numero di giorni trascorsi in ciascuna fase. In particolare, in questo esempio, mentre la durata media del ciclo e il numero di giorni in EST rientrano nei parametri delineati, il modello di ciclo della progressione dello stadio ha rivelato anomalie. Pertanto, è importante esaminare il ciclo estrale in modo completo. Entrambi gli stadi DIE estesi (etichettati come Ext Diest) e EST (etichettati come Ext Est) sono stati registrati durante i cicli mostrati nella figura, e ci sono stati più cicli in cui lo stadio PRO non è stato registrato. Questo esempio dimostra anche l'importanza di esaminare il numero di fasi consecutive viste, che non rientrano negli intervalli tipici, piuttosto che esaminare esclusivamente la lunghezza media del ciclo e i giorni in EST, che rientrano negli intervalli tipici.

Le cause e le correlazioni di questi esempi possono includere fattori quali anomalie fisiologiche (tumori, pseudogravidanza, stress prolungato), condizioni ambientali dannose (illuminazione prolungata, esposizione a sostanze chimiche tossiche, alloggiamento solitario), tempi impropri di raccolta dei campioni, errore del ricercatore (scarsa raccolta del campione, acquisizione di immagini, stadiazione impropria), fenomeni legati all'età (irregolarità comune osservata nell'adolescenza e nella senescenza riproduttiva) o deviazioni uniche per lo specifico animale. Per separare l'errore del ricercatore o la tempistica impropria della raccolta dei campioni e le anomalie fisiche o i fenomeni legati all'età, è utile esaminare i 4 componenti di categorizzazione in modo più dettagliato. Questo può aiutare a determinare le possibili cause di irregolarità o, in un senso più ampio, potrebbe essere utilizzato in studi che stanno studiando più da vicino le caratteristiche del ciclo estrale.

La Figura 9 illustra questa ispezione più ravvicinata includendo le quantità totali e individuali di cella sull'asse y, i tipi di cella rappresentati da diversi colori di riempimento delle barre e le disposizioni delle celle rappresentate da diversi modelli di riempimento delle barre, rappresentate graficamente durante il periodo di monitoraggio totale. Questo metodo di analisi ha permesso di esaminare il numero totale di cicli completati, la durata di ciascun ciclo, la progressione dello stadio e i componenti di categorizzazione in modo più dettagliato per ogni singolo ratto. La Figura 9A rappresenta un ratto che ha avuto un numero di cicli inferiore alla media, con un totale di 3 cicli completi nei 10 giorni monitorati: due cicli di 3 giorni e un ciclo di 5 giorni (media di 3,67). L'irregolarità osservata nella progressione dello stadio con il 50% dei giorni includeva una o più fasi non registrate e il 30% dei campioni raccolti erano in transizione: il giorno 2 come MET-DIE, il giorno 5 come EST-MET e il giorno 8 come transizione PRO-DIE. Ciò potrebbe essere dovuto alla tempistica impropria della raccolta dei campioni, all'errore del ricercatore, a un fenomeno legato all'età o a deviazioni uniche. Un ulteriore monitoraggio avrebbe potuto fornire chiarezza su quale applicazione.

Le tipiche disposizioni dominanti, i tipi di cellule e le quantità di cellule individuali e totali sono state osservate all'interno di ciascuna delle fasi registrate. All'interno delle fasi EST, sono stati osservati un po '(25% dei campioni), moderato (25% dei campioni) e numerose (50% dei campioni) cellule AKE raggruppate, con una minore presenza di cellule LEU, SNE e LNE. In uno stadio MET catturato, era presente una combinazione di numerose cellule LEU disperse casualmente (50%), cellule AKE (20%), LNE (15%) e SNE (15%). Per le fasi DIE, è stato osservato uno smidge (50% dei campioni) e numerose (50% dei campioni) quantità di dispersi casualmente, uniformemente dispersi, e una combinazione di LEU dominanti intervallati da cellule AKE, LNE e SNE. Nell'unica fase PRO raccolta, erano presenti un po' di LEU disperse casualmente (60% delle cellule presenti) e cellule SNE (40% delle cellule presenti), che erano in una combinazione di disposizioni, che rappresentavano una transizione da DIE a PRO.

