Summary
Aqui, descrevemos o procedimento para um estudo piloto para explorar o efeito da estimulação magnética transcraniana repetitiva com diferentes frequências (1 Hz/20 Hz/40 Hz) em Aβ e metabolismo tau em fluido cerebrospinal de macaco rhesus.
Abstract
Estudos anteriores demonstraram que um regime não invasivo de cintilação de luz e estimulação de tom auditivo poderia afetar o metabolismo de Aβ e tau no cérebro. Como técnica não invasiva, a estimulação magnética transcraniana repetitiva (rTMS) tem sido aplicada para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos. Este estudo explorou os efeitos do rTMS nos níveis de Aβ e tau no fluido cefalorraquidiano rhesus macaco (CSF). Este é um estudo único-cego, auto-controlado. Três frequências diferentes (baixa frequência, 1 Hz; altas frequências, 20 Hz e 40 Hz) de rTMS foram utilizadas para estimular o córtex pré-frontal bilateral-dorsolateral (DLPFC) do macaco rhesus. Foi utilizado um método de cateterismo para a coleta de CSF. Todas as amostras foram submetidas à detecção de chips líquidos para análise de biomarcadores CSF (Aβ42, Aβ42/Aβ40, tTau, pTau). Os níveis de biomarcadores CSF mudaram com o tempo após a estimulação por rTMS. Após a estimulação, o nível Aβ42 em CSF mostrou uma tendência de alta em todas as frequências (1 Hz, 20 Hz e 40 Hz), com diferenças mais significativas para as altas frequências (p < 0,05) do que para a baixa frequência.
Após rTMS de alta frequência, o nível total de Tau (tTau) de CSF aumentou imediatamente no ponto de tempo pós-rTMS (p < 0,05) e diminuiu gradualmente em 24 horas. Além disso, os resultados mostraram que o nível de Tau fosfoilado (pTau) aumentou imediatamente após 40 Hz rTMS (p < 0,05). A razão de Aβ42/Aβ40 mostrou tendência de alta em 1 Hz e 20 Hz (p < 0,05). Não houve diferença significativa nos níveis de tau com estimulação de baixa frequência (1 Hz). Assim, as altas frequências (20 Hz e 40 Hz) de rTMS podem ter efeitos positivos nos níveis de Aβ e tau no macaco rhesus CSF, enquanto a baixa frequência (1 Hz) rTMS só pode afetar os níveis de Aβ.
Introduction
Amilóide-β (Aβ) e tau são importantes biomarcadores CSF. Aβ consiste em 42 aminoácidos (Aβ1-42), que é o produto da proteína precursora amiloide transmembrana (APP) hidrolisada por β e γ-secretas1. Aβ1-42 pode agregar-se em placas amiloides extracelulares no cérebro por causa de suas características de solubilidade1,2. Tau é uma proteína associada a microtúbulos que está presente principalmente em axônios e está envolvida no transporte axonal anterogrado3. A hiperfosforilação tau anormal é induzida principalmente pelo desequilíbrio entre quinases e fosfatases, resultando no descolamento de tau de microtúbulos e na formação de emaranhados neurofibrilares (NFT)1. A concentração de tau aumenta no CSF porque as proteínas tau e fosforiladas tau (pTau) são liberadas no espaço extracelular durante o processo neurodegenerativo. Estudos anteriores mostraram que os biomarcadores de CSF são relevantes para as três principais alterações patológicas do cérebro da doença de Alzheimer (DA): placas amiloides extracelulares, formação de NFT intracelular e perda de neurônios4. Concentrações anormais de Aβ e tau presentes no estágio inicial da DA, permitindo assim o diagnóstico precoce da DA5,6.
