Summary
본 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 숙련 된 운동 거동의 성능에 관여하는 신경 회로를 특성화하기 위해 단일 펠릿 도달 - 투 - 파악 작업에서 고속 비디오 그래피와 결합 된 무선 광유전학을 사용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
미세 운동 기술은 일상 생활에서 필수적이며 여러 신경계 장애에서 손상 될 수 있습니다. 이러한 작업의 획득 및 수행에는 감각 - 모터 통합이 필요하며 양측 뇌 회로의 정확한 제어가 필요합니다. 동물 모델에서 단수동 행동 패러다임을 구현하면 작업 수행 중에 제어 조건 및 질병에서 특정 핵의 신경 활동을 조작하고 기록 할 수 있으므로 복잡한 운동 행동에 선조체와 같은 뇌 구조의 기여에 대한 이해가 향상됩니다.
그것의 창조 이래로, 광유전학은 신경 세포의 선택적이고 표적화 된 활성화 또는 억제를 가능하게함으로써 뇌를 심문하는 지배적 인 도구였습니다. 광유전학과 행동 분석의 결합은 특정 뇌 기능의 기본 메커니즘에 대해 밝힙니다. 소형화된 발광 다이오드(LED)를 갖춘 무선 헤드 마운트 시스템은 완전히 자유롭게 움직이는 동물에서 원격 광유전학적 제어를 가능하게 합니다. 이것은 유선 시스템이 발광 효율을 손상시키지 않으면서 동물의 행동에 덜 제한적이라는 한계를 피할 수 있습니다. 현재의 프로토콜은 무선 광유전학 접근법과 고속 비디오 그래피를 단일 수동 손재주 작업으로 결합하여 특정 신경 세포 집단이 미세한 운동 행동에 기여하는 것을 해부합니다.
Introduction
운동 숙련 된 행동은 우리가 수행하는 대부분의 움직임 중에 존재하며, 여러 뇌 장애 1,2,3,4,5,6에서 영향을받는 것으로 알려져 있습니다. 숙련 된 운동의 발달, 학습 및 성능을 연구 할 수있는 작업을 구현하는 것은 특히 뇌 손상, 신경 퇴행성 및 신경 발달 장애 모델 2,7,8,9,10,11,12,13에서 운동 기능의 신경 생물학적 토대를 이해하는 데 중요합니다. . 물체에 도달하고 검색하는 것은 일상 생활에서 일상적으로 이루어지며, 초기 개발 과정에서 습득 한 최초의 운동 기술 중 하나이며 5,6 년 동안 세련되었습니다. 그것은 물체의 특징에 대한 인식, 운동 계획, 행동 선택, 운동 실행, 신체 조정 및 속도 변조 7,14,15,16과 같은 감각 - 운동 과정을 필요로하는 복잡한 행동을 포함한다. 따라서, 일수동적인 높은 손재주 작업은 양쪽 반구 16,17,18,19,20,21,22의 많은 뇌 구조의 참여를 필요로 한다. 마우스에서, 단일 펠릿 도달-대-파악 과제는 개별적으로 제어되고 분석될 수 있는 여러 단계를 특징으로 한다(7,13,23). 이 특징은 획득 및 행동 성능의 상이한 단계에서 특정 뉴런 서브 집단의 기여를 연구 할 수있게하고 모터 시스템13,23,24에 대한 상세한 연구를위한 플랫폼을 제공한다. 움직임은 몇 초 안에 발생합니다. 따라서, 고속 비디오 그래피는 숙련된 운동 궤적(7,25)의 뚜렷한 단계에서 운동학적 분석에 사용되어야 한다. 비디오로부터 신체 자세, 궤적, 속도 및 에러 유형(25)을 포함하는 몇몇 파라미터들이 추출될 수 있다. 운동학적 분석은 무선 광유전학적 조작(7,23) 동안 미묘한 변화를 검출하는데 사용될 수 있다.