Nella Figura 9B, il ratto rappresentato aveva un totale di 3 cicli completi, con un modello di ciclo di 4 giorni. I campioni raccolti non rappresentavano una progressione di fase coerente, con un periodo DIE esteso (giorni 6-9) e altri 5 casi di fasi non registrate (2 fasi MET non registrate, 2 fasi PRO non registrate e 1 fase EST non registrata). Poiché solo il 20% dei campioni era in transizione (giorno 3 come DIE-PRO, giorno 5 come EST-MET, giorno 18 come MET-DIE e giorno 19 come DIE-PRO), e solo 3 fasi non sono state registrate al di fuori della fase MET e del periodo DIE prolungato, si è concluso che i tempi di raccolta del campione erano appropriati per questo specifico animale. Poiché gli ultimi 10 giorni monitorati includevano una progressione ordinata attraverso le 4 fasi, le irregolarità iniziali potevano essere attribuite all'età adolescenziale. La maggiore durata del monitoraggio (20 giorni) ha permesso che si verificasse questa conclusione.

L'esame dei componenti di categorizzazione ha rivelato intervalli tipici. Gli stadi EST riflettevano una dominanza di un moderato (50% dei campioni) a una quantità numerosa (50% dei campioni) di cellule AKE raggruppate con meno cellule LEU, SNE e LNE. Nei campioni MET raccolti, c'era una combinazione di un moderato (33,33% dei campioni) a numerosi (66,67% dei campioni) LEU dispersi e raggruppati in modo casuale (con un intervallo di quantità del 10-90%), SNE raggruppato (0-30%), LNE disperso casualmente (0-10%) e cellule AKE raggruppate e disperse casualmente (10-90%). Le fasi di DIE riflettevano una dominanza di una moderata (20%) a una quantità numerosa (80% dei campioni) di LEU uniformemente disperse, disperse casualmente e raggruppate (intervallo del 50-100%) in presenza di cellule AKE e SNE disperse casualmente. Gli stadi PRO sono stati identificati dalla dominanza di uno smidge (3,33% dei campioni) e da numerose (66,67% dei campioni) quantità di cellule SNE disperse e raggruppate casualmente (10-99%) in presenza di cellule LEU, AKE e LNE.

Un'altra opzione per l'analisi dei dati estratti è la creazione di profili di ciclo estrale includendo gli elementi descritti in precedenza: quantità totali e singole di celle sull'asse y, tipi di celle rappresentati da diversi colori di riempimento delle barre e disposizioni delle celle rappresentate da diversi modelli di riempimento delle barre, rappresentate graficamente durante il periodo di monitoraggio totale per ogni fase del ciclo. Questo può essere completato per ratto o medie dell'intero gruppo. Lo scopo di questo strumento di analisi è quello di esaminare le tendenze dei componenti di categorizzazione per stadio, che assiste la comunità scientifica complessiva nel caratterizzare le distinzioni dei componenti di categorizzazione specifiche per le categorizzazioni dello stadio del ciclo estrale. Nella Figura 10A1, il profilo DIE a 10 giorni mostrava una dominanza di una quantità moderata (50% dei campioni) e numerosa (50% dei campioni) di LEU uniformemente disperse (media del 78,25%) insieme a un minor numero di cellule SNE, AKE e LNE. Nella Figura 10A2, il profilo del diestro a 20 giorni ha mostrato una dominanza di una quantità moderata (20% dei campioni) e numerosa (80% dei campioni) di LEU uniformemente disperse, raggruppate e disperse casualmente (media dell'82% come presente in tutti i 10 giorni) insieme a un numero inferiore di cellule AKE e SNE.

Lo stadio PRO esposto nella Figura 10B1 ha mostrato una dominanza di un numero moderato di cellule SNE disperse casualmente (60%) in presenza di LEU e cellule AKE. Il profilo dello stadio PRO a 20 giorni nella Figura 10B2 ha mostrato una dominanza di uno smidge (33,33% dei campioni) e una quantità numerosa (66,67% dei campioni) di una combinazione di disposizioni e cellule SNE disperse casualmente (media del 66,33% come presente in tutti e 3 i campioni) insieme a LEU e cellule AKE. Il profilo EST a 10 giorni osservato nella Figura 10C1 ha mostrato una dominanza di una quantità moderata (50% dei campioni) o numerosa (50% dei campioni) di cellule AKE (media dell'80% per i 2 giorni presenti) in una combinazione di disposizioni, insieme a un numero inferiore di cellule LEU, SNE e LNE. Nella Figura 10C2, il profilo EST a 20 giorni ha mostrato una dominanza di cellule moderate (75% dei campioni) o una quantità numerosa (15% dei campioni) di cellule AKE disperse casualmente (media del 57,5% per i 4 giorni presenti) o quelle in una combinazione di disposizioni, insieme a un numero inferiore di cellule LEU, SNE e LNE.

