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Biology

Modèle de saignement par transsection veineuse de la queue chez des souris hémophiliques A entièrement anesthésiées

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62952
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 4, 5, 1, 6, 1
1Global Drug Discovery, Novo Nordisk A/S, 2Department of Veterinary and Animal Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Independent consultant, 5Catalyst Biosciences, 6Værløse Dyreklinik

Summary

Le modèle de saignement par transsection de la veine caudale raffinée (TVT) chez les souris anesthésiées est une méthode in vivo sensible pour l’évaluation des saignements hémophiles. Ce modèle de saignement TVT optimisé utilise la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation, affinant d’autres modèles et évitant la mort comme critère d’évaluation.

Abstract

Les modèles de saignement de la queue sont des outils importants dans la recherche sur l’hémophilie, en particulier pour l’évaluation des effets du procoagulant. Le modèle de survie par transsection de la veine caudale (TVT) a été préféré dans de nombreux contextes en raison de la sensibilité aux doses cliniquement pertinentes de FVIII, tandis que d’autres modèles établis, tels que le modèle du clip de la queue, nécessitent des niveaux plus élevés de composés procoagulants. Pour éviter d’utiliser la survie comme critère d’évaluation, nous avons développé un modèle TVT établissant la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation et d’anesthésie complète pendant toute l’expérience. En bref, les souris anesthésiées sont positionnées avec la queue immergée dans une solution saline tempérée (37 ° C) et dosées avec le composé d’essai dans la veine latérale droite de la queue. Après 5 min, la veine latérale gauche de la queue est transectée à l’aide d’un guide modèle, la queue est retournée à la solution saline et tous les épisodes de saignement sont surveillés et enregistrés pendant 40 minutes tout en recueillant le sang. Si aucun saignement ne se produit à 10 min, 20 min ou 30 min après la blessure, le caillot est remis en question doucement en essuyant la coupe deux fois avec un tampon de gaze humide. Après 40 minutes, la perte de sang est quantifiée par la quantité d’hémoglobine saignée dans la solution saline. Cette procédure rapide et relativement simple se traduit par des saignements cohérents et reproductibles. Par rapport au modèle de survie TVT, il utilise une procédure plus humaine sans compromettre la sensibilité à l’intervention pharmacologique. En outre, il est possible d’utiliser les deux sexes, réduisant ainsi le nombre total d’animaux à élever, conformément aux principes des 3R. Une limitation potentielle dans les modèles de saignement est la nature stochastique de l’hémostase, qui peut réduire la reproductibilité du modèle. Pour contrer cela, la perturbation manuelle du caillot garantit que le caillot est remis en question pendant la surveillance, empêchant l’hémostase primaire (plaquette) d’arrêter le saignement. Cet ajout au catalogue de modèles de lésions hémorragiques offre une option pour caractériser les effets du procoagulant de manière standardisée et humaine.

Introduction

Les modèles animaux sont essentiels pour comprendre la pathogenèse de l’hémophilie et pour développer et tester des schémas thérapeutiques et des thérapies. La souris knock-out de facteur VIII (F8-KO) est un modèle largement utilisé pour l’étude de l’hémophilie A 1,2. Ces souris récapitulent les principales caractéristiques de la maladie et ont été largement utilisées pour le développement de traitements, tels que les produits recombinants FVIII 3,4,5 et les stratégies de thérapie génique 6,7.

Il existe différents modèles de lésions hémorragiques pour évaluer les effets pharmacologiques de différents composés hémostatiques in vivo. L’un de ces modèles de coagulation est le modèle de survie par transsection de la veine caudale chez les souris 8,9,10,11,12,13,14, mesurant la capacité des souris hémophiles à survivre à l’exsanguination après la transsection de la queue. Cette méthode a été introduite il y a plus de quatre décennies15 et est encore utilisée 9,16,17. Cependant, le modèle utilise la survie comme critère d’évaluation et nécessite l’observation des animaux sur une période allant jusqu’à 24 heures, au cours de laquelle les animaux sont conscients et peuvent donc ressentir de la douleur et de la détresse.

Des modèles de saignement de plus courte durée et sous anesthésie complète ont été décrits précédemment, tels que le modèle de clip de queue (également connu sous le nom de pointe de la queue)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Néanmoins, pour une normalisation complète de la perte de sang après le défi hémorragique, ces modèles nécessitent des doses de composés procoagulants (par exemple, FVIII) beaucoup plus élevées que celles administrées cliniquement29. Un modèle de blessure différent sous anesthésie, la méthode de saignement vena saphena, est sensible à des doses plus faibles de composés procoagulants30, mais nécessite un niveau élevé d’intervention de l’expérimentateur car les caillots doivent être perturbés fréquemment (par opposition à 3 fois dans le modèle présenté).

