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Biology

Modello di sanguinamento della traslazione della vena della coda in topi di emofilia A completamente anestetizzati

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62952
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 4, 5, 1, 6, 1
1Global Drug Discovery, Novo Nordisk A/S, 2Department of Veterinary and Animal Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Independent consultant, 5Catalyst Biosciences, 6Værløse Dyreklinik

Summary

Il modello di sanguinamento della transezione della vena della coda raffinata (TVT) nei topi anestetizzati è un metodo sensibile in vivo per la valutazione del sanguinamento emofilico. Questo modello di sanguinamento TVT ottimizzato utilizza la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint, perfezionando altri modelli ed evitando la morte come endpoint.

Abstract

I modelli di sanguinamento della coda sono strumenti importanti nella ricerca sull'emofilia, in particolare per la valutazione degli effetti procoagulanti. Il modello di sopravvivenza alla transezione della vena caudale (TVT) è stato preferito in molti contesti a causa della sensibilità a dosi clinicamente rilevanti di FVIII, mentre altri modelli consolidati, come il modello di clip di coda, richiedono livelli più elevati di composti procoagulanti. Per evitare di utilizzare la sopravvivenza come endpoint, abbiamo sviluppato un modello TVT che stabilisce la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint e l'anestesia completa durante l'intero esperimento. In breve, i topi anestetizzati vengono posizionati con la coda immersa in soluzione salina temperata (37 ° C) e dosati con il composto di prova nella vena laterale destra della coda. Dopo 5 minuti, la vena laterale sinistra della coda viene trasettata utilizzando una guida modello, la coda viene restituita alla soluzione salina e tutti gli episodi emorragici vengono monitorati e registrati per 40 minuti durante la raccolta del sangue. Se non si verifica alcun sanguinamento a 10 minuti, 20 minuti o 30 minuti dopo l'infortunio, il coagulo viene sfidato delicatamente pulendo il taglio due volte con un tampone di garza bagnato. Dopo 40 minuti, la perdita di sangue è quantificata dalla quantità di emoglobina sanguinata nella soluzione salina. Questa procedura veloce e relativamente semplice si traduce in sanguinamenti coerenti e riproducibili. Rispetto al modello di sopravvivenza TVT, utilizza una procedura più umana senza compromettere la sensibilità all'intervento farmacologico. Inoltre, è possibile utilizzare entrambi i sessi, riducendo il numero totale di animali che devono essere allevati, nel rispetto dei principi delle 3R. Una potenziale limitazione nei modelli di sanguinamento è la natura stocastica dell'emostasi, che può ridurre la riproducibilità del modello. Per contrastare questo, l'interruzione manuale del coagulo assicura che il coagulo venga sfidato durante il monitoraggio, impedendo all'emostasi primaria (piastrinica) di fermare il sanguinamento. Questa aggiunta al catalogo di modelli di lesioni emorragiche offre un'opzione per caratterizzare gli effetti procoagulanti in modo standardizzato e umano.

Introduction

I modelli animali sono essenziali per comprendere la patogenesi dell'emofilia e sviluppare e testare regimi di trattamento e terapie. Il topo knock-out fattore VIII (F8-KO) è un modello ampiamente utilizzato per lo studio dell'emofilia A 1,2. Questi topi ricapitolano le caratteristiche chiave della malattia e sono stati ampiamente utilizzati per lo sviluppo di trattamenti, come i prodotti FVIII ricombinanti 3,4,5 e le strategie di terapia genica 6,7.

Esistono vari modelli di lesioni emorragiche per valutare gli effetti farmacologici di diversi composti emostatici in vivo. Uno di questi modelli di coagulazione è il modello di sopravvivenza alla traslazione della vena della coda nei topi 8,9,10,11,12,13,14, che misura la capacità dei topi emofili di sopravvivere al dissanguamento dopo la traslazione della coda. Questo metodo è stato introdotto più di quattro decenni fa15 ed è ancora utilizzato 9,16,17. Tuttavia, il modello utilizza la sopravvivenza come endpoint e richiede l'osservazione degli animali per un periodo fino a 24 ore, durante il quale gli animali sono coscienti e quindi possono provare dolore e angoscia.

Modelli sanguinanti di durata più breve e in anestesia completa sono stati descritti in precedenza, come il modello di clip di coda (noto anche come punta della coda)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Tuttavia, per una completa normalizzazione della perdita di sangue dopo la sfida emorragica, questi modelli richiedono dosi di composti procoagulanti (ad esempio, FVIII) molto più elevate di quelle somministrate clinicamente29. Un diverso modello di lesione in anestesia, il metodo di sanguinamento della vena saphena, è sensibile a dosi più basse di composti procoagulanti30, ma richiede un alto livello di intervento dello sperimentatore poiché i coaguli devono essere interrotti frequentemente (al contrario di 3 volte nel modello presentato).