무선 헤드 마운트 시스템을 통해 빛을 전달하기 위해 소형 발광 다이오드(LED)를 사용하면 동물이 작업을 수행하는 동안 원격 광유전학 제어를 할 수 있습니다. 무선 광유전학 제어기는 자극기로부터 단일 펄스 또는 연속 트리거 명령을 수용하고, 적외선(IR) 신호를 소형화된 LED(23,26)에 연결된 수신기로 전송한다. 현재의 프로토콜은 이러한 무선 광유전학 접근법을 손재주 태스크의 고속 비디오 그래피와 결합하여 미세 운동 거동(23)의 수행 동안 특정 뉴런 집단의 역할을 해부한다. 단일 수동 작업이기 때문에 두 반구에서 구조물의 참여를 평가할 수 있습니다. 전통적으로 뇌는 매우 비대칭적인 방식으로 신체 움직임을 제어합니다. 그러나 손재주가 높은 작업에는 동측성 핵과 핵10,20,21,22,23 내의 신경 하위 집단의 차별적 기여를 포함하여 많은 뇌 구조로부터의 신중한 조정과 제어가 필요합니다. 이 프로토콜은 양쪽 반구로부터의 피질하 구조가 앞다리(23)의 궤적을 조절한다는 것을 보여준다. 이 패러다임은 뇌 질환의 다른 뇌 영역과 모델을 연구하는 데 적합 할 수 있습니다.
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Protocol
동물 사용과 관련된 절차는 지역 및 국가 지침에 따라 수행되었으며 해당 기관 동물 관리 및 사용위원회 (세포 생리학 연구소 IACUC 프로토콜 VLH151-19)의 승인을 받았습니다. Drd1-Cre 형질전환 수컷 마우스는C57BL/6 배경으로 출생 후 27, 35-40일째에 현재의 프로토콜에 사용되었다. 마우스는 다음의 조건 하에서 유지되었다: 온도 22±1°C; 습도 55%; 가벼운 일정 12/12 시간 오후 7시에 불을 끄고 출생 후 21 일에 젖을 떼었습니다. 젖을 뗀 새끼들은 2-5 명의 동성 그룹에 수용되었습니다. 동물들은 마이크로 배리어 탑을 가진 정적 하우징에 수용되었다. 침구는 멸균 아스펜 부스러기로 구성되었습니다. 설치류 펠릿 및 RO-정제수는 언급되는 경우를 제외하고 Ad libitum을 제공하였다.
1. 수술 절차
- 관심 구조물의 등쪽 복부 좌표에 따라 원하는 길이로 LED 캐뉼라를 준비합니다(두개골의 두께를 고려하면 0.5mm 더 길고, 등쪽 선조체의 경우 3.5mm).
- 유리 섬유를 최종 원하는 크기보다 긴 길이로 자르고 거친 사포로 섬유 팁을 목표 길이로 갈아서 마지막으로 미세한 사포로 섬유 끝을 닦으십시오.
참고: LED 캐뉼라는 적외선 수신기에 부착된 직경 250μm의 유리 광섬유 입니다(재료 표 참조).
- 유리 섬유를 최종 원하는 크기보다 긴 길이로 자르고 거친 사포로 섬유 팁을 목표 길이로 갈아서 마지막으로 미세한 사포로 섬유 끝을 닦으십시오.
- 수평 풀러가있는 나노 인젝터 용 유리 피펫 (1.14mm 외경, 0.53mm 내경 및 길이 3.5 )을 당겨 나중에 보관하십시오. 풀러를 하나의 루프에 프로그래밍하여 긴 점진적 경사 테이퍼 (4-5 mm)가있는 15-20 μm 팁 직경을 얻습니다.
- 입체 택시 장치, 후드, 마이크로 인젝터 ( 재료 표 참조) 및 주변 표면을 70 % 에탄올로 철저히 소독하여 수술 부위를 준비하십시오.
참고: 마우스 입체 택시 장치는 Adeno Associated Virus (AAV)를 정확하게 주입하고 LED 캐뉼라를 관심 영역에 배치하는 데 필수적입니다. - 깨끗한 실험실 코트 또는 일회용 수술 가운, 멸균 장갑, 얼굴 마스크 및 일회용 헤드 캡을 포함하여 절차에 적합한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
- 멸균 수술 도구, 면화 팁, 용액, 마이크로 피펫, 피펫 팁, 모세 혈관, 미네랄 오일로 마이크로 채우기 및 마커와 같은 수술 영역 가까이에 필요한 장비를 배치하십시오.
- 미세 주사를위한 피펫을 미네랄 오일로 채우고 마이크로 인젝터에 넣으십시오. 마이크로 인젝터가 미네랄 오일을 배출하여 올바르게 작동하는지 확인하십시오.
참고: 수술 중 사용되는 모든 기구는 오토클레이브 및 멸균되어야 합니다. 무균 기술을 사용해야합니다. - 기체 이소플루란 4-5 %로 동물을 마취시켜 마취를 유도하고 수술 기간 동안 1.2 %를 0.5-1 L / min 순수 산소로 마취하십시오. 수술은 동물이 깊은 마취 지점에 도달 한 후에 만 시작되며, 약간의 꼬집음 후에 발 철수가 없음으로 평가됩니다.
