Monitoreo del ciclo estral de roedores utilizando lavado vaginal: no hay tal cosa como un ciclo normal

Summary

Este estudio detalla los factores cruciales a considerar en diseños experimentales que involucran ratas hembras. En un sentido más amplio, estos datos sirven para disminuir el estigma y ayudar en el desarrollo de herramientas de diagnóstico e intervención más inclusivas.

Abstract

La metodología actual establece un enfoque reproducible, estandarizado y rentable para monitorear el ciclo estral de las ratas adolescentes hembra Sprague Dawley (SD). Este estudio demuestra la complejidad de los ciclos hormonales y el amplio espectro de comprensión requerido para construir una técnica de monitoreo confiable y válida. A través de un examen en profundidad de los principales elementos de diseño experimental y procedimiento, esta descripción del ciclo y sus principios fundamentales proporciona un marco para una mayor comprensión y deconstruye conceptos erróneos para su futura replicación.

Junto con un esquema del proceso de recolección de muestras que emplea el lavado vaginal, el procedimiento describe el mecanismo de categorización de datos en el modelo de cuatro etapas de proestro, estro, metestro y diestro. Estas etapas se caracterizan por un nuevo enfoque propuesto, utilizando los 4 determinantes de categorización de la condición del fluido vaginal, tipo (s) de célula (s) presente, disposición celular y cantidad de células en el momento de la recolección. Las variaciones de cada etapa, las muestras favorables y desfavorables, la distinción entre ciclicidad y aciclicidad, y las representaciones gráficas de los componentes de categorización recopilados se presentan junto con prácticas interpretativas y organizativas efectivas de los datos. En general, estas herramientas permiten la publicación de rangos de datos cuantificables por primera vez, lo que lleva a la estandarización de los factores de categorización tras la replicación.

Introduction

Contribuciones novedosas
El ciclo estral de roedores ha sido identificado como un indicador esencial de bienestar. Sin embargo, los sesgos inconscientes de los investigadores y las interpretaciones inexactas con respecto al cuerpo femenino obstaculizan a la comunidad científica. La etimología misma de la palabra "estro" implica un sentido de inferioridad y negatividad. Eurípides usó el término para describir un "frenesí" o locura, Homero para describir el pánico y Platón para describir un impulso irracional. Este estudio destaca cómo estas perspectivas primigenias influyen en la comunidad científica actual y aborda estas preocupaciones a través de un nuevo paradigma de mosaico: una combinación actualizada de métodos previamente estudiados, ampliados en alcance para un enfoque más integral.

El estudio y el uso de esta técnica son necesarios, en primer lugar, ya que no existe una técnica de monitoreo estandarizada y completa, y las prácticas de interpretación de datos pueden no estar claras. En segundo lugar, aunque las características del ciclo estral dependen de las ratas individuales que se están estudiando, a menudo se universalizan. En tercer lugar, si bien los ciclos hormonales son procesos rutinarios y beneficiosos, están rodeados de estigmas peligrosos explorados en la sección "Traducción a humanos". Este estudio tiene como objetivo abordar estos tres problemas de tres maneras: (A) describiendo una técnica de monitoreo del ciclo estral en profundidad y aclarando cómo se pueden interpretar los resultados, (B) delineando métodos que mantienen la integridad e individualidad de cada ciclo, y (C) llamando la atención sobre conceptos erróneos que perpetúan prácticas sin fundamento.

Este estudio también es único en su enfoque en ratas adolescentes, un período marcado por cambios cruciales en el desarrollo que arrojan luz sobre diversas manifestaciones conductuales, anatómicas y fisiológicas en la edad adulta¹. La construcción de un diseño experimental estandarizado para monitorear los ciclos hormonales en una población poco investigada mientras se deconstruyen los sesgos comunes permitirá el desarrollo de correlaciones hormonales confiables y válidas ^2,3,4 y la determinación de interrupciones del ciclo dependientes de la condición ^5,6,7,8,9,10 . En última instancia, estas novedades sirven para ampliar los criterios de diagnóstico, tratamientos e intervenciones de diversas preocupaciones de bienestar.

Definiciones y usos fundamentales
El ciclo estral es una colección de procesos fisiológicos dinámicos que ocurren en respuesta a las tres hormonas esteroides sexuales femeninas oscilantes: estradiol, hormona leuteinizante (LH) y progesterona (Figura 1A, B). Las interacciones entre el sistema endocrino y el sistema nervioso central regulan el ciclo, que con mayor frecuencia persiste durante 4-5 días y se repite desde el inicio de la maduración sexual hasta la senescencia reproductiva y / o el cese. Se divide en categorías separadas basadas en los niveles hormonales, más comúnmente en las 4 etapas de diestro (DIE), proestro (PRO), estro (EST) y metestro (MET), que progresan de manera circular. El número de divisiones puede variar de 3 etapas¹¹ a 13 etapas¹², dependiendo de la naturaleza del estudio¹³. El menor número de divisiones a menudo excluye el MET como una etapa y lo clasifica como un período de transición de corta duración. El número más alto generalmente incluye subsecciones que permiten una inspección más cercana de fenómenos como el desarrollo tumoral o el pseudoembarazo espontáneo, el estado fisiológico del embarazo sin implantación embrionaria 12,14,15.

En este estudio, las etapas se identificaron a través de componentes del canal vaginal, llamados los 3 determinantes de categorización: tipo(s) de célula(s) presente(s), disposición celular y cantidad de células (Figura 2A-D). Si bien la condición del fluido vaginal no se monitoreó en este estudio, se recomienda incluirlo como un cuarto componente de categorización. Se puede encontrar más información sobre el examen del fluido vaginal en la lista de^{referencias 16}. Los componentes de categorización se pueden examinar mediante la extracción de células a través del lavado vaginal, la técnica principal recomendada en el monitoreo del ciclo estral moderno. Si bien los procesos fisiológicos en profundidad dentro de cada etapa están fuera del alcance de este estudio, se puede encontrar más información en la literatura¹⁷.

El uso y desarrollo continuo de esta técnica de monitoreo del ciclo estral se basa en las conexiones entre las hormonas esteroides sexuales y la función de los sistemas corporales como el sistema cardiovascular¹⁸, el sistema endocrino⁸ y el sistema nervioso central 19,20,21. Al mismo tiempo, el monitoreo del ciclo estral puede no ser siempre necesario cuando los roedores hembra están involucrados 22,23,24,25. Más bien, es importante considerar primero si se han reportado diferencias de sexo en el área específica de estudio, que pueden explorarse más a fondo en las revisiones publicadas^22,23. Aunque el monitoreo del ciclo estral es vital en un amplio espectro de investigaciones de investigación, no debe verse como un obstáculo para incluir roedores hembra en los experimentos. Si bien esta técnica puede parecer compleja y llevar mucho tiempo, el procedimiento en sí puede tardar menos de 15 minutos en completarse, dependiendo del investigador, y es rentable. En general, la inclusión de roedores hembra en estudios científicos es ventajosa para la comprensión de los sistemas corporales, diversas afecciones y patologías, y el bienestar general, ya que estos desarrollos se han basado principalmente en la plantilla corporal masculina.

Parámetros universales y variabilidades naturales en el roedor
El establecimiento de rangos para aspectos vistos como "típicos" es necesario para definir patrones de ciclo estándar, establecer parámetros con fines comparativos y analíticos, y detectar anomalías y valores atípicos. Al mismo tiempo, también es importante reconocer que el ciclo de cada rata es único, y se esperan desviaciones basadas en la tensión animal, los procesos fisiológicos y las condiciones ambientales. De hecho, uno de los aspectos más "normales" del ciclo estral es la variabilidad. Esto se ve en la duración total del ciclo, con un rango de 3-38 días ^26,27; la edad de maduración sexual que puede variar de 32-34 días a múltiples semanas 28,29,30; lo que se considera acíclico¹¹, y los patrones determinantes de categorización ^11,13. En general, no existe una plantilla universal para el ciclo estral, y traducir eso tanto a la comunidad científica como al público en general es una parte importante del proceso experimental.

Puntos de tiempo experimentales y edad de desarrollo
Reconocer este principio de variabilidad ayuda a construir un diseño experimental confiable y válido. Por ejemplo, el inicio del monitoreo del ciclo estral se basa en el desarrollo anatómico y fisiológico de las ratas, que varía según los factores ambientales y fisiológicos. El monitoreo no puede comenzar hasta el desarrollo de la abertura vaginal (VO), que es el orificio vaginal externo rodeado por la vulva que conduce a la porción interior del canal vaginal (Figura 3A-D). Si bien el VO a menudo se desarrolla completamente entre las edades de 32 y 34 días, permanece individualizado para cada sujeto, y mucho sobre el proceso sigue siendo desconocido. Esta abertura se ha utilizado para identificar el inicio de la maduración sexual, que se ha relacionado con el aumento del estradiol³¹, la maduración del eje hipotalámico-hipofisario-ovárico³² y la primera ovulación en ratas 17,33,34,35. Sin embargo, publicaciones recientes han encontrado que es solo un marcador indirecto del desarrollo reproductivo, ya que puede desacoplarse de las ocurrencias hormonales y de desarrollo en ambientes desfavorables³¹ y puede representar cambios en los niveles de estradiol en lugar de la maduración sexual³³. Por lo tanto, se recomienda no confiar únicamente en el VO para determinar la edad de desarrollo y como calificador para el monitoreo del ciclo estral³⁶, sino también utilizar la aparición de la primera etapa EST y la cornificación de las células epiteliales³⁰ para marcar el inicio de la maduración sexual.

