Summary
Den raffinerede halevenetranssektion (TVT) blødningsmodel i bedøvede mus er en følsom in vivo-metode til vurdering af hæmofil blødning. Denne optimerede TVT-blødningsmodel bruger blodtab og blødningstid som endepunkter, forfiner andre modeller og undgår død som et endepunkt.
Abstract
Haleblødningsmodeller er vigtige værktøjer i hæmofiliforskning, specifikt til vurdering af prokoagulerende virkninger. Overlevelsesmodellen for halevenetranssektion (TVT) er blevet foretrukket i mange indstillinger på grund af følsomhed over for klinisk relevante doser af FVIII, mens andre etablerede modeller, såsom haleclipsmodellen, kræver højere niveauer af prokoagulerende forbindelser. For at undgå at bruge overlevelse som endepunkt udviklede vi en TVT-model, der etablerede blodtab og blødningstid som endepunkter og fuld bedøvelse under hele eksperimentet. Kort fortalt placeres bedøvede mus med halen nedsænket i tempereret saltvand (37 ° C) og doseres med testforbindelsen i højre laterale halevene. Efter 5 min krydses den venstre laterale halevene ved hjælp af en skabelonguide, halen returneres til saltvandet, og alle blødningsepisoder overvåges og registreres i 40 minutter, mens blodet opsamles. Hvis der ikke opstår blødning 10 min, 20 min eller 30 min efter skaden, udfordres blodproppen forsigtigt ved at tørre snittet to gange med en våd gazepind. Efter 40 minutter kvantificeres blodtab ved mængden af hæmoglobin, der blødte ind i saltvandet. Denne hurtige og relativt enkle procedure resulterer i ensartede og reproducerbare blødninger. Sammenlignet med TVT-overlevelsesmodellen bruger den en mere human procedure uden at gå på kompromis med følsomheden over for farmakologisk intervention. Desuden er det muligt at bruge begge køn, hvilket reducerer det samlede antal dyr, der skal opdrættes, i overensstemmelse med principperne i 3R'er. En potentiel begrænsning i blødningsmodeller er den stokastiske karakter af hæmostase, som kan reducere reproducerbarheden af modellen. For at imødegå dette sikrer manuel blodpropforstyrrelse, at blodproppen udfordres under overvågning, hvilket forhindrer primær (blodplade) hæmostase i at stoppe blødningen. Denne tilføjelse til kataloget over blødningsskademodeller giver mulighed for at karakterisere prokoagulerende virkninger på en standardiseret og human måde.
Introduction
Dyremodeller er afgørende for at forstå patogenesen af hæmofili og udvikle og teste behandlingsregimer og terapier. Faktor VIII knock-out mus (F8-KO) er en meget anvendt model til undersøgelse af hæmofili A 1,2. Disse mus rekapitulerer nøglefunktioner i sygdommen og er blevet brugt i vid udstrækning til udvikling af behandlinger, såsom rekombinante FVIII-produkter 3,4,5 og genterapistrategier 6,7.
Der er forskellige blødningsskademodeller til evaluering af de farmakologiske virkninger af forskellige hæmostatiske forbindelser in vivo. En af disse koagulationsmodeller er overlevelsesmodellen for halevenetranssektion hos mus 8,9,10,11,12,13,14, der måler hæmofile mus evne til at overleve ekssanguination efter haletranssektion. Denne metode blev introduceret for mere end fire årtier siden15 og bruges stadig 9,16,17. Modellen bruger dog overlevelse som endepunkt og kræver observation af dyrene over en periode på op til 24 timer, hvor dyrene er ved bevidsthed og dermed kan opleve smerte og angst.
Blødningsmodeller af kortere varighed og under fuld bedøvelse er tidligere beskrevet, såsom haleclipsmodellen (også kendt som halespidsen)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Ikke desto mindre kræver disse modeller doser af prokoagulerende forbindelser (f.eks. FVIII) langt højere end dem, der administreres klinisk29 for en fuldstændig normalisering af blodtab efter blødningsudfordringen. En anden skadesmodel under anæstesi, vena saphena blødningsmetoden, er følsom over for lavere doser af prokoagulerende forbindelser30, men kræver et højt niveau af eksperimentatorintervention, da blodpropperne skal forstyrres ofte (i modsætning til 3 gange i den præsenterede model).
