Summary
ここでは、アカゲザル脳脊髄液中のAβおよびタウ代謝に対する異なる周波数(1Hz/20Hz/40Hz)の反復経頭蓋磁気刺激の影響を探るためのパイロット研究の手順を説明する。
Abstract
以前の研究では、非侵襲的な光のちらつきレジームと聴覚音の刺激が脳内のAβとタウの代謝に影響を与える可能性があることが実証されています。非侵襲的技術として、神経変性疾患の治療に反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)が適用されている。この研究は、アカゲザル脳脊髄液(CSF)中のAβおよびタウレベルに対するrTMSの効果を調査した。これは、単一盲検の自己制御研究です。rTMSの3つの異なる周波数(低周波、1Hz;高周波、20Hzおよび40Hz)を用いて、アカゲザルの両側背外側前頭前野(DLPFC)を刺激した。CSFを採取するためにカテーテル法を用いた。全てのサンプルを液体チップ検出に供し、CSFバイオマーカー(Aβ42、Aβ42/Aβ40、tTau、pTau)を分析した。CSFバイオマーカーレベルは、rTMSによる刺激後の時間とともに変化した。刺激後、CSFのAβ42レベルは、すべての周波数(1Hz、20Hz、および40Hz)で上昇傾向を示し、高周波(p<0.05)では低周波よりも有意差が大きかった。
高周波rTMSの後、CSFの総タウ(tTau)レベルは、rTMS後の時点(p<0.05)で直ちに増加し、24時間ずつ徐々に減少した。さらに、結果は、リン酸化タウ(pTau)のレベルが40Hz rTMSの直後に増加したことを示した(p<0.05)。Aβ42/Aβ40の比は、1Hzおよび20Hzで上昇傾向を示した(p<0.05)。低周波(1Hz)刺激によるタウレベルに有意差はなかった。したがって、rTMSの高周波(20Hzおよび40Hz)はアカゲザルCSFのAβおよびタウレベルにプラスの効果をもたらす可能性があるが、低周波(1Hz)rTMSはAβレベルにのみ影響する可能性がある。
Introduction
アミロイドβ(Aβ)およびタウは重要なCSFバイオマーカーである。Aβは42個のアミノ酸(Aβ1-42)からなり、膜貫通アミロイド前駆体タンパク質(APP)がβセクレターゼおよびγセクレターゼ1によって加水分解された産物です。Aβ1-42は、その溶解特性のために脳内の細胞外アミロイドプラークに凝集する可能性がある1,2。タウは微小管関連タンパク質で、主に軸索に存在し、順行性軸索輸送に関与しています3。異常なタウの過剰リン酸化は、主にキナーゼとホスファターゼとの間の不均衡によって誘発され、微小管からのタウの剥離および神経原線維のもつれ(NFT)の形成をもたらす1。タウおよびリン酸化タウタンパク質(pTau)が神経変性プロセス中に細胞外空間に放出されるため、CSF中のタウの濃度が増加する。これまでの研究では、CSFバイオマーカーがアルツハイマー病(AD)脳の3つの主要な病理学的変化(細胞外アミロイドプラーク、細胞内NFT形成、およびニューロン喪失)に関連していることが示されています4。ADの初期段階に存在するAβおよびタウの異常な濃度は、したがって早期AD診断を可能にする5,6。
2016年、ツァイらは、非侵襲的な光のちらつき(40Hz)が、沈着前マウスの視覚野におけるAβ1-40およびAβ1-42のレベルを低下させることを見出した7。最近、彼らはさらに、聴覚緊張刺激(40Hz)が認識と空間記憶を改善し、5XFADマウスの海馬および聴覚野(AC)におけるアミロイドタンパク質レベルを低下させ、P301SタウオパチーモデルにおけるpTau濃度を低下させることを報告した8。これらの結果は、非侵襲的技術がAβおよびタウ代謝に影響を及ぼす可能性があることを示している。
非侵襲的なツールとして、経頭蓋磁気刺激(TMS)は、脊髄、末梢神経、および大脳皮質を含む神経組織を電気的に刺激することができる9。さらに、それは刺激部位および機能的接続における大脳皮質の興奮性を改変することができる。したがって、TMSは、神経変性障害の治療および予後および診断検査に使用されている。TMSにおける臨床介入の最も一般的な形態であるrTMSは、皮質の活性化を誘導し、皮質の興奮性を改変し、認知/運動機能を調節することができる。
