Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Trådlös optogenetisk kontroll av skickligt motoriskt beteende

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63082
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Det nuvarande protokollet beskriver hur man använder trådlös optogenetik i kombination med höghastighetsvideoografi i en enda pellets nå-till-grepp-uppgift för att karakterisera de neurala kretsarna som är involverade i utförandet av skickligt motoriskt beteende hos fritt rörliga möss.

Abstract

Finmotorik är viktigt i vardagen och kan äventyras vid flera nervsystemet. Förvärvet och utförandet av dessa uppgifter kräver sensorisk-motorisk integration och involverar exakt kontroll av bilaterala hjärnkretsar. Implementering av unimanuella beteendeparadigmer i djurmodeller kommer att förbättra förståelsen för bidraget från hjärnstrukturer, som striatum, till komplext motoriskt beteende eftersom det möjliggör manipulation och registrering av neural aktivitet hos specifika kärnor under kontrollförhållanden och sjukdom under utförandet av uppgiften.

Sedan dess skapande har optogenetik varit ett dominerande verktyg för att förhöra hjärnan genom att möjliggöra selektiv och riktad aktivering eller hämning av neuronala populationer. Kombinationen av optogenetik med beteendeanalyser belyser de underliggande mekanismerna för specifika hjärnfunktioner. Trådlösa huvudmonterade system med miniatyriserade lysdioder (LED) möjliggör fjärroptogenetisk kontroll i ett helt fritt rörligt djur. Detta undviker att begränsningarna i ett trådbundet system är mindre restriktiva för djurens beteende utan att kompromissa med ljusutsläppseffektiviteten. Det nuvarande protokollet kombinerar ett trådlöst optogenetiskt tillvägagångssätt med höghastighets videografi i en enmanuell fingerfärdighetsuppgift för att dissekera bidraget från specifika neuronala populationer till finmotoriskt beteende.

Introduction

Motoriskt skickligt beteende är närvarande under de flesta rörelser som utförs av oss, och det är känt att det påverkas i flera hjärnsjukdomar 1,2,3,4,5,6. Att implementera uppgifter som gör det möjligt att studera utveckling, inlärning och prestanda av skickliga rörelser är avgörande för att förstå motorfunktionens neurobiologiska underlag, särskilt i modeller av hjärnskada, neurodegenerativa och neurodevelopmental störningar 2,7,8,9,10,11,12,13 . Att nå och hämta föremål görs rutinmässigt i vardagliga handlingar, och det är en av de första motoriska färdigheterna som förvärvats under tidig utveckling och sedan förfinats genom åren 5,6. Det består av ett komplext beteende som kräver sensoriska motoriska processer såsom uppfattningen av objektets funktioner, rörelseplanering, åtgärdsval, rörelseutförande, kroppskoordination och hastighetsmodulering 7,14,15,16. Således kräver unimanuella uppgifter med hög fingerfärdighet deltagande av många hjärnstrukturer i båda halvklotet 16,17,18,19,20,21,22. Hos möss karakteriseras den enda pellets nå-till-grepp-uppgiften för flera faser som kan styras och analyseras separat 7,13,23. Denna funktion gör det möjligt att studera bidraget från specifika neuronala delpopulationer vid olika stadier av förvärv och beteendeprestanda och ger en plattform för detaljerade studier av motorsystem 13,23,24. Rörelsen sker på några sekunder; således bör höghastighetsvideo användas för kinematisk analys i distinkta steg i den skickliga motorbanan 7,25. Flera parametrar kan extraheras från videorna, inklusive kroppshållning, bana, hastighet och typ av fel25. Kinematisk analys kan användas för att detektera subtila förändringar under trådlös optogenetisk manipulation 7,23.