Standardisering i retning af en fælles protokol til test af nye prokoagulerende forbindelser ville i høj grad lette datasammenligningen mellem laboratorier 31,32,33. I TVT-modeller er der endnu ikke en fælles aftale om studerede endepunkter (blodtab 7,26, blødningstid 9,34 og overlevelsesrate35,36), og eksperimentel længde varierer mellem undersøgelse13.
Vores primære mål er at beskrive og karakterisere en optimeret model med høj reproducerbarhed, muligheden for at studere on-demand samt en profylaktisk behandling, følsomhed over for farmakologisk intervention svarende til overlevelsesmodellen, men ikke ved at bruge død eller nærdød som endepunkter. For at mindske smerte og angst bør dyrene ikke være bevidste under blødning, og der skal gennemføres et mere etisk endepunkt37.
Haleclipsmodeller udføres generelt i en af to varianter, enten amputering af halespidsen, f.eks. amputation af 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 eller i en mere alvorlig variant transekteret med en halediameter omkring 1-3 mm 8,22,25 . Dette medfører en kombineret arteriovenøs blødning, da laterale og dorsale vener og ventral arterie normalt afskæres, og generelt jo større amputationen er, desto lavere er følsomheden over for en prokoagulerende forbindelse. Da halespidsen er amputeret, udsættes den arteriovenøse skade desuden uden noget modsat væv; således er det i det mindste i teorien forskelligt fra de mest almindelige hæmofile blødninger.
Som navnet antyder, er det kun venen, der er skadet i halevenetranssektionsmodeller som beskrevet i dette papir, hvilket resulterer i en udelukkende venøs blødning. Da karret ikke er helt afskåret, forventes skaden at være mindre end i amputationsmodellerne, og vævet omkring snittet, som en blodprop kan klæbe til, bevares. Derudover er der lavere blodtryk i venen i modsætning til arterien. Disse faktorer bidrager til en øget følsomhed i forhold til amputationsmodeller, således at normalisering af blødning kan opnås med klinisk relevante doser substitutionsterapi, fx med rFVIII i hæmofili A, hvilket er nyttigt til evaluering af størrelsen og holdbarheden af virkningerne af prokoagulerende behandling 26,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol, er godkendt af Dyrevelfærdsorganet hos Novo Nordisk A/S og Dyreforsøgstilsynet, Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri. Den optimerede 40 minutters metode inkluderer anæstesi og doseringstid i designet (figur 1). Hæmofile mus af begge køn mellem 10-16 uger er nødvendige for denne procedure.
1. Forberedelser før undersøgelsen
- Forbered doseringsopløsningerne i de korrekte koncentrationer.
- Start vandbadet og opvarm til 37 °C. Fyld 15 ml centrifugerørene til blodopsamling med saltvand (0,9% NaCl).
- Anbring 15 ml saltvandsrørene i hullerne i den opvarmede bundplade mindst 15 minutter før forsøgets start.
- Identificer musene og registrer deres vægt. Undgå at håndtere mus mere end nødvendigt, da dette kan forårsage stress og påvirke undersøgelsen.
- Forbered arbejdsstationen i røghætten, inden du fortsætter, så alt er inden for rækkevidde: servietter, haleholder, gasbind, sprøjter, skalpeller, stopure og notationspapir til blodgennemstrømning.
- Placer halemærket og skæreblokkene på varmepladen - kolde blokke får venerne til at trække sig sammen og derved påvirke blødningen.
2. Anæstesi
- Udfør isofluranbedøvelsesproceduren inde i en røghætte.
- Indstil gasfordamperen til oprindeligt 5% isofluran i 30% O2/70% N2O i anæstesikammeret med 1 L / min flow. Giv tilstrækkelig tid til, at anæstesikammeret kan fyldes (ca. 5 minutter afhængigt af kammervolumen og gasstrømningshastighed). Sørg for hurtig induktion (mindre end et minut).
