Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hale Vene Transeksjon Blødning Modell i Fullt Bedøvet Hemofili En Mus

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62952
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 4, 5, 1, 6, 1
1Global Drug Discovery, Novo Nordisk A/S, 2Department of Veterinary and Animal Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Independent consultant, 5Catalyst Biosciences, 6Værløse Dyreklinik

Summary

Den raffinerte hale vene transeksjon (TVT) blødning modell i bedøvede mus er en sensitiv in vivo metode for vurdering av hemofil blødning. Denne optimaliserte TVT blødningsmodellen bruker blodtap og blødningstid som endepunkter, raffinerer andre modeller og unngår døden som endepunkt.

Abstract

Haleblødningsmodeller er viktige verktøy i hemofili forskning, spesielt for vurdering av prokoagulant effekter. Hale vene transeksjon (TVT) overlevelsesmodell har blitt foretrukket i mange settinger på grunn av følsomhet for klinisk relevante doser av FVIII, mens andre etablerte modeller, som hale klipp modellen, krever høyere nivåer av prokoagulant forbindelser. For å unngå å bruke overlevelse som endepunkt, utviklet vi en TVT-modell som etablerte blodtap og blødningstid som endepunkter og full anestesi under hele eksperimentet. Kort sagt er bedøvede mus plassert med halen nedsenket i temperert saltvann (37 °C) og dosert med testforbindelsen i høyre sidehaleåre. Etter 5 min blir venstre lateral hale vene transektert ved hjelp av en malguide, halen returneres til saltvannsoppløsningen, og alle blødningsepisoder overvåkes og registreres i 40 minutter mens du samler blodet. Hvis ingen blødning oppstår på 10 min, 20 min eller 30 min etter skade, blir blodpropp utfordret forsiktig ved å tørke kuttet to ganger med en våt gasbindpinne. Etter 40 min kvantifiseres blodtapet av mengden hemoglobin blødde inn i saltvannsoppløsningen. Denne raske og relativt enkle prosedyren resulterer i konsistente og reproduserbare blødninger. Sammenlignet med TVT-overlevelsesmodellen bruker den en mer human prosedyre uten å gå på kompromiss med følsomheten for farmakologisk inngrep. Videre er det mulig å bruke begge kjønn, og redusere det totale antall dyr som må avles, i samsvar med prinsippene til 3R. En potensiell begrensning i blødningsmodeller er den stokastiske naturen til hemostase, noe som kan redusere reproduserbarheten til modellen. For å motvirke dette sikrer manuell blodproppforstyrrelser at blodpropp utfordres under overvåking, og forhindrer at primær (blodplate) hemostase stopper blødningen. Dette tillegget til katalogen over blødningsskademodeller gir et alternativ for å karakterisere prokoagulant effekter på en standardisert og human måte.

Introduction

Dyremodeller er avgjørende for å forstå patogenesen av hemofili og utvikle og teste behandlingsregimer og terapier. Factor VIII knock-out mus (F8-KO) er en mye brukt modell for studiet av hemofili A 1,2. Disse musene rekapitulerer viktige egenskaper ved sykdommen og har blitt mye brukt til utvikling av behandlinger, for eksempel rekombinante FVIII-produkter 3,4,5 og genterapistrategier 6,7.

Det finnes ulike blødningsskademodeller for å evaluere de farmakologiske effektene av forskjellige hemostatiske forbindelser in vivo. En av disse koagulasjonsmodellene er hale vene transeksjon overlevelsesmodell hos mus 8,9,10,11,12,13,14, som måler evnen til hemofile mus til å overleve ekssanguinasjon etter haletranseksjon. Denne metoden ble introdusert for mer enn fire tiår siden15 og brukes fortsatt 9,16,17. Modellen utnytter imidlertid overlevelse som endepunkt og krever observasjon av dyrene over en periode på opptil 24 timer, hvor dyrene er bevisste og dermed kan oppleve smerte og nød.

Blødningsmodeller med kortere varighet og under full anestesi har blitt beskrevet tidligere, for eksempel haleklippmodellen (også kjent som halespissen)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Likevel, for en fullstendig normalisering av blodtap etter blødningsutfordringen, krever disse modellene doser av prokoagulantforbindelser (f.eks. FVIII) langt høyere enn de som administreres klinisk29. En annen skademodell under anestesi, vena saphena blødningsmetoden, er følsom for lavere doser av prokoagulantforbindelser30, men krever et høyt nivå av eksperimenteringsintervensjon siden blodproppene må forstyrres ofte (i motsetning til 3 ganger i den presenterte modellen).