Att använda miniatyriserade lysdioder (LED) för att leverera ljus via ett trådlöst huvudmonterat system gör det möjligt att ha fjärroptoneisk kontroll medan djuret utför uppgiften. Den trådlösa optogenetiska styrenheten accepterar kommandon med enkel puls eller kontinuerlig avtryckare från en stimulator och skickar infraröda (IR) signaler till en mottagare ansluten till den miniatyriseradeLED 23,26. Det nuvarande protokollet kombinerar detta trådlösa optogenetiska tillvägagångssätt med höghastighets videografi av en fingerfärdighetsuppgift för att dissekera rollen hos specifika neuronala populationer under utförandet av finmotoriskt beteende23. Eftersom det är en enmanuell uppgift möjliggör det att bedöma deltagandet av strukturer i båda halvklotet. Traditionellt styr hjärnan kroppsrörelsen på ett mycket asymmetriskt sätt; emellertid kräver uppgifter med hög fingerfärdighet noggrann samordning och kontroll från många hjärnstrukturer, inklusive ipsilaterala kärnor och differentiellt bidrag från neuronala subpopulationer inom kärnor 10,20,21,22,23. Detta protokoll visar att subkortiska strukturer från båda halvklotet styr banan för frambenet23. Detta paradigm kan vara lämpligt för att studera andra hjärnregioner och modeller av hjärnsjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Försöken med djuranvändning genomfördes enligt lokala och nationella riktlinjer och godkändes av motsvarande institutionella djurvårds- och användningskommitté (Institute of Cellular Physiology IACUC-protokoll VLH151-19). Drd1-Cre transgena hanmöss27, 35-40 dagar postnatal med C57BL/6-bakgrund användes i det aktuella protokollet. Möss hölls under följande förhållanden: temperatur 22±1 °C; luftfuktighet 55%; ljusschema 12/12 h med släckta lampor kl 19 och avvandes efter dag 21. Avvända valpar var inrymda i samkönade grupper om 2-5. Djur var inrymda i statiskt hus med mikrobarriärtoppar. Sängkläderna bestod av sterila aspspån. Gnagarpellets och RO-renat vatten tillhandahölls ad libitum, om inte annat anges.

