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Biology

Modelo de sangrado por transyección de la vena de la cola en ratones con hemofilia A totalmente anestesiada

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62952
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 4, 5, 1, 6, 1
1Global Drug Discovery, Novo Nordisk A/S, 2Department of Veterinary and Animal Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Independent consultant, 5Catalyst Biosciences, 6Værløse Dyreklinik

Summary

El modelo de sangrado de transección refinada de la vena de la cola (TVT) en ratones anestesiados es un método sensible in vivo para la evaluación del sangrado hemofílico. Este modelo optimizado de sangrado TVT utiliza la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado como puntos finales, refinando otros modelos y evitando la muerte como punto final.

Abstract

Los modelos de sangrado de cola son herramientas importantes en la investigación de la hemofilia, específicamente para la evaluación de los efectos procoagulantes. El modelo de supervivencia de la transección de la vena de la cola (TVT) se ha preferido en muchos entornos debido a la sensibilidad a las dosis clínicamente relevantes de FVIII, mientras que otros modelos establecidos, como el modelo de clip de la cola, requieren niveles más altos de compuestos procoagulantes. Para evitar el uso de la supervivencia como punto final, desarrollamos un modelo de TVT que establece la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado como puntos finales y la anestesia completa durante todo el experimento. Brevemente, los ratones anestesiados se colocan con la cola sumergida en solución salina templada (37 ° C) y se dosifican con el compuesto de prueba en la vena lateral derecha de la cola. Después de 5 min, la vena de la cola lateral izquierda se transecta utilizando una guía de plantilla, la cola se devuelve a la solución salina y todos los episodios de sangrado se monitorean y registran durante 40 minutos mientras se recolecta la sangre. Si no se produce sangrado a los 10 minutos, 20 minutos o 30 minutos después de la lesión, el coágulo se desafía suavemente limpiando el corte dos veces con un hisopo de gasa húmeda. Después de 40 min, la pérdida de sangre se cuantifica por la cantidad de hemoglobina sangrada en la solución salina. Este procedimiento rápido y relativamente simple da como resultado hemorragias consistentes y reproducibles. En comparación con el modelo de supervivencia TVT, utiliza un procedimiento más humano sin comprometer la sensibilidad a la intervención farmacológica. Además, es posible utilizar ambos sexos, reduciendo el número total de animales que necesitan ser criados, en cumplimiento de los principios de las 3R. Una limitación potencial en los modelos de sangrado es la naturaleza estocástica de la hemostasia, que puede reducir la reproducibilidad del modelo. Para contrarrestar esto, la interrupción manual del coágulo asegura que el coágulo sea desafiado durante el monitoreo, evitando que la hemostasia primaria (plaquetaria) detenga el sangrado. Esta adición al catálogo de modelos de lesiones hemorrágicas proporciona una opción para caracterizar los efectos procoagulantes de una manera estandarizada y humana.

Introduction

Los modelos animales son esenciales para comprender la patogénesis de la hemofilia y desarrollar y probar regímenes de tratamiento y terapias. El ratón knock-out factor VIII (F8-KO) es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de la hemofilia A 1,2. Estos ratones recapitulan características clave de la enfermedad y han sido ampliamente utilizados para el desarrollo de tratamientos, como los productos FVIII recombinantes 3,4,5 y las estrategias de terapia génica 6,7.

Existen varios modelos de lesiones hemorrágicas para evaluar los efectos farmacológicos de diferentes compuestos hemostáticos in vivo. Uno de estos modelos de coagulación es el modelo de supervivencia de la transección de la vena de la cola en ratones 8,9,10,11,12,13,14, que mide la capacidad de los ratones hemofílicos para sobrevivir a la exsanguinación después de la transección de la cola. Este método se introdujo hace más de cuatro décadas15 y todavía se utiliza 9,16,17. Sin embargo, el modelo utiliza la supervivencia como punto final y requiere la observación de los animales durante un período de hasta 24 h, durante el cual los animales están conscientes y, por lo tanto, pueden experimentar dolor y angustia.

Anteriormente se han descrito modelos sangrantes de menor duración y bajo anestesia completa, como el modelo de clip de cola (también conocido como punta de cola)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Sin embargo, para una normalización completa de la pérdida de sangre después del desafío hemorrágico, estos modelos requieren dosis de compuestos procoagulantes (por ejemplo, FVIII) mucho más altas que las administradas clínicamente29. Un modelo de lesión diferente bajo anestesia, el método de sangrado de vena saphena, es sensible a dosis más bajas de compuestos procoagulantes30, pero requiere un alto nivel de intervención del experimentador, ya que los coágulos deben interrumpirse con frecuencia (a diferencia de 3 veces en el modelo presentado).