Standardisering mot en felles protokoll for å teste nye prokoagulantforbindelser vil i stor grad lette datasammenligning mellom laboratorier 31,32,33. I TVT-modeller er det ennå ikke en felles enighet om studerte endepunkter (blodtap 7,26, blødningstid 9,34 og overlevelsesrate35,36), og eksperimentell lengde varierer mellom studie13.

Vårt primære mål er å beskrive og karakterisere en optimalisert modell med høy reproduserbarhet, muligheten til å studere on-demand samt en profylaktisk behandling, følsomhet for farmakologisk intervensjon tilsvarende overlevelsesmodellen, men likevel ikke bruke død eller nær-døden som endepunkter. For å redusere smerte og nød bør dyrene ikke være bevisste under blødning og et mer etisk endepunkt må implementeres37.

Haleklipsmodeller utføres vanligvis i en av to varianter, enten amputerer spissen av halen, for eksempel amputasjon på 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 eller, i en mer alvorlig variant, transektert med en halediameter rundt 1-3 mm 8,22,25 . Dette forårsaker en kombinert arteriovenøs blødning, da laterale og dorsale årer og ventral arterie vanligvis blir kuttet, og generelt, jo større amputasjonen er, jo lavere følsomhet for en prokoagulant forbindelse. Videre, siden halespissen er amputert, blir arteriovenøs skade utsatt uten motstående vev; Dermed er det i det minste i teorien ulikt de vanligste hemofile blødningene.

Som navnet antyder, er bare venen skadet i hale vene transeksjonsmodeller som beskrevet i dette papiret, og dermed resulterer i en utelukkende venøs blødning. Siden fartøyet ikke er helt avskåret, forventes skaden å være mindre enn i amputasjonsmodellene, og vevet rundt kuttet, som en blodpropp kan holde seg til, beholdes. I tillegg er det lavere blodtrykk i venen i motsetning til arterien. Disse faktorene bidrar til økt følsomhet i forhold til amputasjonsmodeller, slik at normalisering av blødning kan oppnås med klinisk relevante doser av erstatningsterapi, for eksempel med rFVIII i hemofili A, som er nyttig for å evaluere omfanget og holdbarheten av effekter av prokoagulant behandling 26,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som er beskrevet i denne protokollen er godkjent av Dyrevelferdsorganet i Novo Nordisk A/S, og det danske dyreforsøksinspektøratet, Det danske mat-, landbruks- og fiskeridepartementet. Den optimaliserte 40 minutters metoden inkluderer anestesi og doseringstid i designet (figur 1). Hemofile mus av begge kjønn mellom 10-16 uker er nødvendig for denne prosedyren.

1. Forberedelser før studien

  1. Forbered doseringsløsningene i de riktige konsentrasjonene.
  2. Start vannbadet og varm opp til 37 °C. Fyll 15 ml sentrifugerør for blodoppsamling med saltvann (0,9% NaCl).
  3. Plasser de 15 ml saltvannsrørene i hullene i den oppvarmede bunnplaten minst 15 minutter før starten av eksperimentet.
  4. Identifiser musene og registrer vekten. Unngå å håndtere mus mer enn nødvendig, da dette kan forårsake stress og påvirke studien.
  5. Forbered arbeidsstasjonen i avtrekkshetten før du fortsetter slik at alt er innen rekkevidde: servietter, haleholder, gasbind, sprøyter, skalpeller, stoppeklokker og blodstrømsnotasjonspapir.
  6. Plasser halemerket og skjæreblokkene på varmeplaten - kalde blokker vil få venene til å trekke seg sammen og dermed påvirke blødningen.