La normalisation vers un protocole commun pour tester de nouveaux composés procoagulants faciliterait grandement la comparaison des données entre les laboratoires 31,32,33. Dans les modèles TVT, il n’y a pas encore d’accord commun sur les critères d’évaluation étudiés (perte de sang 7,26, temps de saignement 9,34 et taux de survie35,36), et la durée expérimentale varie entre les études13.

Notre objectif principal est de décrire et de caractériser un modèle optimisé avec une reproductibilité élevée, la possibilité d’étudier à la demande ainsi qu’un traitement prophylactique, la sensibilité à l’intervention pharmacologique équivalente au modèle de survie, mais sans utiliser la mort ou la mort imminente comme critères d’évaluation. Afin de réduire la douleur et la détresse, les animaux ne doivent pas être conscients pendant les saignements et un critère d’évaluation plus éthique doit être mis en œuvre37.

Les modèles de clip de queue sont généralement effectués dans l’une des deux variantes, soit en amputant l’extrémité de la queue, par exemple, l’amputation de 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 ou, dans une variante plus sévère, transecté à un diamètre de queue d’environ 1-3 mm 8,22,25 . Cela provoque un saignement artérioveineux combiné, car les veines latérales et dorsales et l’artère ventrale sont généralement sectionnées et, en général, plus l’amputation est importante, plus la sensibilité à un composé procoagulant est faible. De plus, comme l’extrémité de la queue est amputée, la blessure artérioveineuse est exposée sans aucun tissu opposé; ainsi, du moins en théorie, il est différent des saignements hémophiles les plus courants.

Comme son nom l’indique, seule la veine est blessée dans les modèles de transsection de la veine caudale tels que décrits dans cet article, entraînant ainsi un saignement exclusivement veineux. Étant donné que le vaisseau n’est pas complètement sectionné, la blessure devrait être plus petite que dans les modèles d’amputation, et le tissu autour de la coupure, auquel un caillot peut adhérer, est conservé. En outre, il y a une pression artérielle plus basse dans la veine par opposition à l’artère. Ces facteurs contribuent à une sensibilité accrue par rapport aux modèles d’amputation, de sorte que la normalisation des saignements peut être obtenue avec des doses cliniquement pertinentes de traitement de remplacement, par exemple avec le rFVIII dans l’hémophilie A, ce qui est utile pour évaluer l’ampleur et la durabilité des effets du traitement par procoagulant 26,38,39.

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Protocol

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par l’organisme de bien-être animal de Novo Nordisk A/S et l’Inspection danoise de l’expérimentation animale, ministère danois de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche. La méthode optimisée de 40 minutes inclut l’anesthésie et le temps de dosage dans la conception (Figure 1). Des souris hémophiles des deux sexes âgées de 10 à 16 semaines sont nécessaires pour cette procédure.

1. Préparatifs avant l’étude

  1. Préparer les solutions posologiques aux concentrations correctes.
  2. Démarrez le bain-marie et chauffez à 37 °C. Remplissez les tubes de centrifugeuse de 15 mL pour la collecte de sang avec une solution saline (0,9% NaCl).
  3. Placez les tubes salins de 15 mL dans les trous de la plaque de base chauffée au moins 15 minutes avant le début de l’expérience.
  4. Identifiez les souris et enregistrez leur poids. Évitez de manipuler des souris plus que nécessaire, car cela peut causer du stress et affecter l’étude.
  5. Préparez le poste de travail dans la hotte avant de continuer afin que tout soit à portée de main : serviettes, porte-queue, gaze, seringues, scalpels, chronomètres et papier de notation du flux sanguin.
  6. Placez la marque de queue et les blocs de coupe sur la plaque chauffante - les blocs froids feront contracter les veines et affecteront ainsi le saignement.