- 동물의 호흡률과 온도를 지속적으로 모니터링합니다. 34°C로 설정된 가열 패드에 의해 체온을 유지한다.
- 안과 연고를 바르십시오. 트리머와 제모 크림으로 두피에서 머리카락을 제거하십시오. 8% 포비돈-요오드( 재료 표 참조)와 70% 에탄올을 각각 세 번 번갈아 가며 면봉으로 두피를 닦으십시오.
- 마우스를 입체 택시 장치에 넣고 머리를 고정하여 두개골이 평탄한 측방 및 전후 축에 수평을 이루도록하십시오.
- 시상 축을 따라 눈 높이에서 두피를 통해 메스로 1cm 절개를하십시오. 두개골을 노출시키고 면봉으로 골막을 닦기 위해 피부를 수축시킵니다.
- 식염수와 멸균 면봉으로 두개골 표면을 청소하십시오. 멸균 흡수성 안구 창(표 참조) 또는 유사한 멸균 흡수 성 물질을 사용하여 표면의 출혈을 해결하십시오.
- 면봉에 2.5 % 과산화수소를 떨어 뜨리고 두개골 봉합사를 볼 수있게하고 더 나은 참조를 갖기 위해 몇 초 동안 작용하게하십시오. 몇 초 후, 깨끗한 면봉으로 철저히 청소하십시오.
- 유리 피펫 (최종 팁 직경 15 μm)을 사용하여 브레그마와 람다를 찾아 두개골이 전후 축에 수평을 이루고 있는지 확인하십시오.
참고 : 유리 피펫의 끝을 보려면 스테레오스코픽 현미경 또는 USB 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 두개골을 평평하게하기 위해 입 홀더의 높이를 조정하십시오. - 모세관을 선택된 전후방(AP) 및 내측방(ML) 좌표(등측 선조체 AP 1.2 mm, ML 2.28 mm) 쪽으로 이동시킨다. 멸균 마커를 사용하여 선택한 좌표 위의 두피에 기준점을 페인트합니다.
- 기준점에서, 작은 둥근 치과 드릴 비트로 멸균 회전 도구 또는 치과 드릴을 사용하여 두개골에 부드러운 압력을 가하여 ~ 1mm 직경의 두개골 절제술을 저속으로 수행합니다 ( 재료 표 참조).
- 모세관을 300-400 nL의 Cre-의존성 아데노-연관 바이러스 (AAV)와 함께 로딩하여 채널로돕신 또는 AAV를 발현하는 AAV1-dflox-hChR-2-mCherry와 같은 리포터 단백질 (예를 들어, mCherry)만을 관심 영역에서 대조군으로 발현시킨다 ( 표 참조). 팁이 막히지 않았는지 확인한 다음 원하는 등쪽 - 복부 (DV) 좌표 (등쪽 선조체 DV -3.35mm)로 뇌에 유리 피펫을 도입하십시오.
- 자동 인젝터를 사용하여 200nL를 23nL/s의 속도로 주입합니다. 주입을 마친 후 10 분 동안 기다렸다가 유출을 피하기 위해 유리 피펫을 천천히 철회하십시오.
참고 : 30G 바늘을 사용하여 적절한 마이크로 인젝터로 주입 할 수 있습니다.
- 자동 인젝터를 사용하여 200nL를 23nL/s의 속도로 주입합니다. 주입을 마친 후 10 분 동안 기다렸다가 유출을 피하기 위해 유리 피펫을 천천히 철회하십시오.
- 면봉으로 잔류 물을 청소하고 건조하십시오.
- 멸균 유리 LED 캐뉼라를 입체 택시 암에 부착하고 bregma를 참조로 사용하여 좌표를 보정하십시오. 캐뉼라를 매우 천천히 (300 μm / 분) 삽입하여 조직 손상을 피하고 주사 부위 위에 100 μm 올려 놓습니다.
- LED 캐뉼라가 제자리에 놓이면 두개골 절제술의 가장자리에 조직 접착제의 방울 (100 μL)을 추가하십시오.
- 섬유를 두개골에 고정시키는 제조업체의 지시에 따라 치과 시멘트 혼합물 ( 재료 표 참조)을 준비하십시오.