Il profilo dello stadio MET a 10 giorni nella Figura 10D1 includeva numerose LEU disperse casualmente (50%), cellule AKE (20%) e cellule SNE (30%). Il profilo dello stadio MET a 20 giorni nella Figura 10D2 ha mostrato una quantità moderata (3,33% dei campioni) o numerosa (6,667% dei campioni) di LEU (media del 50% in tutti e 3 i campioni), SNE (media del 15% come presente in tutti e 3 i campioni), cellule AKE (con il 23,33% nei 3 campioni presenti), cellule LNE (media del 15% in tutti e 2 i campioni presenti). La metà delle LEU sono state disperse in modo casuale (1 campione) e il restante 50% era una combinazione di disposizioni (1 campione). Due terzi delle cellule SNE sono state disperse casualmente quando presenti, mentre il restante 33,33% era in una combinazione di disposizioni quando presenti (1 su 3 campioni). Infine, il 66,67% delle cellule AKE sono state raggruppate nei campioni presenti (2 giorni), mentre il restante 33,33% era in una combinazione di disposizioni (1 giorno). La tabella 1 include le medie numeriche dei determinanti di categorizzazione dei due gruppi. Mentre i dati della Figura 9A,B e della Figura 10A-D includono informazioni sulla categorizzazione dei determinanti dei singoli animali, queste tabelle includono le medie per lo stadio dell'estro come esempio. Se riprodotti in altri laboratori, questi parametri potrebbero diventare lo standard per l'identificazione dello stadio. Questo, a sua volta, potrebbe ridurre il livello di soggettività attualmente coinvolto nel processo di stadiazione.

Statistica
In generale, ci sono alcuni parametri da considerare quando si interpretano le caratteristiche del ciclo, anche se c'è una mancanza di consenso su ciò che è considerato "anormale" e le deviazioni sono tipiche. Goldman et al. identificano "regolare" come un ciclo di 4-5 giorni con 24-48 h EST e 48-72 h DIE stadi¹¹. La divergenza da questi parametri potrebbe essere dovuta a vari fattori, tra cui una o più anomalie fisiologiche, tempi di raccolta impropri o l'aciclicità iniziale spesso sperimentata dai ratti adolescenti quando i livelli ormonali maturano. Oltre a consultare il veterinario di laboratorio, consentire un periodo di raccolta della prova per garantire una tempistica adeguata e monitorare gli animali dopo l'adolescenza per stabilire una tempistica comparativa, le analisi statistiche possono essere utili per attribuire causalità e / o correlazione a eventuali anomalie. Dopo aver caratterizzato i cicli in categorie (ad esempio, coerenti e anormali), un'analisi del chi quadrato può aiutare a confrontare i gruppi. Inoltre, i componenti di categorizzazione o le caratteristiche generali del ciclo possono essere confrontati dopo l'intervento utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA)¹¹. Tuttavia, tali deviazioni potrebbero non essere biologicamente significative, come discusso nell'introduzione, e quindi il contesto sperimentale deve essere considerato.