2. Anesthésie

  1. Effectuer la procédure d’anesthésie à l’isoflurane à l’intérieur d’une hotte.
  2. Réglez le vaporisateur de gaz à 5% d’isoflurane dans 30% O2/70% N2O dans la chambre d’anesthésie avec un débit de 1 L / min. Prévoyez suffisamment de temps pour que la chambre d’anesthésie se remplisse (environ 5 minutes en fonction du volume de la chambre et du débit de gaz). Assurez une induction rapide (moins d’une minute).
  3. Placez les souris dans la chambre d’anesthésie jusqu’à ce qu’elles perdent connaissance.
    REMARQUE: Cela devrait se produire dans une minute ou moins si la chambre est suffisamment remplie.
  4. Assurer une bonne anesthésie par l’absence de réponse douloureuse au réflexe de pédale (pincement ferme de l’orteil).
  5. Placez les souris sur la plaque chauffante, en vous assurant que le nez est dans le cône de nez.
  6. Réduire l’anesthésie à un niveau d’entretien de 2% d’isoflurane dans 30% O2/70% N2O et placer un couvercle en plastique au-dessus des souris pour réduire la perte de chaleur. Appliquez une pommade oculaire appropriée pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  7. Marquez la queue à un diamètre de 2,5 mm à l’aide du bloc de marquage de queue. Ne forcez pas la queue dans la fente du bloc - elle doit s’adapter parfaitement (Figure supplémentaire 1)
  8. Placez la queue dans le tube salin pendant au moins 5 minutes pour assurer une veine caudale chaude qui est optimale pour le dosage intraveineux (i.v.).

3. Dosage de la solution d’essai

  1. Placez une souris dans le porte-queue avec le nez dans un masque d’anesthésie.
  2. Dosez l’animal avec le composé d’intérêt (dans ce cas, rFVIII) et démarrez immédiatement le chronomètre (t = 0).
  3. Replacez la souris sur la plaque chauffante avec la queue dans le tube salin. Répétez la procédure avec les autres souris.

4. Effectuer la transsection de la veine caudale

  1. Effectuer la transsection de la veine caudale exactement 5 min après l’administration. Placez la queue dans le bloc de coupe et tournez de 90° pour exposer la veine (Figure supplémentaire 2).
  2. Effectuer la coupe du côté opposé / de la veine à partir de laquelle la solution d’essai a été dosée.
  3. Dessinez la lame de scalpel #11 à travers la fente du bloc de coupe qui maintient la queue pour créer un saignement. Réinitialisez le chronomètre et retournez immédiatement la queue à la solution saline.

5. Temps d’observation et défis

  1. Observez le saignement et annotez le début et l’arrêt du saignement pendant 40 minutes; annotez-le sur le papier de notation du flux sanguin.
    REMARQUE: Cette évaluation visuelle des saignements peut varier légèrement en raison de la subjectivité.
  2. Le saignement primaire doit cesser dans les 3 minutes suivant la coupure. Si ce n’est pas le cas, disqualifiez la souris, euthanasiez-la et remplacez-la (le fait de ne pas arrêter le saignement primaire peut indiquer une blessure trop grave ou un manque d’hémostase primaire, comme chez les souris KO vWF).
  3. S’il n’y a pas de saignement à 10 min, 20 min et 30 min après la blessure, remettez la queue au défi comme décrit aux étapes 4 à 5.
  4. Utilisez un tampon de gaze imbibé d’une solution saline chaude provenant d’un tube séparé conservé au bain-marie. Soulevez la queue de la solution saline et essuyez doucement deux fois avec la gaze humide dans une direction distale sur la coupe de la queue.
  5. Après chaque défi, ré-immergez immédiatement la queue dans le tube salin à nouveau.
  6. À t = 40 min, arrêtez la collecte de sang en retirant la queue du tube salin.

6. Prélèvement sanguin

  1. Après t = 40 min, obtenir des échantillons de sang de la veine supraorbitaire.

7. Euthanasie

  1. Euthanasier les souris par luxation cervicale alors qu’elles sont encore sous anesthésie complète.

8. Traitement des échantillons

  1. Centrifuger les tubes de prélèvement sanguin de 15 mL avec une solution saline à 4000 x g pendant 5 min à température ambiante.
  2. Jeter le surnageant des tubes de 15 mL, remettre la pastille dans 2 à 14 mL de solution de lysage des érythrocytes (RBC), puis la diluer jusqu’à ce qu’elle atteigne une couleur de café claire.
  3. Notez le volume total (volume de sang + volume d’érythrocytes (RBC) solution de lysage ajoutée à l’aide des marques de graduation sur le tube).
  4. Transférer 2 mL de la dilution dans un tube d’hémoglobine et réfrigérer jusqu’à l’analyse de l’hémoglobine.
  5. Déterminez la perte de sang en mesurant la concentration d’hémoglobine dans la solution saline. Mesurer l’absorbance à 550 nm sur un lecteur de microplaques (Table des matériaux).
  6. Convertir l’absorbance en hémoglobine nmol à l’aide d’une courbe standard préparée à partir d’hémoglobine humaine (table des matériaux) et corriger la dilution avec une solution de lysage RBC.