1. Kirurgiska ingrepp

  1. Förbered en LED-kanyl i önskad längd enligt de dorsoventrala koordinaterna för strukturen av intresse (helst 0,5 mm längre för att ta hänsyn till skallens tjocklek, för dorsolateral striatum 3,5 mm) (Figur 1).
    1. Skär glasfibern till en längd längre än den slutliga önskade storleken, slipa fiberspetsen till mållängden med grovt sandpapper och slutligen polera fiberspetsen med fint sandpapper.
      OBS: LED-kanyl är en optisk glasfiber med en diameter på 250 μm ansluten till en infraröd mottagare (se materialtabell).
  2. Dra glaspipetter (1,14 mm ytterdiameter, 0,53 mm innerdiameter och 3,5 i längd) för nanoinjektorn med en horisontell avdragare (se materialtabell) och förvara dem för senare. Programmera avdragaren i en ögla för att få en spetsdiameter på 15-20 μm med en lång gradvis lutningsavsmalning (4-5 mm).
  3. Förbered operationsområdet genom att desinficera stereotaxiska apparaten, huven, mikroinjektorn (se materialtabellen) och omgivande ytor noggrant med 70% etanol.
    OBS: En stereotaxisk musapparat är avgörande för att injicera Adeno Associated Virus (AAV) exakt och placera LED-kanylen i det intressanta området.
  4. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för proceduren, inklusive en ren labbrock eller engångskirurgisk klänning, sterila handskar, ansiktsmask och engångshuvudlock.
  5. Placera nödvändig utrustning nära operationsområdet, såsom sterila kirurgiska verktyg, bomullsspetsar, lösningar, mikropipett, pipettspetsar, kapillärer, mikrofyllning med mineralolja och markör.
  6. Fyll en pipett för mikroinjektioner med mineralolja och placera den i mikroinjektorn. Se till att mikroinjektorn fungerar korrekt genom att mata ut lite mineralolja.
    OBS: Alla instrument som används under operationen ska vara autoklaverade och sterila. Aseptisk teknik bör användas.
  7. Bedöva djur med gasformig isofluran 4-5% för att inducera anestesi och 1,2% under hela operationen med 0,5-1 L/ min rent syre. Operationen börjar först efter att djuret har nått en punkt med djupbedövning, bedömd av frånvaron av tassuttag efter en liten nypa.
    1. Övervaka kontinuerligt djurets andningsfrekvens och temperatur. Håll kroppstemperaturen med en värmedyna inställd på 34 °C.
  8. Applicera en oftalmisk salva. Ta bort hår från hårbotten med en trimer och hårborttagningskräm. Torka hårbotten med bomullspinne med 8% povidon-jod (se materialtabell) och 70% etanol alternerat tre gånger vardera.
  9. Placera musen i stereotaxiska apparaten och säkra huvudet, se till att skallen är jämn i de mediolaterala och främre bakre axlarna.
  10. Gör ett snitt på 1 cm med en skalpell genom hårbotten på ögonnivån längs sagittalaxeln. Dra tillbaka huden för att exponera skallen och rengör periosteum med bomullspinne.
  11. Rengör kraniumytan med saltlösning och sterila bomullspinne. Lös eventuella blödningar vid ytan med hjälp av sterila absorberande ögonspjut (se materialtabell) eller liknande sterilt absorberande material.
  12. Applicera en droppe 2,5% väteperoxid med en bomullspinne och låt den fungera i några sekunder för att göra skallesuturerna synliga och få en bättre referens. Rengör noggrant med en ren bomullspinne efter några sekunder.
  13. Med glaspipetten (15 μm slutlig spetsdiameter), lokalisera bregma och lambda för att kontrollera att skallen är jämn i den främre-bakre axeln.
    OBS: Det rekommenderas att ha ett stereoskopiskt mikroskop eller USB-mikroskop för att se spetsen på glaspipetten. Om det behövs, justera munhållarens höjd för att jämföra skallen.