Figura 1: Ritmicità ormonale nelle fasi del ciclo estrale. (A) I diversi livelli di ormoni steroidei sessuali durante le fasi prominenti del ciclo estrale sono delineati e riassunti. La progressione dello stadio inizia e termina con il metestro per dimostrare i livelli ormonali di costruzione e la progressione circolare del processo. Adattato da una fonte esterna¹¹. (B) Flusso di ormoni steroidei sessuali dal sistema nervoso centrale al sistema riproduttivo attraverso il flusso sanguigno. Si è visto che i livelli ormonali sono aumentati attraverso i segnali dall'ipotalamo e dalla ghiandola pituitaria attraverso l'ormone di rilascio della gonadotropina (GrH o LHRH) e la combinazione di ormone follicolo-stimolante e ormone luteinizzante, rispettivamente. Ciò include cicli di feedback sia positivi che negativi a seconda della concentrazione di estradiolo e progesterone. Informazioni¹⁷ e immagini tracciate da fonti^{esterne 65,66,67}. Abbreviazione: LHRH = ormone luteinizzante che rilascia l'ormone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ciclo estrale che classifica i determinanti misurati. (A) Di seguito sono elencati i componenti utilizzati durante la stadiazione dei campioni cellulari raccolti e i componenti dominanti per ogni stadio. È importante ricordare che questi sono parametri generali e le differenze sono previste. (B) Ecco i tipi di cellule dominanti presenti in ogni stadio. Mentre queste sono divisioni generali, ogni tipo di cellula può essere trovato all'interno di tutte le fasi. (C) Qui sono presentati i tipi di disposizione cellulare trovati all'interno di questo studio. (D) L'immagine qui riflette le quantità cellulari tipiche presenti in ciascuna delle 4 fasi del ciclo estrale, con il volume del quadrante che rappresenta le quantità cellulari approssimative. Proveniente da una fonte esterna¹³ e precedentemente adattato⁶⁸. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Apertura vaginale nei ratti Sprague Dawley. (A) Orientamento anatomico dei genitali esterni non sviluppati e apertura vaginale che portano al canale vaginale in relazione all'apertura uretrale. (B) Rappresentazione visiva dell'area non sviluppata, contrassegnata da una freccia. (C) Orientamento anatomico dei genitali esterni sviluppati e dell'orifizio vaginale in relazione all'apertura uretrale, che si verifica tipicamente intorno ai 34 giorni di età. (D) Corrispondente rappresentazione visiva dell'area sviluppata delineata nell'immagine A. Tutte le cifre provengono da una fonte esterna²⁹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Categorizzazione dei determinanti modello di registrazione dei dati. (A) Un'opzione per la registrazione dei dati; include descrizioni dei determinanti di categorizzazione. Questo deve essere usato quotidianamente, uno per ogni ratto monitorato. (B) Questo modello è un'opzione per l'inserimento dei dati, con una registrazione semplificata dei determinanti di categorizzazione e l'identificazione dei ratti. Ciò consente di inserire note nel foglio dati nella seconda categorizzazione PRO. Il colore nella riga superiore riflette il colore assegnato al gruppo sperimentale rappresentato, il che aiuta a distinguere un gruppo da un altro. (C) Un'altra opzione modello; include tutti i determinanti di categorizzazione e può essere modificato in base alle preferenze personali o agli obiettivi dello studio. Abbreviazioni: AKE = epiteliale cheratinizzato anucleato; LEU = leucociti; LNE = grande epitelio nucleato; SNE = piccolo epiteliale nucleato; C = raggruppato; ED = uniformemente disperso; RD = disperso casualmente; COM = combinato; SMD = smidge; MOD = moderato; NUM = numerosi; EXE = esercizio; SED = sedentario; Est = estro; Die = diestro; met-die = transizione metestrus-diestrus; Pro = proestro; pro-Est = transizione proestro-estro; ** = esempio di qualità che potrebbe essere utile in una pubblicazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Variazioni determinanti che categorizzano lo stadio. (A) Questa serie di immagini raffigura vari esempi dello stadio del diestro. La prima immagine (A1) raffigura un deposito di muco rappresentato da filamenti di LEU concentrate, con cellule epiteliali presenti in esborsi casuali. Questo è un esempio dell'importanza di utilizzare sia l'ingrandimento 4x che 10x. Questo ingrandimento 4x sembra simile a un filamento di proestro, ma a un esame più attento a 10x, mostra una dominanza di LEU. La seconda immagine (A2) raffigura ciò che è stato spesso visto nelle fasi del diestro: una dominanza di LEU vista accanto a una disposizione raggruppata di cellule epiteliali: cellule SNE, LNE e AKE. L'ultima immagine di questa serie (A3) riflette un'erogazione casuale di LEU, spesso osservata all'interno della fase diestro in mezzo a goccioline di liquido vaginale e salino. (B) Questa serie di immagini raffigura vari esempi dello stadio del proestro. La prima immagine (B1) raffigura una disposizione aggregante di cellule SNE in filamenti. La seconda immagine (B2) riflette una diapositiva con un numero totale di celle inferiore e un raggruppamento di celle SNE. La terza immagine (B3) mostra l'aggregazione comune e l'erogazione più casuale di cellule SNE e un basso numero di cellule LEU e AKE. (C) Questa serie di immagini raffigura vari esempi dello stadio dell'estro. La prima immagine (C1) raffigura una disposizione comune di aggregazione di cellule AKE, con formazioni di barre di cheratina, in presenza di cellule SNE. La seconda immagine (C2) presenta l'aggregazione di cellule AKE con nuclei e batteri fantasma. L'ultima immagine (C3) presenta una disposizione a forma di filamento di celle AKE. (D) Questa serie di immagini raffigura vari esempi dello stadio del metestro. La prima immagine (D1) raffigura l'esborso casuale e l'aggregazione di LEU, cellule SNE, cellule AKE e cellule LNE in presenza di detriti. La seconda immagine (D2) riflette tutti i tipi di cellule presenti in una disposizione aggregante, insieme alle barre di cheratina. L'ultima immagine (D3) mostra una disposizione più completa delle celle LEU, SNE, AKE e LNE presenti. Queste cifre, prese a 4x (A1, A2, B2, B3, D1 e D3) o 10x (A3, C1, C2, C3 e D2) di oggettivazione, sono state ingrandite per consentire una maggiore visualizzazione dei componenti di categorizzazione. Barre di scala = 100 μm. Per riferimento alle dimensioni; Le celle AKE hanno un diametro di circa 40-52 μm, le LEU di circa 10 μm, le celle LNE di 36-40 μm e le celle SNE di circa 25-32 μm¹⁶. Abbreviazioni: SNE = piccolo epiteliale nucleato; LNE = grande epitelio nucleato; AKE = epiteliale cheratinizzato anucleato; LEU = leucociti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Esempi di fase di transizione. (A) Questa serie di immagini illustra esempi della transizione tra le fasi DIE e PRO. La prima immagine (A1) presenta grandi grumi e l'erogazione casuale di cellule LEU, SNE, LNE e AKE. La seconda immagine (A2) include una grande massa di LEU e SNE raggruppati con fili intervallati di LEU. La terza immagine (A3) include grumi e persino esborsi di LEU e una piccola quantità di END. La quarta e ultima immagine (A4) raffigura sia cellule SNE raggruppate che casuali erogate e LEU. (B) Questa immagine mostra un esempio della transizione tra gli stadi PRO ed EST con l'aggregazione delle cellule SNE e AKE. (C) Questa immagine raffigura l'aggregazione e l'erogazione casuale di cellule AKE, SNE e LNE viste in mezzo ai detriti per rappresentare la transizione da EST a MET. (D) La prima immagine (D1) mostra un esempio della transizione tra gli stadi MET e DIE, con cellule epiteliali in decomposizione che accompagnano un aumento delle LEU. La seconda immagine (D2) raffigura cellule AKE in presenza di LEU raggruppate e cellule SNE precedentemente descritte. Queste cifre, prese con l'ingrandimento 4x (A1, A2, A3, B e C) o 10x (A4, D1 e D2), sono state ingrandite per consentire una maggiore visualizzazione dei componenti di categorizzazione. Barre della scala = 100 m. Per riferimento dimensionale, le celle AKE hanno un diametro di circa 40-52 μm, le LEU di circa 10 μm, le celle LNE di 36-40 μm e le celle SNE di circa 25-32 μm¹⁶. Abbreviazioni: AKE = epiteliale cheratinizzato anucleato; LEU = leucociti; LNE = grande epitelio nucleato; SNE = piccolo epiteliale nucleato; C = raggruppato; EST = estro; DIE = diestro; PRO = proestro; MET = metestro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Raccolte di campioni di cellule sfavorevoli. (A) In queste due immagini, le cellule squamose sono state aspirate dalla parete del canale vaginale, oltre alle LEU disperse casualmente. (B) Questa immagine include una bassa quantità di detriti, in cui le cellule non sono state viste o non sono state raccolte. (C) In questo esempio, è stato osservato un numero totale di cellule basso. (D) In queste due immagini (D1 e D2), la soluzione di estrazione del cloruro di sodio (NaCl) e il liquido vaginale sono stati visti e diffusi in tutti i vetrini del microscopio. Queste cifre, prese con l'ingrandimento 4x (A1, A2 e D1) o 10x (B, C e D2), sono state ingrandite per consentire una maggiore visualizzazione dei componenti di categorizzazione. Barre di scala = 100 μm. Per riferimento dimensionale, le celle AKE hanno un diametro di circa 40-52 μm, le LEU di circa 10 μm, le celle LNE di 36-40 μm e le celle SNE di circa 25-32 μm¹⁶. Abbreviazioni: AKE = epiteliale cheratinizzato anucleato; LEU = leucociti; LNE = grande epitelio nucleato; SNE = piccolo epiteliale nucleato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Campione di pattern ciclico regolare e irregolare. (A) Questa immagine riflette un totale di 16 cicli completi che progrediscono attraverso un modello ripetitivo e coerente, riflettendo l'oscillazione regolare degli ormoni steroidei sessuali. All'interno di questo, il diestro è rappresentato dal più basso, il proestro dal centro e l'estro è rappresentato dalla barra all'altezza più alta. Questi dati vengono analizzati tracciando i giorni tra le fasi dell'estro, con ogni estro a estro che rappresenta un ciclo completo. Questi dati riflettono i dati delle femmine di ratto ospitate presso l'UCLA. (B) Questa immagine rappresenta una combinazione teorica di vari modelli aciclici di 22 ratti. L'estro esteso può essere visto con più giorni ripetitivi di barre a piena altezza, diestro esteso visto con più giorni ripetitivi dell'altezza della barra più bassa e l'assenza del modello ciclico di progressione dal diestro attraverso il mestruso. Abbreviazioni: Est = estro; Diest/Die = diestro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Determinanti di categorizzazione individuali. (A) Questo grafico a barre impilato riflette ogni componente degli strumenti utilizzati per classificare i singoli campioni raccolti nelle fasi estrali del campione. Qui, un soggetto che è stato monitorato per 10 giorni mostra una varietà di tipi di cellule, quantità e disposizioni. Questo è previsto per gli animali adolescenti, poiché i livelli ormonali in genere non diventano coerenti o regolarizzano fino all'età adulta. (B) Qui, viene presentato un profilo estrale per un animale che è stato monitorato per 20 giorni. Irregolarità simili possono essere viste qui, dove il soggetto è rimasto in diestro per 4 giorni contro il tipico 1-2. Questi dati rappresentano le 6 femmine di ratto ospitate alla Pepperdine University. Abbreviazioni: AKE = epiteliale cheratinizzato anucleato; LEU = leucociti; LNE = grande epitelio nucleato; SNE = piccolo epiteliale nucleato; C = raggruppato; ED = uniformemente disperso; RD = disperso casualmente; COM = combinato; SMD = smidge; MOD = moderato; NUM = numerosi; EXE = esercizio ; SED = sedentario; Est = estro; Die = diestro; Pro = proestro; Met = metestro.