9. Analyses statistiques

  1. Analysez les données à l’aide d’un logiciel approprié. Ici, le logiciel GraphPad Prism a été utilisé. Au cours d’une gamme d’études, les méthodes statistiques suivantes se sont avérées efficaces.
    REMARQUE: Pour analyser la perte de sang, le temps de saignement, l’exposition, la numération plaquettaire et l’hématocrite; Le test ANOVA de Brown-Forsythe et Welch a été utilisé (car les données étaient continues mais sans homogénéité de variance des résidus) en appliquant le test de Dunnett pour tenir compte de comparaisons multiples. Un test de Pearson a été utilisé pour tester les corrélations entre le temps de saignement, la perte de sang et les doses. Pour déterminer les valeurs ED50 , une équation de réponse logarithmique inverse (dose) à quatre paramètres a été ajustée aux données sur les saignements et les pertes de sang. Pour analyser l’effet de genre, un test ANOVA bidirectionnel a été utilisé, en appliquant la correction de Bonferroni pour ajuster les comparaisons multiples. Le niveau de signification a été défini comme P < 0,05. Les données sont affichées comme moyens ± SEM.

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Representative Results

Pour évaluer l’applicabilité du modèle optimisé, une étude a été réalisée chez des souris F8-KO (C57BL genetic background) administrées avec une thérapie de remplacement du facteur VIII recombinant disponible dans le commerce (rFVIII); quatre doses différentes ont été testées : 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg et 20 UI/kg. De plus, nous avons testé le témoin correspondant du véhicule (négatif) chez des souris F8-KO et un groupe de type sauvage (WT) en utilisant des souris C57BL comme groupe témoin positif pour évaluer la plage de réponse dans le modèle.

Selon le protocole optimisé, il y a eu une réduction significative de la perte de sang pour les groupes de traitement rFVIII par rapport au groupe de véhicules. De plus, une réduction du temps de saignement a été observée dans les groupes de traitement de 5 UI/kg, 10 UI/kg et 20 UI/kg par rapport au groupe de véhicules (Figure 2). Chez les souris WT, la perte de sang totale variait de 201,8 à 841,9 nmol Hgb (IC à 95 %) et chez les souris véhicules variait de 5335 à 7148 nmol Hgb (IC à 95 %). Après l’équivalence approximative de 1000 nmol Hgb ~ 125 μL de sang total, le saignement moyen chez les souris traitées par véhicule était de 780,25 μL, tandis que sur le groupe 20 UI / kg était de 89,95 μL. Ainsi, une dose de 20 UI/kg a complètement normalisé le saignement, et l’administration de 10 UI/kg a provoqué un effet significatif, réduisant la perte de sang presque à la limite supérieure de la gamme WT (Figure 3). Le temps de saignement des souris WT variait de 0,98 à 9,16 min (IC à 95 %), et des doses de 10 UI/kg et 20 UI/kg réduisaient le temps de saignement à l’intérieur de cette plage. Une forte corrélation entre la perte de sang et le temps de saignement a été observée dans les données combinées (r = 0,9357, P < 0,0001) (Figure 4).

Pour évaluer la sensibilité du modèle, une équation de réponse log(dose) inverse à quatre paramètres a été ajustée aux observations de perte de sang et de temps de saignement, et un effet dose-dépendant clair de l’administration de rFVIII sur la perte de sang et pour le temps de saignement a été observé (Figure 3). Les valeurs estiméesde la der ED 50 pour la perte de sang et le temps de saignement étaient de 2,41 ± 1,69 UI / kg et de 2,55 ± 2,80 UI / kg, respectivement.

Pour illustrer comment les saignements se produisent dans le modèle, tous les épisodes de saignement enregistrés ont été tracés pour fournir une visualisation de la longueur et du nombre de saignements pour chaque souris individuelle (Figure 5). Le saignement primaire est très similaire dans tous les groupes. La plupart des véhicules hémophiles commencent à saigner à nouveau avant le deuxième défi à 20 minutes, et pour environ la moitié de ces animaux, le saignement ne s’arrête pas après le premier défi. Enfin, comme décrit, le traitement par rFVIII a réduit la durée des épisodes hémorragiques chez les souris F8-KO traitées par rapport au véhicule, avec déjà un changement observable à la dose la plus faible. Aux doses les plus élevées, la plupart des souris n’ont saigné que brièvement après avoir été mises au défi.