La estandarización hacia un protocolo común para probar nuevos compuestos procoagulantes facilitaría en gran medida la comparación de datos entre laboratorios 31,32,33. En los modelos de TVT, aún no existe un acuerdo común sobre los criterios de valoración estudiados (pérdida de sangre 7,26, tiempo de sangrado 9,34 y tasade supervivencia 35,36), y la duración experimental varía entre los estudios13.

Nuestro objetivo principal es describir y caracterizar un modelo optimizado con alta reproducibilidad, la posibilidad de estudiar bajo demanda así como un tratamiento profiláctico, sensibilidad a la intervención farmacológica equivalente al modelo de supervivencia, pero sin utilizar la muerte o la casi muerte como criterios de valoración. Para reducir el dolor y la angustia, los animales no deben estar conscientes durante el sangrado y se debe implementar un punto final más ético37.

Los modelos de clip de cola generalmente se llevan a cabo en una de dos variantes, ya sea amputando la punta de la cola, por ejemplo, amputación de 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 o, en una variante más severa, transectada a un diámetro de cola alrededor de 1-3 mm 8,22,25 . Esto causa una hemorragia arteriovenosa combinada, ya que las venas lateral y dorsal y la arteria ventral generalmente se cortan, y en general, cuanto mayor es la amputación, menor es la sensibilidad a un compuesto procoagulante. Además, dado que la punta de la cola está amputada, la lesión arteriovenosa se expone sin ningún tejido opuesto; por lo tanto, al menos en teoría, es diferente a las hemorragias hemofílicas más comunes.

Como su nombre lo indica, solo la vena se lesiona en los modelos de transección de la vena de la cola como los descritos en este documento, lo que resulta en una hemorragia exclusivamente venosa. Dado que el vaso no está completamente cortado, se espera que la lesión sea más pequeña que en los modelos de amputación, y el tejido alrededor del corte, al que puede adherirse un coágulo, se retiene. Además, hay una presión arterial más baja en la vena en comparación con la arteria. Estos factores contribuyen a una mayor sensibilidad en relación con los modelos de amputación, de modo que la normalización de la hemorragia se puede lograr con dosis clínicamente relevantes de terapia de reemplazo, por ejemplo, con rFVIII en la hemofilia A, lo que es útil para evaluar la magnitud y durabilidad de los efectos del tratamiento procoagulante 26,38,39.

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Protocol

Todos los procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Organismo de Bienestar Animal de Novo Nordisk A/S, y la Inspección Danesa de Experimentos Con Animales, el Ministerio danés de Alimentación, Agricultura y Pesca. El método optimizado de 40 minutos incluye anestesia y tiempo de dosificación en el diseño (Figura 1). Se requieren ratones hemofílicos de ambos sexos entre las 10-16 semanas de edad para este procedimiento.

1. Preparativos previos al estudio

  1. Prepare las soluciones dosificadoras en las concentraciones correctas.
  2. Inicie el baño de agua y caliente a 37 °C. Llene los tubos centrífugos de 15 ml para la extracción de sangre con solución salina (0,9% naCl).
  3. Coloque los tubos salinos de 15 ml en los orificios de la placa base calentada al menos 15 minutos antes del inicio del experimento.
  4. Identifique a los ratones y registre su peso. Evite manipular ratones más de lo necesario, ya que esto puede causar estrés y afectar el estudio.
  5. Prepare la estación de trabajo en la campana extractora antes de continuar para que todo esté a su alcance: servilletas, soporte de cola, gasa, jeringas, bisturíes, cronómetros y papel de notación de flujo sanguíneo.
  6. Coloque la marca de la cola y los bloques de corte en la placa de calentamiento: los bloques fríos harán que las venas se contraigan y, por lo tanto, afectarán el sangrado.