El peso corporal se correlaciona notablemente con la edad de desarrollo durante el período adolescente en roedores^30,37 y, por lo tanto, también puede ayudar a determinar la edad de desarrollo en este período. Los mecanismos propuestos relacionados con este fenómeno incluyen la estimulación de hormonas necesarias para el desarrollo reproductivo, como la hormona del crecimiento, y la inhibición del eje suprarrenal hipotalámico-hipofisario (HPA) por el regulador del apetito, la leptina³⁰. Sin embargo, no se recomienda utilizar esta medida como el único indicador de la edad de desarrollo debido a la gran varianza observada entre las ratas entre las especies y los proveedores de proveedores³⁸. La variabilidad observada en el desarrollo de la VO y el peso corporal ejemplifican la importancia del concepto en el proceso experimental general.

Traducción a humanos: contextos culturales y científicos
La relación traslacional de los estudios reproductivos de animales a humanos es bidireccional. Los resultados de estudios basados en animales influyen en cómo se evalúan, abordan y analizan los procesos humanos³⁹. La percepción del sistema reproductivo humano y sus procesos relacionados influyen en cómo se estudian los animales. De hecho, una de las indicaciones más fuertes para futuras investigaciones en esta área proviene de creencias socioculturales sesgadas relacionadas con los ciclos hormonales que influyen en el proceso científico. Muchas de estas convenciones se derivan de una aversión cultural general a discutir la menstruación, lo que ha llevado a una brecha de datos en el conocimiento bien fundamentado^40,41. Esto tiene un espectro de consecuencias que van desde menores hasta letales, desde la altura de las estanterías y el tamaño del teléfono inteligente hasta el ajuste de la armadura corporal de la policía y los diagnósticos de cáncer perdidos⁴².

La descripción de la menstruación como insalubre, destructiva y tóxica, vista en textos venerados, medios de comunicación, diccionarios y enseñanzas médicas, se conserva en publicaciones científicas. Esto ocurre a través de descripciones inexactas y sesgadas de los ciclos hormonales, el aislamiento del sistema reproductivo de sus contrapartes neuroendocrinas e influencias ambientales, y la perspectiva reduccionista de la finalización de un ciclo como un "fracaso en la concepción"^43,44. Esto conduce a la creación de prácticas experimentales poco sólidas, como la omisión de variables externas que influyen en los ciclos hormonales, la determinación de los inicios y puntos finales basados únicamente en los desarrollos anatómicos y la medición del avance del ciclo de una manera lineal en lugar de circular. A pesar de la correlación directa entre los factores socioculturales y las consecuencias biológicas, a menudo no se considera en la literatura científica. A través de la inspección de publicaciones más holísticas 43,44,45, los investigadores pueden deconstruir estos estigmas y crear diseños experimentales más confiables y válidos.

Protocol

Todos los métodos de manejo y procedimiento descritos en este protocolo se alinean con las pautas de cuidado y uso de animales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pepperdine y el Comité de Investigación Animal (ARC) del Canciller de UCLA.

1. Cuidado y uso de animales

1. Adquirir ratas hembra, en número según el análisis de potencia, y ratas macho para promover el efecto Whitten o ciclos más consistentes⁴⁶. Determinar la cepa en base al objetivo del estudio en bases de datos conocidas⁴⁷.
   NOTA: Los datos actuales reflejan los de las hembras adolescentes del Programa Internacional de Normalización Genética (IGS) SD en presencia de ratas SD macho ubicadas en los laboratorios de la Universidad de Pepperdine y UCLA como parte de un estudio colaborativo. Estas ratas llegaron en grupos separados a los 28 días de edad, y la progresión del ciclo estral se monitoreó durante 10 o 20 días para demostrar diferencias en los niveles agudos y crónicos, comenzando a los 34 días de edad (después de un período de aclimatación de 7 días).
2. Antes de la manipulación, permita una cuarentena y / o un período de aclimatación para la estabilización fisiológica después del transporte y el ajuste al nuevo entorno.
   NOTA: Se ha citado un período mínimo de 3 días, con un período de 7 días recomendado 48,49,50,51,52. En general, esto depende de las condiciones de transporte, la tensión animal y los objetivos del estudio.
3. Asegúrese de que el estrés se reduzca con el uso de un período de aclimatación, ya que el estrés puede interrumpir el funcionamiento adecuado del sistema reproductivo⁵³. Sin embargo, no compense en exceso al intentar eliminarlo, ya que una cantidad moderada de estrés es beneficiosa para el bienestar de los animales⁵¹.
4. Ratas anfitrionas en un ambiente de temperatura (68-79 ° F, es decir, 20-26 ° C) y humedad controlada (30-70%) contactando al vivero o a los gerentes de laboratorio y asegurando estas características. Distribuya agua y chow ad libitum con los componentes nutritivos que figuran en el sitio web de la compañía y la limpieza de jaulas una vez a la semana.
   NOTA: En este estudio, las ratas fueron alojadas en grupos de 2 separados por sexo en jaulas de plástico transparente reutilizables de 19" x 10" x 8" y tuvieron acceso a ropa de cama de mazorca de maíz que se cambiaba una vez a la semana. La temperatura se mantuvo a 70 ° F y la humedad al 35-79%, con un promedio del 62%.
5. Verifique el desarrollo de necrosis isquémica o de cola anular de la cola y los dedos de los pies para detectar evidencia de bajos niveles de humedad relativa y temperaturas extremas, que pueden causar la alternancia de respuestas biológicas.
   NOTA: La temperatura y la humedad son importantes para el sistema reproductivo, la maduración sexual y la ciclicidad estral 54,55,56,57,58.
6. Asegure una iluminación adecuada y equilibrada en todo el espacio de la carcasa depositando cantidades iguales de fuentes de luz en todo el espacio del laboratorio que actúan sobre un sistema de luz:oscuridad controlado por el tiempo.
   NOTA: Aquí, un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h, con luces encendidas de 06:00 a 18:00 h, fue controlado por bombillas LED lineales de 2.550 lúmenes.
7. Siga los requisitos de lux proporcionados⁵² en función de las variaciones de la pigmentación, la edad, la cepa, el sexo y el estado hormonal de los animales.
   NOTA: Cuando los investigadores categorizan las muestras celulares recolectadas, la iluminación consistente permitirá una detección visual adecuada y una estadificación confiable⁵⁹. La duración e intensidad de la luz están directamente relacionadas con el sistema reproductivo, la maduración sexual y el ciclo estral 54,55,56,57,60,61.

2. Preparación de equipos y experimentos

1. Revise los determinantes de categorización (vistos en la Figura 2A): cómo identificar cada etapa del ciclo estral y cómo operar el microscopio y el equipo de la cámara.
2. Asegúrese de que cada sujeto a ser monitoreado haya alcanzado la maduración sexual y muestre indicadores apropiados de desarrollo: VO, peso corporal y edad. Pese las ratas y examínelas en busca de VO entre las mismas horas todos los días para obtener comparaciones precisas y transfiéralas con un método de manejo aprobado. Consulte al veterinario afiliado a la universidad si un animal pierde más del 20% de su peso corporal anterior.
   NOTA: El VO permanece caudal a la abertura uretral y craneal al ano, ubicado entre los dos, como se muestra en la Figura 3.
3. Como estos factores dependen de la tensión, consulte con el proveedor las especificaciones y considere los factores ambientales específicos del laboratorio⁶².
   NOTA: En general, esto ocurrirá entre los 32-34 días de edad y un peso corporal promedio que oscila entre 75-150 gramos⁶³ para ratas SD y está indicado por una abertura de forma circular previamente cubierta por una vaina membranosa.
4. Seleccione un período de recolección de muestras apropiado para el grupo de ratas que se está monitoreando para evitar la recolección de muestras de transición. Primero, muestree algunos animales en 2 o 3 puntos de tiempo diferentes a lo largo del día para determinar el momento en que están presentes la mayoría de las etapas del ciclo (por ejemplo, muestreo a las 12:00 horas, 13:00 horas y 14:00 horas para diferentes animales). Complete el lavado vaginal a la misma hora todos los días para una estadificación consistente y confiable.
   NOTA: Se ha informado que las horas entre las 12:00 y las 14:00 h son las mejores para capturar todas las etapas. En este estudio, el monitoreo del ciclo estral ocurrió entre las 12:00 y las 14:00 h, manejado con la retención de estilo de compresión (ver paso 3.4). La importancia del tiempo de monitoreo del ciclo estral en relación con otras intervenciones experimentales (por ejemplo, acondicionamiento conductual, medicación) es un área de investigación en desarrollo y se puede explorar más a fondo¹¹. La determinación de la duración del monitoreo del ciclo estral depende del estudio y puede explorarse más a fondo en estudios publicados^11,33.
5. Retire la cubierta protectora del microscopio y conecte la cámara a la computadora quitando la cubierta protectora de la lente de la cámara y colocando la lente sobre el ocular del microscopio.
6. Luego, abra el software preseleccionado en la computadora. Para utilizar el software seleccionado en este estudio, seleccione la cámara conectada al USB ubicada en el lado izquierdo de la pantalla, debajo de la pestaña etiquetada Lista de cámaras. Asegúrese de que la cámara USB esté conectada correctamente a la computadora, que leerá Sin dispositivo en la pestaña etiquetada Lista de cámaras, si no es así.
7. Una vez que se haya seleccionado la cámara USB debajo de la pestaña, encienda el interruptor de luz del microscopio ubicado en la base.
8. Cree una carpeta en el equipo designada para las fotos de ejemplo de celda. Cree una carpeta de archivos para cada día separado en que se recopilen los datos, preparados previamente antes de tomar las imágenes.
9. Con el equipo preparado, recupere la jaula del sujeto de su lugar de retención y llévela a la estación de recolección de muestras.