La concentration plasmatique de rFVIII a été mesurée par un test de canalisation de l’oxygène luminescent (LOCI) détectant le hFVIII et des analogues pour vérifier que l’effet observé dans la réduction de la perte de sang et du temps de saignement dépendait de la concentration (Figure 6). Il existe une variabilité au sein de chaque groupe (CV moyen de 46%), mais des différences significatives entre les groupes peuvent être observées, corroborant ainsi que l’effet observé sur la perte de sang et le temps de saignement dépend de la concentration plasmatique de FVIII. Toutes les souris traitées par véhicule ont été mesurées en dessous de la limite inférieure de quantification pour le dosage (2 U/L) et sont représentées avec cette valeur. Les souris WT n’ont pas été mesurées car le test FVIII appliqué est spécifique à la détection du FVIII humain.

La numération plaquettaire et l’hématocrite ont été déterminés pour tous les groupes à l’aide des échantillons de sang prélevés après le saignement (figure 7 et mesurés à l’aide d’un analyseur hématologique (table des matières). Il n’y avait aucune variation entre les groupes dans la numération plaquettaire, ce qui indique que le nombre de plaquettes n’est pas affecté, et les souris, par conséquent, restent capables d’hémostase primaire. Pour les mesures de l’hématocrite, des niveaux normaux ont été observés chez les animaux recevant des doses modérées et plus élevées de FVIII (5 UI/ kg, 10 UI / kg et 20 UI / kg), tandis que des niveaux significativement plus faibles ont été observés dans les groupes traités par véhicule et 1 UI / kg (par rapport aux animaux WT). Il s’agit d’une observation fréquente chez les animaux hémophiles après des saignements abondants.

Classiquement, un seul sexe d’animaux (généralement mâles) a été utilisé dans les études animales, et cela est également décrit pour les modèles de survie TVT 8,9,11,12. S’efforçant de réduire le nombre total de souris hémophiles nécessaires dans les études futures (pour la reproduction et l’étude), les deux sexes ont été utilisés. Pour évaluer l’effet du sexe dans ce modèle optimisé (figure 8), les résultats de la perte de sang et du temps de saignement ont été soumis à une analyse bidirectionnelle de l’ANOVA avec le sexe et la dose comme facteurs. Dans cette analyse, l’effet de la dose de rFVIII était statistiquement significatif (P < 0,0001), mais le sexe de la souris n’a pas affecté de manière significative les résultats (P 0,35), et aucune interaction significative n’a été trouvée entre les paramètres, indiquant que les réponses au traitement ne différaient pas entre les sexes.

Figure 1
Figure 1 : Conception temporelle de la configuration expérimentale. La phase précédant la transsection de la veine caudale (TVT) comprend l’induction de l’anesthésie, le réchauffement de la queue dans une solution saline et le dosage. Après la blessure TVT, 40 minutes de surveillance du saignement sous anesthésie, avec des défis ultérieurs toutes les 10 minutes, sont effectuées. La procédure expérimentale est conclue par le prélèvement d’échantillons de sang et l’euthanasie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Effet du rFVIII après administration intraveineuse. Perte de sang totale (panneau de gauche) et temps de saignement total (panneau de droite) des souris F8-KO. Chaque souris est représentée sous forme d’observations individuelles et de moyenne ± SEM. Les différentes doses d’essai de rFVIII sont représentées dans l’axe des x. Les données ont été analysées par Brown-Forsythe et Welch ANOVA en appliquant le test de Dunnett pour tenir compte de plusieurs comparaisons. P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Courbes dose-réponse pour la perte de sang et le temps de saignement. Perte de sang (panneau de gauche) et temps de saignement (panneau de droite). La zone grise représente l’IC à 95 % des valeurs de 6 souris C57BL/6 de type sauvage non traitées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Graphique de corrélation pour la perte de sang et le temps de saignement. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Profils de saignement individuels chez des souris traitées par type sauvage, véhicule, 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg et 20 UI/kg traitées par rFVIII. Chaque ligne représente le profil de saignement d’une seule souris, tandis que chaque barre pointillée représente un épisode de saignement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Exposition au RVCIII. La concentration plasmatique de FVIII a été mesurée par un test de canalisation de l’oxygène luminescent (LOCI) pour la détection du FVIII humain. Les souris véhicules étaient sous la limite inférieure de quantification (LLOQ) et ont donc été tracées avec la valeur LLOQ (2 U/L). Les animaux WT n’ont pas été mesurés puisque le test FVIII appliqué est spécifique pour détecter le FVIII humain. Les différentes doses d’essai de rFVIII et un contrôle WT sont représentés dans l’axe des x. ** P < 0,01, *** P < 0,001 et **** P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Données hématologiques. La numération plaquettaire (panneau de gauche) et l’hématocrite (panneau de droite) des souris F8-KO sont montrées comme moyennes d’observations individuelles avec SEM. Les différentes doses d’essai de rFVIII et un contrôle WT sont représentés sur l’axe des x. Les données ont été analysées par Brown-Forsythe et Welch ANOVA en appliquant le test de Dunnett pour tenir compte de plusieurs comparaisons. ** P < 0,01 et *** P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Graphique 8. Effet du genre. La perte de sang (panneau de gauche) et le temps de saignement (panneau de droite) classés par traitement sont présentés comme des observations individuelles avec une moyenne ± SEM. Les données ont été analysées par ANOVA bidirectionnelle en appliquant la correction de Bonferroni pour ajuster pour plusieurs comparaisons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Temps de saignement ED50 (UI/kg) Perte de sang ED50 (UI/kg) ED50 survie (UI/kg)
Modèles sous anesthésie Modèle optimisé de transsection de la veine caudale 2,6 ± 2,8 2.4 ± 1.7 non pertinent
Vena saphena modèle30 8.1 ± 2.2 5.1 ± 2.1 non pertinent
Clip de queue modéré (L =3mm)27 non déclaré 4,6 ± 0,5 non pertinent
Clip de queue modéré (L =4mm)28 39 28 non pertinent
Clip de queue modéré (L = 4mm)20 non déclaré 53 non pertinent
Modèles de survie Modèle de survie par transsection de la veine de la queue36 non déclaré non déclaré 58
Modèle de survie par transsection de la veine de la queue10 non déclaré non déclaré 21