Figura 10: Profili di stadio. (A) Questa sezione illustra i dati determinanti di categorizzazione per i singoli ratti durante ogni giorno classificati come diestro. La prima immagine (A1) rappresenta i dati raccolti in 10 giorni e la seconda (A2) per 20 giorni. (B) Questa sezione descrive i dati per i singoli ratti durante ogni giorno classificati come proestro. La prima immagine (B1) rappresenta i dati raccolti in 10 giorni e la seconda (B2) per 20 giorni. (C) Questo rappresenta i dati per i singoli ratti durante ogni giorno identificati come stadio di estro. La prima immagine (C1) rappresenta i dati raccolti in 10 giorni e la seconda (C2) per 20 giorni. (D) Questa sezione della serie illustra i dati dei componenti di categorizzazione per i singoli ratti durante ogni giorno identificato come stadio di metestro. La prima immagine (D1) rappresenta i dati raccolti per un periodo di 10 giorni e la seconda (D2) per 20 giorni. I dati in queste cifre riflettono quello di 6 ratti femmina ospitati presso la Pepperdine University. Abbreviazioni: AKE = epiteliale cheratinizzato anucleato; LEU = leucociti; LNE = grande epitelio nucleato; SNE = piccolo epiteliale nucleato; C = raggruppato; ED = uniformemente disperso; RD = disperso casualmente; COM = combinato; SMD = smidge; MOD = moderato; NUM = numerosi; EXE = esercizio ; SED = sedentario; Est = estro; Die = diestro; Pro = proestro; Met = metestro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