3. Recolección de células vaginales

1. Recupere una jeringa desechable y llene cada una de las jeringas con 0,2 ml de NaCl estéril al 0,9%. Si hay burbujas de aire, mueva suavemente la jeringa del barril hasta que todas las burbujas de aire hayan alcanzado la punta abierta de la jeringa y expulse el aire. Si todavía hay burbujas de aire presentes, expulse la solución de nuevo en el receptáculo de NaCl y vuelva a llenarla hasta que no haya ninguna.
   NOTA: El movimiento excesivo puede resultar en la formación de más burbujas de aire.
2. Devuelva cada jeringa a la envoltura de plástico para mantener un campo estéril, con la punta de la jeringa dentro de la parte sellada de la envoltura.
3. Abra la jaula y levante suavemente al sujeto por la base de la cola o el tronco del cuerpo, cerrando la tapa de la jaula para evitar que otros salgan. Seleccione un método de retención de los que se enumeran a continuación en función de las preferencias personales y la respuesta del animal.
4. Use la sujeción de estilo de compresión para ratas adolescentes colocando al sujeto contra la región superior del pecho, con la nariz del sujeto apuntando hacia el suelo. Antes de comenzar el hisopo, asegúrese de que el sujeto esté lo suficientemente comprimido como para evitar el movimiento, pero que sea cómodo y seguro en la bodega. Exponga el canal vaginal del sujeto flexionando suavemente la cola antes de insertar la jeringa.
5. Use el levantamiento de patas traseras para ratas adultas colocando las patas delanteras del animal en la parte superior o lateral de la jaula, mientras que la cola y las extremidades posteriores se sujetan con una sujeción suave entre el primer y segundo dedo, dejando el pulgar libre para operar la jeringa⁶⁴.
6. Permita que los animales se aclimaten al manejo y monitoreo. Maneje a los animales con suavidad pero de forma segura para reducir el exceso de estrés y proteger al investigador de agresiones como morder.
   NOTA: Los primeros días de monitoreo pueden no producir los resultados deseados a medida que los animales se aclimatan a sus condiciones. El manejo de los animales para recoger el peso corporal durante el período de aclimatación puede ayudar a esta transición³³.
7. Mientras mantiene la jeringa firme con el dedo índice y el dedo medio, inserte la punta de la jeringa (no más de 2 mm) en un ángulo paralelo al canal vaginal. Expulse lentamente el NaCl hacia el canal empujando el émbolo hacia adentro. No inserte la jeringa más en el canal, ya que hacerlo puede interrumpir el ciclo estral.
8. Extraiga el NaCl del canal vaginal tirando del émbolo de la jeringa lejos del revestimiento epitelial (hacia arriba). Si hay dificultad para mantener al sujeto en la bodega durante este proceso, colóquelo de nuevo en la jaula durante un corto período de descanso antes de intentar la extracción de NaCl.
9. Una vez que se haya recolectado la muestra celular, coloque al sujeto de nuevo en la jaula y repita este procedimiento para cada animal antes de que todas las muestras se evalúen bajo el microscopio.
   NOTA: Alternativamente, cada muestra puede ser recolectada y evaluada antes de pasar al siguiente animal. Un animal puede requerir un segundo lavado si la muestra no se puede clasificar. La misma jeringa de la colección inicial se puede reutilizar si no entra en contacto con la solución salina directamente en el recipiente y solo para el mismo animal.

4. Evaluación de la muestra

1. Comience la categorización examinando la muestra de fluido vaginal extraída. Registre la viscosidad como viscosa o no viscosa y la coloración como opaca o transparente en el documento de descripción u otro sistema de registro.
   NOTA: Esta sección del protocolo se puede realizar en el momento de la recolección de muestras o más tarde.
2. Expulse 2-3 gotas del líquido en un portaobjetos de microscopio y coloque un vidrio de cubierta de microscopio en la parte superior del portaobjetos. Coloque el vidrio de la cubierta en el portaobjetos del microscopio desde la parte superior del portaobjetos hasta la parte inferior o de un lado del portaobjetos al otro para evitar la formación de burbujas de aire. Si es posible, deje aproximadamente la mitad de la muestra recolectada en la jeringa si se requiere un examen adicional y para evitar que se coloque una cantidad excesiva de líquido en el portaobjetos.
3. Localice las células recolectadas moviendo el portaobjetos del microscopio a través del escenario. Si hay muy pocas células o una gran cantidad de escombros, expulse el líquido restante a un nuevo portaobjetos y vuelva a examinarlo. Si la cantidad de muestra que queda en la jeringa es insuficiente, o si la segunda gota presenta problemas similares, recoja otra muestra del sujeto antes de intentar identificar la etapa del ciclo estral.
4. Una vez que las celdas hayan sido localizadas y antes de tocar la computadora o el teclado de la computadora, retire el guante para evitar ensuciar el teclado.
5. Adquiera imágenes de las muestras de celdas haciendo clic en la función etiquetada Snap en el lado izquierdo del panel de software.
6. Luego, guarde el archivo haciendo clic en Guardar como debajo del icono Archivo en la esquina superior izquierda de la página. Guarde la foto en una carpeta preetiquetada en la computadora.
   NOTA: Plantilla de etiqueta de ejemplo: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective lente utilizada.
7. Tome más de una foto en cada lente objetivo si no hay muchas celdas dentro de cada marco.
   NOTA: Etiquetas de ejemplo para varias imágenes: #1_01/09/2021_EST_4x1 y #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Repita el procedimiento para cada muestra recolectada bajo lentes de objetivos múltiples. Incluya al menos una objetivación más pequeña, como 4x, y al menos una objetivación más grande, como 20x.
9. Cargue las imágenes en una unidad / carpeta compartida o en un disco duro externo para que todos los investigadores involucrados tengan acceso a los archivos y haya copias de seguridad disponibles.