2. Anestesia

  1. Realice el procedimiento anestésico de isoflurano dentro de una campana extractora de humos.
  2. Ajuste el vaporizador de gas a inicialmente 5% de isoflurano en 30% O2/70% N2O en la cámara de anestesia con 1 L/min de flujo. Deje suficiente tiempo para que la cámara de anestesia se llene (aproximadamente 5 minutos dependiendo del volumen de la cámara y la tasa de flujo de gas). Asegurar una inducción rápida (menos de un minuto).
  3. Coloque a los ratones en la cámara de anestesia hasta que pierdan el conocimiento.
    NOTA: Esto debe ocurrir dentro de un minuto o menos si la cámara está suficientemente llena.
  4. Asegurar una anestesia adecuada por la ausencia de respuesta dolorosa al reflejo del pedaleo (pellizco firme del dedo del pie).
  5. Coloque los ratones en la placa de calentamiento, asegurándose de que la nariz esté en el cono de la nariz.
  6. Reducir la anestesia a un nivel de mantenimiento de 2% de isoflurano en 30% O2/70% N2O y colocar una cubierta de plástico sobre los ratones para reducir la pérdida de calor. Aplique un ungüento adecuado para los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
  7. Marque la cola en un diámetro de 2,5 mm utilizando el bloque de marca de cola. No fuerce la cola en la hendidura del bloque, debe ajustarse perfectamente (Figura suplementaria 1)
  8. Coloque la cola en el tubo salino durante al menos 5 minutos para asegurar una vena de la cola caliente que sea óptima para la dosificación intravenosa (i.v.).

3. Dosificación de la solución de prueba

  1. Coloque un ratón en el soporte de la cola con la nariz en una máscara de anestesia.
  2. Dosifique al animal con el compuesto de interés (en este caso, rFVIII) e inicie inmediatamente el cronómetro (t = 0).
  3. Coloque el ratón de nuevo en la placa calefactora con la cola en el tubo salino. Repita el procedimiento con los otros ratones.

4. Realización de la transección de la vena de la cola

  1. Realice la transección de la vena de la cola exactamente 5 minutos después de la dosificación. Coloque la cola en el bloque de corte y gire 90° para exponer la vena (Figura suplementaria 2).
  2. Realice el corte en el lado opuesto / vena desde donde se dosificó la solución de prueba.
  3. Dibuje la hoja de bisturí # 11 a través de la hendidura del bloque de corte que sostiene la cola para crear sangrado. Restablezca el cronómetro y devuelva la cola inmediatamente a la solución salina.

5. Tiempo de observación y desafíos

  1. Observe el sangrado y anote el inicio y la detención del sangrado a lo largo de 40 minutos; anotarlo en el papel de notación del flujo sanguíneo.
    NOTA: Esta evaluación visual del sangrado puede variar ligeramente debido a la subjetividad.
  2. El sangrado primario debe detenerse dentro de los 3 minutos posteriores a la realización del corte. Si este no es el caso, descalificar al ratón, sacrificar y reemplazar (no detener la hemorragia primaria puede indicar una lesión demasiado grave o falta de hemostasia primaria, como en los ratones vWF KO).
  3. Si no hay sangrado a los 10 minutos, 20 minutos y 30 minutos después de la lesión, desafíe el corte de la cola como se describe en los pasos 4-5.
  4. Use un hisopo de gasa empapado en solución salina tibia de un tubo separado que se mantiene en el baño de agua. Levante la cola de la solución salina y limpie suavemente dos veces con la gasa húmeda en una dirección distal sobre el corte de la cola.
  5. Después de cada desafío, vuelva a sumergir inmediatamente la cola en el tubo salino nuevamente.
  6. A t = 40 min, detenga la recolección de sangre retirando la cola del tubo salino.

6. Muestreo de sangre

  1. Después de t = 40 min, obtenga muestras de sangre de la vena supraorbitaria.

7. Eutanasia

  1. Eutanasiar a los ratones por dislocación cervical mientras aún están bajo anestesia completa.

8. Tratamiento de muestras

  1. Centrifugar los tubos de extracción de sangre de 15 ml con solución salina a 4000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  2. Deseche el sobrenadante de los tubos de 15 ml, vuelva a suspender el pellet en 2-14 ml de solución lisadora de eritrocitos (RBC) y luego diluya hasta que alcance un color de café claro.
  3. Tenga en cuenta el volumen total (volumen de sangre + volumen de solución de lisado de eritrocitos (RBC) agregado utilizando las marcas de graduación en el tubo).
  4. Transfiera 2 ml de la dilución a un tubo de hemoglobina y refrigere hasta el análisis de hemoglobina.
  5. Determine la pérdida de sangre midiendo la concentración de hemoglobina en la solución salina. Mida la absorbancia a 550 nm en un lector de microplacas (Tabla de Materiales).
  6. Convertir la absorbancia a nmol de hemoglobina utilizando una curva estándar preparada a partir de hemoglobina humana (Tabla de Materiales) y corregir la dilución con solución lisante de glóbulos rojos.