20Hz rTMSは、グルタミン酸およびAβを含む酸化ストレッサーに対してインビトロ神経保護効果を有し、マウスにおけるモノクローナル海馬HT22細胞の全体的な生存率を改善したことが報告された10。1HzのrTMS刺激後、海馬におけるβ部位APP切断酵素1、APP、およびそのC末端断片がかなり減少した。特に、海馬CA1における長期増強、空間学習、および記憶の障害は逆転した11,12。Baiらは、ワーキングメモリ試験中のAβ誘発ガンマ振動機能不全に対するrTMSの影響を調査した。彼らは、rTMSがAβ誘発性機能障害を逆転させ、作業記憶に潜在的な利益をもたらす可能性があると結論付けた13。しかし、rTMSがタウ代謝に及ぼす影響や、rTMSの前後のCSFにおけるAβとタウの動的変化に関する報告はほとんどない。このプロトコルは、アカゲザルCSFのAβおよびタウレベルに対する異なる周波数(低周波、1Hz、高周波、20Hz、および40Hz)におけるrTMSの影響を調査する手順を説明しています。
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Protocol
すべての実験は、中華人民共和国科学技術部が策定した実験動物の世話と使用のためのガイダンスとバーゼル宣言の原則の下で行われました。四川大学西中国病院(中国・成都)の動物愛護委員会が承認しました。 図1は 、ここで使用した単一盲検の自己対照試験デザインを示しています。
1. rTMS デバイス
- 8形状の磁界刺激器コイルを使用してrTMS刺激を行います。
2. 動物
- 雄のアカゲザル(マカカムラッタ、5kg、5歳)を水道水と標準的なチャウに無料で利用できる個々の家庭用ケージに保管してください。環境条件が60〜70%の相対湿度、24±2°Cの温度、および12:12時間の光:暗いサイクル14,15を提供するように制御されていることを確認してください。すべての実験は、実験動物の世話と使用のためのガイダンスに従って行います。
3. 連続槽マグナCSFサンプリング法
- 訓練を受けた2人の実験者にカテーテル法を行ってもらい、胸郭マグナからCSFをサンプリングします(図2)。
- ポジショニング
- 5mg / kgのゾラゼパム - チレタミンの筋肉内注射によってサルを麻酔する( 材料表を参照)。サルの麻酔を確実に成功させるためには、深くて遅い呼吸、鈍いまたは不在の角膜反射、および四肢の筋肉の弛緩を探してください。この段階では、温度、脈拍、呼吸、粘膜の色、毛細血管の補充時間を監視します。
- 2mg/kgモルヒネを4時間ごとに筋肉内注射で投与する。
- サルを横褥瘡の位置にある手術台の上に置きます。猿の首を曲げ、猿の背中をひっくり返し、膝を胸の方に持っていく。
- パンク
- 消毒のために、無菌技術を用いて腰の周りの領域を準備する。腰椎L4/L5の間に脊髄針を挿入し、靭帯フラバが収容されている腰椎槽に入るときに「ポップ」があるまで押し込みます。
- 硬膜に入る2番目の「ポップ」があるまで針をもう一度押します。脊髄針からスタイレットを抜き取り、CSFの滴を集める。
- カテーテル挿入
- 透視的ガイダンスの下で、硬膜外カテーテルを穿刺針を通してくも膜下腔に挿入し、胸郭内で浮力になるまで挿入する。
- ポート移植
- 穿刺部位から頭部の方向に5cm切開を行い、皮下組織から皮膚を隔離してサンプリングポートを配置する。ポートを硬膜外カテーテルの端部に接続し、ポートを皮膚の下に埋め込む。その後、切開部を縫合する。感染を防ぐために毎日傷口を消毒してください。
注:サルは手術の翌日に完全に回復します。
- 穿刺部位から頭部の方向に5cm切開を行い、皮下組織から皮膚を隔離してサンプリングポートを配置する。ポートを硬膜外カテーテルの端部に接続し、ポートを皮膚の下に埋め込む。その後、切開部を縫合する。感染を防ぐために毎日傷口を消毒してください。
- CSF コレクション
- ケージのバーを使用してサルを拘束し、背中を曲げたままにします。
- サンプリングポートの中央にシリンジを挿入し、カテーテルを介して胸郭マグナからCSFを抽出する。最初の0.2 mLのCSF(カテーテルとポートの総容量は0.1 mL)を捨て、分析のために1 mLのCSFを収集します16。
4. モンキーチェア適応トレーニング
- rTMS介入のプロセスを中断しないように、実験前にサルをサルの椅子に固定してください(図3A、B)。
- 麻酔薬の影響を避けるために、サルの覚醒状態でバイオマーカー分析のためにCSFを収集します。
- くも膜下カテーテル法の3日目に、実験開始の2週間前に、サルをサルチェアによる適応訓練に被験者し、1日2回、毎回30分間行った。
5. rTMS適応トレーニング/偽刺激