La standardizzazione verso un protocollo comune per testare nuovi composti procoagulanti faciliterebbe notevolmente il confronto dei dati tra i laboratori 31,32,33. Nei modelli TVT, non esiste ancora un accordo comune sugli endpoint studiati (perdita di sangue 7,26, tempo di sanguinamento 9,34 e tasso di sopravvivenza 35,36) e la lunghezza sperimentale varia tra gli studi13.

Il nostro obiettivo primario è quello di descrivere e caratterizzare un modello ottimizzato con elevata riproducibilità, la possibilità di studiare on-demand e un trattamento profilattico, la sensibilità all'intervento farmacologico equivalente al modello di sopravvivenza, ma non utilizzando la morte o la pre-morte come endpoint. Al fine di ridurre il dolore e l'angoscia, gli animali non dovrebbero essere coscienti durante il sanguinamento e un endpoint più etico deve essere implementato37.

I modelli di clip di coda sono generalmente condotti in una delle due varianti, amputando la punta della coda, ad esempio amputazione di 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 o, in una variante più grave, transettata ad un diametro di coda di circa 1-3 mm 8,22,25 . Ciò provoca un sanguinamento artero-venoso combinato, poiché le vene laterali e dorsali e l'arteria ventrale sono solitamente recise e, in generale, maggiore è l'amputazione, minore è la sensibilità a un composto procoagulante. Inoltre, poiché la punta della coda viene amputata, la lesione artero-venosa viene esposta senza alcun tessuto opposto; quindi, almeno in teoria, è dissimile dai più comuni sanguinamenti emofilici.

Come suggerisce il nome, solo la vena è ferita nei modelli di trasezione della vena della coda come descritto in questo articolo, causando così un sanguinamento esclusivamente venoso. Poiché il vaso non è completamente reciso, la lesione dovrebbe essere più piccola rispetto ai modelli di amputazione e il tessuto intorno al taglio, a cui un coagulo può aderire, viene trattenuto. Inoltre, c'è una pressione sanguigna più bassa nella vena rispetto all'arteria. Questi fattori contribuiscono ad una maggiore sensibilità rispetto ai modelli di amputazione, in modo tale che la normalizzazione del sanguinamento può essere raggiunta con dosi clinicamente rilevanti di terapia sostitutiva, ad esempio con rFVIII nell'emofilia A, che è utile per valutare l'entità e la durata degli effetti del trattamento procoagulante 26,38,39.

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Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dall'Animal Welfare Body di Novo Nordisk A/S e dall'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali, il Ministero danese dell'alimentazione, dell'agricoltura e della pesca. Il metodo ottimizzato di 40 minuti include l'anestesia e il tempo di dosaggio nella progettazione (Figura 1). Per questa procedura sono necessari topi emofili di entrambi i sessi tra le 10-16 settimane di età.

1. Preparativi prima dello studio

  1. Preparare le soluzioni dosatrici nelle concentrazioni corrette.
  2. Iniziare il bagno d'acqua e riscaldare a 37 °C. Riempire le provette centrifughe da 15 ml per la raccolta del sangue con soluzione salina (0,9% NaCl).
  3. Posizionare i tubi salini da 15 ml nei fori della piastra di base riscaldata almeno 15 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
  4. Identifica i topi e registra il loro peso. Evitare di maneggiare i topi più del necessario in quanto ciò può causare stress e influenzare lo studio.
  5. Preparare la postazione di lavoro nella cappa aspirante prima di procedere in modo che tutto sia a portata di mano: tovaglioli, portacocca, garza, siringhe, bisturi, cronometri e carta di notazione del flusso sanguigno.
  6. Posizionare il segno di coda e tagliare i blocchi sulla piastra riscaldante - i blocchi freddi faranno contrarre le vene e quindi influenzeranno il sanguinamento.