  14. Flytta kapillären mot de valda främre-bakre (AP) och mediala-laterala (ML) koordinaterna (dorsolateral striatum AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Måla en referenspunkt i hårbotten ovanför de markerade koordinaterna med en steril markör.
  15. I referenspunkten utför du en kraniotomi med en diameter på ~ 1 mm som applicerar försiktigt tryck på skallen med ett sterilt roterande verktyg eller tandborr med låg till medelhög hastighet med en liten rund tandborrkrona (se materialtabell).
  16. Ladda kapillären med 300-400 nL Cre-beroende adenoassocierat virus (AAV) såsom AAV1-dflox-hChR-2-mCherry för att uttrycka Channelrhodopsin eller en AAV för att endast uttrycka reporterproteinet (t.ex. mCherry) som en kontroll i det intressanta området (se materialtabell). Kontrollera att spetsen inte är igensatt och inför sedan glaspipetten i hjärnan vid önskade dorso-ventrala (DV) koordinater (dorsolateral striatum DV -3,35 mm).
    1. Injicera 200 nL med en automatisk injektor med en hastighet av 23 ml/s. Vänta i 10 minuter efter avslutad injektion, dra ut glaspipetten långsamt för att undvika spill.
      OBS: Det är möjligt att använda en 30 G nål för att injicera med lämplig mikroinjektor.
  17. Rengör och torka eventuella rester med bomullspinne.
  18. Fäst den sterila glas-LED-kanylen på stereotaxiska armen och kalibrera koordinaterna med bregma som referens. Sätt in kanylen mycket långsamt (300 μm/min) för att undvika vävnadsskador och placera den 100 μm ovanför injektionsstället.
  19. När LED-kanylen är på plats, tillsätt en droppe (100 μL) vävnadslim vid kanten av kraniotomin.
  20. Förbered tandcementblandningen (se materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner för att fästa fibern på skallen.
    OBS: Använd kort en kyld porslinsfat för att få mer arbetstid innan cementuppsättningar. Tillsätt 2 skopor harts klart pulver till porslinskålen, tillsätt 4 droppar snabb bas och 1 droppe katalysator och blanda sedan väl. Förhållandet mellan pulver och vätska kan justeras om en tunnare eller tjockare viskositet behövs.
  21. Använd en steril borste och applicera tandcementblandningen runt kanylkontakten lite efter lite, bygg lager tills skallen är täckt och kontakten är ordentligt fastsatt på skallen och lämnar stiften helt fria. Undvik att få tandcement på musens hud.
  22. Låt torka helt.
  23. Stäng huden runt implantatet med vävnadslim (se materialtabell).
  24. Placera musen i en återhämtningsbur över en värmedyna vid 33 ° C. Övervaka förekomsten av ett eller flera av följande tecken på smärta / obehag: 1) Böjd, brist eller minskning av motorisk aktivitet, 2) Underlåtenhet att sköta reflekterad i en ovårdad smutsig päls, 3) Överdriven slickning eller repor, rodnad i snittstället, 4) aggressivt beteende, 5) anorexi eller uttorkning och 6) Brist på bobildning.
    OBS: Håll musen individuellt buren under alla procedurer för att undvika att implantatet lossnar. Vid avlägsnande av kanylen, utför eutanasi genom att injicera 150 mg / kg natriumpentobarbital följt av halshuggning efter att djupbedövning har uppnåtts.
  25. Injicera subkutant (SC) meloxikam 1 mg/kg en gång dagligen i tre dagar efter operationen för att ge smärtlindring.
  26. Vänta minst 7 dagar för fullständig återhämtning och 14 dagar för opsinuttryck innan ytterligare procedurer.
    OBS: Utför en postoperativ uppföljning var 12: e timme i tre dagar och kontrollera sedan djur varje dag fram till dagen för eutanasi i slutet av experimentet.

2. Utbildning i räckvidd

  1. På dag 7 efter operationen, starta matbristprotokollet28. Väg möss i tre dagar i rad för att bestämma deras genomsnittliga ad libitum kroppsvikt. Schemalägg sedan matbegränsningar så att djuren får tillräckligt med näringsämnen för att bibehålla cirka 90% och inte mindre än 85% kroppsvikt.
    OBS: Detta uppnås genom att tillhandahålla 2,5-3 g mat dagligen. Övervaka djurens vikt dagligen och poäng för övergripande välbefinnande genom att observera djurens beteende och utseende, till exempel päls och ögons utseende. Använd poängsystemet för kroppstillstånd från referens29.
  2. Under förtränings-, tränings- och testperioderna, förse varje mus med 20 pellets (20 mg dammfria chokladsmakade pellets) dagligen (se materialtabell) (ätit under uppgiften eller efter) förutom standardmatpellets.
  3. Tre dagar före tillvänjning, sprid 0,4 g / djur / dag 20 mg dammfria chokladsmakade pellets i sina hemburar, så att möss bekantar sig med pellets som fungerar som belöning under uppgiften att nå grepp.
  4. Habituate möss genom att placera dem 10 min i testkammaren en dag före förträning med pellets utspridda på kammargolvet (figur 1A).
  5. Tillåt mat dagligen efter träning och testning. Håll ett liknande schema varje dag.
  6. På den första dagen av förträningen, placera mössen i reach-to-grasp-kammaren och observera framifrån. Placera pelletsen framför kammaren nära öppningen så att de börjar konsumera pelletsen. I detta skede får möss ta tag i pellets i någon form.
  7. På dag två av förträningen, placera pelletsen längre och längre från öppningen tills du får dem till indragningen (1 cm från öppningen) så att möss kan forma sin räckviddsrörelse (figur 1C).
  8. Träna möss att springa till baksidan av buren och återgå till buröppningen för att få nästa matpellets som en strategi för att individualisera försök.
    OBS: Detta kan uppnås genom att vänta tills musen är på baksidan av buren innan du placerar en pellet i indragningen för varje försök.
  9. Placera pellets som ska greppas av antingen höger eller vänster tass.
    OBS: Möss börjar använda företrädesvis en tass för att greppa, som kommer att användas de följande dagarna av träning och testning.
  10. Träna djur i 6 dagar i dagliga sessioner som varar 20 försök eller tills högst 10 minuter går. Från dag 2 av träningen, sätt mockmottagaren (mått 12 x 18 x 7 mm, 1 g, se materialtabell), så att möss blir vana vid vikten medan de utför uppgiften (figur 1B). Varje dag gör antalet träffar och missade försök.
  11. Spela in beteende med en vanlig kamera och fånga 30-60 bilder / s från framsidan av kammaren. Dessutom kan man placera en spegel under träningskammaren i 45° vinkel för att övervaka djurens hållning (figur 1D,E).
  12. För post hoc kinematisk analys (figur 2), montera en höghastighetskamera (se materialtabell) i en vinkel på 45 ° för att spela in från sidan av buren. Om en 3D-analys krävs, placera en andra höghastighetskamera för att spela in i en 35 ° vinkel från kammarens framsida; båda kamerorna ska placeras i höger eller vänster sida av buren beroende på djurens sida och ska fångas med samma bildhastighet och synkroniseras7 (figur 3D, E).
  13. Ställ in höghastighetskamerorna på 100 bilder /s med en upplösning på 376 x 252 pixlar eller mer om möjligt. Placera vita frigolitväggar bakom kammarens sidor och baksida för att minska bakgrunden och öka kontrasten (figur 1E).
  14. På testdagen, byt ut mock-enheten med en infraröd mottagare för trådlös optogenetisk stimulering (figur 1B, C).
  15. När möss börjar nå, vrid LED-kanylen manuellt med fjärrkontrollen för att få en kontinuerlig stimulering under den tid beteendet utförs och inte längre än 2 s. Att programmera ett automatiskt stimuleringsparadigm är att föredra. Stimuleringsanordningen utlöser en lysdiod på 470 nm (blått ljus) med en intensitet på 1,0 mW/mm2.
  16. Samla in videorna för vidare undersökning, inklusive poängsättning och kinematisk analys.

3. Histologisk bekräftelse efter hoc

  1. Efter avslutat experiment, bekräfta viralt uttryck och LED-kanylplacering. Bedöva djuret med en cocktail av ketamin 100 mg/kg och xylazin 10 mg/kg. När musen uppvisar tecken på djupbedövning (steg 1.7), perfuse med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 4% PFA.
  2. Ta bort implanterad kanyl försiktigt genom att ta ett fast grepp om kontakten med pincett och dra försiktigt upp.
  3. Extrahera och efterfixera hjärnan i 24 timmar i 4% PFA23.
  4. Utför 3-10 min tvättar med PBS.
  5. Skär hjärnan i 50 μm sektioner med hjälp av en mikrotom (se materialtabell).
  6. Montera sektionerna i diabilder med hårdmonterade monteringsmedia med DAPI för att fläcka kärnor och täcka glidbanor.
  7. Efter torkning, observera sektionerna under konfokalmikroskopet och verifiera den implanterade kanylens placering och uttryck av Ch2R smält med något fluorescerande protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reach-to-grasp-uppgiften är ett paradigm som ofta används för att studera formning, inlärning, prestanda och kinematik av fin färdighetsrörelse under olika experimentella manipulationer. Möss lär sig att utföra uppgiften på ett par dagar och uppnå mer än 55% noggrannhet att nå en platå efter 5 dagars träning (figur 2A,B). I likhet med vad som tidigare har rapporterats utför en procentandel av djuren inte uppgiften på lämpligt sätt (29,62 %), och dessa bör uteslutas från ytterligare analys30. Dessa inkluderar en delmängd av icke-lärande möss (6/54 möss, 11,1%) som från början av träningen missar målet som siktar för långt från pelleten eller utför grepprörelsen innan de är i rätt position över pelleten. Under de första träningsdagarna utförde en annan grupp uppgiften med hög noggrannhet men började prestera dåligt genom att sikta för långt från pelleten dag 3-4 (10/54 möss, 18,51%). Inom denna grupp börjar vissa möss träna med en föredragen tass men ändrar sina preferenser efter några dagar; detta har tidigare diskuterats av Chen et al., 201430.