9. Análisis estadísticos

  1. Analice los datos utilizando el software adecuado. Aquí se utilizó el software GraphPad Prism. En una variedad de estudios, se encontró que los siguientes métodos estadísticos tuvieron un buen desempeño.
    NOTA: Para analizar la pérdida de sangre, el tiempo de sangrado, la exposición, los recuentos de plaquetas y el hematocrito; Se utilizó la prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch, (ya que los datos eran continuos pero sin homogeneidad de varianza de los residuos) aplicando la prueba de Dunnett para ajustar las comparaciones múltiples. Se utilizó una prueba de Pearson para detectar correlaciones entre el tiempo de sangrado, la pérdida de sangre y las dosis. Para determinar los valores de ED50 , se ajustó una ecuación de respuesta de registro inverso (dosis) de cuatro parámetros a los datos de sangrado y pérdida de sangre. Para analizar el efecto de género, se utilizó una prueba ANOVA bidireccional, aplicando la corrección de Bonferroni para ajustar las comparaciones múltiples. El nivel de significancia se definió como P < 0,05. Los datos se muestran como medios ± SEM.

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Representative Results

Para evaluar la aplicabilidad del modelo optimizado, se realizó un estudio en ratones F8-KO (fondo genético C57BL) administrados con una terapia de reemplazo de factor VIII recombinante disponible comercialmente (rFVIII); se probaron cuatro dosis diferentes: 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg y 20 UI/kg. Además, probamos el control correspondiente del vehículo (negativo) en ratones F8-KO y el grupo de tipo salvaje (WT) utilizando ratones C57BL como grupo de control positivo para evaluar el rango de respuesta en el modelo.

Siguiendo el protocolo optimizado, hubo una reducción significativa en la pérdida de sangre para los grupos de tratamiento con rFVIII en comparación con el grupo de vehículos. Además, se observó una reducción en el tiempo de sangrado en los grupos de tratamiento de 5 UI/kg, 10 UI/kg y 20 UI/kg en comparación con el grupo de vehículos (Figura 2). En ratones WT, la pérdida total de sangre varió de 201.8-841.9 nmol Hgb (IC 95%) y en ratones vehículos varió de 5335 a 7148 nmol Hgb (IC 95%). Siguiendo la equivalencia aproximada de 1000 nmol Hgb ~ 125 μL de sangre total, el sangrado medio en ratones tratados con vehículos fue de 780,25 μL, mientras que en el grupo de 20 UI / kg fue de 89,95 μL. Así, una dosis de 20 UI/kg normalizó completamente el sangrado, y la administración de 10 UI/kg causó un efecto significativo, reduciendo la pérdida de sangre casi hasta el límite superior del rango WT (Figura 3). El tiempo de sangrado de los ratones WT varió de 0,98 a 9,16 min (IC del 95%), y los niveles de dosis de 10 UI / kg y 20 UI / kg redujeron el tiempo de sangrado dentro de este rango. Se observó una fuerte correlación entre la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado en los datos combinados (r = 0,9357, P < 0,0001) (Figura 4).

Para evaluar la sensibilidad del modelo, se ajustó una ecuación de respuesta logarítmica inversa (dosis) de cuatro parámetros para las observaciones de pérdida de sangre y tiempo de sangrado, y se observó un efecto claro dependiente de la dosis de la administración de rFVIII sobre la pérdida de sangre y para el tiempo de sangrado (Figura 3). Los valores estimados de ED50 para la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado fueron de 2,41 ± 1,69 UI/kg y 2,55 ± 2,80 UI/kg, respectivamente.

Para ilustrar cómo se produce el sangrado en el modelo, todos los episodios hemorrágicos registrados se han trazado para proporcionar una visualización de la longitud y el número de hemorragias de cada ratón individual (Figura 5). El sangrado primario es muy similar en todos los grupos. La mayoría del grupo de vehículos hemofílicos comienza a volver a sangrar antes del segundo desafío a los 20 minutos, y para aproximadamente la mitad de estos animales, el sangrado no se detiene después del primer desafío. Finalmente, como se describe, el tratamiento con rFVIII redujo la duración de los episodios hemorrágicos en ratones F8-KO tratados en comparación con el vehículo, con un cambio ya observable a la dosis más baja. En los niveles de dosis más altos, la mayoría de los ratones solo sangraron brevemente después de ser desafiados.