참고 : 간단히 말해서, 시멘트가 놓이기 전에 더 많은 작업 시간을 가지기 위해 차가운 도자기 접시를 사용하십시오. 도자기 접시에 수지 투명 분말 2 스쿱을 넣고 빠른베이스 4 방울과 촉매 1 방울을 넣은 다음 잘 섞으십시오. 분말 / 액체 비율은 더 얇거나 두꺼운 점도가 필요한 경우 조정할 수 있습니다. - 멸균 브러시를 사용하여 캐뉼라 커넥터 주위에 치과 시멘트 혼합물을 조금씩 바르고 두개골이 덮히고 커넥터가 두개골에 단단히 부착 될 때까지 층을 구축하여 핀을 완전히 자유롭게 만듭니다. 마우스의 피부에 치과 시멘트가 생기지 않도록하십시오.
- 완전히 말리십시오.
- 조직 접착제를 사용하여 임플란트 주위의 피부를 닫습니다 ( 재료 표 참조).
- 마우스를 33 ° C의 가열 패드 위에 회복 케이지에 놓으십시오. 다음과 같은 통증 / 불편 함의 징후 중 하나 이상이 있는지 모니터링하십시오 : 1) 운동 활동의 헐렁 거림, 부족 또는 감소, 2) 보관되지 않은 더러운 코트에 반사 된 손질 실패, 3) 과도한 핥기 또는 긁힘, 절개 부위의 발적, 4) 공격적인 행동, 5) 식욕 부진 또는 탈수, 6) 둥지 형성 부족.
참고: 임플란트 분리를 피하기 위해 모든 시술 중에 마우스를 개별적으로 감금하십시오. 캐뉼라가 분리 된 경우, 150 mg / kg의 펜토바르비탈 나트륨을 주입하여 안락사를 수행 한 다음 깊은 마취에 도달 한 후 감금하십시오. - 진통제를 제공하기 위해 수술 후 사흘 동안 피하 (SC) 멜록시캄 1 mg / kg을 하루에 한 번 주사하십시오.
- 추가 절차 전에 완전한 회복을 위해 적어도 7 일, opsin 발현을 위해 14 일을 기다리십시오.
참고 : 사흘 동안 12 시간마다 수술 후 후속 조치를 수행 한 다음 실험이 끝날 때까지 안락사 일까지 매일 동물을 확인하십시오.
2. 도달 범위 파악 교육
- 수술 후 7일째에, 식량 부족 프로토콜28을 시작한다. 생쥐를 사흘 연속 계량하여 평균 Ad libitum 체중을 결정합니다. 그런 다음 동물이 체중의 약 90 %와 85 % 이상을 유지하기에 충분한 영양소를 섭취 할 수 있도록 음식 제한을 계획하십시오.
참고 : 이것은 매일 2.5-3g의 음식을 제공함으로써 달성됩니다. 동물의 체중을 매일 모니터링하고 코트 및 눈 모양과 같은 동물의 행동과 외모를 관찰하는 전반적인 웰빙에 대한 점수를 매기십시오. 참조29의 신체 상태 채점 시스템을 사용하십시오. - 사전 훈련, 훈련 및 테스트 기간 동안 표준 식품 펠릿 외에 매일 20 펠릿 (먼지가없는 초콜릿 맛의 펠렛 20mg)을 각 마우스에 제공하십시오 ( 재료 표 참조) (작업 중 또는 이후에 먹음).
- 습관화 사흘 전에 0.4 g / animal / day 20 mg의 먼지가없는 초콜릿 맛의 펠렛을 집 케이지에 뿌려서 쥐가 도달 할 수있는 작업 중에 보상으로 사용되는 펠렛에 익숙해 지도록하십시오.
- 생쥐를 시험 챔버에 10분 동안 배치한 후 사전 훈련하기 전에 챔버 바닥에 흩어져 있는 펠릿으로 습관화시킨다(그림 1A).
- 훈련과 테스트 후에 매일 음식을 섭취하십시오. 매일 비슷한 일정을 유지하십시오.
- 사전 훈련 첫날에 쥐를 손이 닿는 곳에 놓고 앞쪽에서 관찰하십시오. 펠릿을 챔버 앞쪽에 개구부 가까이에 두어 펠릿을 소비하기 시작합니다. 이 단계에서 마우스는 어떤 형태로든 펠렛을 잡을 수 있습니다.
- 사전 훈련 둘째 날에는 펠릿을 구멍에서 더 멀리 떨어뜨려 들여쓰기(개구부에서 1cm)까지 올려 놓으면 쥐가 손이 닿는 움직임을 형성할 수 있습니다(그림 1C).
- 쥐가 케이지의 뒤쪽으로 달려가 케이지 개구부로 돌아가 시험을 개별화하기위한 전략으로 다음 음식 펠릿을 받도록 훈련시킵니다.