2. Anestesi

  1. Utfør isofluranbedøvelsen inne i en avtrekkshette.
  2. Sett gassdamperen til i utgangspunktet 5% isofluran i 30% O2/70% N2O i anestesikammeret med 1 L / min strømning. La det være tilstrekkelig tid for anestesikammeret å fylle (ca. 5 min avhengig av kammervolum og gassstrøm). Sørg for rask induksjon (mindre enn ett minutt).
  3. Plasser musene i anestesikammeret til de mister bevisstheten.
    MERK: Dette bør skje innen et minutt eller mindre hvis kammeret er tilstrekkelig fylt.
  4. Sørg for riktig bedøvelse ved fravær av smertefull respons på pedal refleks (fast tå klemme).
  5. Plasser musene på varmeplaten, og sørg for at nesen er i nesekjeglen.
  6. Reduser anestesi til et vedlikeholdsnivå på 2% isofluran i 30% O2/70% N2O og legg et plastdeksel over musene for å redusere tap av varme. Påfør en passende øyesalve for å forhindre tørrhet under anestesi.
  7. Merk halen med en diameter på 2,5 mm ved hjelp av halemerkeblokken. Ikke tving halen inn i spalten i blokken - den må passe godt (Tilleggsfigur 1)
  8. Plasser halen i saltvannsrøret i minst 5 minutter for å sikre en varm haleåre som er optimal for intravenøs (dvs.) dosering.

3. Dosering av testløsning

  1. Plasser en mus i haleholderen med nesen i en anestesimaske.
  2. Doser dyret med forbindelsen av interesse (i dette tilfellet rFVIII) og start umiddelbart stoppeklokken (t = 0).
  3. Sett musen tilbake på varmeplaten med halen i saltvannsrøret. Gjenta prosedyren med de andre musene.

4. Utføre hale vene transeksjon

  1. Utfør hale vene transeksjon nøyaktig 5 min etter dosering. Plasser halen i skjæreblokken og vri 90° for å eksponere venen (Supplerende figur 2).
  2. Utfør kuttet på motsatt side/vene fra der testløsningen ble dosert.
  3. Tegn #11 skalpellbladet gjennom spalten på skjæreblokken som holder halen for å skape blødning. Tilbakestill stoppeklokken og returner halen umiddelbart til saltvannslinjen.

5. Observasjonstid og utfordringer

  1. Vær oppmerksom på blødningen og kommenter starten og stoppen av blødningen gjennom 40 min; kommenter det på blodstrømsnotasjonspapiret.
    MERK: Denne visuelle vurderingen av blødning kan variere noe på grunn av subjektivitet.
  2. Primærblødningen må stoppe innen 3 minutter etter at kuttet er gjort. Hvis dette ikke er tilfelle, diskvalifiser musen, euthanize og erstatt (unnlatelse av å stoppe den primære blødningen kan indikere en for alvorlig skade eller mangler primær hemostase, som i vWF KO-mus).
  3. Hvis det ikke er blødning på 10 min, 20 min og 30 min etter skade, utfordre hale kuttet som beskrevet i trinn 4-5.
  4. Bruk en gasbind som er gjennomvåt i varm saltvann fra et separat rør som holdes i vannbadet. Løft halen ut av saltvannen og tørk forsiktig to ganger med den våte gasbindet i distal retning over halekuttet.
  5. Etter hver utfordring, senk straks halen inn i saltvannsrøret igjen.
  6. På t = 40 min, stopp blodoppsamlingen ved å fjerne halen fra saltvannsrøret.

6. Blodprøvetaking

  1. Etter t = 40 min, få blodprøver fra supraorbital vene.

7. Eutanasi

  1. Euthanize musene ved cervical dislokasjon mens fortsatt under full anestesi.

8. Behandling av prøver

  1. Sentrifuger 15 ml blodoppsamlingsrør med saltvann ved 4000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  2. Kast supernatanten fra de 15 ml rørene, resuspender pellet i 2-14 ml erytrocytter (RBC) lysingsløsning, og fortynn den deretter til den når en lett kaffefarge.
  3. Legg merke til det totale volumet (volum blod + volum erytrocytter (RBC) lysingsløsning lagt til ved hjelp av konfirmasjonsmerkene på røret).
  4. Overfør 2 ml av fortynning til et hemoglobinrør og kjøle det til hemoglobinanalysen.
  5. Bestem blodtapet ved å måle hemoglobinkonsentrasjonen i saltoppløsningen. Mål absorbansen ved 550 nm på en mikroplateleser (Materialtabell).
  6. Konverter absorbansen til nmol hemoglobin ved hjelp av en standardkurve fremstilt fra humant hemoglobin (materialbord) og riktig for fortynning med RBC lysing løsning.