Tableau 1 : Valeurs ED50 . Comparaison des valeurs ED50 de différents modèles de saignement disponibles pour les études sur l’hémophilie chez la souris. Les données sont extraites des articles cités [références en exposant] et présentées sous la forme deED 50 (UI/kg)

Figure supplémentaire 1 : Modèle de mesure. Produit en aluminium. Spécifications de taille: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x L x H). Rainure: 2,5 mm de profondeur et 2,5 mm de largeur; rayon 1,25 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Modèle de coupe. Produit en acier inoxydable. Spécifications de taille: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x L x H). Rainure: 3 mm de profondeur et 3 mm de largeur; rayon 1,5 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cette méthode optimisée de transsection de la veine caudale (TVT) présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de survie TVT. Les animaux sont entièrement anesthésiés pendant toute la durée de l’étude, ce qui facilite la manipulation des souris et augmente le bien-être des animaux. De plus, contrairement au modèle de survie TVT, l’observation de nuit n’est pas nécessaire, et ce modèle optimisé offre la possibilité de mesurer la perte de sang et d’observer le temps de saignement exact sur 40 min. En outre, des périodes plus longues de saignement chez les animaux conscients peuvent causer la mort par exsanguination, entraînant de la douleur et de la détresse chez les animaux et probablement du stress, entraînant potentiellement une variation accrue14. La perte de sang et le temps de saignement ont été caractérisés et validés avec succès en tant que critères d’évaluation, remplaçant le temps jusqu’à la mort ou la mort imminente. La blessure réelle à la queue est bien définie et normalisée puisqu’elle utilise un guide de bloc de coupe pour effectuer le TVT, assurant une coupe reproductible, réduisant la difficulté de la procédure et la variabilité technique. Par conséquent, une plus grande robustesse du modèle peut être obtenue, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. En outre, les données ont démontré qu’il est possible d’utiliser à la fois des souris mâles et femelles, réduisant ainsi le nombre total d’animaux à élever, conformément aux principes 3R. Parallèlement à ces observations, il existe une tendance selon laquelle les souris femelles saignent légèrement moins et varient légèrement plus dans les groupes à saignement élevé, mais pas dans les groupes à faibles saignements. Des mesures de perte de sang plus faibles pourraient être associées à des femmes ayant une taille plus petite, et donc moins de volume sanguin par rapport aux hommes du même âge.

Les saignements spontanés chez les patients hémophiles sont généralement internes, impliquant en particulier des saignements musculo-squelettiques, mous et muco-cutanés, tandis que les blessures externes (telles que les coupures mineures) ne sont pas la cause la plus fréquente de saignements prolongés, bien que des coupures et des traumatismes plus graves puissent mettre la vie en danger40,41. Ce modèle optimisé induit des saignements veineux uniquement, tandis que d’autres modèles, tels que le clip de queue, induisent un mélange de saignements artério-veineux. Étant donné que le modèle décrit est un modèle veineux seulement, l’effet de la dose de procoagulant dans ce modèle TVT pourrait ne pas refléter l’effet d’une lésion artérielle plus grave; ainsi, d’autres modèles de saignement doivent être utilisés si de tels saignements sont au centre de l’attention.