La concentración plasmática de rFVIII se midió mediante el ensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI) que detectó hFVIII y análogos para verificar que el efecto observado en la reducción de la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado dependía de la concentración (Figura 6). Existe variabilidad dentro de cada grupo (CV medio 46%), pero aún así, se pueden observar diferencias significativas entre los grupos, corroborando así que el efecto observado en la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado depende de la concentración plasmática de FVIII. Todos los ratones tratados con vehículos miden por debajo del límite inferior de cuantificación para el ensayo (2 U /L) y se representan con este valor. Los ratones WT no se midieron ya que el ensayo FVIII aplicado es específico para detectar FVIII humano.

Los recuentos plaquetarios y el hematocrito se determinaron para todos los grupos utilizando las muestras de sangre recogidas después de la hemorragia (Figura 7 y medidas con un analizador hematológico (Tabla de Materiales). No hubo variación entre los grupos en los recuentos de plaquetas, lo que indica que el número de plaquetas no se ve afectado, y los ratones, por lo tanto, siguen siendo capaces de hemostasia primaria. Para las mediciones del hematocrito, se observaron niveles normales en animales que recibieron dosis moderadas y más altas de FVIII (5 UI/kg, 10 UI/kg y 20 UI/kg), mientras que se observaron niveles significativamente más bajos en el vehículo y en los grupos tratados con 1 UI/kg (en comparación con los animales WT). Esta es una observación frecuente en animales hemofílicos después de un sangrado abundante.

Clásicamente, solo se ha utilizado un género de animales (típicamente machos) en estudios con animales, y esto también se describe para los modelos de supervivencia de TVT 8,9,11,12. Esforzándose por reducir el número total de ratones hemofílicos necesarios en estudios futuros (para la reproducción y el estudio), se utilizaron ambos sexos. Para evaluar el efecto del género en este modelo optimizado (Figura 8), tanto los resultados de pérdida de sangre como los de tiempo de sangrado se sometieron a un análisis ANOVA bidireccional con el género y la dosis como factores. En este análisis, el efecto de la dosis de rFVIII fue estadísticamente significativo (P < 0,0001), pero el sexo del ratón no afectó significativamente los resultados (P 0,35), y no se encontró interacción significativa entre los parámetros, lo que indica que las respuestas al tratamiento no difirieron entre los géneros.

Figure 1
Figura 1: Diseño temporal de la configuración experimental. La fase previa a la transección de la vena de la cola (TVT) incluye la inducción de la anestesia, el calentamiento de la cola en solución salina y la dosificación. Después de la lesión de TVT, se realizan 40 minutos de monitoreo del sangrado bajo anestesia, con desafíos posteriores cada 10 minutos. El procedimiento experimental concluye con la recogida de muestras de sangre y la eutanasia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Efecto de rFVIII después de la administración intravenosa. Pérdida total de sangre (panel izquierdo) y tiempo total de sangrado (panel derecho) de ratones F8-KO. Cada ratón se muestra como observaciones individuales y medias ± SEM. Las diferentes dosis de prueba de rFVIII se representan en el eje x. Los datos fueron analizados por Brown-Forsythe y Welch ANOVA aplicando la prueba de Dunnett para ajustar las comparaciones múltiples. P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Curvas dosis-respuesta para la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado. Pérdida de sangre (panel izquierdo) y tiempo de sangrado (panel derecho). El área gris representa el IC del 95% de los valores de 6 ratones C57BL/6 de tipo salvaje no tratados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Diagrama de correlación para la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Perfiles de sangrado individuales en ratones tratados con tipo salvaje, vehículo, 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg y 20 UI/kg rFVIII. Cada línea representa el perfil sangrante de un solo ratón, mientras que cada barra punteada representa un episodio sangrante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Exposición a rFVIII. La concentración de FVIII en plasma se midió mediante un ensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI) para la detección de FVIII humano. Los ratones vehículo estaban por debajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ) y, por lo tanto, se trazaron con el valor LLOQ (2 U / L). Los animales WT no se midieron ya que el ensayo FVIII aplicado es específico para detectar FVIII humano. Las diferentes dosis de prueba de rFVIII y un control WT están representadas en el eje x. ** P < 0,01, *** P < 0,001 y **** P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Datos hematológicos. El recuento de plaquetas (panel izquierdo) y el hematocrito (panel derecho) de ratones F8-KO se muestran como media de observaciones individuales con SEM. Las diferentes dosis de prueba de rFVIII y un control WT se representan en el eje x. Los datos fueron analizados por Brown-Forsythe y Welch ANOVA aplicando la prueba de Dunnett para ajustar las comparaciones múltiples. ** P < 0,01 y *** P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8. Efecto del género. La pérdida de sangre (panel izquierdo) y el tiempo de sangrado (panel derecho) clasificados por tratamiento se muestran como observaciones individuales con media ± SEM. Los datos se analizaron mediante ANOVA bidireccional aplicando la corrección de Bonferroni para ajustar las comparaciones múltiples. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tiempo de sangrado ED50 (UI/kg) Pérdida de sangre ED50 (UI/kg) Supervivencia a la DE50 (UI/kg)
Modelos bajo anestesia Modelo de transección de vena de cola optimizado 2.6 ± 2.8 2.4 ± 1.7 no relevante
Vena saphena modelo30 8.1 ± 2.2 5.1 ± 2.1 no relevante
Clip de cola moderado (L=3 mm)27 no reportado 4,6 ± 0,5 no relevante
Clip de cola moderado (L=4 mm)28 39 28 no relevante
Clip de cola moderado (L=4 mm)20 no reportado 53 no relevante
Modelos de supervivencia Modelo de supervivencia de la transección de la venade la cola 36 no reportado no reportado 58
Modelo de supervivencia de la transección de la venade la cola 10 no reportado no reportado 21