9. Statistiske analyser

  1. Analyser dataene ved hjelp av riktig programvare. Her ble GraphPad Prism programvare brukt. Over en rekke studier ble følgende statistiske metoder funnet å fungere godt.
    MERK: For å analysere blodtap, blødningstid, eksponering, blodplatetall og hematokrit; Brown-Forsythe og Welch ANOVA test ble brukt, (som dataene var kontinuerlige, men uten varians homogenitet av rester) bruke Dunnetts test for å justere for flere sammenligninger. En Pearsons test ble brukt til å teste for sammenhenger mellom blødningstid, blodtap og doser. For å bestemme ED50-verdier ble en fire-parameter inverse logg (dose) responsligning montert på blødnings- og blodtapsdata. For å analysere kjønnseffekten ble det brukt en toveis ANOVA-test, som brukte Bonferroni-korreksjon for å justere for flere sammenligninger. Signifikansnivået ble definert som P < 0,05. Data vises som ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å vurdere anvendelsen av den optimaliserte modellen ble det utført en studie i F8-KO (C57BL genetisk bakgrunn) mus administrert med en kommersielt tilgjengelig rekombinant faktor VIII erstatningsterapi (rFVIII); fire forskjellige doser ble testet: 1 IE/kg, 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg. Videre testet vi den tilsvarende kjøretøykontroll (negativ) i F8-KO mus og wild-type (WT) gruppe ved hjelp av C57BL mus som en positiv kontrollgruppe for å vurdere responsområdet i modellen.

Etter den optimaliserte protokollen var det en betydelig reduksjon i blodtap for rFVIII behandlingsgrupper sammenlignet med kjøretøygruppen. I tillegg ble det observert en reduksjon i blødningstiden i behandlingsgruppene 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg sammenlignet med kjøretøygruppen (figur 2). I WT-mus varierte det totale blodtapet fra 201,8-841,9 nmol HGB (95% KI) og i kjøretøymus varierte fra 5335 til 7148 nmol Hgb (95% KI). Etter den omtrentlige ekvivalensen av 1000 nmol Hgb ~ 125 μL fullblod, var gjennomsnittlig blødning hos kjøretøybehandlede mus 780,25 μL, mens på 20 IE / kg-gruppen var 89,95 μL. Dermed normaliserte en dose på 20 IE/kg blødningen fullstendig, og administrering av 10 IE/kg forårsaket en betydelig effekt, noe som reduserte blodtapet nesten til den øvre grensen for WT-området (figur 3). Blødningstiden til WT-mus varierte fra 0,98-9,16 min (95% KI), og dosenivåer på 10 IE/kg og 20 IE/kg redusert blødningstid til innenfor dette området. Det ble observert en sterk sammenheng mellom blodtap og blødningstid i de kombinerte dataene (r = 0,9357, P < 0,0001) (figur 4).

For å evaluere modellens følsomhet ble det montert en fireparameters inverse log(dose) responsligning på blodtap og observasjoner av blødningstid, og en klar doseavhengig effekt av rFVIII-administrasjon på blodtap og for blødningstiden ble observert (figur 3). De estimerte ED50-verdiene for blodtap og blødningstid var henholdsvis 2,41 ± 1,69 IE/kg og 2,55 ± 2,80 IE/kg.

For å illustrere hvordan blødning skjer i modellen, har alle innspilte blødningsepisoder blitt plottet inn for å gi en visualisering av lengden og antall blødninger for hver enkelt mus (figur 5). Den primære blødningen er svært lik i alle gruppene. Det meste av den hemofile kjøretøygruppen begynner å blø igjen før den andre utfordringen på 20 min, og i omtrent halvparten av disse dyrene stopper blødningen ikke etter den første utfordringen. Til slutt, som beskrevet, reduserte rFVIII-behandlingen lengden på blødningsepisodene hos behandlede F8-KO-mus sammenlignet med kjøretøy, med allerede en observerbar endring ved laveste dose. På de høyeste dosenivåene blødde de fleste musene bare kort tid etter å ha blitt utfordret.

Plasma rFVIII-konsentrasjonen ble målt ved luminescerende oksygenkanalanalyse (LOCI) som påviste hFVIII og analoger for å verifisere at effekten som ble observert for å redusere blodtap og blødningstid var konsentrasjonsavhengig (figur 6). Det er variasjon i hver gruppe (gjennomsnittlig CV 46%), men likevel kan signifikante forskjeller mellom grupper observeres, og dermed bekrefte at effekten observert i blodtap og blødningstid er avhengig av plasmakonsentrasjonen av FVIII. Alle kjøretøybehandlede mus målt under den nedre kvantitetsgrensen for analysen (2 U/L) og er representert med denne verdien. WT-mus ble ikke målt siden den anvendte FVIII-analysen er spesifikk for å oppdage menneskelig FVIII.