Comme le montre le profil hémorragique individuel, le saignement primaire est très similaire dans tous les groupes, ce qui indique que l’hémostase primaire, c’est-à-dire l’agrégation des plaquettes activées, est intacte dans le paramètre d’hémophilie A42. Dans une blessure immobilisée, même en cas d’hémophilie sévère, l’agrégation plaquettaire peut suffire à atténuer les saignements. Pour cette raison, grâce à des études empiriques, nous avons constaté que l’induction d’un défi hémorragique toutes les 10 minutes est une étape nécessaire du protocole afin de perturber les agrégats de plaquettes activées, qui peuvent être assez fortes pour prévenir les saignements même sans la génération de fibrine de la coagulation fonctionnelle. Étant donné que les souris entièrement anesthésiées ne bougent pas et ne peuvent pas contester physiquement la blessure comme cela se produit dans le modèle de survie TVT non anesthésié, il était nécessaire d’introduire les étapes de défi pour empêcher l’agrégation plaquettaire seule d’atténuer les saignements. Certaines souris hémophiles non traitées saignent à nouveau spontanément avant le défi, mais après le premier défi, des saignements spontanés se produisent chez la plupart des souris hémophiles non traitées, et après le deuxième défi, beaucoup saignent continuellement jusqu’à la fin de l’expérience. Comme prévu, il y avait une augmentation des saignements chez les souris véhicules F8-KO par rapport aux souris WT. Les souris traitées avec des doses accrues de rFVIII ont montré une réduction dose-dépendante de la perte de sang et du temps de saignement. Un effet significatif sur les saignements a été observé à des doses de 5 UI / kg et plus (par rapport aux souris traitées par véhicule). Les deux doses les plus élevées ont réduit les saignements à des niveaux assez proches de la réponse hémorragique de type sauvage, indiquant une normalisation ou une quasi-normalisation des saignements.

Dans le tableau 1, nous présentons une comparaison de différentes valeurs ED50 pour plusieurs modèles de saignement, classés par les critères d’évaluation étudiés. Dans ce modèle optimisé, nous avons observé des valeurs ED50 comparables pour la perte de sang et le temps de saignement (2,4 ± 1,7 UI / kg et 2,6 ± 2,8 UI / kg, respectivement). En utilisant le même modèle d’étude de la rFVIIa, les valeurs ED50 pour la perte de sang et le temps de saignement étaient de 0,42 mg / kg et 0,39 mg / kg, respectivement38. Il s’agit d’une plus grande sensibilité à l’intervention pharmacologique que les modèles de saignement décrits précédemment sous anesthésie, tels que le modèle de clip de queue, avec FVIII ED50 pour une perte de sang de 4,6 ± 0,5 UI / kg27, 28 UI / kg28 et 53 UI / kg20. En outre, il existe une grande variabilité des valeurs ED50 dans les différents modèles de clip de queue 20,27,28. Un autre modèle sous anesthésie est le modèle de clip de queue sévère. C’est une méthode plus rapide puisque la période d’observation n’est que de 20 min, mais elle est moins sensible à l’activité du procoagulant. Des doses supérieures à 200 UI/kg de FVIII étaient nécessaires pour obtenir une réduction statistiquement significative de la perte de sang par rapport aux animaux traités par véhicule25. Dans le modèle30 de vena saphena, la valeur ED50 pour le temps de saignement était de 8,1 ± 2,2 UI / kg, et ED50 pour la perte de sang moyenne était de 5,1 ± 2,1 UI / kg, également moins sensible que notre modèle raffiné en ce qui concerne les deux paramètres. De plus, ce modèle nécessite un travail délicat pour effectuer la lésion du vaisseau et de multiples interventions répétées qui, si elles ne sont pas effectuées de manière reproductible, pourraient influencer le résultat.