Em 2016, Tsai et al. descobriram que a luz não invasiva (40 Hz) reduziu os níveis de Aβ1-40 e Aβ1-42 no córtex visual de ratos pré-depósito7. Recentemente, eles relataram ainda que a estimulação de tons auditivos (40 Hz) melhorou o reconhecimento e a memória espacial, reduziu os níveis de proteína amiloide no hipocampo e córtex auditivo (AC) de camundongos 5XFAD e diminuiu as concentrações de pTau no modelo de tauopatia P301S8. Esses resultados indicam que técnicas não invasivas podem impactar o metabolismo de Aβ e Tau.
Como uma ferramenta não invasiva, a estimulação magnética transcraniana (TMS) poderia estimular eletricamente o tecido neural, incluindo a medula espinhal, nervos periféricos e córtex cerebral9. Além disso, pode modificar a excitabilidade do córtex cerebral no local estimulado e nas conexões funcionais. Portanto, a TMS tem sido utilizada no tratamento de distúrbios neurodegenerativos e testes prognósticos e diagnósticos. A forma mais comum de intervenção clínica em TMS, rTMS, pode induzir ativação do córtex, modificar a excitabilidade do córtex e regular a função cognitiva/motora.
Foi relatado que 20 Hz rTMS teve um efeito neuroprotetor in vitro contra estressores oxidativos, incluindo glutamato e Aβ e melhorou a viabilidade geral das células HT22 hipocampal monoclonais em camundongos10. Após a estimulação de rTMS de 1 Hz, a enzima app-cleaving de β local 1, APP, e seus fragmentos de terminal C no hipocampo foram consideravelmente reduzidos. Notavelmente, o comprometimento da potencialização a longo prazo, aprendizagem espacial e memória no CA1 hipocampal foi revertido11,12. Bai et al. investigaram o efeito de rTMS na disfunção de oscilação gama induzida por Aβ durante um teste de memória de trabalho. Eles concluíram que a rTMS poderia reverter a disfunção induzida por Aβ, resultando em benefícios potenciais para a memória de trabalho13. No entanto, há poucos relatórios sobre os efeitos do rTMS no metabolismo tau e as mudanças dinâmicas em Aβ e tau em CSF antes e depois da rTMS. Este protocolo descreve o procedimento para investigar os efeitos do rTMS em diferentes frequências (baixa frequência, 1 Hz; altas frequências,20 Hz e 40 Hz) nos níveis Aβ e tau no macaco rhesus CSF.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados sob a Orientação para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, formulada pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da República Popular da China, bem como os princípios da Declaração de Basileia. A aprovação foi dada pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan (Chengdu, China). A Figura 1 mostra o projeto de estudo autônomo e cego usado aqui.
1. dispositivos rTMS
- Use uma bobina estimuladora de campo magnético em 8 formas para realizar a estimulação rTMS.
2. Animal
- Mantenha o macaco rhesus macho (Macaca mulatta, 5 kg, 5 anos) em uma gaiola doméstica individual com acesso livre à água da torneira e chow padrão. Certifique-se de que as condições ambientais sejam controladas para proporcionar uma umidade relativa de 60-70%, uma temperatura de 24 ± 2 °C, e uma luz de 12:12 h: ciclo escuro14,15. Realizar todos os experimentos de acordo com a Orientação para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
3. Um método de amostragem CSF cisterna magna serial
- Que dois experimentadores treinados realizem um método de cateterismo para amostrar CSF da cisterna magna (Figura 2).
- Posicionamento
- Anestesiar o macaco por uma injeção intramuscular de 5 mg/kg de zolazepam-tiletamina (ver a Tabela de Materiais). Para garantir a anesthetização bem sucedida do macaco, procure respiração profunda e lenta, reflexo maçante ou ausente da córnea, e relaxamento dos músculos das extremidades. Monitore sua temperatura, pulso, respiração, cor da membrana mucosa e tempo de recarga capilar durante esta fase.
- Administre 2 mg/kg de morfina por injeção intramuscular a cada 4 horas.
- Coloque o macaco sobre uma mesa de operação na posição de decúbito lateral. Dobre o pescoço do macaco, incline a parte de trás do macaco, e traga os joelhos em direção ao peito.