Blodplatetall og hematokrit ble bestemt for alle grupper som brukte blodprøvene som ble samlet inn etter blødning (figur 7 og målt med en hematologisk analysator (Materialfortegnelse). Det var ingen variasjon mellom grupper i blodplatetall, noe som indikerer at blodplatenumre ikke påvirkes, og musene forblir derfor i stand til primær hemostase. For hematokritmålinger ble det observert normale nivåer hos dyr som fikk moderate og høyere FVIII-doser (5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg), mens det ble observert signifikant lavere nivåer i kjøretøyet og 1 IE/kg behandlede grupper (sammenlignet med WT-dyr). Dette er en hyppig observasjon hos hemofile dyr etter tung blødning.

Klassisk har bare ett kjønn av dyr (typisk mannlig) blitt brukt i dyrestudier, og dette er også beskrevet for TVT-overlevelsesmodeller 8,9,11,12. Streber etter å redusere det totale antallet hemofile mus som trengs i fremtidige studier (for avl og studien), ble begge kjønn brukt. For å evaluere effekten av kjønn i denne optimaliserte modellen (figur 8) ble både blodtap og blødningstidsresultater utsatt for toveis ANOVA-analyse med kjønn og dose som faktorer. I denne analysen var effekten av rFVIII-dosen statistisk signifikant (P < 0,0001), men muse kjønn påvirket ikke resultatene (P 0,35), og det ble ikke funnet noen signifikant interaksjon mellom parametrene, noe som indikerer at responsen på behandlingen ikke var forskjellig mellom kjønnene.

Figure 1
Figur 1: Temporal utforming av det eksperimentelle oppsettet. Fasen før hale vene transeksjon (TVT) inkluderer anestesi induksjon, oppvarming av halen i saltvann og dosering. Etter TVT-skaden utføres 40 minutter med overvåking av blødningen under anestesi, med påfølgende utfordringer hvert 10. Den eksperimentelle prosedyren avsluttes ved innsamling av blodprøver og eutanasi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Effekt av rFVIII etter intravenøs administrering. Totalt blodtap (venstre panel) og total blødningstid (høyre panel) av F8-KO mus. Hver mus vises som individuelle observasjoner og betyr ± SEM. De forskjellige testdosene av rFVIII er representert i x-aksen. Data ble analysert av Brown-Forsythe og Welch ANOVA som brukte Dunnetts test for å justere for flere sammenligninger. P < 0.0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Doseresponskurver for blodtap og blødningstid. Blodtap (venstre panel) og blødningstid (høyre panel). Det grå området representerer 95 % KI fra verdiene fra 6 ubehandlede, ville C57BL/6-mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Korrelasjonsplott for blodtap og blødningstid. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Individuelle blødningsprofiler i villtype, kjøretøy, 1 IE/kg, 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg rFVIII-behandlede mus. Hver linje representerer blødningsprofilen til en enkelt mus, mens hver prikkete stolpe representerer en blødningsepisode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Eksponering for rFVIII. FVIII-konsentrasjonen i plasma ble målt ved en luminescerende oksygenkanalanalyse (LOCI) for påvisning av human FVIII. Kjøretøymus var under den nedre grensen for kvantasjon (LLOQ) og ble derfor plottet med LLOQ-verdien (2 U / L). WT-dyr ble ikke målt siden den påførte FVIII-analysen er spesifikk for å oppdage menneskelig FVIII. De forskjellige testdosene rFVIII og en WT-kontroll er representert i x-aksen. ** P < 0,01, *** P < 0,001 og **** P < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Hematologiske data. Blodplateantall (venstre panel) og hematokritt (høyre panel) av F8-KO-mus vises som individuelle observasjoner gjennomsnitt med SEM. De forskjellige testdosene rFVIII og en WT-kontroll er representert på x-aksen. Data ble analysert av Brown-Forsythe og Welch ANOVA som brukte Dunnetts test for å justere for flere sammenligninger. ** P < 0,01 og *** P < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8. Effekt av kjønn. Blodtap (venstre panel) og blødningstid (høyre panel) klassifisert etter behandling vises som individuelle observasjoner med gjennomsnittlig ± SEM. Data ble analysert av toveis ANOVA som brukte Bonferroni-korreksjonen for å justere for flere sammenligninger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