Tabla 1: Valores de ED50 . Comparación de los valores de ED50 de diferentes modelos de sangrado disponibles para estudios de hemofilia en ratones. Los datos se extraen de los artículos citados [superíndice de referencias] y se presentan como ED50 (UI/kg)

Figura suplementaria 1: Plantilla de medición. Producido en aluminio. Especificaciones de tamaño: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x W x H). Ranura: 2,5 mm de profundidad y 2,5 mm de ancho; radio 1.25 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Plantilla de corte. Producido en acero inoxidable. Especificaciones de tamaño: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x W x H). Ranura: 3 mm de profundidad y 3 mm de ancho; radio 1.5 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este método optimizado de transección de la vena de la cola (TVT) tiene varias ventajas en comparación con el método de supervivencia de TVT. Los animales están completamente anestesiados durante toda la duración del estudio, lo que facilita el manejo del ratón y aumenta el bienestar animal. Además, a diferencia del modelo de supervivencia TVT, no se requiere observación nocturna, y este modelo optimizado ofrece la posibilidad de medir la pérdida de sangre y observar el tiempo exacto de sangrado durante 40 min. Además, los períodos más largos de sangrado en animales conscientes pueden causar la muerte por exsanguinación, lo que lleva a dolor y angustia en los animales y probablemente estrés, lo que podría resultar en una mayor variación14. La pérdida de sangre y el tiempo de sangrado se han caracterizado y validado con éxito como puntos finales, reemplazando el tiempo hasta la muerte o casi la muerte. La lesión de cola real está bien definida y estandarizada, ya que utiliza una guía de bloque de corte para realizar el TVT, asegurando un corte reproducible, reduciendo la dificultad del procedimiento y la variabilidad técnica. Por lo tanto, se puede lograr una mayor robustez del modelo, reduciendo el número de animales necesarios. Además, los datos han demostrado que es posible utilizar ratones machos y hembras, reduciendo así el número total de animales a criar, de acuerdo con los principios 3R. Junto con estas observaciones, existe la tendencia de que los ratones hembra sangren un poco menos y varíen un poco más en los grupos de sangrado alto, pero no en los grupos de sangrado bajo. Las medidas de pérdida de sangre más bajas podrían estar asociadas con mujeres que tienen un tamaño más pequeño y, por lo tanto, menos volumen de sangre en comparación con los hombres de la misma edad.