2. Anestesia

  1. Eseguire la procedura di anestesia isoflurano all'interno di una cappa aspirante.
  2. Impostare il vaporizzatore a gas su isoflurano inizialmente al 5% in 30% O2/70% N2O nella camera di anestesia con portata 1 L/min. Lasciare un tempo sufficiente per il riempimento della camera di anestesia (circa 5 minuti a seconda del volume della camera e della portata del gas). Garantire un'induzione rapida (meno di un minuto).
  3. Metti i topi nella camera di anestesia fino a quando non perdono conoscenza.
    NOTA: Ciò dovrebbe avvenire entro un minuto o meno se la camera è sufficientemente riempita.
  4. Garantire una corretta anestesia dall'assenza di risposta dolorosa al riflesso del pedale (pizzico fermo della punta).
  5. Posizionare i topi sulla piastra riscaldante, assicurandosi che il naso sia nel cono del naso.
  6. Ridurre l'anestesia a un livello di mantenimento del 2% di isoflurano in 30% O2/70% N2O e posizionare un coperchio di plastica sopra i topi per ridurre la perdita di calore. Applicare un unguento per gli occhi adatto per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  7. Contrassegnare la coda con un diametro di 2,5 mm utilizzando il blocco del segno di coda. Non forzare la coda nella fessura nel blocco - deve adattarsi perfettamente (Figura supplementare 1)
  8. Posizionare la coda nel tubo salino per almeno 5 minuti per garantire una vena della coda calda che sia ottimale per il dosaggio endovenoso (e.v.).

3. Dosaggio della soluzione di prova

  1. Metti un topo nel supporto della coda con il naso in una maschera di anestesia.
  2. Dosare l'animale con il composto di interesse (in questo caso, rFVIII) e avviare immediatamente il cronometro (t = 0).
  3. Riposizionare il mouse sulla piastra riscaldante con la coda nel tubo salino. Ripeti la procedura con gli altri topi.

4. Esecuzione della transezione della vena della coda

  1. Eseguire la traslazione della vena della coda esattamente 5 minuti dopo la somministrazione. Posizionare la coda nel blocco di taglio e ruotare di 90° per esporre la vena (Figura supplementare 2).
  2. Eseguire il taglio sul lato opposto/vena da dove è stata dosata la soluzione di prova.
  3. Disegna la lama del bisturi #11 attraverso la fessura del blocco di taglio che tiene la coda per creare sanguinamento. Reimpostare il cronometro e riportare immediatamente la coda alla soluzione salina.

5. Tempo di osservazione e sfide

  1. Osservare l'emorragia e annotare l'inizio e l'arresto dell'emorragia per 40 minuti; annotalo sulla carta di notazione del flusso sanguigno.
    NOTA: Questa valutazione visiva del sanguinamento può variare leggermente a causa della soggettività.
  2. Il sanguinamento primario deve fermarsi entro 3 minuti dopo il taglio. Se questo non è il caso, squalificare il topo, eutanasizzare e sostituire (il mancato arresto dell'emorragia primaria può indicare una lesione troppo grave o una mancanza di emostasi primaria, come nei topi vWF KO).
  3. Se non c'è sanguinamento a 10 minuti, 20 minuti e 30 minuti dopo l'infortunio, sfidare il taglio della coda come descritto nei passaggi 4-5.
  4. Utilizzare un tampone di garza imbevuto di soluzione salina calda da un tubo separato tenuto a bagnomaria. Sollevare la coda dalla soluzione salina e pulire delicatamente due volte con la garza bagnata in direzione distale sopra il taglio della coda.
  5. Dopo ogni sfida, immergere immediatamente nuovamente la coda nel tubo salino.
  6. A t = 40 min, interrompere la raccolta del sangue rimuovendo la coda dal tubo salino.

6. Prelievo di sangue

  1. Dopo t = 40 min, ottenere campioni di sangue dalla vena sopraorbitale.

7. Eutanasia

  1. Eutanasia dei topi per lussazione cervicale mentre erano ancora in anestesia completa.

8. Trattamento dei campioni

  1. Centrifugare le provette di raccolta del sangue da 15 ml con soluzione salina a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Scartare il surnatante dai tubi da 15 mL, risospesciare il pellet in 2-14 mL di soluzione lisciante per eritrociti (RBC) e quindi diluirlo fino a raggiungere un colore chiaro del caffè.
  3. Notare il volume totale (volume di sangue + volume di soluzione di lisi degli eritrociti (RBC) aggiunto utilizzando i segni di graduazione sul tubo).
  4. Trasferire 2 ml della diluizione in un tubo di emoglobina e conservarlo in frigorifero fino all'analisi dell'emoglobina.
  5. Determinare la perdita di sangue misurando la concentrazione di emoglobina nella soluzione salina. Misurare l'assorbanza a 550 nm su un lettore di micropiastre (Tabella dei materiali).
  6. Convertire l'assorbanza in emoglobina nmol utilizzando una curva standard preparata dall'emoglobina umana (Tabella dei materiali) e correggere la diluizione con soluzione di lisante RBC.