- Punção
- Para desinfecção, prepare a área ao redor da parte inferior das costas usando técnica asséptica. Insira uma agulha espinhal entre as vértebras lombares L4/L5, empurre-a até que haja um "pop" quando entrar na cisterna lombar onde o flavum ligamentum está alojado.
- Empurre a agulha novamente até que haja um segundo "pop" onde ela entra na dura mater. Retire o estom com a agulha espinhal e colete gotas de CSF.
- Inserção de cateter
- Sob orientação fluoroscópica, insira o cateter peridural através da agulha de punção no espaço subaracnóide até que esteja flutuando na cisterna magna.
- Implantação de portas
- Faça uma incisão de 5 cm do local da punção até a direção da cabeça e isole a pele do tecido subcutâneo para colocar a porta de amostragem. Conecte a porta ao fim do cateter peridural e implante a porta sob a pele; então, suturar a incisão. Desinfete a ferida diariamente para evitar infecções.
NOTA: O macaco se recupera totalmente no dia seguinte à cirurgia.
- Faça uma incisão de 5 cm do local da punção até a direção da cabeça e isole a pele do tecido subcutâneo para colocar a porta de amostragem. Conecte a porta ao fim do cateter peridural e implante a porta sob a pele; então, suturar a incisão. Desinfete a ferida diariamente para evitar infecções.
- Coleção CSF
- Use as barras da gaiola para conter o macaco e mantenha as costas dobradas.
- Insira uma seringa no centro da porta de amostragem para extrair o CSF da cisterna magna através do cateter. Descarte os primeiros 0,2 mL de CSF (o volume total do cateter e da porta é de 0,1 mL), e depois colete 1 mL de CSF para análise16.
4. Treinamento adaptativo da cadeira de macaco
- Fixar o macaco na cadeira do macaco antes do experimento para evitar interromper o processo de intervenção rTMS (Figura 3A,B).
- Coletar CSF para análise biomarcadora no estado acordado do macaco para evitar a influência de drogas anestésicos.
- No terceiro dia após o cateterismo subaracnóide, duas semanas antes do início do experimento, submete o macaco a treinamento adaptativo com a cadeira de macaco, duas vezes por dia, por 30 minutos cada vez.
5. rTMS treinamento adaptativo/estimulação sham
- Realize o treinamento adaptativo rTMS/estimulação sham uma semana após o treinamento adaptativo com a cadeira de macaco, uma semana antes do início do experimento formal para evitar dificultar o progresso do experimento por causa de vibrações e sons durante o processo de estimulação.
- Use uma bobina falsa (que só produz vibração e som e não gera um campo magnético) para estimular o macaco. Ofereça alimentos ao macaco após a estimulação para ajudá-lo a se adaptar ao processo (Figura 3C).
- Realize o treinamento adaptativo rTMS em uma cadeira de macaco duas vezes ao dia, por 30 minutos cada vez por um total de 2 semanas.
6. Protocolo de tratamento
- Utilize três frequências diferentes (1 Hz/20 Hz/40 Hz) de rTMS para estimular o bilateral-DLPFC (R-L-DLPFC) do macaco, como descrito anteriormente17. Localize o DLPFC de acordo com o sistema internacional 10-20.
- Realizar três sessões diferentes de rTMS com um período de lavagem superior a 24 h18,19.
- Para o primeiro período, utilize os seguintes parâmetros: uma frequência de 1 Hz para rTMS, um padrão de rTMS composto por 20 trens estourados, 20 pulsos com intervalos inter-trens de 10 s entre trens e uma intensidade de estimulação de 100% do limiar médio do motor de repouso (RMT), duas vezes por dia durante três dias consecutivos20,21.
- Para o segundo período, utilize os seguintes parâmetros: trens de alta frequência (20 Hz) rTMS com 100% de RMT para 2 s de duração com intervalos inter-trens de 28 s, um total de 2.000 estímulos (40 estímulos/trem, 50 trens) por sessão, duas vezes por dia durante três dias consecutivos22.