ED50 blødningstid (IE/kg) ED50 blodtap (IE/kg) ED50 overlevelse (IE/kg)
Modeller under anestesi Optimalisert hale vene transeksjon modell 2.6 ± 2.8 2.4 ± 1.7 ikke relevant
Vena saphena modell30 8.1 ± 2.2 5.1 ± 2.1 ikke relevant
Moderat hale klips (L = 3mm)27 ikke rapportert 4.6 ± 0,5 ikke relevant
Moderat hale klips (L = 4mm)28 39 28 ikke relevant
Moderat hale klips (L = 4mm)20 ikke rapportert 53 ikke relevant
Overlevelsesmodeller Hale vene transeksjon overlevelse modell36 ikke rapportert ikke rapportert 58
Hale vene transeksjon overlevelse modell10 ikke rapportert ikke rapportert 21

Tabell 1: ED50-verdier . Sammenligning av ED50 verdier av ulike tilgjengelige blødningsmodeller for hemofili studier hos mus. Data hentes ut fra siterte artikler [referanser hevet skrift] og presenteres som ED50 (IE/kg)

Supplerende figur 1: Målemal. Produsert i aluminium. Størrelses spesifikasjoner: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Spor: 2,5 mm dybde og 2,5 mm bredde; radius 1,25 mm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Skjæremal. Produsert i rustfritt stål. Størrelses spesifikasjoner: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Spor: 3 mm dybde og 3 mm bredde; radius 1,5 mm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne optimaliserte metoden for hale vene transeksjon (TVT) har flere fordeler sammenlignet med TVT overlevelsesmetoden. Dyrene er fullt bedøvet for hele studievarigheten, noe som gjør musehåndtering enklere og øker dyrets velvære. Videre, i motsetning til TVT-overlevelsesmodellen, er det ikke nødvendig med observasjon over natten, og denne optimaliserte modellen gir muligheten til å måle blodtap og observere den nøyaktige blødningstiden over 40 minutter. Også lengre perioder med blødning hos bevisste dyr kan forårsake død ved ekssanguinasjon, noe som fører til smerte og nød hos dyrene og sannsynligvis stress, noe som potensielt kan føre til økt variasjon14. Blodtap og blødningstid har blitt vellykket karakterisert og validert som endepunkter, og erstatter tid til døden eller nær døden. Den faktiske haleskaden er godt definert og standardisert siden den bruker en skjæreblokkguide for å utføre TVT, sikre et reproduserbart kutt, noe som reduserer vanskeligheten med prosedyren og den tekniske variasjonen. Derfor kan høyere modell robusthet oppnås, noe som reduserer antall dyr som trengs. Videre har data vist at det er mulig å bruke både mannlige og kvinnelige mus, og dermed redusere det totale antall dyr som skal avles, i samsvar med 3R-prinsippene. Sammen med disse observasjonene er det en trend at kvinnelige mus blør litt mindre og varierer litt mer i høyblødningsgrupper, men ikke i lavblødningsgrupper. Lavere blodtapstiltak kan være forbundet med at kvinner har en mindre størrelse, og dermed mindre blodvolum sammenlignet med samme eldre menn.

Spontane blødninger hos hemofile pasienter er vanligvis interne, spesielt involverer muskel-skjelett, bløtvev og mucocutaneous blødning, mens ytre skader (som mindre kutt) ikke er den vanligste årsaken til lengre blødninger, selv om mer alvorlige kutt og traumer kan være livstruende40,41. Denne optimaliserte modellen induserer venøs-bare blødning, mens andre modeller, for eksempel hale klipp, indusere en blanding av arterio-venøs blødning. Siden den beskrevne modellen er en vene-bare modell, prokoagulant dose-effekt i denne TVT-modellen kan ikke gjenspeile effekten i en mer alvorlig arteriell skade; Dermed bør andre blødningsmodeller brukes hvis slike blødninger er i fokus.