9. Analisi statistiche

  1. Analizzare i dati utilizzando un software appropriato. Qui è stato utilizzato il software GraphPad Prism. Nel corso di una serie di studi, i seguenti metodi statistici sono risultati per funzionare bene.
    NOTA: Per analizzare la perdita di sangue, il tempo di sanguinamento, l'esposizione, la conta piastrinica e l'ematocrito; È stato utilizzato il test ANOVA di Brown-Forsythe e Welch (poiché i dati erano continui ma senza omogeneità di varianza dei residui) applicando il test di Dunnett per adattarsi a confronti multipli. Un test di Pearson è stato utilizzato per testare le correlazioni tra tempo di sanguinamento, perdita di sangue e dosi. Per determinare i valori di ED50 , è stata montata un'equazione di risposta inversa (dose) a quattro parametri sui dati di sanguinamento e perdita di sangue. Per analizzare l'effetto di genere, è stato utilizzato un test ANOVA bidirezionale, applicando la correzione di Bonferroni per adattarsi a confronti multipli. Il livello di significatività è stato definito come P < 0,05. I dati vengono visualizzati come mezzi ± SEM.

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Representative Results

Per valutare l'applicabilità del modello ottimizzato, è stato condotto uno studio su topi F8-KO (background genetico C57BL) somministrati con una terapia sostitutiva con fattore VIII ricombinante disponibile in commercio (rFVIII); sono state testate quattro diverse dosi: 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg. Inoltre, abbiamo testato il corrispondente controllo del veicolo (negativo) nei topi F8-KO e nel gruppo wild-type (WT) utilizzando topi C57BL come gruppo di controllo positivo per valutare l'intervallo di risposta nel modello.

Seguendo il protocollo ottimizzato, c'è stata una significativa riduzione della perdita di sangue per i gruppi di trattamento rFVIII rispetto al gruppo veicolo. Inoltre, è stata osservata una riduzione del tempo di sanguinamento nei gruppi di trattamento da 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg rispetto al gruppo veicolo (Figura 2). Nei topi WT, la perdita totale di sangue variava da 201,8-841,9 nmol Hgb (IC 95%) e nei topi veicolari variava da 5335 a 7148 nmol Hgb (IC 95%). Seguendo l'equivalenza approssimativa di 1000 nmol Hgb ~ 125 μL di sangue intero, il sanguinamento medio nei topi trattati con veicoli era di 780,25 μL, mentre sul gruppo 20 UI / kg era di 89,95 μL. Pertanto, una dose di 20 UI / kg ha completamente normalizzato il sanguinamento e la somministrazione di 10 UI / kg ha causato un effetto significativo, riducendo la perdita di sangue quasi al limite superiore dell'intervallo WT (Figura 3). Il tempo di sanguinamento dei topi WT variava da 0,98-9,16 minuti (IC al 95%) e i livelli di dose di 10 UI / kg e 20 UI / kg riducevano il tempo di sanguinamento all'interno di questo intervallo. Una forte correlazione tra perdita di sangue e tempo di sanguinamento è stata osservata nei dati combinati (r = 0,9357, P < 0,0001) (Figura 4).

Per valutare la sensibilità del modello, è stata adattata un'equazione di risposta log(dose) inversa a quattro parametri alle osservazioni della perdita di sangue e del tempo di sanguinamento ed è stato osservato un chiaro effetto dose-dipendente della somministrazione di rFVIII sulla perdita di sangue e per il tempo di sanguinamento (Figura 3). I valori stimati di ED50 per la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento erano rispettivamente di 2,41 ± 1,69 UI/kg e 2,55 ± 2,80 UI/kg.

Per illustrare come si verifica il sanguinamento nel modello, tutti gli episodi di sanguinamento registrati sono stati tracciati per fornire una visualizzazione della lunghezza e del numero di sanguinamenti per ogni singolo topo (Figura 5). Il sanguinamento primario è molto simile in tutti i gruppi. La maggior parte del gruppo di veicoli emofili inizia a sanguinare di nuovo prima della seconda sfida a 20 minuti, e per circa la metà di questi animali, l'emorragia non si ferma dopo la prima sfida. Infine, come descritto, il trattamento con rFVIII ha ridotto la durata degli episodi emorragici nei topi F8-KO trattati rispetto al veicolo, con una variazione già osservabile alla dose più bassa. Ai livelli di dose più alti, la maggior parte dei topi sanguinava solo brevemente dopo essere stata sfidata.