참고: 이것은 각 시험의 압흔에 펠릿을 넣기 전에 마우스가 케이지의 뒤쪽에 있을 때까지 기다림으로써 달성될 수 있습니다. - 오른쪽 또는 왼쪽 발로 잡을 펠릿을 놓습니다.
참고 : 마우스는 우선적으로 한 발을 사용하여 잡기 시작하며, 다음 날의 훈련 및 테스트에 사용됩니다. - 20회 시행되는 일일 세션에서 6일 동안 또는 최대 10분이 경과할 때까지 동물을 훈련시킵니다. 훈련 2 일째부터 모의 수신기 (치수 12 x 18 x 7 mm, 1g, 재료 표 참조)를 넣어 쥐가 작업을 수행하는 동안 체중에 익숙해 지도록하십시오 (그림 1B). 매일 히트 횟수와 놓친 시험 횟수를 채점합니다.
- 일반 카메라로 동작을 기록하고 챔버 전면에서 30-60 프레임 / s를 캡처하십시오. 또한 45° 각도로 훈련실 아래에 거울을 배치하여 동물의 자세를 모니터링할 수 있습니다(그림 1D,E).
- 사후 운동학 분석(그림 2)의 경우, 고속 카메라(재료 표 참조)를 45° 각도로 장착하여 케이지 측면에서 녹화합니다. 3D 분석이 필요한 경우 두 번째 고속 카메라를 배치하여 챔버 앞쪽에서 35° 각도로 녹화합니다. 두 카메라 모두 동물의 측면성에 따라 케이지의 오른쪽 또는 왼쪽에 배치되어야 하며 동일한 프레임 속도로 캡처하고 동기화해야 합니다(그림 3D,E).
- 가능한 경우 고속 카메라를 376 x 252픽셀 이상의 해상도로 100프레임/초로 설정합니다. 흰색 스티로폼 벽을 챔버의 측면과 뒷면 뒤에 배치하여 배경을 줄이고 대비를 높입니다(그림 1E).
- 시험 당일에는 모의 장치를 무선 광유전학 자극을 위한 적외선 수신기로 교체하십시오(그림 1B,C).
- 마우스가 도달하기 시작하면 LED 캐뉼라를 리모컨으로 수동으로 돌려 동작이 수행되는 시간 및 2 초 이상 연속 자극을 가하지 않도록하십시오. 자동 자극 패러다임을 프로그래밍하는 것이 바람직하다. 자극 장치는 1.0mW/mm2의 팁에서 강도로 470nm(청색광)의 LED를 트리거합니다.
- 채점 및 운동학 분석을 포함한 추가 시험을 위해 비디오를 수집하십시오.
3. 사후 조직학적 확인
- 실험이 완료되면 바이러스 발현 및 LED 캐뉼라 배치를 확인하십시오. 케타민 100 mg / kg과 크실라진 10 mg / kg의 칵테일로 동물을 마취하십시오. 마우스가 깊은 마취의 징후를 보이면 (단계 1.7), 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 관류시킨 다음 4 % PFA를 사용합니다.
- 포셉으로 커넥터를 단단히 잡고 부드럽게 잡아당겨 이식된 캐뉼라를 조심스럽게 제거하십시오.
- 4% PFA23에서 24시간 동안 뇌를 추출하고 후고정시킨다.
- PBS로 3-10 분 세척을 수행하십시오.
- 마이크로톰을 사용하여 뇌를 50 μm 절편으로 절단 한다(표 참조).
- DAPI를 사용하여 하드 세트 장착 매체가 있는 슬라이드에 섹션을 마운트하여 핵을 염색하고 슬라이드를 덮습니다.
- 건조 후, 공초점 현미경으로 절편을 관찰하고 이식된 캐뉼라 위치 및 임의의 형광 단백질과 융합된 Ch2R의 발현을 확인하였다.
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Representative Results
도달 - 투 - 파악 과제는 다양한 실험 조작 하에서 미세 기술 운동의 형성, 학습, 성능 및 운동학을 연구하는 데 널리 사용되는 패러다임입니다. 마우스는 며칠 안에 작업을 수행하고 5 일간의 훈련 후에 고원에 도달하는 55 % 이상의 정확도를 달성하는 법을 배웁니다 (그림 2A, B). 이전에 보고된 것과 유사하게, 동물의 백분율은 작업을 적절하게 수행하지 않으며(29.62%), 이들은 추가 분석(30)으로부터 제외되어야 한다. 여기에는 훈련 초기부터 펠릿에서 너무 멀리 조준하는 대상을 놓치거나 펠릿 위에 올바른 위치에 있기 전에 파지 운동을 수행하는 비학습자 마우스(6/54 마우스, 11.1%)의 서브세트가 포함된다. 첫 번째 훈련 일 동안 다른 그룹은 높은 정확도로 작업을 수행했지만 3-4 일 (10/54 마우스, 18.51 %)까지 펠릿에서 너무 멀리 조준하여 성능이 좋지 않았습니다. 이 그룹 내에서 일부 마우스는 선호하는 발을 사용하여 훈련을 시작하지만 며칠 후에 선호도를 변경합니다. 이것은 이전에 Chen et al., 201430에 의해 논의되었습니다.
도달 범위 간 움직임은 시험에서 재판까지, 그리고 동물 내에서 매우 고정 관념적입니다 (그림 2). 고속 비디오 그래피를 사용하면 움직임의 궤적을 추적 할 수 있으므로 제어 조건의 여러 단계와 광유전 자극 중에 운동학을 분석 할 수 있습니다 (그림 1E 및 그림 2C). 이 근사치는 이동 거리, 속도, 가속도, 끝점 및 궤적과 같은 매개 변수를 정량화 가능하게 평가합니다(그림 2 C-E). 펠릿을 검색하기 전에 마우스가 여러 번 도달하는 다중 도달 시험과 마우스가 단일 도달 운동으로 펠릿을 검색하는 단일 시험 이벤트를 모두 분석 할 수 있습니다. 실험은 동물들이 펠릿을 밀어 내거나 새장 뒤쪽으로 이동하여 재판을 다시 시작할 때 끝납니다. 다른 실험 조건 하에서의 궤적의 정량적 비교는 주성분 분석(PCA)에 이어 k-평균 클러스터링(그림 3J-K)23,25로 달성된다.
대부분의 훈련 세션 동안, 마우스는 때때로 펠릿을 파악하지 못합니다 (시험 누락). 일부 조작은 누락 된 시험의 수와 따라서 작업의 정확성을 변경합니다. 그런 다음 히트 시험과 놓친 시험의 차이점을 분석하는 것이 중요합니다. 우리 손에서 놓친 시련은 움직임의 세 가지 뚜렷한 단계의 변화로 인해 발생합니다 : (1) 발이 챔버 개구부를 건너기 전에 궤적을 수정하고(초기 오류), (2) 발이 개구부를 통과 한 후 발이 궤적을 수정하고(최종 오류), (3) 펠릿을 수집하지 못함(파악 오류)(그림 2 I,J)13 . 놓친 시험의 일반적인 특징은 마우스가 히트 시험과 비교하여 펠릿 (끝점)에서 더 멀리 떨어진 잡기 운동을 시작한다는 것입니다 (그림 2G). 또한, 마우스 자세와 관련된 미스는 적중과 놓친 시험 사이의 신체 각도의 유의미한 차이로 측정됩니다 (그림 2H).
광유전학을 표적으로 하는 구조 또는 신경 집단에 따라, 행동 7,19,23,31,32,33에 비해 차별적 효과를 기대할 수 있다. 현재 프로토콜은 도달 운동 동안 마우스가 사용하는 바람직한 발에 대해 대측성 또는 동측성 반구에서 선조체에서 스파이니 프로젝션 뉴런 (SPN)을 활성화시키는 영향을 설명합니다 (그림 3). 기저 신경절 직접 경로에 기원을 부여하는 SPNs를 발현하는 D1 도파민의 대측성 활성화는 대조군 조건에 비해 파악 성공을 64.9±8.8%로 감소시켰다(도 3B). 운동학적 분석은 광유전학적 자극 동안, 발 궤적이 진동 패턴을 기술하였는데, 이는 대조군의 218.4±19.2%로의 이동 거리의 증가에 의해 나타나서, 펠릿을 표적으로 할 수 없는 무능력 및 초기 오차 유형 I의 증가로 이어진다는 것을 보여준다(도 3F). PCA 분석은 대측성 D1 SPNs 활성화 동안 모든 임상시험의 궤적이 대조군 클러스터와 거의 겹치지 않는 클러스터에서 분리됨을 보여주며, 이는 낮은 유사성을 나타낸다(그림 3J-K).