Som vist av den enkelte blødningsprofil, er den primære blødningen svært lik i alle gruppene som indikerer at primær hemostase, det vil si aggregering av aktiverte blodplater, er intakt i hemofili A-innstillingen42. I en immobilisert skade, selv under alvorlig hemofili, kan blodplateaggregasjon være tilstrekkelig til å dempe blødning. Av den grunn, gjennom empiriske studier, har vi funnet ut at å indusere en blødningsutfordring hver 10 min er et nødvendig skritt i protokollen for å forstyrre aggregater av aktiverte blodplater, som kan være sterke nok til å forhindre blødning selv uten fibringenerasjonen fra funksjonell koagulasjon. Siden fullt bedøvede mus ikke beveger seg og ikke fysisk kan utfordre skaden som det skjer i den ikke-bedøvede TVT-overlevelsesmodellen, var det nødvendig å introdusere utfordringstrinnene for å forhindre blodplateaggregering alene fra å dempe blødning. Noen ubehandlede hemofile mus blør spontant før utfordringen, men etter den første utfordringen oppstår spontane re-blødninger hos de fleste ubehandlede hemofile mus, og etter den andre utfordringen blør mange kontinuerlig til slutten av eksperimentet. Som forventet var det økt blødning i kjøretøy F8-KO mus sammenlignet med WT mus. Mus behandlet med økte doser rFVIII viste en doseavhengig reduksjon i både blodtap og blødningstid. Signifikant effekt på blødning ble observert ved doser 5 IE/kg og over (sammenlignet med kjøretøybehandlede mus). De to høyeste dosene reduserte blødningen til nivåer ganske nær den ville blødningsresponsen, noe som indikerer normalisering eller nær normalisering av blødning.

I tabell 1 presenterer vi en sammenligning av ulike ED50-verdier for flere blødningsmodeller, klassifisert etter de studerte endepunktene. I denne optimaliserte modellen observerte vi sammenlignbare ED50-verdier for blodtap og blødningstid (henholdsvis 2,4 ± 1,7 IE/kg og 2,6 ± 2,8 IE/kg). Ved hjelp av samme modell som studerte rFVIIa, var ED50-verdiene for blodtap og blødningstidhenholdsvis 0,42 mg/kg og 0,39 mg/kg. Dette er en større følsomhet for farmakologisk inngrep enn tidligere beskrevne blødningsmodeller under anestesi, for eksempel haleklipsmodellen, med FVIII ED50 for blodtap på 4,6 ± 0,5 IE/kg27, 28 IE/kg28 og 53 IE/kg20. Videre er det en høy variasjon av ED50 verdier i de forskjellige hale klipp modeller 20,27,28. En annen modell under anestesi er den alvorlige haleklippmodellen. Det er en raskere metode siden observasjonsperioden bare er 20 min, men den er mindre følsom for prokoagulant aktivitet. Doser høyere enn 200 IE/kg FVIII var nødvendig for å oppnå en statistisk signifikant reduksjon av blodtap sammenlignet med kjøretøybehandlede dyr25. I vena saphena modell30 var ED50-verdien for blødningstid 8,1 ± 2,2 IE/kg, og ED50 for gjennomsnittlig blodtap var 5,1 ± 2,1 IE/kg, også mindre følsom enn vår raffinerte modell med hensyn til begge parametrene. Videre krever denne modellen delikat arbeid for å utføre karskaden og flere gjentatte intervensjoner som, hvis de ikke utføres reprodusert, kan påvirke utfallet.

I den tradisjonelle TVT-overlevelsesmodellen evalueres overlevelse i en periode på 24 timer etter dosering, hvor blødning eller re-blødning kan oppstå når som helst. Dermed krever effekten i TVT-overlevelsesmodellen at den prokoagulerende effekten av behandlingen vedvarer i minst mesteparten av observasjonsperioden på 24 timer. I metoden som presenteres her, vurderer vi akutte effekter mellom 5 min og 40 min etter dosering; En direkte sammenligning av ED50-verdier er derfor vanskelig å fastslå siden det vil være behov for høyere doser i overlevelsesmodellene for å opprettholde hemostatisk dekning i siste del av observasjonsperioden. Men hvis det er ønskelig, kan den optimaliserte TVT-modellen brukes til å evaluere varigheten av hemostatisk dekning ved å introdusere en forsinkelse mellom dosering og blødningsprosedyren. Dette er beskrevet for en tidligere versjon av vår optimaliserte TVT-modell der utføring av TVT 24 h etter dosering resulterte i en ED50 av omtrent 10-15 IE / kg for umodifisert rFVIII26. Som nevnt i tabell 1, i hale-transeksjonsmodeller med 24-timers overlevelse som endepunkt, er ED50-verdier på 21 IE/kg 9 og 58 IE/kg36 av rFVIII rapportert. På samme måte krever overlevelsesmodellerfor haleklips 8 også høyere prokoagulantdoser enn deres akutte kolleger.