Las hemorragias espontáneas en pacientes hemofílicos suelen ser internas, específicamente involucrando sangrado musculoesquelético, de tejidos blandos y mucocutáneo, mientras que las lesiones externas (como cortes menores) no son la causa más común de hemorragias prolongadas, aunque los cortes y traumatismos más graves pueden ser potencialmente mortales40,41. Este modelo optimizado induce sangrado solo venoso, mientras que otros modelos, como el clip de la cola, inducen una mezcla de sangrado arterio-venoso. Dado que el modelo descrito es un modelo venoso solo venoso, el efecto de la dosis procoagulante en este modelo de TVT podría no reflejar el efecto en una lesión arterial más grave; por lo tanto, se deben usar otros modelos de sangrado si tales hemorragias están enfocadas.

Como muestra el perfil hemorrágico individual, el sangrado primario es muy similar en todos los grupos indicando que la hemostasia primaria, es decir, la agregación de plaquetas activadas, está intacta en el entorno de la hemofilia A42. En una lesión inmovilizada, incluso bajo hemofilia grave, la agregación plaquetaria puede ser suficiente para atenuar el sangrado. Por esa razón, a través de estudios empíricos, hemos encontrado que inducir un desafío de sangrado cada 10 minutos es un paso necesario en el protocolo para interrumpir los agregados de plaquetas activadas, que pueden ser lo suficientemente fuertes como para prevenir el sangrado incluso sin la generación de fibrina de la coagulación funcional. Dado que los ratones completamente anestesiados no se mueven y no pueden desafiar físicamente la lesión como sucede en el modelo de supervivencia tvT no anestesiado, fue necesario introducir los pasos de desafío para evitar que la agregación plaquetaria por sí sola atenúe el sangrado. Algunos ratones hemofílicos no tratados vuelven a sangrar espontáneamente antes del desafío, pero después del primer desafío, se producen hemorragias espontáneas en la mayoría de los ratones hemofílicos no tratados, y después del segundo desafío, muchos sangran continuamente hasta el final del experimento. Como era de esperar, hubo un aumento del sangrado en los ratones F8-KO del vehículo en comparación con los ratones WT. Los ratones tratados con dosis aumentadas de rFVIII mostraron una reducción dependiente de la dosis tanto en la pérdida de sangre como en el tiempo de sangrado. Se observó un efecto significativo sobre el sangrado a dosis de 5 UI/kg o más (en comparación con los ratones tratados con vehículos). Las dos dosis más altas redujeron el sangrado a niveles bastante cercanos a la respuesta hemorrágica de tipo salvaje, lo que indica normalización o casi normalización del sangrado.

En la Tabla 1, presentamos una comparación de diferentes valores de ED50 para varios modelos de sangrado, clasificados por los criterios de valoración estudiados. En este modelo optimizado, observamos valores comparables de ED50 para la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado (2,4 ± 1,7 UI/kg y 2,6 ± 2,8 UI/kg, respectivamente). Utilizando el mismo modelo que estudia rFVIIa, los valores de ED50 para la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado fueron de 0,42 mg / kg y 0,39 mg / kg, respectivamente38. Se trata de una mayor sensibilidad a la intervención farmacológica que los modelos hemorrágicos descritos anteriormente bajo anestesia, como el modelo de clip de cola, con FVIII ED50 para una pérdida de sangre de 4,6 ± 0,5 UI/kg27, 28 UI/kg28 y 53 UI/kg20. Además, existe una alta variabilidad de los valores de ED50 en los diferentes modelos de clip de cola 20,27,28. Otro modelo bajo anestesia es el modelo de clip de cola severa. Es un método más rápido ya que el período de observación es de solo 20 minutos, pero es menos sensible a la actividad procoagulante. Se necesitaron dosis superiores a 200 UI/kg de FVIII para lograr una reducción estadísticamente significativa de la pérdida de sangre en comparación con los animales tratados con vehículos25. En el modelo30 de vena saphena, el valor de ED50 para el tiempo de sangrado fue de 8.1 ± 2.2 UI / kg, y ED50 para la pérdida promedio de sangre fue de 5.1 ± 2.1 UI / kg, también menos sensible que nuestro modelo refinado con respecto a ambos parámetros. Además, este modelo requiere un trabajo delicado para realizar la lesión del vaso y múltiples intervenciones repetidas que, si no se realizan de manera reproducible, podrían influir en el resultado.