- サルチェアによる適応トレーニングの1週間後、正式な実験開始の1週間前にrTMS適応トレーニング/偽刺激を行い、刺激過程での振動や音によって実験の進行を妨げないようにします。
- 偽のコイル(振動と音のみを生成し、磁場を生成しない)を使用してサルを刺激します。サルがプロセスに適応するのを助けるために、刺激後にサルに食べ物を提供する(図3C)。
- サルチェアの上でrTMS適応トレーニングを1日2回、毎回30分間、合計2週間実施します。
6. 治療プロトコル
- 前述のように、rTMSの3つの異なる周波数(1 Hz/20 Hz/40 Hz)を使用して、サルの両側DLPFC(R-L-DLPFC)を刺激します17。DLPFC を国際 10-20 システムに従ってローカライズします。
- rTMSの3つの異なるセッションを、ウォッシュアウト期間が24時間18,19日を超える状態で実施します。
- 最初の期間には、次のパラメータを使用します:rTMSの1Hzの周波数、20のバースト列で構成されるrTMSのパターン、列車間の10秒の列車間間隔を持つ20のパルス、および平均休止運動閾値(RMT)の100%の刺激の強度、3日間連続して1日2回20,21。
- 2 番目の期間には、次のパラメータを使用します:高周波 (20 Hz) rTMS の列車は、28 秒の列車間間隔で 2 秒間、2 秒間、合計 2,000 回の刺激 (40 回の刺激/列車、50 回の列車) の各セッション、1 日 2 回、3 日間連続して 1 日2回実行します22。
- 3 番目の期間では、次のパラメータを使用します: 100% RMT を持つガンマ周波数 (40 Hz) rTMS の列は、28 秒の列車間間隔で区切られた 1 秒の持続時間で配信されます。各セッションのパルスの総数は、20 Hz rTMSと同じにし、1日2回、3日間連続して7,22。
- rTMSの3つの異なるセッションを、ウォッシュアウト期間が24時間18,19日を超える状態で実施します。
7. CSFバイオマーカー
- 4つのCSFバイオマーカー(Aβ42、Aβ42/Aβ40、tTau、pTau)を分析します。
8. CSF収集及びインデックス検出方法
- 低侵襲カテーテル法を使用してCSFをサンプリングします。
- ケージのバーを使用してサルを拘束し、背中を曲げたままにします。他のオペレータに、サンプリングポートの中央にシリンジを挿入し、CSFがカテーテルを通して抽出されるように指示する。
- 5 つの時点 (3 分間隔で各時点に 4 サンプル) で CSF を収集します: rTMS 前、0 h/2 h/6 h/24 h ポスト rTMS23,24,25。3つの周波数に対して合計60サンプルを収集します。番号を付け、-80°Cの冷蔵庫に最大1ヶ月間保管してください。実験後、製造元の指示に従ってすべてのサンプルを液体チップ検出に供します(材料表を参照)。
9. 統計解析
- すべてのデータを平均±標準偏差 (SD) として表示します。
- Shapiro-Wilk検定を実行して、サンプルサイズが小さい場合に正規性を検定します。二元反復測度分散分析とテューキーの多重比較検定を実行します。
注: 0.05 <値 (両側) は統計的に有意であると考えられました。
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Representative Results
結果は、rTMSがアカゲザルCSFのAβおよびタウレベルに影響を及ぼす可能性があることを示した。CSFバイオマーカーレベルは、異なる周波数(1Hz、20Hz、および40Hz)でのrTMS刺激後の時間とともに変化した。
Aβ42 および Aβ42/ Aβ40
図4Aに示すように、1HzのrTMS刺激後、Aβ42レベルは24時間にわたって徐々に増加し(p<0.05)、ウォッシュアウト期間後にベースラインに戻った。同様に、サルの両側DLPFCをrTMSで20Hzで刺激した後、Aβ42レベルは時間とともに増加し、刺激後6時間でピークに達した(p<0.05)。しかし、40Hz rTMSによる刺激後、Aβ42レベルはrTMS後の時点で直ちに有意に増加し(p<0.05)、ゆっくりと減少した。一般に、rTMS(20Hzおよび40Hz)の高周波は、低周波(1Hz)よりもAβ42レベルを大きく増加させた(p<0.05)。さらに、Aβ42レベルは、高周波、特に40Hzでより迅速に増加し、刺激直後にピークに達した。さらに、40HzでのAβ42レベルは、20Hzでのそれと比較して有意に上昇した(p<0.05)。Aβ42/Aβ40の比率は、1Hzおよび20HzのrTMSによる刺激後に上昇傾向を示し、rTMS刺激後2時間から有意に増加した。さらに、1Hz(p<0.05)よりも20HzrTMS後に大きく増加した(図4B)。しかし、40HzにおけるAβ42/Aβ40比に有意差はなかった。