- Para o terceiro período, utilize os seguintes parâmetros: trens de frequência gama (40 Hz) rTMS com 100% de RMT entregues em 1 s de duração separados por intervalos inter-trens de 28 s. Mantenha o número total de pulsos para cada sessão o mesmo que com 20 Hz rTMS, duas vezes por dia durante três dias consecutivos7,22.
- Realizar três sessões diferentes de rTMS com um período de lavagem superior a 24 h18,19.
7. Biomarcadores CSF
- Analise quatro biomarcadores CSF: Aβ42, Aβ42/Aβ40, tTau e pTau.
8. Método de coleta e detecção de índices CSF
- Use um método de cateterismo minimamente invasivo para amostrar o CSF.
- Use as barras da gaiola para conter o macaco e mantenha as costas dobradas. Instrua o outro operador a inserir uma seringa no centro da porta de amostragem, garantindo que o CSF seja extraído através do cateter.
- Coletar CSF em 5 pontos de tempo (4 amostras por ponto de tempo em intervalos de 3 minutos): pré-rTMS, 0 h/2 h/6 h/24 h pós-rTMS23,24,25. Coletar um total de 60 amostras para 3 frequências; número e armazená-los em uma geladeira de -80 °C por até 1 mês. Após o experimento, submou todas as amostras à detecção de chips líquidos de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
9. Análise estatística
- Apresentar todos os dados como média ± desvio padrão (SD).
- Realize o teste Shapiro-Wilk para testar a normalidade em caso de um pequeno tamanho amostral. Realize o teste de comparações múltiplas de ANOVA e Tukey de duas formas.
NOTA: O valor (duas caudas) < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Representative Results
Os resultados mostraram que a rTMS poderia afetar os níveis de Aβ e tau no CSF do macaco rhesus. Os níveis de biomarcadores CSF mudaram com o tempo após a estimulação de rTMS em diferentes frequências (1 Hz, 20 Hz e 40 Hz).
Aβ42 e Aβ42/Aβ40
Como mostrado na Figura 4A, após a estimulação de rTMS de 1 Hz, os níveis de Aβ42 aumentaram gradualmente ao longo de 24 h (p < 0,05) e voltaram à linha de base após o período de lavagem. Da mesma forma, depois de estimular o DLPFC bilateral do macaco com rTMS a 20 Hz, os níveis de Aβ42 aumentaram com o tempo e atingiram um pico de 6h após a estimulação (p < 0,05). No entanto, após a estimulação com rTMS de 40 Hz, os níveis de Aβ42 aumentaram significativamente imediatamente no ponto de tempo do pós-rTMS (p < 0,05) e diminuíram lentamente. Em geral, as altas frequências de rTMS (20 Hz e 40 Hz) aumentaram os níveis de Aβ42 em maior grau do que a baixa frequência (1 Hz) (p < 0,05). Além disso, os níveis de Aβ42 aumentaram mais rapidamente nas altas frequências, especialmente a 40 Hz, atingiram um pico logo após a estimulação. Além disso, o nível Aβ42 a 40 Hz aumentou significativamente em comparação com o de 20 Hz (p < 0,05). A razão de Aβ42/Aβ40 mostrou uma tendência de alta após a estimulação com 1 Hz e 20 Hz rTMS e aumentou significativamente de 2 h após a estimulação do RTMS. Além disso, aumentou em maior medida após 20 Hz rTMS do que com 1 Hz (p < 0,05) (Figura 4B). No entanto, não houve diferença significativa na razão Aβ42/Aβ40 a 40 Hz.