En el modelo tradicional de supervivencia TVT, la supervivencia se evalúa durante un período de 24 h después de la dosificación, durante el cual puede ocurrir sangrado o resangrado en cualquier momento. Por lo tanto, la eficacia en el modelo de supervivencia tvt requiere que el efecto procoagulante del tratamiento persista durante al menos la mayor parte del período de observación de 24 horas. En el método presentado aquí, evaluamos los efectos agudos entre 5 min y 40 min después de la dosificación; por lo tanto, es difícil establecer una comparación directa de los valores de ED50 , ya que se necesitarán dosis más altas en los modelos de supervivencia para mantener la cobertura hemostática durante la última parte del período de observación. Sin embargo, si así se desea, el modelo TVT optimizado se puede utilizar para evaluar la duración de la cobertura hemostática mediante la introducción de un retraso entre la dosificación y el procedimiento de sangrado. Esto se ha descrito para una versión anterior de nuestro modelo TVT optimizado donde realizar el TVT 24 h después de la dosificación resultó en un ED50 de aproximadamente 10-15 UI / kg para rFVIII26 sin modificar. Como se señala en la Tabla 1, en modelos de transección de cola con una supervivencia de 24 horas como criterio de valoración, se han notificado valores de DE50 de 21 UI/kg 9 y 58 UI/kg36 de rFVIII. Del mismo modo, los modelosde supervivencia del clip de cola 8 también requieren dosis de procoagulante más altas que sus contrapartes agudas.

En perspectiva, varios factores de coagulación diferentes (FVIII, FVIIa, FIX) y derivados, algunos de los cuales ahora se comercializan, se han evaluado con el modelo optimizado utilizando diferentes cepas hemofílicas de ratón 26,38,43,44,45,46,47. También hemos podido adaptar el modelo al estudio de intervenciones bajo demanda mediante la dosificación tras la transección, justo antes del primer reto. Además, hemos utilizado con éxito este modelo para evaluar anticuerpos biespecíficos con actividad procoagulante (Østergaard et al., aceptado para su publicación en Blood), superando los desafíos de reactividad cruzada de especies mediante la dosificación de FIX humano y FX humano. Esto demuestra la versatilidad y el valor traslacional del modelo en el desarrollo de nuevos medicamentos en el campo de la hemofilia, como las estrategias dirigidas a plaquetas48. Las estrategias basadas en AAV o de edición del genoma también se pueden evaluar en los casos en que hay un sustituto que es farmacológicamente activo en ratones. Por lo tanto, este modelo de sangrado TVT optimizado es una alternativa a la transección de la vena de la cola y los modelos de supervivencia del clip de la cola, así como una alternativa valiosa a otros modelos de sangrado bajo anestesia. Este modelo es más humano en comparación con el modelo de supervivencia y un ejemplo de refinamiento, ya que los animales no experimentan dolor y sufrimiento. En nuestra opinión, la sensibilidad a los niveles de dosis clínicamente relevantes, la relativa simplicidad técnica y evitar la muerte/casi muerte como criterios de valoración son ventajas significativas.

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Disclosures

Los autores son o eran empleados y/o accionistas de Novo Nordisk A/S en el momento en que se llevó a cabo esta investigación.

Acknowledgments

Esther Bloem y Thomas Nygaard son reconocidos por su apoyo con mediciones de FVIII en plasma. Bo Alsted es reconocido por dibujar y mecanizar la plantilla y cortar bloques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scalpel blade Swann-Morton 503
15 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One, Austria 188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe 320830
Advate Takeda, Japan Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol Hartmann, Soft-Zellin 999 979
Centrifuge Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution Lysebio, ABX Diagnostics 906012
Gauze
Haematological analyser Sysmex CT-2000iv
Heating lamp on stand Phillips IR250
Heating pad with thermostat CMA model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent HemoCue, Denmark HemoCue calibrator, 707037 Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box Sigma Delta Dameca
Isoflurane Baxter 26675-46-7
Magnifier with lights Eschenbach
Measuring template (Aluminum) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips Finnpipette
Photometer Molecular Devices Corporation, CA, USA SpectraMax 340 photometer
Prism Software GraphPad, San Diego, CA, USA Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl Fresenius Kabi, Sweden 883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat TYP 3/8 Julabo

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Biología Número 175 modelo de transección de la vena de la cola sangrado de la cola modelo animal intervención farmacológica hemofilia factor FVIII knock out ratones
Modelo de sangrado por transyección de la vena de la cola en ratones con hemofilia A totalmente anestesiada
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Carol Illa, A., Baumgarten, S., Danielsen, D., Larsen, K., Elm, T., Johansen, P. B., Knudsen, T., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ley, C. D. Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice. J. Vis. Exp. (175), e62952, doi:10.3791/62952 (2021).

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