Dans le modèle de survie TVT traditionnel, la survie est évaluée pendant une période de 24 heures après l’administration, au cours de laquelle des saignements ou des saignements à nouveau peuvent survenir à tout moment. Ainsi, l’efficacité dans le modèle de survie TVT nécessite que l’effet procoagulant du traitement persiste pendant au moins la majorité de la période d’observation de 24 heures. Dans la méthode présentée ici, nous évaluons les effets aigus entre 5 min et 40 min après l’administration; il est donc difficile d’établir une comparaison directe des valeurs dela DE 50 , car des doses plus élevées seront nécessaires dans les modèles de survie afin de maintenir la couverture hémostatique pendant la dernière partie de la période d’observation. Cependant, si vous le souhaitez, le modèle TVT optimisé peut être utilisé pour évaluer la durée de la couverture hémostatique en introduisant un délai entre le dosage et la procédure de saignement. Cela a été décrit pour une version précédente de notre modèle TVT optimisé où l’exécution du TVT 24 h après le dosage a abouti à un ED50 d’environ 10-15 UI / kg pour rFVIII26 non modifié. Comme indiqué dans le tableau 1, dans les modèles de transsection de la queue avec une survie de 24 heures comme critère d’évaluation, des valeurs ED50 de 21 UI/kg 9 et 58 UI/kg36 de rFVIII ont été rapportées. De même, les modèles de survie par clip de queue8 nécessitent également des doses de procoagulant plus élevées que leurs homologues aigus.

En perspective, plusieurs facteurs de coagulation différents (FVIII, FVIIa, FIX) et dérivés, dont certains sont maintenant commercialisés, ont été évalués avec le modèle optimisé en utilisant différentes souches de souris hémophiles 26,38,43,44,45,46,47. Nous avons également pu adapter le modèle à l’étude des interventions à la demande par dosage après la transsection, juste avant le premier défi. De plus, nous avons utilisé avec succès ce modèle pour évaluer les anticorps bispécifiques ayant une activité procoagulante (Østergaard et al., acceptés pour publication dans Blood), surmontant les défis de réactivité croisée des espèces en dosant du FIX humain et du FX humain. Cela démontre la polyvalence et la valeur translationnelle du modèle dans le développement de nouveaux médicaments dans le domaine de l’hémophilie, tels que les stratégies ciblant les plaquettes48. Les stratégies basées sur l’AAV ou l’édition du génome peuvent également être évaluées dans les cas où il existe une mère porteuse pharmacologiquement active chez la souris. Par conséquent, ce modèle de saignement TVT optimisé est une alternative aux modèles de transsection de la veine caudale et de survie du clip de la queue, ainsi qu’une alternative précieuse aux autres modèles de saignement sous anesthésie. Ce modèle est plus humain par rapport au modèle de survie et un exemple de raffinement car les animaux ne ressentent pas de douleur et de souffrance. À notre avis, la sensibilité aux doses cliniquement pertinentes, la simplicité technique relative et l’évitement de la mort ou de la mort imminente comme critères d’évaluation sont des avantages importants.

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Disclosures

Les auteurs sont ou étaient des employés et/ou des actionnaires de Novo Nordisk A/S au moment où cette recherche a été réalisée.

Acknowledgments

Esther Bloem et Thomas Nygaard sont reconnus pour leur soutien avec les mesures de FVIII dans le plasma. Bo Alsted est reconnu pour le dessin et l’usinage du gabarit et la découpe de blocs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scalpel blade Swann-Morton 503
15 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One, Austria 188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe 320830
Advate Takeda, Japan Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol Hartmann, Soft-Zellin 999 979
Centrifuge Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution Lysebio, ABX Diagnostics 906012
Gauze
Haematological analyser Sysmex CT-2000iv
Heating lamp on stand Phillips IR250
Heating pad with thermostat CMA model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent HemoCue, Denmark HemoCue calibrator, 707037 Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box Sigma Delta Dameca
Isoflurane Baxter 26675-46-7
Magnifier with lights Eschenbach
Measuring template (Aluminum) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips Finnpipette
Photometer Molecular Devices Corporation, CA, USA SpectraMax 340 photometer
Prism Software GraphPad, San Diego, CA, USA Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl Fresenius Kabi, Sweden 883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat TYP 3/8 Julabo

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Biologie numéro 175 modèle de transsection de la veine caudale saignement de la queue modèle animal intervention pharmacologique hémophilie facteur FVIII knock out souris
Modèle de saignement par transsection veineuse de la queue chez des souris hémophiliques A entièrement anesthésiées
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Carol Illa, A., Baumgarten, S.,… More

Carol Illa, A., Baumgarten, S., Danielsen, D., Larsen, K., Elm, T., Johansen, P. B., Knudsen, T., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ley, C. D. Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice. J. Vis. Exp. (175), e62952, doi:10.3791/62952 (2021).

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