EST: 10 giorni	Durata (giorni)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	END (%)	Conteggio totale delle cellule (%)
EST: 10 giorni	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44.44 NUM: 44.44 SMD: 11.11
Gamme	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge–numerosi
	Disposizione	C: 50 ED: 0 RD: 50	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 50 ED: 0 RD: 50
EST: 20 giorni	Durata (giorni)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	END (%)	Conteggio totale delle cellule (%)
EST: 20 giorni	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 NUM: 50 SMD: 0
Gamme	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge–numerosi
	Disposizione	C: 60 ED: 6,67 RD: 33,33	C: 0 ED: 12,5 RD: 87,5	D: 33,33 ED: 0 RD: 66,67	D: 44,44 ED: 0 RD: 55,56

Tabella 1: Campione determinante medio dello stadio. Queste tabelle illustrano le medie per i determinanti di categorizzazione e la panoramica per tutte le fasi EST raccolte. La tabella superiore riflette le medie per tutti gli animali monitorati per 10 giorni e la tabella inferiore per 20 giorni. Ciò include la durata del ciclo estrale, i tipi e le percentuali di cellule, le disposizioni cellulari e la percentuale di ciascuna disposizione osservata per ciascun tipo di cellula. Questi dati riflettono i dati di 6 ratti femmina ospitati presso la Pepperdine University. Abbreviazioni: AKE = epiteliale cheratinizzato anucleato; LEU = leucociti; LNE = grande epitelio nucleato; SNE = piccolo epiteliale nucleato; C = raggruppato; ED = uniformemente disperso; RD = disperso casualmente; EST = estro.