プタウとタウ
全体として、サルCSFにおけるtTauレベルは、20Hzおよび40Hzの両方のrTMS刺激(p<0.05)の直後に増加し、徐々に減少した(図4C)。しかし、1Hz rTMS後に有意差はなかった。pTauレベルは、40Hz rTMS(p<0.05)による刺激後すぐに劇的に増加し、24時間後にベースラインレベル以下に低下した(図4D)。さらに、pTauレベルは、1Hzおよび20HzのrTMS刺激後に下降傾向を示した。したがって、他の2つの周波数(1Hzおよび20Hz)と比較して、40HzのrTMSはタウレベルに対してより有意な効果を示した(p<0.05)。
ウォッシュアウト後のベースライン
24時間の休薬期間の後、いずれのCSFバイオマーカーレベルにおいてもベースライン(p>0.05)との有意差は認められなかった。
図 1: このパイロット調査のフローチャート 略語: rTMS = 反復経頭蓋磁気刺激。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:大槽からのCSFの連続サンプリングのための低侵襲カテーテル法。 日常的な腰椎穿刺に続いて、硬膜外カテーテルがくも膜下腔を貫通し、X線(赤い矢印)の指導の下で大槽に浮遊し続ける低侵襲カテーテル法が続いた。サンプリングポートは、完全に意識のある動物において、水槽マグナCSF下のサンプリングを可能にするために、穿刺点の横に皮下に残された。略語:CSF = 脳脊髄液。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:モンキーチェア適応性トレーニング。(B)横方向;(C) rTMS適応トレーニング/偽刺激。略語: rTMS = 反復経頭蓋磁気刺激。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アカゲザルCSFにおけるAβおよびタウレベルに対するrTMSの効果。 各周波数の 5 つのバーは、rTMS 前、rTMS 後 0 時間、rTMS 後 2 時間、rTMS 後 6 時間、および rTMS 後 24 時間という 5 つのタイムポイントを表します。(a)rTMS後のサルCSFにおけるAβ42レベルの変化;(b)rTMS後のサルCSFにおけるAβ42/Aβ40比の変化;(c)rTMS刺激後のサルCSFにおけるtTauレベルの変化;(d)rTMS後のサルCSFにおけるpTauレベルの変化。*はrTMS以前の水準との有意差を表し、p<0.05である。#および▲は、それぞれ同じ時点における1Hzまたは20Hzのレベルとの有意差を表す。pは0.05、**p<0.01、***p<0.001、****は0.0001
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Discussion
ADの十分に確立されたバイオマーカーであるAβ1-42は、脳内のAβ代謝およびアミロイドプラーク形成に関連するCSFコアバイオマーカーであり、臨床試験および臨床で広く使用されている26。最近の研究では、CSF Aβ42/Aβ40比はAD型病理のより良い指標であるため、Aβ42単独よりもADの優れた診断バイオマーカーであることが示されています27,28。タウおよびpTauタンパク質は、神経変性プロセス中に細胞外空間に放出され、CSF20、29におけるタウ濃度の増加をもたらす。したがって、CSF Aβ1-42、Aβ42/Aβ40、tTau、およびpTauが確認され、AD1、29の改訂された診断基準においてCSFバイオマーカーが組み合わされた。