- Placer musene i anæstesikammeret, indtil de mister bevidstheden.
BEMÆRK: Dette skal ske inden for et minut eller mindre, hvis kammeret er tilstrækkeligt fyldt. - Sørg for korrekt bedøvelse ved fravær af smertefuld reaktion på pedalrefleks (fast tåspids).
- Placer musene på varmepladen, og sørg for, at næsen er i næsekeglen.
- Reducer anæstesien til et vedligeholdelsesniveau på 2% isofluran i 30% O2/70% N2O og placer et plastikdæksel over musene for at reducere varmetabet. Påfør en passende øjensalve for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Marker halen med en diameter på 2,5 mm ved hjælp af halemærkeblokken. Tving ikke halen ind i spalten i blokken - den skal passe tæt (supplerende figur 1)
- Placer halen i saltvandsrøret i mindst 5 minutter for at sikre en varm halevene, der er optimal til intravenøs (i.v.) dosering.
3. Dosering af testopløsning
- Placer en mus i haleholderen med næsen i en anæstesimaske.
- Dosis dyret med renteforbindelsen (i dette tilfælde rFVIII) og start straks stopuret (t = 0).
- Placer musen tilbage på varmepladen med halen i saltvandsrøret. Gentag proceduren med de andre mus.
4. Udførelse af hale vene transsektion
- Udfør halevenetranssektionen nøjagtigt 5 minutter efter dosering. Placer halen i skæreblokken og drej 90° for at udsætte venen (supplerende figur 2).
- Snittet udføres på den modsatte side/vene, hvorfra testopløsningen blev doseret.
- Træk skalpelbladet nr. 11 gennem spalten på skæreblokken, der holder halen, for at skabe blødning. Nulstil stopuret, og sæt straks halen tilbage til saltvandet.
5. Observationstid og udfordringer
- Overhold blødningen og kommenter starten og stop af blødningen i løbet af 40 min; kommenter det på blodstrømsnotationspapiret.
BEMÆRK: Denne visuelle vurdering af blødning kan variere lidt på grund af subjektivitet. - Den primære blødning skal stoppe inden for 3 minutter efter, at snittet er foretaget. Hvis dette ikke er tilfældet, diskvalificere musen, aflive og udskifte (manglende stop af den primære blødning kan indikere en for alvorlig skade eller manglende primær hæmostase, som i vWF KO-mus).
- Hvis der ikke er nogen blødning 10 min, 20 min og 30 min efter skaden, skal du udfordre haleskæringen som beskrevet i trin 4-5.
- Brug en gasbind vatpind gennemblødt i varm saltvand fra et separat rør, der opbevares i vandbadet. Løft halen ud af saltvandet og tør blødt to gange med det våde gasbind i distal retning over haleskæringen.
- Efter hver udfordring nedsænkes halen straks i saltvandsrøret igen.
- Ved t = 40 min skal du stoppe blodindsamlingen ved at fjerne halen fra saltvandsrøret.
6. Blodprøvetagning
- Efter t = 40 min, få blodprøver fra supraorbital venen.
7. Eutanasi
- Afliv musene ved cervikal dislokation, mens de stadig er under fuld bedøvelse.
8. Behandling af prøver
- Centrifuger 15 ml blodopsamlingsrør med saltvand ved 4000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér supernatanten fra 15 ml rørene, resuspender pelleten i 2-14 ml erythrocytter (RBC) lysingopløsning, og fortynd den derefter, indtil den når en lys kaffefarve.
- Bemærk det samlede volumen (volumen af blod + volumen erythrocytter (RBC) lysingopløsning tilsat ved hjælp af gradueringsmærkerne på røret).
- Overfør 2 ml fortynding til et hæmoglobinrør og afkøles indtil hæmoglobinanalysen.
- Bestem blodtabet ved at måle hæmoglobinkoncentrationen i saltvandet. Absorbansen måles ved 550 nm på en mikropladelæser (Materialetabel).
- Absorbansen omdannes til nmol hæmoglobin ved hjælp af en standardkurve fremstillet ud fra humant hæmoglobin (materialetabel) og korrigeres for fortyndingen med RBC-lysopløsning.
9. Statistiske analyser
- Analyser dataene ved hjælp af passende software. Her blev GraphPad Prism-software brugt. Over en række undersøgelser viste det sig, at følgende statistiske metoder fungerede godt.
BEMÆRK: At analysere blodtab, blødningstid, eksponering, blodpladetal og hæmatokrit; Brown-Forsythe og Welch ANOVA test blev anvendt, (da dataene var kontinuerlige, men uden varianshomogenitet af residualerne) ved anvendelse af Dunnetts test til at justere for flere sammenligninger. En Pearsons test blev brugt til at teste for sammenhænge mellem blødningstid, blodtab og doser. For at bestemme ED50-værdier blev en fire-parameter invers log (dosis) responsligning monteret på blødnings- og blodtabsdata. For at analysere kønseffekten blev der anvendt en tovejs ANOVA-test, der anvendte Bonferroni-korrektion til at justere for flere sammenligninger. Signifikansniveauet blev defineret som P < 0,05. Data vises som midler ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vurdere anvendeligheden af den optimerede model blev der udført en undersøgelse i F8-KO (C57BL genetisk baggrund) mus administreret med en kommercielt tilgængelig rekombinant faktor VIII substitutionsterapi (rFVIII); fire forskellige doser blev testet: 1 IE/kg, 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg. Desuden testede vi den tilsvarende køretøjs (negative) kontrol i F8-KO-mus og vildtype (WT) gruppe ved hjælp af C57BL-mus som en positiv kontrolgruppe for at vurdere responsområdet i modellen.
Efter den optimerede protokol var der en signifikant reduktion i blodtab for rFVIII-behandlingsgrupper sammenlignet med køretøjsgruppen. Derudover blev der observeret en reduktion i blødningstiden i behandlingsgrupperne 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg sammenlignet med køretøjsgruppen (figur 2). I WT-mus varierede det samlede blodtab fra 201,8-841,9 nmol Hgb (95% CI) og hos køretøjsmus varierede fra 5335 til 7148 nmol Hgb (95% CI). Efter den omtrentlige ækvivalens på 1000 nmol Hgb ~ 125 μL fuldblod var den gennemsnitlige blødning i køretøjsbehandlede mus 780,25 μL, mens den på 20 IE / kg-gruppen var 89,95 μL. Således normaliserede en dosis på 20 IE/kg blødningen fuldstændigt, og administration af 10 IE/kg forårsagede en signifikant effekt, hvilket reducerede blodtabet næsten til den øvre grænse for WT-området (figur 3). Blødningstiden for WT-mus varierede fra 0,98-9,16 min (95% CI), og dosisniveauer på 10 IE/kg og 20 IE/kg reducerede blødningstiden til inden for dette interval. En stærk korrelation mellem blodtab og blødningstid blev observeret i de kombinerede data (r = 0,9357, P < 0,0001) (figur 4).
For at evaluere modellens følsomhed blev en fireparameter invers log (dosis) responsligning tilpasset observationer af blodtab og blødningstid, og en klar dosisafhængig effekt af rFVIII-administration på blodtab og for blødningstiden blev observeret (figur 3). De estimerede ED50-værdier for blodtab og blødningstid var henholdsvis 2,41 ± 1,69 IE /kg og 2,55 ± 2,80 IE / kg.
For at illustrere, hvordan blødning forekommer i modellen, er alle registrerede blødningsepisoder blevet plottet for at give en visualisering af længden og antallet af blødninger for hver enkelt mus (figur 5). Den primære blødning er meget ens i alle grupperne. Det meste af den hæmofile køretøjsgruppe begynder at bløde igen før den anden udfordring efter 20 minutter, og for omkring halvdelen af disse dyr stopper blødningen ikke efter den første udfordring. Endelig reducerede rFVIII-behandlingen som beskrevet længden af blødningsepisoderne hos behandlede F8-KO-mus sammenlignet med køretøjet med allerede en observerbar ændring ved den laveste dosis. Ved de højeste dosisniveauer blødte de fleste mus kun kort efter at være blevet udfordret.
Plasma rFVIII-koncentration blev målt ved selvlysende oxygenkanalassay (LOCI) detektion af hFVIII og analoger for at verificere, at den effekt, der blev observeret ved reduktion af blodtab og blødningstid, var koncentrationsafhængig (figur 6). Der er variabilitet inden for hver gruppe (gennemsnit CV 46%), men alligevel kan der observeres signifikante forskelle mellem grupper, hvilket bekræfter, at effekten observeret ved blodtab og blødningstid er afhængig af plasmakoncentrationen af FVIII. Alle køretøjsbehandlede mus målt under den nedre kvantificeringsgrænse for assayet (2 U/L) og er repræsenteret med denne værdi. WT-mus blev ikke målt, da det anvendte FVIII-assay er specifikt til påvisning af human FVIII.
Blodpladetal og hæmatokrit blev bestemt for alle grupper ved hjælp af blodprøver indsamlet efter blødning (figur 7 og målt med en hæmatologisk analysator (Materialetabel). Der var ingen variation mellem grupper i blodpladetal, hvilket indikerer, at blodpladetal ikke påvirkes, og musene forbliver derfor i stand til primær hæmostase. Ved hæmatokritmålinger blev der observeret normale niveauer hos dyr, der fik moderate og højere FVIII-doser (5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg), mens der blev observeret signifikant lavere niveauer i gruppen af køretøjer og 1 IE/kg behandlet (sammenlignet med WT-dyr). Dette er en hyppig observation hos hæmofile dyr efter kraftig blødning.
Klassisk er der kun anvendt ét køn af dyr (typisk hankøn) i dyreforsøg, og dette er også beskrevet for TVT-overlevelsesmodeller 8,9,11,12. I bestræbelserne på at reducere det samlede antal hæmofile mus, der var nødvendige i fremtidige undersøgelser (til avl og undersøgelsen), blev begge køn brugt. For at evaluere effekten af køn i denne optimerede model (figur 8) blev både blodtab og blødningstidsresultater udsat for tovejs ANOVA-analyse med køn og dosis som faktorer. I denne analyse var effekten af rFVIII-dosis statistisk signifikant (P < 0,0001), men musens køn påvirkede ikke signifikant resultaterne (P 0,35), og der blev ikke fundet nogen signifikant interaktion mellem parametrene, hvilket indikerer, at respons på behandling ikke var forskellig mellem køn.
Figur 1: Tidsmæssigt design af den eksperimentelle opsætning. Fasen før halevenetranssektion (TVT) inkluderer anæstesiinduktion, opvarmning af halen i saltvand og dosering. Efter TVT-skaden udføres 40 minutters overvågning af blødningen under anæstesi med efterfølgende udfordringer hvert 10. minut. Den eksperimentelle procedure afsluttes ved indsamling af blodprøver og eutanasi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Effekt af rFVIII efter intravenøs administration. Totalt blodtab (venstre panel) og total blødningstid (højre panel) af F8-KO mus. Hver mus vises som individuelle observationer og middel ± SEM. De forskellige testdoser af rFVIII er repræsenteret i x-aksen. Data blev analyseret af Brown-Forsythe og Welch ANOVA ved at anvende Dunnetts test til at justere for flere sammenligninger. P < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dosis-respons kurver for blodtab og blødningstid. Blodtab (venstre panel) og blødningstid (højre panel). Gråzonen repræsenterer 95% CI fra værdierne fra 6 ubehandlede vildtype C57BL/6 mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Korrelationsdiagram for blodtab og blødningstid. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Individuelle blødningsprofiler i vildtype, køretøj, 1 IE/kg, 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg rFVIII behandlede mus. Hver linje repræsenterer blødningsprofilen for en enkelt mus, mens hver stiplet bjælke repræsenterer en blødningsepisode. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Eksponering for rFVIII. FVIII-koncentrationen i plasma blev målt ved et selvlysende oxygenkanalassay (LOCI) til påvisning af human FVIII. Køretøjsmus var under den nedre grænse for kvantificering (LLOQ) og blev derfor plottet med LLOQ-værdien (2 U / L). WT-dyr blev ikke målt, da det anvendte FVIII-assay er specifikt til påvisning af human FVIII. De forskellige testdoser af rFVIII og en WT-kontrol er repræsenteret i x-aksen. ** P < 0,01, *** P < 0,001 og **** P < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Hæmatologiske data. Blodpladetal (venstre panel) og hæmatokrit (højre panel) af F8-KO-mus er vist som individuelle observationer gennemsnit med SEM. De forskellige testdoser af rFVIII og en WT-kontrol er repræsenteret på x-aksen. Data blev analyseret af Brown-Forsythe og Welch ANOVA ved at anvende Dunnetts test til at justere for flere sammenligninger. ** P < 0,01 og *** P < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8. Effekt af køn. Blodtab (venstre panel) og blødningstid (højre panel) klassificeret efter behandling vises som individuelle observationer med middel ± SEM. Data blev analyseret af tovejs ANOVA, der anvendte Bonferroni-korrektionen til at justere for flere sammenligninger. Klik her for at se en større version af denne figur.
| ED50 blødningstid (IE/kg) | ED50 blodtab (IE / kg) | ED50 overlevelse (IE/kg) | ||
| Modeller under anæstesi | Optimeret hale vene transsektion model | 2.6 ± 2.8 | 2.4 ± 1.7 | ikke relevant |
| Vena saphena model30 | 8.1 ± 2.2 | 5.1 ± 2.1 | ikke relevant | |
| Moderat haleclips (L=3mm)27 | ikke indberettet | 4,6 ± 0,5 | ikke relevant | |
| Moderat haleclips (L=4mm)28 | 39 | 28 | ikke relevant | |
| Moderat haleclips (L=4 mm)20 | ikke indberettet | 53 | ikke relevant | |
| Overlevelse modeller | Overlevelse af halevenetranssektion model36 | ikke indberettet | ikke indberettet | 58 |
| Overlevelse af halevenetranssektion model10 | ikke indberettet | ikke indberettet | 21 |
Tabel 1: ED50 værdier. Sammenligning af ED50-værdier af forskellige tilgængelige blødningsmodeller til hæmofiliundersøgelser hos mus. Data er hentet fra citerede artikler [referencer hævet] og præsenteret som ED50 (IE/kg)
Supplerende figur 1: Måleskabelon. Produceret i aluminium. Størrelse specifikationer: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Rille: 2,5 mm dybde og 2,5 mm bredde; radius 1,25 mm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Skæreskabelon. Produceret i rustfrit stål. Størrelse specifikationer: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Rille: 3 mm dybde og 3 mm bredde; radius 1,5 mm. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne optimerede metode til halevenetranssektion (TVT) har flere fordele sammenlignet med TVT-overlevelsesmetoden. Dyrene bedøves fuldt ud i hele forsøgsperioden, hvilket gør musehåndtering lettere og øger dyrenes trivsel. I modsætning til TVT-overlevelsesmodellen er der ikke behov for observation natten over, og denne optimerede model giver mulighed for at måle blodtab og observere den nøjagtige blødningstid over 40 minutter. Også længere perioder med blødning hos bevidste dyr kan forårsage død ved ekssanguination, hvilket fører til smerte og angst hos dyrene og sandsynligvis stress, hvilket potentielt kan resultere i øget variation14. Blodtab og blødningstid er med succes blevet karakteriseret og valideret som endepunkter, der erstatter tid til død eller nærdød. Den faktiske haleskade er veldefineret og standardiseret, da den bruger en skæreblokguide til at udføre TVT, hvilket sikrer et reproducerbart snit, hvilket reducerer procedurens vanskelighed og den tekniske variabilitet. Derfor kan der opnås højere modelrobusthed, hvilket reducerer antallet af nødvendige dyr. Desuden har data vist, at det er muligt at anvende både han- og hunmus, hvilket reducerer det samlede antal dyr, der skal opdrættes, i overensstemmelse med 3R-principperne. Sammen med disse observationer er der en tendens til, at hunmus bløder lidt mindre og varierer lidt mere i højt blødende grupper, men ikke i grupper med lav blødning. Lavere blodtabsforanstaltninger kan være forbundet med kvinder, der har en mindre størrelse og derfor mindre blodvolumen sammenlignet med mænd i samme alder.
Spontane blødninger hos hæmofile patienter er normalt interne, specifikt involverer muskuloskeletale, blødt væv og mucokutan blødning, mens eksterne skader (såsom mindre nedskæringer) ikke er den mest almindelige årsag til udvidede blødninger, selvom mere alvorlige nedskæringer og traumer kan være livstruende40,41. Denne optimerede model inducerer kun venøs blødning, mens andre modeller, såsom haleclipsen, inducerer en blanding af arterio-venøs blødning. Da den beskrevne model kun er en venøs model, afspejler den prokoagulerende dosiseffekt i denne TVT-model muligvis ikke effekten i en mere alvorlig arteriel skade; derfor bør andre blødningsmodeller anvendes, hvis sådanne blødninger er i fokus.
Som det fremgår af den individuelle blødningsprofil, er den primære blødning meget ens i alle grupperne, hvilket indikerer, at primær hæmostase, dvs. aggregering af aktiverede blodplader, er intakt i hæmofili A-indstillingen42. I en immobiliseret skade, selv under alvorlig hæmofili, kan blodpladeaggregering være tilstrækkelig til at dæmpe blødningen. Af den grund har vi gennem empiriske undersøgelser fundet ud af, at inducering af en blødningsudfordring hvert 10. minut er et nødvendigt trin i protokollen for at forstyrre aggregater af aktiverede blodplader, som kan være stærke nok til at forhindre blødning selv uden fibringenerering fra funktionel koagulation. Da fuldt bedøvede mus ikke bevæger sig og ikke fysisk kan udfordre skaden, som det sker i den ikke-bedøvede TVT-overlevelsesmodel, var det nødvendigt at introducere udfordringstrinnene for at forhindre blodpladeaggregering alene fra at dæmpe blødning. Nogle ubehandlede hæmofile mus bløder spontant før udfordringen, men efter den første udfordring forekommer spontane genblødninger hos de fleste ubehandlede hæmofile mus, og efter den anden udfordring bløder mange kontinuerligt indtil forsøgets afslutning. Som forventet var der øget blødning i køretøjer F8-KO mus sammenlignet med WT mus. Mus behandlet med øgede doser af rFVIII viste en dosisafhængig reduktion i både blodtab og blødningstid. Signifikant effekt på blødning blev observeret ved doser på 5 IE/kg og derover (sammenlignet med mus behandlet af køretøjer). De to højeste doser reducerede blødningen til niveauer, der ligger ganske tæt på vildtypeblødningsresponset, hvilket indikerer normalisering eller næsten normalisering af blødningen.
I tabel 1 præsenterer vi en sammenligning af forskellige ED50-værdier for flere blødningsmodeller, klassificeret efter de undersøgte endepunkter. I denne optimerede model observerede vi sammenlignelige ED50-værdier for blodtab og blødningstid (henholdsvis 2,4 ± 1,7 IE /kg og 2,6 ± 2,8 IE / kg). Ved hjælp af den samme model, der studerede rFVIIa, var ED50-værdierne for blodtab og blødningstid henholdsvis 0,42 mg / kg og 0,39 mg / kg38. Dette er en større følsomhed over for farmakologisk intervention end tidligere beskrevne blødningsmodeller under anæstesi, såsom haleclipsmodellen, med FVIII ED50 for blodtab på 4,6 ± 0,5 IE / kg27, 28 IE / kg28 og 53 IE / kg20. Desuden er der en høj variation i ED50-værdier i de forskellige haleclipsmodeller 20,27,28. En anden model under anæstesi er den alvorlige haleklipsmodel. Det er en hurtigere metode, da observationsperioden kun er 20 minutter, men den er mindre følsom over for prokoagulerende aktivitet. Doser på over 200 IE/kg FVIII var nødvendige for at opnå en statistisk signifikant reduktion af blodtab sammenlignet med køretøjsbehandlede dyr25. I vena saphena model30 var ED50-værdien for blødningstid 8,1 ± 2,2 IE/kg, og ED50 for gennemsnitligt blodtab var 5,1 ± 2,1 IE/kg, også mindre følsom end vores raffinerede model med hensyn til begge parametre. Desuden kræver denne model delikat arbejde for at udføre fartøjsskaden og flere gentagne indgreb, som, hvis de ikke udføres reproducerbart, kan påvirke resultatet.
I den traditionelle TVT-overlevelsesmodel evalueres overlevelsen i en periode på 24 timer efter dosering, hvor blødning eller genblødning kan forekomme når som helst. Effekten i TVT-overlevelsesmodellen kræver således, at behandlingens prokoagulerende virkning varer ved i mindst størstedelen af observationsperioden på 24 timer. I den metode, der præsenteres her, vurderer vi akutte virkninger mellem 5 min og 40 min efter dosering; en direkte sammenligning af ED50-værdier er således vanskelig at etablere, da højere doser vil være nødvendige i overlevelsesmodellerne for at opretholde hæmostatisk dækning i den sidste del af observationsperioden. Men hvis det ønskes, kan den optimerede TVT-model bruges til at evaluere varigheden af hæmostatisk dækning ved at indføre en forsinkelse mellem dosering og blødningsproceduren. Dette er blevet beskrevet for en tidligere version af vores optimerede TVT-model, hvor udførelse af TVT 24 timer efter dosering resulterede i en ED50 på ca. 10-15 IE/kg for umodificeret rFVIII26. Som nævnt i tabel 1 er der i haletranssektionsmodeller med en overlevelse på 24 timer som endepunkt rapporteret ED50-værdier på 21 IE/kg 9 og 58 IE/kg36 rFVIII. På samme måde kræver haleclipsoverlevelsesmodeller8 også højere prokoagulerende doser end deres akutte modstykker.
I perspektiv er flere forskellige koagulationsfaktorer (FVIII, FVIIa, FIX) og derivater, hvoraf nogle nu markedsføres, blevet evalueret med den optimerede model ved hjælp af forskellige hæmofile musestammer 26,38,43,44,45,46,47. Vi har også været i stand til at tilpasse modellen til studiet af on-demand interventioner ved at dosere efter transsektionen, lige før den første udfordring. Desuden har vi med succes brugt denne model til at evaluere bispecifikke antistoffer med prokoagulerende aktivitet (Østergaard et al., accepteret til offentliggørelse i Blood), overvinde arts krydsreaktivitetsudfordringer ved at dosere human FIX og human FX. Dette demonstrerer alsidigheden og den translationelle værdi af modellen i udviklingen af nye lægemidler inden for hæmofiliområdet, såsom blodplademålrettede strategier48. AAV-baserede eller genomredigeringsstrategier kan også evalueres i tilfælde, hvor der er en surrogat, der er farmakologisk aktiv hos mus. Derfor er denne optimerede TVT-blødningsmodel et alternativ til halevenetranssektion og haleclipsoverlevelsesmodeller samt et værdifuldt alternativ til andre blødningsmodeller under anæstesi. Denne model er mere human sammenlignet med overlevelsesmodellen og et eksempel på raffinement, da dyrene ikke oplever smerte og lidelse. Efter vores mening er følsomheden over for klinisk relevante dosisniveauer, relativ teknisk enkelhed og undgåelse af død/nærdød som endepunkter betydelige fordele.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er eller var ansatte og/eller aktionærer i Novo Nordisk A/S på det tidspunkt, hvor denne forskning blev udført.
Acknowledgments
Esther Bloem og Thomas Nygaard er anerkendt for støtte med målinger af FVIII i plasma. Bo Alsted er anerkendt for at tegne og bearbejde skabelonen og skæreblokkene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II - A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice - characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, Suppl 1 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J.
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts - Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