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Discussion

Passaggi chiave e considerazioni importanti
Alcuni passaggi critici nel protocollo fornito richiedono enfasi, specialmente all'interno della raccolta di cellule vaginali. Durante l'estrazione del liquido vaginale, garantire il corretto angolo e profondità di inserimento della siringa è la chiave per produrre risultati soddisfacenti e, in definitiva, prevenire irritazioni, lesioni o stimolazione cervicale all'animale. La stimolazione della cervice può essere una fonte di induzione della pseudogravidanza, indicata da 12-14 giorni di uno striscio vaginale solo leucocitario¹¹. Durante la fase di valutazione al microscopio, è fondamentale concentrarsi sul piano visivo che mostra le cellule vaginali raccolte. Questo viene completato identificando una o due celle e regolando la visualizzazione fino a raggiungere la messa a fuoco.

Successivamente, l'acquisizione di immagini rappresentative delle cellule vaginali per la stadiazione avviene scansionando l'intero vetrino del microscopio. Ciò garantisce che le immagini catturate riflettano una rappresentazione accurata di ciò che viene raccolto e presente nel canale vaginale degli animali. Prima della categorizzazione, è necessaria la familiarità con i determinanti di categorizzazione, come distinguere i tipi di cellule e le varie trasformazioni che ogni tipo di cellula può possedere. Si raccomanda che ogni partecipante sia adeguatamente formato e pratichi l'identificazione dello stadio attraverso diapositive di pratica prepreparate.

Per ridurre la quantità di pregiudizi e soggettività coinvolti nel processo, si raccomanda di includere due partecipanti nella fase di categorizzazione, entrambi rimanendo ciechi alle assegnazioni del gruppo di trattamento pur conoscendo le identificazioni di stadio precedentemente registrate per ciascun animale. L'assegnazione di due partecipanti per classificare i campioni consente una conferenza e una diminuzione della soggettività nelle identificazioni. Tuttavia, se i partecipanti devono classificare i campioni separatamente, si raccomanda che ci sia un periodo di collaborazione iniziale per aumentare l'affidabilità inter-rater man mano che vengono sviluppate le competenze. Un sistema di esame secondario può essere impiegato per prevenire risultati incoerenti, come lo scambio di set di dati dopo la categorizzazione e l'utilizzo delle foto per confermare le valutazioni iniziali.

Limitazioni e modifiche
I limiti della tecnica attuale includono la durata della redditività. A causa della lesione o dell'irritazione che potrebbe accompagnare l'inserimento ripetitivo di una siringa, il monitoraggio prolungato e ricorrente non è in linea con la cura e l'uso adeguati degli animali. Pertanto, quando si esegue uno studio longitudinale, potrebbe essere necessario modificare la procedura diminuendo la frequenza del lavaggio. Ad esempio, piuttosto che monitorare ogni animale una volta al giorno, i ratti potrebbero essere divisi in gruppi monitorati in giorni diversi durante la settimana. Una seconda limitazione comporta l'assenza di colorazione del campione nel processo delineato, senza separazione dei componenti cellulari per colore, creando una maggiore dipendenza dai determinanti di categorizzazione elencati nel protocollo sopra.

Inoltre, all'interno di tali determinanti di categorizzazione, ci sono elementi di soggettività che potrebbero limitare la replica precisa. In particolare, le percentuali di quantità cellulare all'interno dei campioni raccolti si basano su stime personali. Le modifiche in questo senso potrebbero includere lo sviluppo di un algoritmo matematico per quantificare i singoli tipi di cellule presenti. Modifiche alternative potrebbero includere il numero di campioni depositati su un vetrino del microscopio, che potrebbe essere aumentato a seconda delle dimensioni del vetrino e del coperchio. Ulteriori limitazioni potrebbero includere la mancanza di dati sul fluido vaginale in questo studio: una modifica di studi futuri potrebbe includere la registrazione delle condizioni del fluido vaginale raccolto come contributo alla categorizzazione dello stadio. Ulteriori modifiche del protocollo potrebbero includere l'utilizzo di un altro fluido isotonico per l'estrazione cellulare, che produrrebbe gli stessi risultati, come la soluzione salina¹³ tamponata con fosfato. Infine, quando si applica questa procedura a ratti di età o ceppi diversi, possono essere necessarie modifiche come le tecniche di manipolazione degli animali a causa delle dimensioni corporee o del livello di attività. Ciò può includere il metodo di presa⁶⁹ e i metodi Forelimb Crisscross⁶⁴ per gli adulti e il metodo Di ritenuta a una e due mani⁶⁴ utilizzato per i ratti più giovani.