5. Categorización de etapas

1. Configure la pantalla de la computadora para ver simultáneamente las fotos tomadas y la hoja de grabación (Figura 4A-C).
   NOTA: Esto permitirá que la documentación se produzca mientras se visualiza la muestra recopilada. Esta parte del protocolo se puede completar en el momento de la recolección de muestras o más tarde.
2. Determine qué tipos de celdas están presentes en la muestra. Seleccione entre las cuatro opciones enumeradas en los pasos 5.2.1-5.2.4 utilizando los criterios y registre los hallazgos.
   1. Células epiteliales queratinizadas anucleadas (AKE)/epiteliales cornificadas
      1. Busque células dentadas o de bordes angulares, como se ve en la Figura 2B y la Figura 5C, que a pesar de la falta de núcleos, pueden mostrar áreas redondas ligeras (fantasmas nucleares) dentro de la célula que representan dónde una vez estuvo presente un núcleo. Use un aumento más alto, como 20x y superior, para diferenciar entre tales células nucleadas y anucleadas.
      2. Use un aumento más alto para distinguir la porción queratinizada o cornificada de la célula, una capa delgada de células que carecen de núcleos y llenas de queratina, si lo desea.
         NOTA: Además de su apariencia irregular, estos también se pueden distinguir por cómo pueden plegarse o desmontarse, creando estructuras dentadas y alargadas conocidas como barras de queratina.
   2. Células epiteliales nucleadas grandes (LNE)
      1. Busque estas células típicamente redondas a poligonales encerradas por bordes irregulares, irregulares o angulares.
      2. Observe cómo sus núcleos pueden tomar diversas formas, que van desde intactas hasta degeneradas o picónicas, relacionadas con la condensación irreversible de cromatina en el núcleo de una célula que sufre muerte o deterioro, como se ve en la Figura 2B y la Figura 5D1,2. Tome nota de cómo estos núcleos ocupan menos espacio que el citoplasma dentro de la célula, con una relación nuclear a citoplasmática (N: C) más baja que las células epiteliales pequeñas. Esté atento a los gránulos citoplasmáticos que se pueden ver a aumentos más altos¹³.
   3. Leucocitos (LEU)/neutrófilos/células polimorfonucleares
      1. Busque estas células compactas y esféricas con núcleos multilobulados (por lo tanto, conocidas como células polimorfonucleares), que desaparecen a medida que la célula madura (Figura 2B y Figura 5A). Se puede usar un aumento más alto (por ejemplo, 40x) para observar los núcleos multilobulados.
         NOTA: Tras la recolección y preparación, estas células pueden condensarse, plegarse o romperse.
   4. Células epiteliales nucleadas pequeñas (SNE)
      1. Esté atento a estas células de forma redonda a ovalada que son más grandes que los neutrófilos descritos anteriormente.
      2. Observe los núcleos redondos de estas células epiteliales no queratinizadas (Figura 2B), que ocupan una mayor cantidad de espacio que el citoplasma dentro de la célula, creando una mayor proporción de N: C en relación con las células epiteliales grandes.
         NOTA: Tras la recolección y preparación, estas celdas pueden plegarse o superponerse para crear una forma que se asemeje a una cadena o barra, como se muestra en la Figura 5B1.
3. Examine cómo se organizan las celdas presentes en la muestra para cada objetivación. Utilice la objetivación inferior, como 4x, para ver una vista representativa de la disposición general de las celdas. Registre si las células están agrupadas juntas (C), dispersas uniformemente (ED) o dispersas aleatoriamente (RD) (consulte la Figura 4C), y observe la organización específica de cada tipo de célula (por ejemplo, las células epiteliales nucleadas pequeñas se agrupan y los neutrófilos se distribuyen uniformemente).
4. A continuación, estime visualmente y registre la cantidad total de células (una pizca, moderada, numerosa) y las cantidades de células individuales (porcentaje de cada tipo de célula presente).
   NOTA: Un smidge representa el número más pequeño de celdas presentes que se pueden utilizar para determinar la categorización de la muestra, numeroso representa la presencia de un número incontable de celdas que representan la mayoría, si no todo, del espacio en la diapositiva o están apiladas una encima de la otra, y un número moderado de celdas representa un número comparativamente promedio de celdas (ejemplos vistos en la Figura 5A-D y la Figura 6A-D).
5. Tenga en cuenta si hay alguna desviación de los criterios enumerados o de los aspectos que son típicos para el tema específico en la categoría de "anomalías" y consulte con un veterinario si es necesario.
6. Determine qué etapa del ciclo estral se presenta en la muestra utilizando los componentes de categorización y las descripciones a continuación.
   1. Morir
      1. Busque LEU como el tipo de célula dominante o único presente, dispuesto de manera agrupada al comienzo de DIE pero más disperso en las últimas etapas.
         NOTA: Durante la transición a DIE, la cantidad de células puede disminuir a medida que las células epiteliales comienzan a descomponerse, como se ve en la Figura 6D1. Al mismo tiempo, el número de LEU comienza a aumentar, y tienden a organizarse de manera agrupada inicialmente y dispersarse con el tiempo.
      2. Tenga en cuenta que la cantidad total de células puede ser comparativamente baja, con mayor frecuencia en las últimas etapas del período DIE, en el segundo o tercer día.
      3. Observe la alta cantidad de moco que puede estar presente en esta etapa, que se presenta como hebras concentradas de LEU (Figura 5A1). Esté atento a los pequeños grupos o hebras celulares de células SNE que acompañan a las LEU durante las fases tardías de la transición a PRO (Figura 5A1,2).
      4. Observe la apariencia viscosa y opaca del fluido vaginal cuando se realiza la transición, la transición completa y la transición fuera de DIE.
         NOTA: La duración media de esta etapa es de 48 h durante un ciclo de 4 días y posiblemente de 72 h durante un ciclo de 5 días.
   2. Pro
      1. Busque células SNE como las células dominantes y células LEUs, LNE y / o AKE que se pueden ver en números bajos. Utilice una alta objetivación para observar la apariencia granular de las células SNE que normalmente están dispuestas en grupos, hojas o hebras durante esta etapa (Figura 5B1,2).
      2. Observe la apariencia viscosa y opaca del fluido vaginal al pasar de DIE a PRO, y cómo se vuelve no visual y transparente una vez que pasa completamente a la etapa PRO (duración promedio de 14 h en ratas).
   3. Est
      1. Busque el dominio de las células AKE, una disminución de las células SNE en EST y un aumento en el número y tamaño de las células a medida que EST continúa^11,13.
      2. Tome nota de la característica distintiva de la disposición a menudo agrupada de las células AKE, en forma de barras de queratina o que contienen núcleos fantasmas, que pueden dispersarse más aleatoriamente en la transición de PRO (Figura 6B) a MET (Figura 6C).
      3. Observe el fluido vaginal no visual y transparente característico, que se puede esperar a medida que las ratas están en transición, completamente en transición y fuera de EST.
         NOTA: La progresión de EST incluye mucha diversificación (Figura 5C y Figura 6B, C). La etapa generalmente ocurre durante un promedio de 24 h en un ciclo de 4 días o posiblemente 48 h en un ciclo de 5 días.
   4. Conocido
      1. Busque un mayor número de células SNE y LNE a medida que la rata está haciendo la transición a MET, ya sea dominante en términos de proporción celular dentro del canal o cerca de la misma proporción a las LEU^11,13. Además, tome nota de la mayor cantidad de desechos en MET y las transiciones que en otras etapas debido a la desintegración de las células epiteliales después de EST y pasando a DIE.
      2. Observe la falta de disposición consistente ya que se ven todos los tipos de células y en varias cantidades (Figura 5D1-3). Sin embargo, busque las LEU que están empaquetadas o agrupadas cerca de las células epiteliales en las etapas iniciales que pueden volver a la disposición agrupada cuando se hace la transición a DIE.
      3. Observe la apariencia no visual y transparente del fluido vaginal en esta etapa y el cambio a una apariencia más viscosa y opaca mientras se mueve hacia DIE.
         NOTA: La duración media de esta etapa es de 6-8 h.
7. Etiquete las muestras en transiciones con la etapa hacia la que se mueve el sujeto, con la transición entre paréntesis para rastrear cuándo se recolectan. Se puede encontrar más información sobre cómo distinguir entre estas 4 etapas y sus transiciones en los Resultados Representativos.
   NOTA: Como las muestras recogidas son estáticas y el ciclo es dinámico, las diapositivas pueden representar transiciones entre etapas (véase en la Figura 6A-D).
8. Complete este proceso para cada animal hasta que se complete la fase de monitoreo.
9. En el día 11 (45 días de edad) o 21 (55 días de edad), eutanasiar a las ratas con 5% de isoflurano y 2% de oxígeno antes de una decapitación de guillotina. Estos puntos de tiempo pueden variar dependiendo de la naturaleza del estudio.

Representative Results

Los datos actuales reflejan los de las hembras adolescentes del Programa Internacional de Normalización Genética (IGS) SD en presencia de ratas SD macho. Estos animales fueron localizados en los laboratorios de la Universidad de Pepperdine y ucla como parte de un estudio colaborativo. La Figura 5 presenta múltiples variaciones de las 4 etapas del ciclo. La Figura 5A1 se identificó como una muestra de diestro con varios tipos de células presentes. Este ejemplo demuestra que las muestras con un mayor número de células epiteliales califican como diestro cuando cumplen con las otras calificaciones de componentes de categorización, como un dominio de las IUE. Esta muestra también demostró la disposición de las HEBRAS de moco compuestas por LEU que se ven a menudo en esta etapa, que se asemeja a las hebras que consisten en células SNE observadas en la etapa PRO. Para distinguir una hebra de moco en la etapa DIE de las hebras que aparecen en la etapa PRO compuesta por células SNE, es importante identificar el dominio de las LEU. La Figura 5A2,3 muestra una progresión de la disposición celular que a menudo se observa: una agrupación inicial de las UCI que se recolectan y se mueven a un desembolso aleatorio (RD) o incluso desembolso (ED) en muestras recolectadas en períodos posteriores de la etapa DIE. Específicamente, la Figura 5A2 fue una muestra DIE con numerosas células presentes. Esto refleja cómo las LEU también pueden ir acompañadas de un alto número de células epiteliales (Figura 5A1,2), distinguidas del metestro por una dominancia de las LEU y la ausencia de barras de queratina. En contraste, la Figura 5A3 demuestra que un bajo recuento total de células (una pizca) se observó comúnmente durante la fase posterior de la etapa DIE, como durante el segundo o tercer día. Durante la etapa PRO, las células SNE se organizaron con frecuencia en hebras con numerosas células apiladas una encima de la otra (Figura 5B1) o una pizca de células dispuestas en grupos más pequeños (Figura 5B2). La Figura 5B3 ejemplifica una muestra PRO con la aglomeración característica en forma de hoja de células SNE que se superponen y forman barras que podrían confundirse con las barras de queratina compuestas de células AKE presentes en la etapa EST. Para distinguir los dos, es importante identificar la dominancia de las células SNE en PRO y de las células AKE en EST.

La Figura 5C1,2 demuestra la aglomeración típica y el desembolso aleatorio de células AKE observadas en EST, con la primera incluyendo numerosas células y la segunda un número moderado. Los núcleos fantasmas, las formaciones de barras de queratina y las bacterias que a menudo se recolectan durante esta etapa se ven en estos ejemplos. Las células SNE se representaron a veces durante la etapa EST (Figura 5C1) como restos de la etapa PRO anterior. La etapa EST tardía, cuando las células SNE comienzan a emerger a medida que el sujeto se mueve hacia MET, a menudo se confunde con la etapa PRO. Para distinguir los dos, es importante tener en cuenta el tamaño nuclear. En general, las células nucleadas de PRO tienen una relación N:C más alta. La muestra mostrada en la Figura 5C3 presentó una disposición en forma de hebra de numerosas células AKE que no se consideró una característica de la etapa EST. Esto demuestra que cada animal es único, que pueden ocurrir desviaciones de los criterios y que los determinantes de categorización deben examinarse en combinación.

Para distinguir entre EST y PRO cuando las células SNE están presentes, se observó que se produjo una relación N: C más baja en estas células durante la etapa EST. Para distinguir las barras de queratina presentes en EST de las formadas por la superposición o laminación de células SNE en la etapa PRO (Figura 5B3) y las formadas por células epiteliales en descomposición en la transición de MET (Figura 6D1), es importante identificar el tipo de célula dominante, la disposición y la cantidad para distinguir la etapa que se representa. Por último, la Figura 5D1,2 ejemplifica la combinación de todos los tipos de células presentes en el desembolso aleatorio que representa la etapa MET. Además de las numerosas células presentes en estos ejemplos, fue común recolectar una mayor cantidad de desechos durante esta etapa (Figura 5D2) debido a la descomposición de las células epiteliales después de EST y la transición a DIE con un dominio de LEU que funcionan para limpiar el canal vaginal de las células epiteliales. La Figura 5D2 también muestra cómo met se puede distinguir de DIE por su mayor concentración de células epiteliales y la presencia de barras de queratina. En general, estas representaciones representan el amplio espectro que existe dentro de cada etapa y no son exhaustivas.

Las representaciones de las 4 fases de transición se muestran en la Figura 6. Si bien este estudio clasificó las muestras en transición como una de las 4 etapas del ciclo estral, sigue siendo importante identificar las fases de transición correctamente. En la transición de DIE a PRO (Figura 6A), a menudo hubo una disminución general en el número de UCI y un aumento en el número de células SNE. Las células LNE y AKE estuvieron a veces presentes en esta transición, aunque no en grandes cantidades (Figura 6A1). La Figura 6A2-4 muestra el mayor número de células SNE agrupadas y dispersadas aleatoriamente que a menudo se recolectaron durante esta transición, con un bajo número de LEU dispersadas aleatoria y uniformemente. En general, al distinguir de otras etapas de transición, fue importante tener en cuenta el predominio de las células SNE y el comienzo de grupos y formaciones de hebras observadas en PRO. Todos los ejemplos de la Figura 6A representan un recuento de numerosas celdas, excepto la Figura 6A4, con una pizca. En la Figura 6B, la imagen muestra un ejemplo de numerosas células SNE y AKE agrupadas que se ven en la transición de PRO a EST.