この研究は、rTMS刺激後、CSFのAβ42レベルがすべての周波数で上昇傾向を示したことを実証している。高周波rTMS(20Hzおよび40Hz)は、Aβ42レベルを低周波よりも大きく増加させた。以前の研究30,31によると、CSF中の低レベルのAβ42は、AD特異的神経変性(すなわち、海馬萎縮)と関連している。しかしながら、rTMS刺激後のAβの増加はADの病理学的特徴を逆転させ、rTMSがAβレベルを正常化し得ることを示している。前臨床試験では、Aβレベルがニューロン活性によって調節されていることが示されています32。したがって、高周波rTMS対低周波rTMSは、ニューラルネットワーク活動を活性化することによって、Aβ42を含むすべてのAβ物質の産生を増加させる可能性がある。さらに、この研究では、3つの異なる周波数(1Hz、20Hz、および40Hz)でrTMSを24時間投与した後、pTauレベルがベースラインを下回っていることが判明しました。これは、異常なpTauタンパク質の減少を示し、微小管への結合を減少させ、ニューロンの正常な構造を維持した。しかし、高周波rTMSの後、CSFのtTauレベルは直ちに増加し、24時間にわたって徐々に減少した。この現象の根底にあるメカニズムは、いまだに解明されていない。
本研究は、CSFにおけるAβおよびタウ代謝に対するrTMSの効果を客観的に確認するものである。他の評価方法と比較して、CSFバイオマーカーは、脳の代謝および病理を反映することができ、脳のための窓を提供する。この方法は安全で忍容性が高く、臨床的適用性が高い33,34。CSFを収集する最も一般的な技術は、腰椎穿刺を行うことである。しかし、繰り返し硬膜穿刺によるCNS感染やCSF漏出のリスクがあるため、短期間に数回CSFを採取することは困難です35,36。
このプロトコルは、新しいCSFサンプリング法を使用しており、前述の有害事象のリスクが低く、完全に覚醒した条件下でCSFサンプリングを繰り返すことができます。サンプリングポートは、サルがポートを傷つけることができないように皮膚の下に配置されます。したがって、CSFは、腰椎穿刺ではなく、サンプリングポートを介して直接収集することができます。この方法は便利で迅速で、麻酔薬の影響を回避します16。したがって、サルCSFの複数のサンプルを必要とする研究者は、この連続槽マグナCSFサンプリング法を検討することができます。rTMSのプロセスを中断しないようにするには、実験を開始する前に、サルチェアア適応トレーニングとrTMS適応トレーニングが重要です。
それにもかかわらず、サルの頭は訓練後でさえ実験中にまだ小さな動きの範囲を持っています。したがって、ロボット支援追跡システムを使用して、刺激部位を局在化し、ヘッドが動いたときにTMSコイルを同時に配置することをお勧めします。この研究にはいくつかの制限があります:ここで使用された動物は病理学的モデル(老化した犬など)ではなく正常なサルであり37、サンプルサイズは小さかった。しかし、このパイロット研究は、rTMS後のAβおよびタウのレベルにおける興味深い動的変化を示しており、ADに対するrTMSの潜在的な利点を示しており、さらなる調査が必要である。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、猿の椅子やその他の関連機器を提供してくれた四川省グリーンハウスバイオテック株式会社に感謝したいと思います。この研究は、公共、商業、または非営利セクターの資金提供機関から特定の助成金を受けていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Puncture Kit for Single Use | Weigao, Shandong, China | ||
| CCY-I magnetic field stimulator | YIRUIDE MEDICAL, Wuhan, China | ||
| GraphPad Prism version 7.0 | GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human Amyloid Beta and Tau Magnetic Bead Panel | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA | liquid chip detection | |
| MILLIPLEX Analyst 5.1 | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA | ||
| Monkey Chair HH-E-1 | Brainsight, Cambridge, MA 02140 USA | ||
| Zoletil 50 | Virbac, France | zolazepam–tiletamine |
References
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