pTau e tTau
No geral, os níveis de tTau no CSF macaco aumentaram imediatamente após a estimulação rTMS de 20 Hz e 40 Hz (p < 0,05) e diminuíram gradualmente (Figura 4C). No entanto, não houve diferença significativa após 1 Hz rTMS. O nível pTau aumentou imediatamente e dramaticamente após a estimulação com rTMS de 40 Hz (p < 0,05) e diminuiu para abaixo do nível de linha de base após 24 horas (Figura 4D). Além disso, o nível pTau mostrou uma tendência de queda após a estimulação de rTMS de 1 Hz e 20 Hz. Portanto, em comparação com as outras duas frequências (1 Hz e 20 Hz), 40 Hz rTMS apresentaram efeitos mais significativos nos níveis de Tau (p < 0,05).
Linha de base após lavagem
Após um período de lavagem de 24 horas, não foi observada diferença significativa da linha de base (p > 0,05) em quaisquer níveis de biomarcadores CSF.
Figura 1: O fluxograma deste estudo piloto. Abreviação: rTMS = estimulação magnética transcraniana repetitiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cateterismo minimamente invasivo para amostragem serial de CSF da cisterna magna. Uma punção lombar de rotina foi seguida por um cateterismo minimamente invasivo, no qual um cateter peridural penetrou no espaço subaracnóide e foi mantido flutuando na cisterna magna sob a orientação de raio-X (seta vermelha). Uma porta de amostragem foi deixada subcutâneamente ao lado do ponto de punção para permitir a amostragem da CISTERNA Magna CSF sob em um animal totalmente consciente. Abreviação: CSF = fluido cefalorraquidiano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Treinamento de adaptabilidade da cadeira de macaco. (A) Frente; (B) lateral; (C) rTMS treinamento adaptativo/estimulação de sham. Abreviação: rTMS = estimulação magnética transcraniana repetitiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos de rTMS nos níveis de Aβ e tau no macaco rhesus CSF. As cinco barras para cada frequência representam cinco pontos de tempo: pré-rTMS, 0 h pós-rTMS, 2 h pós-rTMS, 6 h pós-rTMS e 24 h pós-rTMS. (A) Alterações no nível Aβ42 no CSF do macaco após rTMS; (B) alterações na razão Aβ42/Aβ40 no CSF do macaco após rTMS; (C) alterações nos níveis de tTau no CSF do macaco após a estimulação de rTMS; (D) Alterações nos níveis de pTau no CSF do macaco após rTMS. * representa uma diferença significativa em vez do nível pré-rTMS, p < 0,05. # e ◗ representam diferenças significativas em relação ao nível de 1 Hz ou 20 Hz no mesmo ponto de tempo, respectivamente. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** representa p < 0,0001. Abreviaturas: rTMS = estimulação magnética transcraniana repetitiva; CSF = fluido cefalorraquidiano; tTau = total Tau; pTau = Tau fosforilado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aβ1-42, um biomarcador bem estabelecido de AD, é um biomarcador de núcleo CSF relacionado ao metabolismo Aβ e formação de placas amiloides no cérebro e tem sido amplamente utilizado em ensaios clínicos e na clínica26. Estudos recentes têm demonstrado que a razão CSF Aβ42/Aβ40 é um melhor biomarcador diagnóstico do que apenas Aβ42 porque é um indicador melhor da patologia do tipo DA AD27,28. As proteínas Tau e pTau são liberadas no espaço extracelular durante o processo neurodegenerativo, resultando em aumento das concentrações de tau em CSF20,29. Portanto, os biomarcadores CSF Aβ1-42, Aβ42/Aβ40, tTau e pTau são confirmados e combinados de biomarcadores CSF nos critérios diagnósticos revisados de AD1,29.