La concentrazione plasmatica di rFVIII è stata misurata mediante il saggio loci (Luminescent oxygen channeling assay) che rileva hFVIII e analoghi per verificare che l'effetto osservato nel ridurre la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento fosse dipendente dalla concentrazione (Figura 6). Esiste variabilità all'interno di ciascun gruppo (CV medio 46%), ma si possono comunque osservare differenze significative tra i gruppi, confermando così che l'effetto osservato nella perdita di sangue e nel tempo di sanguinamento dipende dalla concentrazione plasmatica di FVIII. Tutti i topi trattati con veicolo misurati al di sotto del limite inferiore di quantificazione per il test (2 U/L) e sono rappresentati con questo valore. I topi WT non sono stati misurati poiché il test FVIII applicato è specifico per rilevare FVIII umano.

La conta piastrinica e l'ematocrito sono stati determinati per tutti i gruppi utilizzando i campioni di sangue raccolti dopo il sanguinamento (Figura 7 e misurati con un analizzatore ematologico (Tabella dei materiali). Non c'è stata alcuna variazione tra i gruppi nella conta piastrinica, indicando che il numero di piastrine non è influenzato e i topi, quindi, rimangono capaci di emostasi primaria. Per le misurazioni dell'ematocrito, sono stati osservati livelli normali negli animali che ricevevano dosi moderate e più elevate di FVIII (5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg), mentre livelli significativamente più bassi sono stati osservati nel veicolo e 1 UI/kg trattati (rispetto agli animali WT). Questa è un'osservazione frequente negli animali emofili dopo forti emorragie.

Classicamente, solo un genere di animali (tipicamente maschi) è stato utilizzato negli studi sugli animali, e questo è descritto anche per i modelli di sopravvivenza TVT 8,9,11,12. Sforzandosi di ridurre il numero totale di topi emofili necessari negli studi futuri (per l'allevamento e lo studio), sono stati utilizzati entrambi i sessi. Per valutare l'effetto del genere in questo modello ottimizzato (Figura 8), sia la perdita di sangue che i risultati del tempo di sanguinamento sono stati sottoposti ad analisi ANOVA bidirezionale con genere e dose come fattori. In questa analisi, l'effetto della dose di rFVIII era statisticamente significativo (P < 0,0001), ma il sesso del topo non ha influenzato significativamente i risultati (P 0,35) e non è stata trovata alcuna interazione significativa tra i parametri, indicando che le risposte al trattamento non differivano tra i sessi.

Figure 1
Figura 1: Progettazione temporale del setup sperimentale. La fase precedente alla transezione della vena della coda (TVT) comprende l'induzione dell'anestesia, il riscaldamento della coda in soluzione salina e il dosaggio. Dopo la lesione TVT, vengono eseguiti 40 minuti di monitoraggio dell'emorragia in anestesia, con sfide successive ogni 10 minuti. La procedura sperimentale si conclude con la raccolta di campioni di sangue e l'eutanasia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Effetto di rFVIII dopo somministrazione endovenosa. Perdita totale di sangue (pannello di sinistra) e tempo di sanguinamento totale (pannello di destra) di topi F8-KO. Ogni topo è mostrato come osservazioni individuali e media ± SEM. Le diverse dosi di prova di rFVIII sono rappresentate nell'asse x. I dati sono stati analizzati da Brown-Forsythe e Welch ANOVA applicando il test di Dunnett per adattarsi a confronti multipli. P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Curve dose-risposta per perdita di sangue e tempo di sanguinamento. Perdita di sangue (pannello di sinistra) e tempo di sanguinamento (pannello di destra). L'area grigia rappresenta l'IC del 95% rispetto ai valori di 6 topi C57BL/6 wild-type non trattati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Grafico di correlazione per la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Profili di sanguinamento individuali in topi trattati con wild-type, veicolo, 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg rFVIII. Ogni linea rappresenta il profilo sanguinante di un singolo topo, mentre ogni barra tratteggiata rappresenta un episodio sanguinante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Esposizione a rFVIII. La concentrazione di FVIII nel plasma è stata misurata mediante un saggio di canalizzazione dell'ossigeno luminescente (LOCI) per il rilevamento di FVIII umano. I topi veicolari erano al di sotto del limite inferiore di quantificazione (LLOQ) e sono stati quindi tracciati con il valore LLOQ (2 U / L). Gli animali WT non sono stati misurati poiché il test FVIII applicato è specifico per rilevare FVIII umano. Le diverse dosi di prova di rFVIII e un controllo WT sono rappresentate nell'asse x. ** P < 0,01, *** P < 0,001 e **** P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Dati ematologici. La conta piastrinica (pannello di sinistra) e l'ematocrito (pannello di destra) dei topi F8-KO sono mostrati come osservazioni individuali medie con SEM. Le diverse dosi di prova di rFVIII e un controllo WT sono rappresentate sull'asse x. I dati sono stati analizzati da Brown-Forsythe e Welch ANOVA applicando il test di Dunnett per adattarsi a confronti multipli. ** P < 0,01 e *** P < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8. Effetto del genere. La perdita di sangue (pannello di sinistra) e il tempo di sanguinamento (pannello di destra) classificati per trattamento sono mostrati come osservazioni individuali con ± SEM. I dati sono stati analizzati da ANOVA bidirezionale applicando la correzione bonferroni per regolare per confronti multipli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tempo di sanguinamento ED50 (UI/kg) Perdita di sangue ED50 (UI/kg) Sopravvivenza a ED50 (UI/kg)
Modelli in anestesia Modello di transezione della vena di coda ottimizzato 2.6 ± 2.8 2.4 ± 1.7 non pertinente
Vena saphena modello30 8.1 ± 2.2 5.1 ± 2.1 non pertinente
Clip di coda moderata (L=3mm)27 non segnalato 4,6 ± 0,5 non pertinente
Clip di coda moderata (L=4mm)28 39 28 non pertinente
Clip di coda moderata (L=4mm)20 non segnalato 53 non pertinente
Modelli di sopravvivenza Modello di sopravvivenza alla traslazione della vena della coda36 non segnalato non segnalato 58
Modello di sopravvivenza alla transezione della vena della coda10 non segnalato non segnalato 21