Durante esta transición, se observa que las células SNE están en mayor número con menos aglomerados y más desembolsos aleatorios de células AKE que durante EST. La Figura 6C muestra la aparición de AKE, SNE y LNE y la disminución de células AKE en la transición de EST a MET con un alto número de células. Los desechos presentes representan las células AKE en descomposición de la etapa de estro anterior que a menudo se ven en el meteestro. Esto también se ve en la etapa final de transición, de MET a DIE, donde las células epiteliales comenzaron a descomponerse y producir desechos (Figura 6D1,2), con numerosas células presentes en la primera y un número moderado en la segunda. Estas cifras muestran el fenómeno de los LEU que aumentan en número para convertirse en el tipo de célula dominante en la transición al diestro. Para el grupo monitoreado durante 20 días (n = 3), hubo 12 días cuando se recolectaron muestras de transición, con un promedio de 4. Para el grupo monitoreado durante 10 días (n = 3), hubo 9 días en que se recolectaron muestras de transición, con un promedio de 3.

La Figura 7 representa colecciones de muestras celulares desfavorables, la mayoría de las cuales justificaron lavados repetidos. La Figura 7A1 muestra una masa de células escamosas recolectadas debido a una inserción y extracción inadecuada de la jeringa, lo que hace que las células escamosas se succionen de la pared del canal vaginal. Estas células se pueden distinguir de las células epiteliales agrupadas o LEU debido a la alta densidad y compacidad de la masa y sus bordes distintivos. La Figura 7B representa una colección de escombros, donde no se extrajeron células, el plano de enfoque es incorrecto o la diapositiva no se escaneó completamente en busca de celdas. Los desechos se pueden distinguir de las células a través de la familiaridad con los tipos de células y el tamaño pequeño y la aglomeración a menudo distintivos. Estos desechos a menudo provienen de la ropa de cama de los animales, el pelo o la descomposición celular. La figura 7C muestra una diapositiva que contiene un recuento de celdas que está por debajo de un poco. Si bien los recuentos bajos de células se observaron comúnmente durante el MET tardío y el DIE temprano, esto representa diapositivas que tienen muy pocas células para categorizar con precisión en una etapa.

La Figura 7D muestra dos ejemplos de la solución de extracción de NaCl combinada con líquido vaginal del canal en el portaobjetos del microscopio. En la primera imagen, figura 7D1, el fluido estaba presente y desenfocado, obstruyendo la capacidad de categorizar con precisión. En la Figura 7D2, el fluido se extendió a través de la diapositiva en círculos cohesivos junto a las LEU. Si bien este ejemplo no requiere un lavado repetido debido a la alta presencia celular, es importante considerar la cantidad de líquido colocado en el portaobjetos y la colocación del portaobjetos de la cubierta del microscopio para evitar frotis. En general, estas imágenes enfatizan la importancia de capturar imágenes representativas de calidad para una categorización adecuada. Esto incluye considerar la forma de extracción celular, el plano de enfoque y el contenido de la imagen escaneando cada diapositiva antes de capturar una imagen.

Después de categorizar a cada animal en el grupo (s) experimental (s), es común graficar las progresiones de etapa en un gráfico de barras o líneas. Esto permite a los investigadores examinar el patrón general del ciclo e identificar cuándo el animal presenta una progresión irregular de las etapas estrales, conocida como aciclicidad. Las muestras se pueden analizar por la duración del ciclo y el patrón de progresión de etapa en esta herramienta de análisis. Mostrado en la Figura 8A, B, este concepto incluye la asignación de barras de diferentes alturas, en el caso de este estudio, a las etapas individuales y la traducción de los datos registrados (Figura 4B) a través del eje x. En estos ejemplos, MET y DIE están representados por el más bajo, PRO por el medio y EST por las alturas de barra más altas. Debido a la corta duración de la etapa MET, se combina con la etapa DIE en una barra. Aunque existen diferentes métodos para medir la finalización del ciclo, es común contar un ciclo completo como el movimiento de un EST a otro¹¹. Sin embargo, esto no refleja la finalización de un ciclo, sino una duración de la etapa EST de 2 días cuando hay etapas EST consecutivas.

La Figura 8A refleja los datos de una rata que progresa a través de una progresión consistente y repetitiva a través de MET / DIE, PRO y EST. Además, esta rata se encontraba dentro del rango de ciclos de 4 a 5 días a una longitud promedio de 4.375. Cada etapa no excede los rangos estandarizados de longitud, con un promedio de 1.0625 días pasados en EST, una evaluación típica de la aciclicidad. Si los datos extraídos siguen este patrón de EST a EST con regularidad, esto confirma no solo que los niveles hormonales del sujeto se mantuvieron dentro de rangos aceptables, sino también que el procedimiento se realizó sin interrumpir significativamente la naturaleza cíclica del proceso. Por último, esta rata completó 16 ciclos, determinados contando el número de barras EST a EST.

La Figura 8B representa los tipos comunes de aciclicidad, incluidas las etapas extendidas (vistas como EXT) y no registradas. Esta figura también destaca la importancia de examinar tanto el patrón de ciclo como la duración y el número de días pasados en cada etapa. Específicamente, en este ejemplo, mientras que la duración promedio del ciclo y el número de días en EST caen dentro de los parámetros descritos, el patrón de ciclo de progresión de la etapa reveló anomalías. Por lo tanto, es importante examinar el ciclo estral de manera exhaustiva. Tanto las etapas extendidas DIE (etiquetadas como Ext Diest) como EST (etiquetadas como Ext Est) se registraron a lo largo de los ciclos que se muestran en la figura, y hubo múltiples ciclos en los que la etapa PRO no se registró. Este ejemplo también demuestra la importancia de examinar el número de etapas consecutivas observadas, que caen fuera de los rangos típicos, en lugar de examinar únicamente la duración promedio del ciclo y los días en EST, que caen dentro de los rangos típicos.

Las causas y correlaciones de estos ejemplos pueden incluir factores tales como anomalías fisiológicas (tumores, pseudoembarazo, estrés prolongado), condiciones ambientales dañinas (iluminación prolongada, exposición a productos químicos tóxicos, alojamiento solitario), tiempo inadecuado de recolección de muestras, error del investigador (recolección deficiente de muestras, captura de imágenes, estadificación inadecuada), fenómenos relacionados con la edad (irregularidad común observada en la adolescencia y la senescencia reproductiva) o desviaciones únicas para el específico animal. Para separar el error del investigador o el momento inadecuado de la recolección de muestras y las anomalías físicas o los fenómenos relacionados con la edad, es útil examinar los 4 componentes de categorización con mayor detalle. Esto puede ayudar a determinar las posibles causas de las irregularidades o, en un sentido más amplio, podría utilizarse en estudios que están estudiando las características del ciclo estral más de cerca.

La Figura 9 ilustra esta inspección más cercana al incluir cantidades de celdas totales e individuales en el eje Y, tipos de celdas representados por diferentes colores de relleno de barras y arreglos de celdas representados por diferentes patrones de relleno de barras, graficados a lo largo del período de monitoreo total. Este método de análisis permitió el examen del número total de ciclos completados, la duración de cada ciclo, la progresión de la etapa y los componentes de categorización con mayor detalle para cada rata individual. La Figura 9A representa una rata que tuvo un número de ciclos inferior al promedio, con un total de 3 ciclos completos en los 10 días monitoreados: dos ciclos de 3 días y un ciclo de 5 días (promedio de 3.67). La irregularidad observada en la progresión de la etapa con el 50% de los días incluyó una o más etapas no registradas y el 30% de las muestras recolectadas estaban en transición: el día 2 como MET-DIE, el día 5 como EST-MET y el día 8 como transición PRO-DIE. Esto podría haberse debido al momento inadecuado de la recolección de muestras, un error del investigador, un fenómeno relacionado con la edad o desviaciones únicas. Un seguimiento más detallado podría haber aclarado cuál se aplicaba.

Los arreglos dominantes típicos, los tipos de células y las cantidades de células individuales y totales se observaron dentro de cada una de las etapas registradas. Dentro de las etapas EST, se observó una pizca (25% de las muestras), moderada (25% de las muestras) y numerosa (50% de las muestras) células AKE agrupadas, con una menor presencia de LEU, SNE y células LNE. En la etapa de MET capturada, una combinación de numerosas LEU dispersadas aleatoriamente (50%), células AKE (20%), LNE (15%) y SNE (15%) células estaban presentes. Para las etapas de DIE, se observó una cantidad de smidge (50% de las muestras) y numerosa (50% de las muestras) de células dispersas al azar, dispersas uniformemente y una combinación de UEL dominantes intercaladas con células AKE, LNE y SNE. En la etapa PRO recolectada, una pizca de LEU dispersadas aleatoriamente (60% de las células presentes) y células SNE (40% de las células presentes), que estaban en una combinación de arreglos, estaban presentes, lo que representa una transición de DIE a PRO.

En la Figura 9B, la rata representada tuvo un total de 3 ciclos completos, con un patrón de ciclo de 4 días. Las muestras recogidas no representaron una progresión de etapa consistente, con un período DIE extendido (días 6-9) y otros 5 casos de etapas no registradas (2 etapas MET no registradas, 2 etapas PRO no registradas y 1 etapa EST no registrada). Como solo el 20% de las muestras estaban en transición (día 3 como DIE-PRO, día 5 como EST-MET, día 18 como MET-DIE y día 19 como DIE-PRO), y solo 3 etapas no se registraron fuera de la etapa MET y el período DIE prolongado, se concluyó que el momento de la recolección de muestras era apropiado para este animal específico. Como los últimos 10 días monitoreados incluyeron una progresión ordenada a través de las 4 etapas, las irregularidades iniciales podrían atribuirse a la edad adolescente. Cuanto mayor fue la duración del monitoreo (20 días) permitió que se produjera esta conclusión.

El examen de los componentes de categorización reveló rangos típicos. Las etapas EST reflejaron una dominancia de una cantidad moderada (50% de las muestras) a una cantidad numerosa (50% de las muestras) de células AKE agrupadas con menos células LEUs, SNE y LNE. En las muestras de MET recogidas, hubo una combinación de un MODERADO (33,33% de las muestras) a numeroso (66,67% de las muestras) dispersos aleatoriamente y agrupados LEUs (con un rango de cantidad de 10-90%), SNE agrupado (0-30%), LNE dispersada aleatoriamente (0-10%) y células AKE agrupadas y dispersadas aleatoriamente (10-90%). Las etapas DIE reflejaron una dominancia de una cantidad moderada (20%) a numerosa (80% de muestras) de LEU dispersadas uniformemente, dispersas aleatoriamente y agrupadas (rango de 50-100%) en presencia de células AKE y SNE dispersas aleatoriamente. Las etapas pro se identificaron por la dominancia de una pizca (3,33% de las muestras) y numerosa (66,67% de las muestras) cantidad de células SNE dispersas y agrupadas al azar (10-99%) en presencia de CÉLULAS LEU, AKE y LNE.

Otra opción al analizar los datos extraídos es la creación de perfiles de ciclos estrales mediante la inclusión de los elementos descritos anteriormente: cantidades de celdas totales e individuales en el eje y, tipos de celdas representados por diferentes colores de relleno de barras y arreglos de celdas representados por diferentes patrones de relleno de barras, graficados a lo largo del período de monitoreo total para cada etapa del ciclo. Esto se puede completar por rata o promedios de todo el grupo. El propósito de esta herramienta de análisis es examinar las tendencias de los componentes de categorización por etapa, lo que ayuda a la comunidad científica en general a caracterizar las distinciones de componentes de categorización específicas de las categorizaciones de la etapa del ciclo estral. En la Figura 10A1, el perfil DIE de 10 días mostró una dominancia de una cantidad moderada (50% de las muestras) y numerosa (50% de las muestras) de LEU uniformemente dispersas (promedio de 78.25%) junto con menos células SNE, AKE y LNE. En la Figura 10A2, el perfil de diestro de 20 días mostró una dominancia de una cantidad moderada (20% de las muestras) y numerosa (80% de las muestras) de LEU uniformemente dispersas, agrupadas y dispersadas aleatoriamente (promedio del 82% como presente en los 10 días) junto con un menor número de células AKE y SNE.

La etapa PRO exhibida en la Figura 10B1 mostró una dominancia de un número moderado de células SNE dispersadas aleatoriamente (60%) en presencia de LEU y células AKE. El perfil de etapa PRO de 20 días en la Figura 10B2 mostró una dominancia de una smidge (33,33% de las muestras) y una cantidad numerosa (66,67% de las muestras) de una combinación de arreglos y SNE dispersada aleatoriamente (promedio de 66,33% como presente en las 3 muestras) células junto con LEU y células AKE. El perfil EST de 10 días visto en la Figura 10C1 mostró una dominancia de una cantidad moderada (50% de las muestras) o numerosa (50% de las muestras) de células AKE (promedio del 80% durante los 2 días presentes) en una combinación de arreglos, junto con un menor número de CÉLULAS LEU, SNE y LNE. En la Figura 10C2, el perfil EST de 20 días mostró una dominancia de células moderadas (75% de las muestras) o numerosas (15% de las muestras) de células AKE dispersas aleatoriamente (promedio de 57,5% para los 4 días presentes) o aquellas en una combinación de arreglos, junto con un menor número de CÉLULAS LEU, SNE y LNE.

El perfil de etapa MET de 10 días en la Figura 10D1 incluyó numerosas LEU dispersadas aleatoriamente (50%), células AKE (20%) y células SNE (30%). El perfil de estadio MET de 20 días en la Figura 10D2 mostró una cantidad moderada (3,33% de las muestras) o numerosa (6,667% de las muestras) de LEU (promedio del 50% en las 3 muestras), SNE (promedio del 15% como presente en las 3 muestras), células AKE (con 23,33% en las 3 muestras presentes), células LNE (promedio del 15% en las 2 muestras presentes). La mitad de las LEU se dispersaron aleatoriamente (1 muestra) y el 50% restante fue una combinación de arreglos (1 muestra). Dos tercios de las células SNE se dispersaron aleatoriamente cuando estaban presentes, mientras que el 33,33% restante estaba en una combinación de arreglos cuando estaban presentes (1 de 3 muestras). Por último, el 66,67% de las células AKE se agruparon en las muestras presentes (2 días), mientras que el 33,33% restante se agrupó en una combinación de arreglos (1 día). La Tabla 1 incluye los promedios numéricos de los determinantes de categorización de los dos grupos. Si bien los datos de la Figura 9A, B y la Figura 10A-D incluyen información sobre los determinantes de categorización de animales individuales, estas tablas incluyen promedios para la etapa de estro como ejemplo. Cuando se reproducen en otros laboratorios, estos parámetros podrían convertirse en el estándar para la identificación de etapas. Esto, a su vez, podría disminuir el nivel de subjetividad actualmente involucrado en el proceso de estadificación.

Estadística
En general, hay algunos parámetros a considerar al interpretar las características del ciclo, aunque hay una falta de consenso sobre lo que se considera "anormal", y las desviaciones son típicas. Goldman et al. identifican "regular" como un ciclo de 4-5 días con 24-48 h EST y 48-72 h DIE etapas¹¹. La divergencia de estos parámetros podría deberse a varios factores, incluidas una o más anomalías fisiológicas, un momento de recolección inadecuado o la aciclicidad inicial que a menudo experimentan las ratas adolescentes a medida que maduran los niveles hormonales. Además de consultar al veterinario de laboratorio, habilitar un período de recolección de prueba para garantizar el momento adecuado y monitorear a los animales más allá de la adolescencia para establecer un cronograma comparativo, los análisis estadísticos pueden ser útiles para atribuir la causalidad y / o correlación a cualquier anomalía. Después de caracterizar los ciclos en categorías (por ejemplo, consistentes y anormales), un análisis de chi cuadrado puede ayudar a comparar los grupos. Además, los componentes de categorización o las características generales del ciclo se pueden comparar después de la intervención mediante el análisis de varianza (ANOVA)¹¹. Sin embargo, tales desviaciones pueden no ser biológicamente significativas, como se discutió en la introducción, y por lo tanto se debe considerar el contexto experimental.