Este estudo demonstra que após a estimulação do RTMS, os níveis de Aβ42 em CSF apresentaram tendência de alta em todas as frequências. RTMS de alta frequência (20 Hz e 40 Hz) aumentou os níveis de Aβ42 em maior grau do que a baixa frequência. De acordo com pesquisas anteriores30,31, um baixo nível de Aβ42 em CSF está associado à neurodegeneração específica da DA (ou seja, atrofia hipocampal). No entanto, o aumento do Aβ após a estimulação do RTMS reverte as características patológicas do AD, indicando que o rTMS pode normalizar os níveis de Aβ. Um estudo pré-clínico indica que o nível Aβ é regulado pela atividade neuronal32. Portanto, rTMS de alta frequência, vs. rTMS de baixa frequência, pode aumentar a produção de todas as substâncias Aβ, incluindo Aβ42, ativando a atividade da rede neural. Além disso, o estudo constatou que após 24 h de rTMS em três frequências diferentes (1 Hz, 20 Hz e 40 Hz), o nível pTau ficou abaixo da linha de base. Isso indicou uma diminuição da proteína pTau anormal, reduzindo sua ligação aos microtúbulos e mantendo a estrutura normal dos neurônios. No entanto, após a rTMS de alta frequência, o nível tTau de CSF aumentou imediatamente e diminuiu gradualmente ao longo de 24 horas. O mecanismo subjacente a esse fenômeno ainda não está claro.
Este estudo confirma objetivamente o efeito de rTMS no metabolismo Aβ e tau no CSF. Comparado com outros métodos de avaliação, os biomarcadores CSF podem refletir o metabolismo e a patologia do cérebro, fornecendo uma janela para o cérebro. Este método é seguro e bem tolerado e tem grande aplicabilidade clínica33,34. A técnica mais comum para coletar CSF é realizar uma punção lombar. No entanto, é desafiador coletar CSF várias vezes em um curto período, pois há riscos de infecção por CNS e vazamento de CSF devido à punção dural repetida35,36.
Este protocolo utiliza um novo método de amostragem de CSF, permitindo a amostragem repetida de CSF em condições totalmente acordadas, com baixos riscos dos eventos adversos acima mencionados. A porta de amostragem é colocada sob a pele para que o macaco não possa arranhar a porta. Portanto, o CSF pode ser coletado diretamente através da porta de amostragem e não por punção lombar. O método é conveniente e rápido e evita o impacto dos anestésicos16. Portanto, pesquisadores que precisam de múltiplas amostras de CSF macaco podem considerar este método de amostragem cisterna magna CSF serial. Para evitar interromper o processo de rTMS, o treinamento adaptativo da cadeira de macaco e o treinamento adaptativo rTMS são importantes antes de iniciar o experimento.
No entanto, a cabeça do macaco ainda tem uma pequena amplitude de movimento durante o experimento mesmo após o treinamento. Portanto, é aconselhável usar um sistema de rastreamento assistido por robôs, para localizar os locais de estimulação e posicionar a bobina TMS simultaneamente quando a cabeça se move. Este estudo tem algumas limitações: o animal utilizado aqui era um macaco normal em vez de um modelo patológico (como caninos idosos37), e o tamanho da amostra era pequeno. No entanto, este estudo piloto mostrou mudanças dinâmicas interessantes nos níveis de Aβ e tau após o RTMS, indicando os benefícios potenciais do rTMS em AD e garantindo uma investigação mais aprofundada.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer à Sichuan Green-House Biotech Co., Ltd por fornecer a cadeira de macaco e outros dispositivos relativos. Esta pesquisa não recebeu nenhuma subvenção específica de qualquer agência de financiamento nos setores público, comercial ou sem fins lucrativos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Puncture Kit for Single Use | Weigao, Shandong, China | ||
| CCY-I magnetic field stimulator | YIRUIDE MEDICAL, Wuhan, China | ||
| GraphPad Prism version 7.0 | GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human Amyloid Beta and Tau Magnetic Bead Panel | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA | liquid chip detection | |
| MILLIPLEX Analyst 5.1 | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA | ||
| Monkey Chair HH-E-1 | Brainsight, Cambridge, MA 02140 USA | ||
| Zoletil 50 | Virbac, France | zolazepam–tiletamine |
References
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