Metodi alternativi
Rispetto ai metodi alternativi di monitoraggio del ciclo estrale, il lavaggio vaginale è unico per la sua accuratezza, quantità di informazioni prodotte, minima invasività e bassi costi associati. L'esame istologico dell'utero e delle ovaie può essere utilizzato per identificare le fasi del ciclo, ma è più invadente e non consente un monitoraggio continuo. Mentre la misurazione dei livelli di ormoni steroidei sessuali aiuta a monitorare il ciclo estrale, richiede la raccolta di sangue e non consente la caratterizzazione del profilo unico del fluido cellulare o vaginale di ciascun soggetto. Poiché lo sviluppo dei genitali esterni è indirettamente correlato ai livelli di ormoni steroidei sessuali, l'esame dell'apertura vaginale può fornire informazioni sulla maturazione sessuale. Inoltre, la colorazione del tessuto, il livello di umidità, le dimensioni e il gonfiore dell'apertura vaginale sono stati correlati con le fasi del ciclo estrale⁷⁰. Tuttavia, la fisiologia precisa che porta all'apertura del canale vaginale nei ratti deve ancora essere completamente riportata. Recenti pubblicazioni hanno scoperto che questo è solo un marcatore indiretto dello sviluppo riproduttivo e non sempre si allinea con la pubescenza^31,34. L'analisi biochimica dei campioni di urina è economica e facilmente condutbile, ma non consente la specificità e l'affidabilità di altri metodi⁷¹. Pertanto, non è affidabile o valido come esaminare le cellule presenti nel canale vaginale.

Inoltre, la misurazione dell'impedenza elettrica è stata utilizzata per monitorare il ciclo estrale ed è meno irritante fisicamente rispetto al lavaggio liquido. Tuttavia, questo metodo non fornisce tante informazioni sui componenti di categorizzazione. Questo dispositivo è specificamente progettato per ottimizzare i tempi dell'accoppiamento intenzionale, misurando quando i livelli di ormoni steroidei sessuali sono più alti 72,73,74. Inoltre, è stato riportato che questo metodo è efficace per distinguere tra EST e nonEST, ma è limitato nella sua capacità di monitorare il ciclo estrale al di fuori di quel⁷⁵. Nel complesso, questo metodo è stato segnalato per essere inaffidabile, non sempre conveniente, e non è spesso utilizzato in letteratura portando a una mancanza di dati comparabili⁷⁴. Mentre il tampone vaginale è più simile al lavaggio nelle informazioni che fornisce, include un aumentato rischio di irritazione o lesioni in quanto richiede di contattare direttamente il rivestimento del canale vaginale per recuperare le cellule. Infine, mentre la colorazione dei vetrini del microscopio può fornire un contrasto più netto tra i tipi di cellule e consentire la conservazione del campione, è uno sforzo più dispendioso in termini di tempo e denaro rispetto al supporto umido⁵³. Nel complesso, ogni tecnica di monitoraggio ha i suoi limiti e vantaggi, e potrebbe essere utile utilizzare una combinazione di questi metodi per ricevere un esame completo del ciclo estrale del roditore.

Applicazioni
Rimane importante vedere lo studio attuale nel contesto della più ampia comunità scientifica e del pubblico in generale. Questa metodologia può essere utilizzata in qualsiasi progetto che comporti l'esame di animali di sesso femminile, non solo all'interno di studi incentrati sull'allevamento intenzionale, per escludere animali che presentano anomalie e / o la funzione dell'asse ipotalamo-ipofisi-ovaio, ma anche per le principali intuizioni all'interno dei gruppi di trattamento. Più specificamente, questa procedura ha un impatto all'interno di i) studi farmacologici, poiché vari farmaci e sostanze chimiche interrompono o alterano il tratto riproduttivo e il ciclo estrale 11,27,76; ii) studi neurologici, come quelli focalizzati su lesioni cerebrali traumatiche, cognizione o disturbi degenerativi, dovuti alle interazioni tra ormoni steroidei sessuali e il sistema nervoso⁷⁷; iii) ricerca sul sistema circolatorio dovuta ai recettori degli ormoni steroidei sessuali localizzati sui miociti e alle successive interazioni⁷⁷; iv) ricerca relativa alla crescita ossea³⁸; al sistema endocrino^11,78; e v) altri studi non riproduttivi³.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questo studio è stato condotto attraverso una collaborazione finanziata dal NIH tra l'Università della California Los Angeles Brain Injury Research Center (BIRC).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558 Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4

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Biology

Monitoraggio del ciclo estroso dei roditori che utilizza la lavanda vaginale: nessun ciclo normale

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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