Tabella 1: Valori ED50 . Confronto dei valori di ED50 di diversi modelli di sanguinamento disponibili per studi sull'emofilia nei topi. I dati sono estratti da articoli citati [riferimenti in apice] e presentati come ED50 (UI/kg)

Figura supplementare 1: Modello di misurazione. Prodotto in alluminio. Specifiche di dimensioni: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x P x A). Scanalatura: profondità 2,5 mm e larghezza 2,5 mm; raggio 1,25 mm. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Modello di taglio. Prodotto in acciaio inox. Specifiche di dimensioni: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x P x A). Scanalatura: profondità 3 mm e larghezza 3 mm; raggio 1,5 mm. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questo metodo ottimizzato di transezione della vena della coda (TVT) presenta diversi vantaggi rispetto al metodo di sopravvivenza TVT. Gli animali sono completamente anestetizzati per l'intera durata dello studio, il che rende più facile la manipolazione del topo e aumenta il benessere degli animali. Inoltre, a differenza del modello di sopravvivenza TVT, non è richiesta l'osservazione notturna e questo modello ottimizzato offre la possibilità di misurare la perdita di sangue e osservare il tempo esatto di sanguinamento oltre 40 minuti. Inoltre, periodi più lunghi di sanguinamento negli animali coscienti possono causare la morte per dissanguamento, portando a dolore e angoscia negli animali e probabilmente stress, potenzialmente con conseguente aumento della variazione14. La perdita di sangue e il tempo di sanguinamento sono stati caratterizzati e convalidati con successo come endpoint, sostituendo il tempo alla morte o alla pre-morte. La lesione della coda effettiva è ben definita e standardizzata poiché utilizza una guida del blocco di taglio per eseguire il TVT, assicurando un taglio riproducibile, riducendo la difficoltà della procedura e la variabilità tecnica. Pertanto, è possibile ottenere una maggiore robustezza del modello, riducendo il numero di animali necessari. Inoltre, i dati hanno dimostrato che è possibile utilizzare topi sia maschi che femmine, riducendo così il numero totale di animali da allevare, in conformità con i principi 3R. Insieme a queste osservazioni, c'è una tendenza che i topi femmina sanguinano leggermente meno e variano leggermente di più nei gruppi ad alto sanguinamento, ma non nei gruppi a basso sanguinamento. Misure di perdita di sangue più basse potrebbero essere associate a femmine di dimensioni più piccole e quindi meno volume di sangue rispetto ai maschi della stessa età.

I sanguinamenti spontanei nei pazienti emofilici sono di solito interni, in particolare coinvolgendo sanguinamento muscolo-scheletrico, dei tessuti molli e mucocutaneo, mentre le lesioni esterne (come tagli minori) non sono la causa più comune di sanguinamenti prolungati, anche se tagli e traumi più gravi possono essere pericolosi per la vita40,41. Questo modello ottimizzato induce sanguinamento solo venoso, mentre altri modelli, come la clip della coda, inducono un mix di sanguinamento arterio-venoso. Poiché il modello descritto è un modello solo venoso, l'effetto dose procoagulante in questo modello TVT potrebbe non riflettere l'effetto in una lesione arteriosa più grave; pertanto, altri modelli di sanguinamento dovrebbero essere utilizzati se tali sanguinamenti sono a fuoco.

Come mostrato dal profilo di sanguinamento individuale, il sanguinamento primario è molto simile in tutti i gruppi che indicano che l'emostasi primaria, cioè l'aggregazione di piastrine attivate, è intatta nell'impostazione42 dell'emofilia A. In una lesione immobilizzata, anche in caso di emofilia grave, l'aggregazione piastrinica può essere sufficiente per attenuare il sanguinamento. Per questo motivo, attraverso studi empirici, abbiamo scoperto che indurre una sfida emorragica ogni 10 minuti è un passo necessario nel protocollo al fine di interrompere gli aggregati di piastrine attivate, che possono essere abbastanza forti da prevenire il sanguinamento anche senza la generazione di fibrina dalla coagulazione funzionale. Poiché i topi completamente anestetizzati non si muovono e non possono sfidare fisicamente la lesione come accade nel modello di sopravvivenza TVT non anestetizzato, è stato necessario introdurre i passaggi di sfida per impedire che l'aggregazione piastrinica da sola attenui il sanguinamento. Alcuni topi emofilici non trattati sanguinano spontaneamente prima della sfida, ma dopo la prima sfida, si verificano sanguinamenti spontanei nella maggior parte dei topi emofilici non trattati e, dopo la seconda sfida, molti sanguinano continuamente fino alla fine dell'esperimento. Come previsto, c'è stato un aumento del sanguinamento nei topi F8-KO del veicolo rispetto ai topi WT. I topi trattati con dosi aumentate di rFVIII hanno mostrato una riduzione dose-dipendente sia della perdita di sangue che del tempo di sanguinamento. Un effetto significativo sul sanguinamento è stato osservato a dosi di 5 UI/kg e superiori (rispetto ai topi trattati con veicoli). Le due dosi più alte hanno ridotto il sanguinamento a livelli abbastanza vicini alla risposta al sanguinamento wild-type, indicando la normalizzazione o la quasi normalizzazione del sanguinamento.

Nella Tabella 1, presentiamo un confronto di diversi valori di ED50 per diversi modelli di sanguinamento, classificati dagli endpoint studiati. In questo modello ottimizzato, abbiamo osservato valori ED50 comparabili per la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento (2,4 ± 1,7 UI / kg e 2,6 ± 2,8 UI / kg, rispettivamente). Utilizzando lo stesso modello che studia rFVIIa, i valori di ED50 per la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento erano rispettivamente di 0,42 mg/kg e 0,39 mg/kg, rispettivamente38. Si tratta di una maggiore sensibilità all'intervento farmacologico rispetto ai modelli di sanguinamento precedentemente descritti in anestesia, come il modello a clip di coda, con FVIII ED50 per perdita di sangue di 4,6 ± 0,5 UI / kg27, 28 UI / kg28 e 53 UI / kg20. Inoltre, c'è un'alta variabilità dei valori ED50 nei diversi modelli di clip di coda 20,27,28. Un altro modello in anestesia è il modello di clip di coda severa. È un metodo più veloce poiché il periodo di osservazione è di soli 20 minuti, ma è meno sensibile all'attività procoagulante. Dosi superiori a 200 UI/kg di FVIII sono state necessarie per ottenere una riduzione statisticamente significativa della perdita di sangue rispetto agli animali trattati con veicoli25. Nel modello di vena saphena30, il valore di ED50 per il tempo di sanguinamento era di 8,1 ± 2,2 UI / kg e ED50 per la perdita media di sangue era di 5,1 ± 2,1 UI / kg, anche meno sensibile del nostro modello raffinato per quanto riguarda entrambi i parametri. Inoltre, questo modello richiede un lavoro delicato per eseguire la lesione del vaso e molteplici interventi ripetuti che, se non eseguiti in modo riproducibile, potrebbero influenzare il risultato.

Nel modello di sopravvivenza TVT tradizionale, la sopravvivenza viene valutata per un periodo di 24 ore dopo la somministrazione, durante il quale possono verificarsi sanguinamento o ri-sanguinamento in qualsiasi momento. Pertanto, l'efficacia nel modello di sopravvivenza TVT richiede che l'effetto procoagulante del trattamento persista almeno per la maggior parte del periodo di osservazione di 24 ore. Nel metodo qui presentato, valutiamo gli effetti acuti tra 5 min e 40 min dopo la somministrazione; pertanto, un confronto diretto dei valori di ED50 è difficile da stabilire poiché saranno necessarie dosi più elevate nei modelli di sopravvivenza al fine di mantenere la copertura emostatica durante l'ultima parte del periodo di osservazione. Tuttavia, se lo si desidera, il modello TVT ottimizzato può essere utilizzato per valutare la durata della copertura emostatica introducendo un ritardo tra la somministrazione e la procedura di sanguinamento. Questo è stato descritto per una versione precedente del nostro modello TVT ottimizzato in cui l'esecuzione del TVT 24 ore dopo il dosaggio ha comportato un ED50 di circa 10-15 UI / kg per rFVIII26 non modificato. Come indicato nella Tabella 1, nei modelli di transezione di coda con una sopravvivenza di 24 ore come endpoint, sono stati riportati valori di ED50 di 21 UI/kg 9 e 58 UI/kg36 di rFVIII. Allo stesso modo, i modellidi sopravvivenza a clip di coda 8 richiedono anche dosi procoagulanti più elevate rispetto alle loro controparti acute.

In prospettiva, diversi fattori della coagulazione (FVIII, FVIIa, FIX) e derivati, alcuni dei quali sono ora commercializzati, sono stati valutati con il modello ottimizzato utilizzando diversi ceppi di topi emofilici26,38,43,44,45,46,47. Siamo stati anche in grado di adattare il modello allo studio degli interventi on-demand dosando dopo la transezione, poco prima della prima sfida. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questo modello per valutare gli anticorpi bispecifici con attività procoagulante (Østergaard et al., accettati per la pubblicazione in Blood), superando le sfide di cross-reattività delle specie dosando FIX umano e FX umano. Ciò dimostra la versatilità e il valore traslazionale del modello nello sviluppo di nuovi farmaci nel campo dell'emofilia, come le strategie mirate alle piastrine48. Le strategie basate su AAV o di modifica del genoma possono anche essere valutate nei casi in cui esiste un surrogato farmacologicamente attivo nei topi. Pertanto, questo modello di sanguinamento TVT ottimizzato è un'alternativa alla traslazione della vena della coda e ai modelli di sopravvivenza della clip della coda, nonché una valida alternativa ad altri modelli di sanguinamento in anestesia. Questo modello è più umano rispetto al modello di sopravvivenza e un esempio di raffinamento in quanto gli animali non provano dolore e sofferenza. A nostro avviso, la sensibilità ai livelli di dose clinicamente rilevanti, la relativa semplicità tecnica e l'evitare la morte / pre-morte come endpoint sono vantaggi significativi.

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Disclosures

Gli autori sono o erano dipendenti e/o azionisti di Novo Nordisk A/S al momento della realizzazione di questa ricerca.

Acknowledgments

Esther Bloem e Thomas Nygaard sono riconosciuti per il supporto con le misurazioni di FVIII nel plasma. Bo Alsted è riconosciuta per aver disegnato e lavorato la sagoma e i blocchi di taglio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scalpel blade Swann-Morton 503
15 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One, Austria 188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe 320830
Advate Takeda, Japan Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol Hartmann, Soft-Zellin 999 979
Centrifuge Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution Lysebio, ABX Diagnostics 906012
Gauze
Haematological analyser Sysmex CT-2000iv
Heating lamp on stand Phillips IR250
Heating pad with thermostat CMA model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent HemoCue, Denmark HemoCue calibrator, 707037 Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box Sigma Delta Dameca
Isoflurane Baxter 26675-46-7
Magnifier with lights Eschenbach
Measuring template (Aluminum) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips Finnpipette
Photometer Molecular Devices Corporation, CA, USA SpectraMax 340 photometer
Prism Software GraphPad, San Diego, CA, USA Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl Fresenius Kabi, Sweden 883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat TYP 3/8 Julabo

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Modello di sanguinamento della traslazione della vena della coda in topi di emofilia A completamente anestetizzati
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Carol Illa, A., Baumgarten, S.,… More

Carol Illa, A., Baumgarten, S., Danielsen, D., Larsen, K., Elm, T., Johansen, P. B., Knudsen, T., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ley, C. D. Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice. J. Vis. Exp. (175), e62952, doi:10.3791/62952 (2021).

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