한편, 동측 측에서 dSPNs의 활성화는 도달 성공에 영향을 미치지 않으면서 PCA 분석(도 3K)에 의해 보여지는 궤적 분산의 증가(도 3K)의 증가로 이어지고(120.7±23.6%, n=4), 총 이동 거리(136.3±35.5%), 또는 도달 단계 동안의 최대 속도(117.3±10.3%)(도 3C)는 동측성 D1 SPNs 활성화가 행동 결과를 변화시키지 않고 도달 궤적을 어느 정도 변형시킨다는 것을 나타낸다(도 3G-I ). 운동학적 분석은 동측성 조작에 의한 움직임 제어의 미묘한 변화를 나타낸다. 마지막으로, 신체 자세 분석은 대측성 D1SPNs 활성화 동안 신체 각도의 변화를 보여줍니다 (그림 3L). 이 간단한 작업조차도 목표를 달성하기 위해 적절한 이동 실행을 허용하는 많은 구성 요소가 있음을 강조합니다.
그림 1 : 실험 설정. (A) 행동 챔버의 회로도. cm의 다음 치수를 갖는 아크릴 시트로 만들어진 챔버: 18.5 (h) x 8.5 (w) x 20 (d) 전면 창 1 (w) x 5 (h) 및 작은 선반 8.5 (w) x 4 (d). (B) LED 캐뉼라(왼쪽)와 무선 수신기(오른쪽)의 사진. (C) 도달 - 투 - 파악 작업을 수행하는 동안 수신기에 연결된 이식 된 LED 캐뉼러가있는 마우스의 측면도 (흰색 화살표 헤드는 수신기를 나타내고, 별표는 캐뉼라를 보유하고있는 치과 시멘트를 나타내고, 빈 화살촉은 펠릿을 보여줍니다). (D) 실험 설정의 스케치. 두 대의 고속 카메라가 도달 범위를 두 차원으로 기록하고, 세 번째 카메라는 챔버 아래의 거울에서 마우스의 위치를 포함하여 작업의 파노라마 뷰를 수집했습니다. 동물들은 자신이 선호하는 발을 자유롭게 선택할 수 있었고, 자극 측면은 항상 선호되는 발의 측면을 참조한다. (E) 시험 중 카메라의 정확한 위치와 각 카메라의 대표 이미지. 이 그림은 참조23에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 도달 행동에 대한 운동학적 분석. (a) 일-0일(d0)일부터 25일(d25일)까지의 실험의 타임라인. (B) 펠릿 검색 정확도(총 성공 횟수/총 시행 횟수 x 100)로 측정되는 시간 경과에 따른 도달 투 파악 작업 동안의 성능. (C) 고속 비디오로부터의 궤적 추적의 예. (D) 타격 중 발의 개별 궤적과 놓친 시험. (E) 타격 및 놓친 시험 동안 발에 의해 이동 된 총 거리. (F) 타격의 궤적을 통한 발의 가속 및 거리 대 거리로 플롯 된 시도를 놓친 경우. 속도. (G) 히트에서의 종점 거리 요약 = 3.16 mm, 미스 6.08 mm (만-휘트니-윌콕슨 테스트누락 대 히트 U = 4184, p<0.0001, n = 28 마우스). (H) 두 종류의 시험에서 신체 각도의 차이, 미스 = 8.4±5.3°, 히트 6.7±4° (만-휘트니-윌콕슨 시험 U = 6437, P = 0.0243, n = 28 마우스). (I) 세 가지 유형의 오류에 대한 회로도. (j) 대조군 조건에서 마우스에 의해 만들어진 세 종류의 오류의 비율. 이 그림은 참조23에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 도달 - 투 - 파악 거동 동안 대측성 및 동측성 D1 SPN의 광유전 적 활성화 . (A) 자극 패러다임의 회로도. (B) 비자극 시험과 비교한 성공률. (C) 통제 조건과 비교하여 이동 거리의 변화. (D), (G) 광유전학적 자극 유무에 관계없이 발에 의해 만들어진 경로의 이차원 플롯. (E) , (H) 움직임에 도달하는 동안 발에 의해 이동 된 총 거리. (F) , (I) 다양한 종류의 오류의 분포 요약. D1 대측성: 초기 오차 또는 유형 I(대조군 = 18.2±11.6%, 자극 = 79.9±8.2% 피셔의 정확한 검정, p<0.0001). (j) D1SPNs의 대측성 활성화와 비교한 대조군 조건에서의 궤적의 PCA 분석의 예. 음영 영역은 각 조건의 군집을 나타내고 별은 군집 중심입니다. (K) 상이한 실험 조건의 클러스터들 간의 중첩의 요약. (L) 신체 각도의 변화. 이 도면은 참조23에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
잘 정의 된 행동 패러다임에서 신경 집단의 광유전 적 조작의 사용은 운동 제어 7,23의 기초가되는 메커니즘에 대한 우리의 지식을 발전시키고 있습니다. 무선 방법은 여러 동물 또는 자유 이동34,35에 대한 테스트가 필요한 작업에 특히 적합합니다. 그럼에도 불구하고, 기술과 장치가 세련됨에 따라, 그것은 광유전학34,36과 결합 된 모든 행동 과제에 대한 선택 사항이어야합니다.
현재의 방법은 소형화된 LED가 높은 강도의 신뢰할 수 있는 광원을 제공하고 임플란트를 며칠 동안 자극이 필요한 연구에 사용할 수 있기 때문에 많은 장점을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 옵신 자극을 위한 광섬유의 삽입은 뇌 조직을 기계적으로 손상시키고, 감염을 일으키고, 때때로 캐뉼라(37)의 위치에서 염증을 일으킬 수 있다. 오래 지속되는 고주파 광유전학적 자극은 열을 발생시키고 광독성(37)을 야기할 수 있음이 입증되었다. 적색 또는 심지어 근적외선으로 활성화되는 적색 편이 이펙터 옵신을 사용함으로써 광독성을 감소시킬 수 있고, 이는 열(38)의 발생을 감소시킨다.
또한 수신기를 연결하는 핀이 두개골 외부에 남아 있기 때문에 치과 시멘트가 올바르게 적용되지 않으면 때때로 마우스가 캐뉼라의 변위 또는 분리를 일으킬 수 있습니다. 이것은 종종 뇌 조직의 손상으로 이어지고 추가 분석을 위해 고려해야 할 피험자의 수를 줄입니다. 최근의 발전은 뇌 조직 깊숙이 침투하는 근적외선에 반응하여 상향 변환 발광을 통해 가시광선을 방출할 수 있는 입자를 사용하는 섬유리스 광유전학(fiberless optogenetics)을 도입하였다(36). 섬유리스 장치는 눈에 띄지 않는 임플란트(35)를 갖는 자유롭게 행동하는 동물에서 더 긴 시간 프레임에 걸쳐 광유전학적으로 자극할 기회를 가져온다. 이것은 수중 미로에서도 억제되지 않은 움직임을 허용하고, 여러 동물을 함께 수용하고(사회적 고립의 영향을 피하기 위해), 보다 자연주의적인 환경에서 동물을 연구할 수 있게 한다(35,36).
섬유가없는 광유전학이 제공하는 모든 장점에도 불구하고 여전히 생체 적합성 및 열 생성 문제에 직면 해 있습니다. 광자 변환의 효율성 또한 그것을 제한합니다. 마지막으로, 높은 배출 효율(34,36)에 대해 추가적인 개선이 요구된다.
이 패러다임과 고속 비디오 그래피의 결합은 다양한 실험 조건에서 운동학 분석을 가능하게합니다. 이것은 행동 및 모터 제어의 뚜렷한 구성 요소에 대한 미묘한 효과조차도 민감하게 감지합니다. 더 많은 분석 도구가 개발됨에 따라 온라인 운동 학적 분석과 다양한 상황에서 운동 행동의 심층적 인 특성화를 할 수 있습니다. 운동 운동학에 도달하는 마우스의 철저한 정량화는 최근 Becker et al.25에 의해 발표되었습니다.
최소 침습적 기술로 자유롭게 움직이는 동물에서 뉴런 집단을 선택적으로 조작할 수 있는 가능성은 정확한 행동 과제(23)에서 특정 뉴런 유형의 기여를 해부할 수 있게 한다. 도달 - 투 - 파악 작업은 모터 동작13,19에 대한 번역 가능한 패러다임입니다. 보존 된 뇌 구조는 과제 7,12,23의 획득, 학습 및 수행의 여러 단계에 참여하는 것으로 알려져 있습니다. 이 행동의 기초가되는 신경 회로를 드러내면 모터 제어에 대한 이해가 높아집니다. 몇몇 연구는 특히 높은 손재주가 필요한 경우20,21,22 일수작업 작업보다 이중 반구형 제어의 중요성을 강조합니다. 광유전학적 조작과 결합된 운동학적 분석은 이 복잡한 행동의 다양한 메카니즘을 조사할 수 있게 해준다. 그것은 정상적인 상태 및 질병 모델에서 감각 운동 피드백의 기여도를 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개를 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 UNAM-PAPIIT 프로젝트 IA203520에서 지원했습니다. IFC 동물 시설에서 마우스 식민지 유지 보수에 도움을 준 것과 IT 지원을 위한 전산 장치, 특히 Francisco Perez-Eugenio에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
References
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