Figura 1: Ritmicidad hormonal en las etapas del ciclo estral. (A) Se describen y resumen los diferentes niveles de hormonas esteroides sexuales durante las etapas prominentes del ciclo estral. La progresión de la etapa comienza y termina con el metestro para demostrar los niveles de la hormona de construcción y la progresión circular del proceso. Adaptado de una fuente externa¹¹. (B) Flujo de hormonas esteroides sexuales desde el sistema nervioso central al sistema reproductivo a través del torrente sanguíneo. Se observa que los niveles hormonales aumentan a través de señales del hipotálamo y la glándula pituitaria a través de la hormona liberadora de gonadotropina (GrH o LHRH) y la combinación de la hormona estimulante del folículo y la hormona luteinizante, respectivamente. Esto incluye bucles de retroalimentación positiva y negativa dependiendo de la concentración de estradiol y progesterona. Información¹⁷ e imágenes trazadas de fuentes externas 65,66,67. Abreviatura: LHRH = hormona liberadora de hormona luteinizante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ciclo estral categorizando los determinantes medidos. (A) Aquí se enumeran los componentes utilizados al estadificar las muestras celulares recolectadas y los componentes dominantes para cada etapa. Es importante recordar que estos son parámetros generales y se esperan diferencias. (B) Aquí están los tipos de células dominantes presentes en cada etapa. Si bien estas son divisiones generales, cada tipo de célula se puede encontrar dentro de todas las etapas. (C) Aquí se presentan los tipos de disposición celular encontrados en este estudio. (D) La imagen aquí refleja las cantidades típicas de células presentes en cada una de las 4 etapas del ciclo estral, con el volumen del cuadrante representando las cantidades aproximadas de células. Procedente de una fuente externa¹³ y previamente adaptado⁶⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Abertura vaginal en ratas Sprague Dawley. (A) Orientación anatómica de los genitales externos no desarrollados y la abertura vaginal que conducen al canal vaginal en relación con la abertura uretral. (B) Representación visual del área no desarrollada, marcada por una flecha. (C) Orientación anatómica de los genitales externos desarrollados y el orificio vaginal en relación con la abertura uretral, que generalmente ocurre alrededor de los 34 días de edad. D) Representación visual correspondiente de la zona desarrollada esbozada en la imagen A. Todas las cifras proceden de una fuente externa²⁹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Categorización de la plantilla de registro de datos determinantes. (A) Una opción para el registro de datos; incluye descripciones de los determinantes de categorización. Esto se debe usar diariamente, uno por cada rata monitoreada. (B) Esta plantilla es una opción para la entrada de datos, con un registro simplificado de los determinantes de categorización y la identificación de ratas. Esto permite que las notas se introduzcan en la hoja de datos en la segunda categorización PRO. El color de la fila superior refleja el color asignado al grupo experimental representado, lo que ayuda a distinguir un grupo de otro. C) Otra opción de plantilla; incluye todos los determinantes de categorización y puede modificarse en función de las preferencias personales o los objetivos del estudio. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizado anucleado; LEU = leucocitos; LNE = epitelio nucleado grande; SNE = epitelio nucleado pequeño; C = agrupado; DE = uniformemente disperso; RD = disperso aleatoriamente; COM = combinado; SMD = smidge; MOD = moderado; NUM = numeroso; EXE = ejercicio; SED = sedentario; Est = estro; Morir = diestro; met-die = transición metestro-diestro; Pro = proestro; pro-Est = transición proestro-estro; ** = ejemplo de calidad que podría ser útil en una publicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Variaciones determinantes de categorización por etapas. (A) Esta serie de imágenes muestra varios ejemplos de la etapa de diestro. La primera imagen (A1) representa un depósito de moco representado por hebras de LEU concentrados, con células epiteliales presentes en desembolsos aleatorios. Este es un ejemplo de la importancia de utilizar el aumento de 4x y 10x. Este aumento de 4x parece similar a una hebra de proestro, pero tras una inspección más cercana a 10x, muestra un dominio de las LEU. La segunda imagen (A2) representa lo que a menudo se veía en las etapas de diestro: un dominio de los UCI visto junto con una disposición agrupada de células epiteliales: células SNE, LNE y AKE. La última imagen de esta serie (A3) refleja un desembolso aleatorio de LEU, a menudo visto dentro de la fase de diestro en medio de gotitas de líquido vaginal y salino. (B) Esta serie de imágenes representa varios ejemplos de la etapa proestro. La primera imagen (B1) muestra una disposición aglutinante de células SNE en hebras. La segunda imagen (B2) refleja una diapositiva con un recuento total de células más bajo y una agrupación de células SNE. La tercera imagen (B3) muestra la aglomeración común y el desembolso más aleatorio de células SNE y un bajo número de LEU y células AKE. (C) Esta serie de imágenes representa varios ejemplos de la etapa de estro. La primera imagen (C1) muestra una disposición aglutinante común de células AKE, con formaciones de barras de queratina, en presencia de células SNE. La segunda imagen (C2) presenta la aglomeración de células AKE con núcleos fantasma y bacterias. La última imagen (C3) presenta una disposición en forma de hebra de células AKE. (D) Esta serie de imágenes representa varios ejemplos de la etapa metestrus. La primera imagen (D1) muestra el desembolso aleatorio y la agrupación de LEU, células SNE, células AKE y células LNE en presencia de escombros. La segunda imagen (D2) refleja todos los tipos de células presentes en una disposición aglutinante, junto con las barras de queratina. La última imagen (D3) muestra una disposición más completa de las células LEUs, SNE, AKE y LNE presentes. Estas cifras, tomadas en la objetivación 4x (A1, A2, B2, B3, D1 y D3) o 10x (A3, C1, C2, C3 y D2), se han ampliado para permitir una mayor visualización de los componentes de categorización. Barras de escala = 100 μm. Para referencia de tamaño; Las células AKE tienen un diámetro de aproximadamente 40-52 μm, las LEU de aproximadamente 10 μm, las células LNE de 36-40 μm y las células SNE de aproximadamente 25-32 μm¹⁶. Abreviaturas: SNE = epitelio nucleado pequeño; LNE = epitelio nucleado grande; AKE = epitelial queratinizado anucleado; LEUs = leucocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Muestras de etapas de transición. (A) Esta serie de imágenes muestra ejemplos de la transición entre las etapas DIE y PRO. La primera imagen (A1) presenta grandes grupos y desembolso aleatorio de células LEUs, SNE, LNE y AKE. La segunda imagen (A2) incluye una gran masa de LEU agrupados y SNE con hebras intercaladas de LEU. La tercera imagen (A3) incluye grupos e incluso desembolsos de LEU y una pequeña cantidad de SNE. La cuarta y última imagen (A4) muestra células SNE y LEU tanto agrupadas como aleatoriamente desembolsadas. (B) Esta imagen muestra un ejemplo de la transición entre las etapas PRO y EST con la agrupación de células SNE y AKE. (C) Esta imagen representa el aglutinamiento y el desembolso aleatorio de células AKE, SNE y LNE que se ven en medio de los escombros para representar la transición de EST a MET. (D) La primera imagen (D1) muestra un ejemplo de la transición entre las etapas MET y DIE, con células epiteliales en descomposición que acompañan un aumento de las LU. La segunda imagen (D2) representa células AKE en presencia de LEU agrupadas y células SNE descritas anteriormente. Estas cifras, tomadas en el aumento de 4x (A1, A2, A3, B y C) o 10x (A4, D1 y D2), se han ampliado para permitir una mayor visualización de los componentes de categorización. Barras de escala = 100 m. Para referencia de tamaño, las células AKE tienen un diámetro de aproximadamente 40-52 μm, las LEU de aproximadamente 10 μm, las células LNE de 36-40 μm y las células SNE de aproximadamente 25-32 μm¹⁶. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizado anucleado; LEUs = leucocitos; LNE = epitelio nucleado grande; SNE = epitelio nucleado pequeño; C = agrupado; EST = estro; DIE = diestro; PRO = proestro; MET = metestro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Colecciones de muestras celulares desfavorables. (A) En estas dos imágenes, las células escamosas fueron succionadas de la pared del canal vaginal, además de las LEU dispersadas aleatoriamente. (B) Esta imagen incluye una baja cantidad de escombros, donde las células no fueron vistas o no recogidas. (C) En este ejemplo, se observó un recuento total de células bajas. (D) En estas dos imágenes (D1 y D2), se observó la solución de extracción de cloruro de sodio (NaCl) y el fluido vaginal y se extendieron por los portaobjetos del microscopio. Estas cifras, tomadas en el aumento de 4x (A1, A2 y D1) o 10x (B, C y D2), se han ampliado para permitir una mayor visualización de los componentes de categorización. Barras de escala = 100 μm. Para referencia de tamaño, las células AKE tienen un diámetro de aproximadamente 40-52 μm, las LEU de aproximadamente 10 μm, las células LNE de 36-40 μm y las células SNE de aproximadamente 25-32 μm¹⁶. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizado anucleado; LEUs = leucocitos; LNE = epitelio nucleado grande; SNE = epitelio nucleado pequeño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Muestra de patrón de ciclo regular e irregular. (A) Esta imagen refleja un total de 16 ciclos completos que progresan a través de un patrón repetitivo y consistente, reflejando la oscilación regular de las hormonas esteroides sexuales. Dentro de esto, el diestro está representado por el más bajo, el proestro por el medio, y el estro está representado por la barra a la altura más alta. Estos datos se analizan mediante el seguimiento de los días entre las etapas de estro, y cada estro a estro representa un ciclo completo. Estos datos reflejan datos de las ratas hembra alojadas en UCLA. (B) Esta imagen representa una combinación teórica de varios patrones acíclicos de 22 ratas. El estro extendido se puede ver con múltiples días repetitivos de barras a toda altura, diestro extendido visto con múltiples días repetitivos de la altura de barra más baja y la ausencia del patrón cíclico de progresión desde diestro hasta metestro. Abreviaturas: Est = estro; Diest/Die = diestro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Determinantes de categorización individuales. (A) Este gráfico de barras apiladas refleja cada componente de las herramientas utilizadas para clasificar muestras individuales recolectadas en las etapas de muestra estral. Aquí, un sujeto que fue monitoreado durante 10 días muestra una variedad de tipos de células, cantidades y arreglos. Esto se espera para los animales adolescentes, ya que los niveles hormonales generalmente no se vuelven consistentes o regularizan hasta la edad adulta. (B) Aquí, se presenta un perfil estral para un animal que fue monitoreado durante 20 días. Irregularidades similares se pueden ver aquí, donde el sujeto permaneció en diestro durante 4 días frente al típico 1-2. Estos datos representan las 6 ratas hembra alojadas en la Universidad de Pepperdine. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizado anucleado; LEU = leucocitos; LNE = epitelio nucleado grande; SNE = epitelio nucleado pequeño; C = agrupado; DE = uniformemente disperso; RD = disperso aleatoriamente; COM = combinado; SMD = smidge; MOD = moderado; NUM = numeroso; EXE = ejercicio ; SED = sedentario; Est = estro; Morir = diestro; Pro = proestro; Met = metestro.

Figura 10: Perfiles de etapa. (A) Esta sección muestra los datos determinantes de categorización para ratas individuales durante cada día categorizadas como diestro. La primera imagen (A1) representa los datos recopilados durante 10 días y la segunda (A2) durante 20 días. (B) Esta sección muestra datos de ratas individuales durante todos los días categorizados como proestro. La primera imagen (B1) representa los datos recopilados durante 10 días y la segunda (B2) durante 20 días. (C) Esto representa datos de ratas individuales durante todos los días identificadas como etapa de estro. La primera imagen (C1) representa los datos recopilados durante 10 días y la segunda (C2) durante 20 días. (D) Esta sección de la serie muestra los datos de componentes de categorización para ratas individuales durante todos los días identificadas como etapa de metestro. La primera imagen (D1) representa los datos recopilados durante un período de 10 días y la segunda (D2) durante 20 días. Los datos en estas cifras reflejan los de 6 ratas hembra alojadas en la Universidad de Pepperdine. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizado anucleado; LEU = leucocitos; LNE = epitelio nucleado grande; SNE = epitelio nucleado pequeño; C = agrupado; DE = uniformemente disperso; RD = disperso aleatoriamente; COM = combinado; SMD = smidge; MOD = moderado; NUM = numeroso; EXE = ejercicio ; SED = sedentario; Est = estro; Morir = diestro; Pro = proestro; Met = metestro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

EST: 10 días	Duración (días)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	SNE (%)	Recuento total de células (%)
	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44.44 NUM: 44.44 SMD: 11.11
Gamas	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge–numeroso
	Arreglo	C: 50 DE: 0 RD: 50	C: 0 DE: 0 RD: 100	C: 0 DE: 0 RD: 100	C: 50 DE: 0 RD: 50
EST: 20 días	Duración (días)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	SNE (%)	Recuento total de células (%)
	4	71.92	5.5	2.92	19.67	MOD: 50 NUM: 50 SMD: 0
Gamas	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge–numeroso
	Arreglo	C: 60 DE: 6.67 RD: 33.33	C: 0 DE: 12.5 RD: 87,5	C: 33.33 DE: 0 RD: 66,67	C: 44,44 DE: 0 RD: 55,56

Tabla 1: Muestra determinante de estadio medio. Estas tablas representan los promedios para los determinantes de categorización y la visión general para todas las etapas est recopiladas. La tabla superior refleja los promedios de todos los animales monitoreados durante 10 días y la tabla inferior durante 20 días. Esto incluye la duración del ciclo estral, los tipos y porcentajes de células, y los arreglos celulares y el porcentaje de cada disposición visto para cada tipo de célula. Estos datos reflejan datos de 6 ratas hembra alojadas en la Universidad de Pepperdine. Abreviaturas: AKE = epitelial queratinizado anucleado; LEU = leucocitos; LNE = epitelio nucleado grande; SNE = epitelio nucleado pequeño; C = agrupado; DE = uniformemente disperso; RD = disperso aleatoriamente; EST = estro.

Discussion

Pasos clave y consideraciones importantes
Ciertos pasos críticos en el protocolo proporcionado requieren énfasis, especialmente dentro de la recolección de células vaginales. Durante la extracción de líquido vaginal, garantizar el ángulo y la profundidad adecuados de la inserción de la jeringa es clave para producir resultados satisfactorios y, en última instancia, prevenir la irritación, lesiones o estimulación cervical del animal. La estimulación del cuello uterino puede ser una fuente de inducción del pseudoembarazo, indicada por 12-14 días de un frotis vaginal solo de leucocitos¹¹. Durante la fase de evaluación del microscopio, es crucial centrarse en el plano visual que muestra las células vaginales recolectadas. Esto se completa identificando una o dos celdas y ajustando la visualización hasta que se logre el enfoque.

Después de esto, la captura de imágenes representativas de las células vaginales para la estadificación se produce escaneando la totalidad de la diapositiva del microscopio. Esto asegura que las imágenes capturadas reflejen una representación precisa de lo que se recoge y está presente en el canal vaginal de los animales. Antes de la categorización, es necesaria la familiaridad con los determinantes de categorización, como distinguir los tipos de células y las diversas transformaciones que puede poseer cada tipo de célula. Se recomienda que cada participante esté debidamente capacitado y practique la identificación de etapas a través de diapositivas de práctica preparadas previamente.

Para disminuir la cantidad de sesgo y subjetividad involucrados en el proceso, se recomienda incluir dos participantes en la fase de categorización, ambos permaneciendo ciegos a las asignaciones del grupo de tratamiento mientras conocen las identificaciones de etapas previamente registradas para cada animal. La asignación de dos participantes para categorizar las muestras permite la conferencia y una disminución de la subjetividad en las identificaciones. Sin embargo, si los participantes van a categorizar las muestras por separado, se recomienda que haya un período de colaboración inicial para aumentar la confiabilidad entre evaluadores a medida que se desarrolla la experiencia. Se puede emplear un sistema de examen secundario para evitar hallazgos inconsistentes, como el intercambio de conjuntos de datos después de la categorización y la utilización de las fotos para confirmar las evaluaciones iniciales.

Limitaciones y modificaciones
Las limitaciones de la técnica actual incluyen la duración de la viabilidad. Debido a la lesión o irritación que podría acompañar a la inserción repetitiva de una jeringa, el monitoreo prolongado y recurrente no se alinea con el cuidado y el uso adecuados de los animales. Por lo tanto, al realizar un estudio longitudinal, puede ser necesario modificar el procedimiento disminuyendo la frecuencia del lavado. Por ejemplo, en lugar de monitorear a cada animal una vez al día, las ratas podrían dividirse en grupos monitoreados en diferentes días a lo largo de la semana. Una segunda limitación implica la ausencia de tinción de muestra en el proceso descrito, sin separación de componentes celulares por color, creando una mayor dependencia de los determinantes de categorización enumerados en el protocolo anterior.

Además, dentro de tales determinantes de categorización, hay elementos de subjetividad que podrían limitar la replicación precisa. Específicamente, los porcentajes de cantidad de células dentro de las muestras recolectadas se basan en estimaciones personales. Las modificaciones en este sentido podrían incluir el desarrollo de un algoritmo matemático para cuantificar los tipos de células individuales presentes. Las modificaciones alternativas podrían incluir el número de muestras depositadas en un portaobjetos de microscopio, que podría aumentarse dependiendo del tamaño de la diapositiva y la cubierta. Otras limitaciones podrían incluir la falta de datos de fluidos vaginales en este estudio; una modificación de estudios futuros podría incluir el registro de las condiciones del fluido vaginal recolectado como una contribución a la categorización de etapas. Las modificaciones adicionales del protocolo podrían incluir la utilización de otro fluido isotónico para la extracción celular, lo que produciría los mismos resultados, como la solución salina^{tamponada con fosfato 13}. Por último, al aplicar este procedimiento a ratas de diferentes edades o cepas, pueden ser necesarias modificaciones como las técnicas de manipulación de animales debido al tamaño corporal o al nivel de actividad. Esto puede incluir el método de agarre⁶⁹ y los métodos Forelimb Crisscross⁶⁴ para adultos y el método De restricción de una y^{dos manos 64} utilizado para ratas más jóvenes.

Métodos alternativos
En comparación con los métodos alternativos de monitoreo del ciclo estral, el lavado vaginal es único en su precisión, cantidad de información producida, mínima invasividad y bajos costos asociados. El examen histológico del útero y los ovarios se puede utilizar para identificar las etapas del ciclo, pero es más intrusivo y no permite un monitoreo continuo. Si bien la medición de los niveles de hormona esteroides sexuales ayuda a monitorear el ciclo estral, requiere la recolección de sangre y no permite la caracterización del perfil único de fluido celular o vaginal de cada sujeto. Como el desarrollo de los genitales externos se correlaciona indirectamente con los niveles de hormona esteroides sexuales, el examen de la abertura vaginal puede proporcionar información sobre la maduración sexual. Además, la coloración del tejido, el nivel de humedad, el tamaño y la hinchazón de la abertura vaginal se han correlacionado con las etapas del ciclo estral⁷⁰. Sin embargo, la fisiología precisa que conduce a la apertura del canal vaginal en ratas aún no se ha informado por completo. Publicaciones recientes han encontrado que esto es solo un marcador indirecto del desarrollo reproductivo y no siempre se alinea con la pubescencia^31,34. El análisis bioquímico de las muestras de orina es rentable y fácil de realizar, pero no permite la especificidad y fiabilidad de otros métodos⁷¹. Por lo tanto, no es tan confiable o válido como examinar las células presentes en el canal vaginal.

Además, la medición de la impedancia eléctrica se ha utilizado para monitorear el ciclo estral y es menos irritante físicamente que el lavado líquido. Sin embargo, este método no proporciona tanta información sobre los componentes de categorización. Este dispositivo está diseñado específicamente para optimizar el momento del apareamiento intencional, midiendo cuándo los niveles de hormona esteroides sexuales son más altos 72,73,74. Además, se ha informado que este método es efectivo para distinguir entre EST y noEST, pero está limitado en su capacidad para monitorear el ciclo estral fuera de ese⁷⁵. En general, se ha informado que este método no es confiable, no siempre es rentable y no se utiliza a menudo en la literatura, lo que lleva a una falta de datos comparables⁷⁴. Si bien el hisopo vaginal es más similar al lavado en la información que proporciona, incluye un mayor riesgo de irritación o lesión, ya que requiere contactar directamente con el revestimiento del canal vaginal para recuperar las células. Por último, si bien la tinción de los portaobjetos del microscopio puede proporcionar un contraste más nítido entre los tipos de células y permitir la preservación de la muestra, es un esfuerzo más lento y costoso que el montaje húmedo⁵³. En general, cada técnica de monitoreo tiene sus limitaciones y ventajas, y podría ser beneficioso utilizar una combinación de estos métodos para recibir un examen exhaustivo del ciclo estral de roedores.

Aplicaciones
Sigue siendo importante ver el estudio actual en el contexto de la comunidad científica en general y el público en general. Esta metodología se puede utilizar en cualquier proyecto que implique el examen de animales hembras, no solo dentro de estudios centrados en la cría intencional, para excluir animales que presentan anomalías y / o la función del eje hipotalámico-hipofisario-ovárico, sino también para obtener información principal dentro de los grupos de tratamiento. Más específicamente, este procedimiento es impactante dentro de i) estudios farmacológicos, ya que varios medicamentos y productos químicos interrumpen o alteran el tracto reproductivo y el ciclo estral 11,27,76; ii) estudios neurológicos, como los centrados en lesiones cerebrales traumáticas, cognición o trastornos degenerativos, debidos a interacciones entre las hormonas esteroides sexuales y el sistema nervioso⁷⁷; iii) investigación del sistema circulatorio debido a los receptores de hormonas esteroides sexuales localizados en los miocitos y las interacciones posteriores⁷⁷; iv) investigación relacionada con el crecimiento óseo³⁸; al sistema endocrino^11,78; y v) otros estudios no reproductivos³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4