I perspektiv har flere forskjellige koagulasjonsfaktorer (FVIII, FVIIa, FIX) og derivater, hvorav noen nå markedsføres, blitt evaluert med den optimaliserte modellen ved hjelp av forskjellige hemofile musestammer 26,38,43,44,45,46,47. Vi har også kunnet tilpasse modellen til studiet av behovsbetinget intervensjoner ved dosering etter transeksjonen, like før den første utfordringen. Videre har vi med hell brukt denne modellen til å evaluere bisspesifikke antistoffer med prokoagulant aktivitet (Østergaard et al., akseptert for publisering i Blood), overvinne arter kryss-reaktivitet utfordringer ved dosering menneskelig FIX og menneskelig FX. Dette demonstrerer allsidigheten og translasjonsverdien av modellen i utviklingen av nye legemidler innen hemofilifeltet, for eksempel blodplatemålrettede strategier48. AAV-baserte eller genomredigeringsstrategier kan også evalueres i tilfeller der det er en surrogat som er farmakologisk aktiv hos mus. Derfor er denne optimaliserte TVT blødningsmodellen et alternativ til hale vene transeksjon og hale klipp overlevelsesmodeller, samt et verdifullt alternativ til andre blødningsmodeller under anestesi. Denne modellen er mer human sammenlignet med overlevelsesmodellen og et eksempel på raffinement, da dyrene ikke opplever smerte og lidelse. Etter vårt syn er følsomheten for klinisk relevante dosenivåer, relativ teknisk enkelhet og unngå død/nær-død som endepunkter betydelige fordeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne er eller var ansatte og/eller aksjonærer i Novo Nordisk A/S på det tidspunktet denne forskningen ble utført.

Acknowledgments

Esther Bloem og Thomas Nygaard er anerkjent for støtte med målinger av FVIII i plasma. Bo Alsted er anerkjent for å tegne og bearbeide malen og kutte blokker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scalpel blade Swann-Morton 503
15 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One, Austria 188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe 320830
Advate Takeda, Japan Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol Hartmann, Soft-Zellin 999 979
Centrifuge Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution Lysebio, ABX Diagnostics 906012
Gauze
Haematological analyser Sysmex CT-2000iv
Heating lamp on stand Phillips IR250
Heating pad with thermostat CMA model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent HemoCue, Denmark HemoCue calibrator, 707037 Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box Sigma Delta Dameca
Isoflurane Baxter 26675-46-7
Magnifier with lights Eschenbach
Measuring template (Aluminum) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips Finnpipette
Photometer Molecular Devices Corporation, CA, USA SpectraMax 340 photometer
Prism Software GraphPad, San Diego, CA, USA Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl Fresenius Kabi, Sweden 883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat TYP 3/8 Julabo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
  2. Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
  3. Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
  4. Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
  5. Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
  6. Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
  7. Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
  8. Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
  9. Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
  10. Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
  11. Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
  12. Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
  13. Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
  14. Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
  15. Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II - A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
  16. Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
  17. Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
  18. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  19. Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
  20. Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
  21. Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
  22. Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
  23. Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
  24. Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
  25. Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
  26. Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice - characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
  27. Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
  28. Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
  29. Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, Suppl 1 101-108 (2003).
  30. Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
  31. Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
  32. Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
  33. Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
  34. Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
  35. Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
  36. Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
  37. Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
  38. Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
  39. Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
  40. Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J. Haemophilias A and B. Lancet. 361 (9371), 1801-1809 (2003).
  41. Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
  42. Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
  43. Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
  44. Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
  45. Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
  46. Kawecki, C., et al. Posters Abstracts - Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
  47. Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
  48. Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).

Tags

Biologi Utgave 175 hale vene transeksjon modell hale blødning dyr modell farmakologi intervensjon hemofili faktor FVIII slå ut mus
Hale Vene Transeksjon Blødning Modell i Fullt Bedøvet Hemofili En Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carol Illa, A., Baumgarten, S.,… More

Carol Illa, A., Baumgarten, S., Danielsen, D., Larsen, K., Elm, T., Johansen, P. B., Knudsen, T., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ley, C. D. Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice. J. Vis. Exp. (175), e62952, doi:10.3791/62952 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter