Summary
O modelo de sangramento de veia traseira refinada (TVT) em camundongos anestesiados é um método in vivo sensível para a avaliação do sangramento hemofílico. Este modelo de sangramento otimizado da TVT usa perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais, refinando outros modelos e evitando a morte como ponto final.
Abstract
Modelos de sangramento de cauda são ferramentas importantes na pesquisa de hemofilia, especificamente para a avaliação de efeitos procoagulantes. O modelo de sobrevivência da veia traseira (TVT) tem sido preferido em muitas configurações devido à sensibilidade a doses clinicamente relevantes de FVIII, enquanto outros modelos estabelecidos, como o modelo de clipe de cauda, requerem níveis mais elevados de compostos procoagulantes. Para evitar o uso da sobrevivência como ponto final, desenvolvemos um modelo de TVT estabelecendo perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais e anestesia completa durante todo o experimento. Brevemente, camundongos anestesiados são posicionados com a cauda submersa em soro fisiológico temperado (37°C) e dosados com o composto de teste na veia lateral direita da cauda. Após 5 minutos, a veia lateral esquerda é transectada usando um guia de modelo, a cauda é devolvida ao soro fisiológico, e todos os episódios de sangramento são monitorados e registrados por 40 minutos durante a coleta do sangue. Se não ocorrer sangramento em 10 min, 20 min ou 30 min após a lesão, o coágulo é desafiado suavemente limpando o corte duas vezes com um cotonete de gaze molhada. Após 40 min, a perda de sangue é quantificada pela quantidade de hemoglobina sangrada no soro fisiológico. Este procedimento rápido e relativamente simples resulta em sangramentos consistentes e reprodutíveis. Em comparação com o modelo de sobrevivência da TVT, utiliza um procedimento mais humano sem comprometer a sensibilidade à intervenção farmacológica. Além disso, é possível utilizar ambos os sexos, reduzindo o número total de animais que precisam ser criados, em adesão aos princípios das 3R's. Uma limitação potencial nos modelos sanguíneos é a natureza estocástica da hemostase, que pode reduzir a reprodutibilidade do modelo. Para combater isso, a interrupção manual do coágulo garante que o coágulo seja desafiado durante o monitoramento, impedindo que a hemostasia primária (plaqueta) pare de sangrar. Esta adição ao catálogo de modelos de lesão hemorrágida fornece uma opção para caracterizar efeitos procoagulantes de forma padronizada e humana.
Introduction
Modelos animais são essenciais para compreender a patogênese da hemofilia e desenvolver e testar regimes e terapias de tratamento. O rato-nocaute Fator VIII (F8-KO) é um modelo amplamente utilizado para o estudo da hemofilia A 1,2. Esses camundongos recapitulam características-chave da doença e têm sido amplamente utilizados para o desenvolvimento de tratamentos, como produtos FVIII recombinantes 3,4,5 e estratégias de terapia genética 6,7.
Existem vários modelos de lesão hemorrágica para avaliar os efeitos farmacológicos de diferentes compostos hemostáticos in vivo. Um desses modelos de coagulação é o modelo de sobrevivência da transeção da veia traseira em camundongos 8,9,10,11,12,13,14, medindo a capacidade dos camundongos hemofílicos de sobreviver à exsanguinação após transeção de cauda. Este método foi introduzido há mais de quatro décadas, 15 e ainda é utilizado 9,16,17. No entanto, o modelo utiliza a sobrevivência como ponto final e requer observação dos animais durante um período de até 24 horas, durante o qual os animais estão conscientes e, portanto, podem sentir dor e angústia.
Modelos de sangramento de menor duração e sob anestesia total foram descritos anteriormente, como o modelo de clipe de cauda (também conhecido como ponta traseira)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . No entanto, para uma normalização completa da perda de sangue após o desafio de sangramento, esses modelos requerem doses de compostos procoagulantes (por exemplo, FVIII) muito superiores aos administrados clinicamente29. Um modelo diferente de lesão sob anestesia, o método de sangramento vena saphena, é sensível a doses mais baixas de compostos procoagulantes30, mas requer um alto nível de intervenção experimentadora, uma vez que os coágulos devem ser interrompidos com frequência (ao contrário de 3 vezes no modelo apresentado).
A padronização para um protocolo comum para testar novos compostos procoagulantes facilitaria muito a comparação de dados entre os laboratórios 31,32,33. Nos modelos tvt, ainda não há uma concordância comum sobre os pontos finais estudados (perda de sangue 7,26, tempo de sangramento 9,34 e taxa de sobrevivência35,36), e comprimento experimental varia entre os estudos13.
Nosso objetivo principal é descrever e caracterizar um modelo otimizado com alta reprodutibilidade, a possibilidade de estudar sob demanda, bem como um tratamento profilático, sensibilidade à intervenção farmacológica equivalente ao modelo de sobrevivência, mas não utilizando a morte ou quase-morte como pontos finais. Para reduzir a dor e a angústia, os animais não devem estar conscientes durante o sangramento e um ponto final mais ético precisa ser implementado37.
Os modelos de clipe de cauda são geralmente conduzidos em uma das duas variantes, ou amputando a ponta da cauda, por exemplo, amputação de 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 ou, em uma variante mais grave, transeccionada a um diâmetro de cauda em torno de 1-3 mm 8,22,25 . Isso causa um sangramento arteriovenoso combinado, pois as veias laterais e dorsais e a artéria ventral são geralmente cortadas, e em geral, quanto maior a amputação, menor a sensibilidade a um composto procoagulante. Além disso, uma vez que a ponta da cauda é amputada, a lesão arteriovenosa é exposta sem qualquer tecido oposto; assim, pelo menos em teoria, é diferente dos sangramentos hemofílicos mais comuns.
Como o nome indica, apenas a veia é ferida em modelos de transeção da veia traseira, como descrito neste artigo, resultando em uma hemorragia exclusivamente venosa. Uma vez que o vaso não é totalmente cortado, espera-se que a lesão seja menor do que nos modelos de amputação, e o tecido ao redor do corte, que um coágulo pode aderir, é retido. Além disso, há pressão arterial mais baixa na veia em oposição à artéria. Esses fatores contribuem para um aumento da sensibilidade em relação aos modelos de amputação, de modo que a normalização do sangramento possa ser alcançada com doses clinicamente relevantes de terapia de reposição, por exemplo, com rFVIII em hemofilia A, o que é útil para avaliar a magnitude e durabilidade dos efeitos do tratamento procoagulante 26,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Corpo de Bem-Estar Animal da Novo Nordisk A/S, e pela Inspetoria dinamarquesa de Experimentos Animais, Ministério dinamarquês de Alimentos, Agricultura e Pesca. O método otimizado de 40 minutos inclui anestesia e tempo de dosagem no desenho (Figura 1). Camundongos hemofílicos de ambos os sexos entre 10 e 16 semanas de idade são necessários para este procedimento.
1. Preparativos antes do estudo
- Prepare as soluções de dosagem nas concentrações corretas.
- Comece o banho de água e aqueça até 37 °C. Encha os tubos de centrífuga de 15 mL para coleta de sangue com soro fisiológico (0,9% NaCl).
- Coloque os tubos salinos de 15 mL nos orifícios na placa de base aquecida pelo menos 15 minutos antes do início do experimento.
- Identifique os ratos e regisse seu peso. Evite manusear camundongos mais do que o necessário, pois isso pode causar estresse e afetar o estudo.
- Prepare a estação de trabalho no capô da fumaça antes de prosseguir para que tudo esteja ao alcance: guardanapos, porta-caudas, gaze, seringas, bisturis, cronômetros e papel de notação de fluxo sanguíneo.
- Coloque a marca da cauda e os blocos de corte na placa de aquecimento - blocos frios farão as veias se contraírem e, assim, afetarão o sangramento.
2. Anestesia
- Conduza o procedimento anestésico isoflurane dentro de um capô de fumaça.
- Coloque o vaporizador de gás inicialmente 5% de isoflurane em 30% O2/70% N2O na câmara de anestesia com fluxo de 1 L/min. Dê tempo suficiente para a câmara de anestesia preencher (cerca de 5 minutos dependendo do volume da câmara e da taxa de fluxo de gás). Garanta a indução rápida (menos de um minuto).
- Coloque os ratos na câmara de anestesia até que percam a consciência.
NOTA: Isso deve ocorrer dentro de um minuto ou menos se a câmara estiver suficientemente preenchida. - Certifique-se de uma anestesia adequada pela ausência de resposta dolorosa ao reflexo do pedal (aperto no dedo firme).
- Coloque os ratos na placa de aquecimento, certificando-se de que o nariz está no cone do nariz.
- Reduza a anestesia a um nível de manutenção de 2% de isoflurane em 30% O2/70% N2O e coloque uma tampa plástica acima dos ratos para reduzir a perda de calor. Aplique uma pomada ocular adequada para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
- Marque a cauda com um diâmetro de 2,5 mm usando o bloco de marca da cauda. Não force a cauda para dentro da fenda no bloco - ela deve caber snugly (Figura Suplementar 1)
- Coloque a cauda no tubo salino por pelo menos 5 minutos para garantir uma veia de cauda quente que seja ótima para dosagem intravenosa (i.v.).
3. Dosagem de solução de teste
- Coloque um rato no suporte da cauda com o nariz em uma máscara de anestesia.
- Dose o animal com o composto de juros (neste caso, rFVIII) e inicie imediatamente o cronômetro (t = 0).
- Coloque o mouse de volta na placa de aquecimento com a cauda no tubo salino. Repita o procedimento com os outros ratos.
4. Realização de transeção da veia traseira
- Realize a transeção da veia traseira exatamente 5 minutos após a dosagem. Coloque a cauda no bloco de corte e gire 90° para expor a veia (Figura Suplementar 2).
- Realize o corte no lado/veia oposto de onde a solução de teste foi dosada.
- Desenhe a lâmina de bisturi #11 através da fenda do bloco de corte segurando a cauda para criar sangramento. Reinicie o cronômetro e devolva a cauda imediatamente para o soro fisiológico.
5. Tempo de observação e desafios
- Observe o sangramento e anote o início e pare o sangramento ao longo de 40 minutos; anotar no papel de notação do fluxo sanguíneo.
NOTA: Esta avaliação visual do sangramento pode variar ligeiramente devido à subjetividade. - O sangramento primário deve parar dentro de 3 minutos após o corte ser feito. Se este não for o caso, desqualifique o mouse, eutanásia e substitua (a falha em parar o sangramento primário pode indicar uma lesão muito grave ou falta de hemostasia primária, como em camundongos vWF KO).
- Se não houver sangramento em 10 min, 20 min e 30 min pós-lesão, desafie o corte da cauda como descrito nas etapas 4-5.
- Use um cotonete de gaze embebido em soro fisiológico quente de um tubo separado mantido no banho de água. Levante a cauda para fora do soro fisiológico e limpe suavemente duas vezes com a gaze molhada em uma direção distal sobre o corte da cauda.
- Após cada desafio, volte imediatamente a submergir a cauda no tubo salino novamente.
- Em t=40 min, pare a coleta de sangue removendo a cauda do tubo salino.
6. Amostragem de sangue
- Após t = 40 min, obtenha amostras de sangue da veia supraorbital.
7. Eutanásia
- Eutanize os camundongos por luxação cervical enquanto ainda está sob anestesia total.
8. Tratamento de amostras
- Centrifugar os tubos de coleta de sangue de 15 mL com soro fisiológico a 4000 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Descarte o supernatante dos tubos de 15 mL, resuspenque a pelota em 2-14 mL de solução de eritrócitos (RBC) e, em seguida, dilua-a até atingir uma cor de café leve.
- Observe o volume total (volume de sangue + volume de eritrócitos (RBC) solução de lise adicionada usando as marcas de graduação no tubo).
- Transfira 2 mL da diluição para um tubo de hemoglobina e leve à geladeira até a análise da hemoglobina.
- Determine a perda de sangue medindo a concentração de hemoglobina no soro fisiológico. Meça a absorvância em 550 nm em um leitor de microplacas (Tabela de Materiais).
- Converta a absorvência em hemoglobina nmol usando uma curva padrão preparada a partir de hemoglobina humana (Tabela de Materiais) e corrija para a diluição com solução de dilatação RBC.
9. Análises estatísticas
- Analise os dados usando software apropriado. Aqui foi utilizado o software GraphPad Prism. Ao longo de uma série de estudos, verificou-se que os seguintes métodos estatísticos tiveram um bom desempenho.
NOTA: Para analisar a perda de sangue, tempo de sangramento, exposição, contagem de plaquetas e hematócrito; Foi utilizado o teste Brown-Forsythe e Welch ANOVA ( como os dados eram contínuos, mas sem homogeneidade de variância dos resíduos) aplicando o teste de Dunnett para ajustar para múltiplas comparações. Um teste de Pearson foi usado para testar correlações entre tempo de sangramento, perda de sangue e doses. Para determinar os valores de ED50 , uma equação de resposta inversa de quatro parâmetros (dose) foi encaixada em dados de sangramento e perda de sangue. Para analisar o efeito de gênero, utilizou-se um teste ANOVA bidirecional, aplicando correção de Bonferroni para ajustar para múltiplas comparações. O nível de significância foi definido como P < 0,05. Os dados são exibidos como meios ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para avaliar a aplicabilidade do modelo otimizado, foi realizado um estudo em camundongos F8-KO (C57BL de fundo genético) administrados com uma terapia de substituição recombinante de fator VIII comercialmente disponível (rFVIII); foram testadas quatro doses diferentes: 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg. Além disso, testamos o controle correspondente do veículo (negativo) em camundongos F8-KO e grupo de tipo selvagem (WT) usando camundongos C57BL como um grupo de controle positivo para avaliar a faixa de resposta no modelo.
Após o protocolo otimizado, houve uma redução significativa da perda de sangue para os grupos de tratamento rFVIII em comparação com o grupo de veículos. Além disso, observou-se redução do tempo de sangramento nos grupos de tratamento de 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg em relação ao grupo de veículos (Figura 2). Em camundongos WT, a perda total de sangue variou de 201,8-841,9 nmol Hgb (IC 95%) e em camundongos de veículos variou de 5335 a 7148 nmol Hgb (IC 95%). Após a equivalência aproximada de 1000 nmol Hgb ~125 μL de sangue inteiro, a hemorragia média em camundongos tratados com veículos foi de 780,25 μL, enquanto no grupo de 20 UI/kg foi de 89,95 μL. Assim, uma dose de 20 UI/kg normalizou completamente o sangramento, e a administração de 10 UI/kg causou um efeito significativo, reduzindo a perda de sangue quase ao limite superior da faixa WT (Figura 3). O tempo de sangramento dos camundongos WT variou de 0,98-9,16 min (IC95%) e níveis de dose de 10 UI/kg e 20 UI/kg reduzidos tempo de sangramento para dentro desta faixa. Observou-se forte correlação entre perda sanguínea e tempo de sangramento nos dados combinados (r = 0,9357, P < 0,0001) (Figura 4).
Para avaliar a sensibilidade do modelo, foi observada uma equação de resposta inversa de quatro parâmetros (dose) de registro (dose) para perda de sangue e tempo de sangramento, e observou-se um efeito claro dependente de dose da administração rFVIII sobre a perda de sangue e para o tempo de sangramento (Figura 3). Os valores estimados deED 50 para perda de sangue e tempo de sangramento foram de 2,41 ± 1,69 UI/kg e 2,55 ± 2,80 UI/kg, respectivamente.
Para ilustrar como o sangramento ocorre no modelo, todos os episódios de sangramento registrados foram plotados para fornecer uma visualização do comprimento e número de sangramentos por cada rato individual (Figura 5). O sangramento primário é muito semelhante em todos os grupos. A maioria do grupo de veículos hemofílicos começa a sangrar re-sangrar antes do segundo desafio em 20 minutos, e para cerca de metade desses animais, o sangramento não para após o primeiro desafio. Finalmente, como descrito, o tratamento rFVIII reduziu o comprimento dos episódios de sangramento em camundongos F8-KO tratados em comparação com o veículo, com já uma mudança observável na dose mais baixa. Nos níveis mais altos de dose, a maioria dos camundongos só sangrou brevemente após ser desafiado.
A concentração de plasma rFVIII foi medida pelo ensaio de canalização de oxigênio luminescente (LOCI) detectando hFVIII e análogos para verificar se o efeito observado na redução da perda de sangue e do tempo de sangramento foi dependente da concentração (Figura 6). Há variabilidade dentro de cada grupo (cv médio 46%), mas ainda assim, podem ser observadas diferenças significativas entre os grupos, corroborando assim que o efeito observado na perda de sangue e no tempo de sangramento depende da concentração plasmática do VIII. Todos os camundongos tratados com veículos medidos abaixo do limite inferior de quantitação para o ensaio (2 U/L) e são representados com este valor. Os camundongos WT não foram medidos, uma vez que o ensaio aplicado do FVIII é específico para detectar FVIII humano.
As contagens de plaquetas e hematócrito foram determinadas para todos os grupos utilizando as amostras de sangue coletadas após o sangramento (Figura 7 e medidas com um analisador hematológico (Tabela de Materiais). Não houve variação entre os grupos na contagem de plaquetas, indicando que os números de plaquetas não são afetados, e os camundongos, portanto, permanecem capazes de hemostasia primária. Para as medições de hematócrito, foram observados níveis normais em animais que receberam doses moderadas e superiores de FVIII (5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg), enquanto níveis significativamente inferiores foram observados nos grupos tratados de UI/kg (em comparação com animais de UI/kg). Esta é uma observação frequente em animais hemofílicos após sangramento severo.
Classicamente, apenas um gênero de animais (tipicamente masculinos) tem sido usado em estudos em animais, e isso também é descrito para modelos de sobrevivência da TVT 8,9,11,12. Buscando reduzir o número total de camundongos hemofílicos necessários em estudos futuros (para reprodução e estudo), ambos os sexos foram utilizados. Para avaliar o efeito do gênero neste modelo otimizado (Figura 8), tanto os resultados de perda de sangue quanto o tempo de sangramento foram submetidos à análise bidirecional da ANOVA com sexo e dose como fatores. Nesta análise, o efeito da dose rFVIII foi estatisticamente significativo (P < 0,0001), mas o sexo do camundongo não afetou significativamente os resultados (P 0,35), não foi encontrada interação significativa entre os parâmetros, indicando que as respostas ao tratamento não diferiam entre os sexos.
Figura 1: Projeto temporal da configuração experimental. A fase anterior à transeção da veia traseira (TVT) inclui indução de anestesia, aquecimento da cauda em soro fisiológico e dosagem. Após a lesão da TVT, 40 minutos de monitoramento do sangramento sob anestesia, com desafios subsequentes a cada 10 minutos, é realizado. O procedimento experimental é concluído pela coleta de amostras de sangue e eutanásia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito do rFVIII após administração intravenosa. Perda total de sangue (painel esquerdo) e tempo total de sangramento (painel direito) de camundongos F8-KO. Cada rato é mostrado como observações individuais e média ± SEM. As diferentes doses de teste de rFVIII estão representadas no eixo x. Os dados foram analisados por Brown-Forsythe e Welch ANOVA aplicando o teste de Dunnett para ajustar para múltiplas comparações. P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Curvas de dose-resposta para perda de sangue e tempo de sangramento. Perda de sangue (painel esquerdo) e tempo de sangramento (painel direito). A área cinzenta representa a IC 95% dos valores de 6 camundongos C57BL/6 não tratados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Parcela de correlação para perda de sangue e tempo de sangramento. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Perfis sanguíneos individuais em camundongos tratados de UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg rFVIII. Cada linha representa o perfil sanguíneo de um único rato, enquanto cada barra pontilhada representa um episódio sangrento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exposição ao rFVIII. A concentração de FVIII no plasma foi medida por um ensaio de canalização de oxigênio luminescente (LOCI) para detecção de FVIII humano. Os camundongos veiculares estavam abaixo do limite inferior de quantitação (LLOQ) e, portanto, foram plotados com o valor lloQ (2 U/L). Os animais WT não foram medidos, uma vez que o ensaio aplicado do FVIII é específico para a detecção de FVIII humano. As diferentes doses de teste de rFVIII e um controle WT são representadas no eixo x. ** P < 0,01, *** P < 0,001 e **** P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Dados hematológicos. Contagem de plaquetas (painel esquerdo) e hematócrito (painel direito) de camundongos F8-KO são mostrados como observações individuais significam com SEM. As diferentes doses de teste de rFVIII e um controle WT são representadas no eixo x. Os dados foram analisados por Brown-Forsythe e Welch ANOVA aplicando o teste de Dunnett para ajustar para múltiplas comparações. ** P < 0,01 e *** P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Efeito do gênero. A perda de sangue (painel esquerdo) e o tempo de sangramento (painel direito) classificados pelo tratamento são mostrados como observações individuais com ± SEM. Os dados foram analisados pela ANOVA bidirecional aplicando a correção de Bonferroni para ajustar para múltiplas comparações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo de sangramento ED50 (UI/kg) | Perda de sangue ED50 (UI/kg) | Sobrevivência ED50 (UI/kg) | ||
| Modelos sob anestesia | Modelo de transssecção otimizada da veia traseira | 2.6 ± 2.8 | 2.4 ± 1.7 | não relevante |
| Vena saphena modelo30 | 8.1 ± 2.2 | 5.1 ± 2.1 | não relevante | |
| Clipe de cauda moderada (L=3mm)27 | não relatado | 4.6 ± 0,5 | não relevante | |
| Clipe de cauda moderado (L=4mm)28 | 39 | 28 | não relevante | |
| Clipe de cauda moderada (L=4mm)20 | não relatado | 53 | não relevante | |
| Modelos de sobrevivência | Transeção da veia traseira modelo36 | não relatado | não relatado | 58 |
| Cauda veia transection modelode sobrevivência 10 | não relatado | não relatado | 21 |
Tabela 1: ED50 valores. Comparação deED 50 valores de diferentes modelos de sangramento disponíveis para estudos de hemofilia em camundongos. Os dados são extraídos de artigos citados [referências sobrescrito] e apresentados como ED50 (UI/kg)
Figura suplementar 1: Modelo de medição. Produzido em alumínio. Especificações de tamanho: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x W x H). Ranhura: 2,5 mm de profundidade e 2,5 mm de largura; raio 1,25 mm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: Modelo de corte. Produzido em aço inoxidável. Especificações de tamanho: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x W x H). Ranhura: profundidade de 3 mm e largura de 3 mm; raio 1,5 mm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este método otimizado de transeção de veias traseiras (TVT) tem várias vantagens em comparação com o método de sobrevivência da TVT. Os animais são totalmente anestesiados durante toda a duração do estudo, o que facilita o manuseio do rato e aumenta o bem-estar animal. Além disso, ao contrário do modelo de sobrevivência da TVT, a observação noturna não é necessária, e este modelo otimizado oferece a possibilidade de medir a perda de sangue e observar o tempo exato de sangramento acima de 40 minutos. Além disso, períodos mais longos de sangramento em animais conscientes podem causar a morte por exsanguinação, levando à dor e angústia nos animais e provavelmente estresse, resultando potencialmente em aumento da variação14. A perda de sangue e o tempo de sangramento foram caracterizados e validados com sucesso como pontos finais, substituindo o tempo de morte ou quase-morte. A lesão da cauda real é bem definida e padronizada, pois utiliza um guia de bloco de corte para realizar a TVT, garantindo um corte reprodutível, reduzindo a dificuldade do procedimento e a variabilidade técnica. Assim, pode-se alcançar maior robustez do modelo, reduzindo o número de animais necessários. Além disso, os dados demonstraram que é possível utilizar camundongos machos e fêmeas, reduzindo assim o número total de animais a serem criados, de acordo com os princípios 3R. Junto com essas observações, há uma tendência de que os camundongos fêmeas sangrem um pouco menos e variem ligeiramente mais em grupos de alta hemorragia, mas não em grupos de baixo sangramento. Medidas de menor perda de sangue podem estar associadas a fêmeas com menor tamanho e, portanto, menos volume sanguíneo em comparação com os homens da mesma idade.
Hemorragias espontâneas em pacientes hemofílicos geralmente são internas, especificamente envolvendo musculoesqueléticos, tecidos moles e sangramento mucocutâneo, enquanto lesões externas (como cortes menores) não são a causa mais comum de sangramentos prolongados, embora cortes mais graves e trauma possam serfatais 40,41. Este modelo otimizado induz sangramento apenas venoso, enquanto outros modelos, como o clipe da cauda, induzem uma mistura de sangramento arterio-venoso. Uma vez que o modelo descrito é um modelo apenas venoso, o efeito de dose procoagulante neste modelo TVT pode não refletir o efeito em uma lesão arterial mais grave; assim, outros modelos sanguíneos devem ser usados se tais sangramentos estiverem em foco.
Como mostrado pelo perfil sanguíneo individual, o sangramento primário é muito semelhante em todos os grupos indicando que a hemostasia primária, ou seja, a agregação de plaquetas ativadas, está intacta na hemofilia A configuração42. Em uma lesão imobilizada, mesmo sob hemofilia grave, a agregação de plaquetas pode ser suficiente para atenuar o sangramento. Por essa razão, através de estudos empíricos, descobrimos que induzir um desafio sangrento a cada 10 minutos é um passo necessário no protocolo para interromper agregados de plaquetas ativadas, que podem ser fortes o suficiente para evitar sangramento mesmo sem a geração de fibrinas da coagulação funcional. Uma vez que camundongos totalmente anestesiados não se movem e não podem desafiar fisicamente a lesão como acontece no modelo de sobrevivência da TVT não anestesiada, foi necessário introduzir os passos de desafio para evitar que a agregação de plaquetas sozinhos atenuassem o sangramento. Alguns camundongos hemofílicos não tratados sangram espontaneamente antes do desafio, mas após o primeiro desafio, hemorragias espontâneas ocorrem na maioria dos camundongos hemofílicos não tratados, e após o segundo desafio, muitos sangram continuamente até o final do experimento. Como esperado, houve aumento da hemorragia em camundongos F8-KO do veículo em comparação com os ratos WT. Os camundongos tratados com doses aumentadas de rFVIII apresentaram uma redução dependente de dose tanto na perda de sangue quanto no tempo de sangramento. Efeito significativo no sangramento foi observado em doses de 5 UI/kg ou superior (em comparação com camundongos tratados com veículos). As duas doses mais altas reduziram o sangramento a níveis bem próximos à resposta de sangramento do tipo selvagem, indicando normalização ou quase normalização do sangramento.
Na Tabela 1, apresentamos uma comparação de diferentes valores de ED50 para diversos modelos de sangramento, classificados pelos pontos finais estudados. Neste modelo otimizado, observou-se valores comparável deED 50 para perda de sangue e tempo de sangramento (2,4 ± 1,7 UI/kg e 2,6 ± 2,8 UI/kg, respectivamente). Utilizando o mesmo modelo que estuda rFVIIa, os valores deED 50 para perda de sangue e tempo de sangramento foram de 0,42 mg/kg e 0,39 mg/kg, respectivamente38. Trata-se de uma sensibilidade maior à intervenção farmacológica do que os modelos sanguíneos descritos anteriormente sob anestesia, como o modelo de clipe de cauda, com FVIII ED50 para perda de sangue de 4,6 ± 0,5 UI/kg27, 28 UI/kg28 e 53 UI/kg20. Além disso, há uma alta variabilidade de valoresED 50 nos diferentes modelos de clipe de cauda 20,27,28. Outro modelo sob anestesia é o modelo de clipe de cauda grave. É um método mais rápido, já que o período de observação é de apenas 20 minutos, mas é menos sensível à atividade procoagulante. Doses superiores a 200 UI/kg de VIII foram necessárias para alcançar uma redução estatisticamente significativa da perda de sangue em comparação com os animais tratados comveículos 25. No modelo vena saphena30, o valor deED 50 para o tempo de sangramento foi de 8,1 ± 2,2 UI/kg, eed 50 para perda de sangue médio foi de 5,1 ± 2,1 UI/kg, também menos sensível do que o nosso modelo refinado em relação aos dois parâmetros. Além disso, este modelo requer um trabalho delicado para realizar a lesão do vaso e múltiplas intervenções repetidas que, se não realizadas de forma reprodutável, poderiam influenciar o desfecho.
No modelo tradicional de sobrevivência da TVT, a sobrevida é avaliada por um período de 24h após a dosagem, durante o qual o sangramento ou re-sangramento pode ocorrer a qualquer momento. Assim, a eficácia no modelo de sobrevivência da TVT requer que o efeito procoagulante do tratamento persista por pelo menos a maior parte do período de observação de 24 horas. No método aqui apresentado, avaliamos efeitos agudos entre 5 min e 40 min após a dosagem; assim, é difícil estabelecer uma comparação direta dos valores deED 50 , uma vez que serão necessárias doses mais altas nos modelos de sobrevivência para manter a cobertura hemostática durante a última parte do período de observação. No entanto, se assim desejar, o modelo tvt otimizado pode ser usado para avaliar a duração da cobertura hemostática, introduzindo um atraso entre a dosagem e o procedimento de sangramento. Isso foi descrito para uma versão anterior do nosso modelo de TVT otimizado onde a execução do TVT 24 h após a dosagem resultou em um ED50 de aproximadamente 10-15 UI/kg para rFVIII26 não modificado. Conforme observado na Tabela 1, nos modelos de transeção traseira com sobrevida de 24h como ponto final, foram relatados valores deED 50 de 21 UI/kg 9 e 58 UI/kg36 de rFVIII. Da mesma forma, os modelosde sobrevivência do clipe de cauda 8 também requerem doses mais altas de procoagulante do que suas contrapartes agudas.
Em perspectiva, vários fatores diferentes de coagulação (FVIII, FVIIA, FIX) e derivados, alguns dos quais agora são comercializados, foram avaliados com o modelo otimizado utilizando diferentes cepas de camundongos hemofílicos 26,38,43,44,45,46,47. Também conseguimos adaptar o modelo ao estudo das intervenções sob demanda por dosagem após a transeção, pouco antes do primeiro desafio. Além disso, usamos com sucesso este modelo para avaliar anticorpos bisespecíficos com atividade procoagulante (Østergaard et al., aceitos para publicação em Blood), superando os desafios de reatividade cruzada de espécies pela dosagem de FIX humano e FX humano. Isso demonstra a versatilidade e o valor translacional do modelo no desenvolvimento de novos medicamentos no campo da hemofilia, como estratégias direcionadas a plaquetas48. Estratégias de edição de genomas baseadas em AAV ou genoma também podem ser avaliadas nos casos em que há um substituto que é farmacologicamente ativo em camundongos. Portanto, este modelo de sangramento otimizado TVT é uma alternativa aos modelos de transeção de veias da cauda e clipe de cauda, bem como uma alternativa valiosa para outros modelos sanguíneos sob anestesia. Este modelo é mais humano em comparação com o modelo de sobrevivência e um exemplo de Refinamento, pois os animais não experimentam dor e sofrimento. Em nossa opinião, a sensibilidade aos níveis de dose clinicamente relevantes, a relativa simplicidade técnica e a evitação da morte/quase-morte como pontos finais são vantagens significativas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores são ou eram funcionários e/ou acionistas da Novo Nordisk A/S no momento da realização desta pesquisa.
Acknowledgments
Esther Bloem e Thomas Nygaard são reconhecidos por apoio com medidas de FVIII no plasma. Bo Alsted é reconhecido por desenhar e usinar o modelo e cortar blocos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II - A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice - characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, Suppl 1 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J.
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts - Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