Reach-to-grasp-rörelsen är mycket stereotyp från prövning till prövning och inom djur (figur 2). Användningen av höghastighets videografi gör det möjligt att spåra rörelsebanan vilket gör det möjligt att analysera kinematik vid olika faser i kontrolltillståndet och under optogenetisk stimulering (Figur 1E och Figur 2C). Denna approximation resulterar i en kvantifierbar bedömning av parametrar som tillryggalagd sträcka, hastighet, acceleration, slutpunkt och bana (figur 2 C-E). Det är möjligt att analysera både multi-reach-försök, där musen når flera gånger innan den hämtar pelleten, och enstaka försökshändelser, där musen hämtar pelleten i en enda räckviddsrörelse. Försöket avslutas när djur skjuter bort pelleten eller återupptar försöket genom att gå till baksidan av buren. En kvantitativ jämförelse av banor under olika experimentella förhållanden uppnås med huvudkomponentanalys (PCA) följt av k-medelkluster (figur 3J-K)23,25.

Under de flesta träningspass misslyckas möss ibland med att greppa pelleten (missade försök). Vissa manipuleringar ändrar antalet missade försök och därmed uppgiftens noggrannhet. Då är det viktigt att analysera skillnader mellan träff och missade försök. I våra händer beror missade försök på förändringar i tre distinkta faser av rörelsen: (1) tassen ändrar sin bana innan den korsar kammaröppningen (initialt fel), (2) tassen ändrar sin bana efter att tassen korsar öppningen (slutligt fel) och (3) underlåtenhet att samla pelleten (greppfel) (Figur 2 I,J)13 . En allmän egenskap hos missade försök är att möss startar grepprörelsen längre bort från pelleten (slutpunkten) jämfört med träffförsök (figur 2G). Dessutom mäts missar i samband med musens hållning som signifikanta skillnader i kroppsvinkel mellan träff och missade försök (figur 2H).

Beroende på strukturen eller neuronalpopulationen riktad mot optogenetik kan man förvänta sig differentiella effekter över beteende 7,19,23,31,32,33. Det aktuella protokollet beskriver effekten av att aktivera taggiga projektionsneuroner (SPN) i striatum i kontralaterala eller ipsilaterala halvklot om den föredragna tassen som används av musen under den nånde rörelsen (Figur 3). Kontralateral aktivering av D1 dopamin som uttrycker SPN, som ger upphov till den basala gangliernas direkta väg, minskade greppframgången till 64,9±8,8% jämfört med kontrollförhållandena (Figur 3B). Kinematisk analys avslöjar att under optogenetisk stimulering beskrev tassbanan ett oscillerande mönster, vilket visas av en ökning av det tillryggalagda avståndet till 218,4±19,2% av kontrollen, vilket leder till oförmåga att rikta in sig på pelleten och en ökning av initialt fel typ I (Figur 3F). PCA-analys visar att alla prövningars banor under kontralateral D1 SPN-aktivering separerade i ett kluster med nästan ingen överlappning med ett kontrollkluster, vilket indikerar en låg likhet (figur 3J-K).

Å andra sidan leder aktivering av dSPN på ipsilateralsidan till en ökning av bandispersionen som visas av PCA-analys (figur 3K) utan att påverka att nå framgång (120,7±23,6%, n = 4), totalt tillryggalagt avstånd (136,3±35,5%) eller maximal hastighet under räckviddsfasen (117,3±10,3%) (figur 3C), vilket indikerar att ipsilateral D1 SPNs-aktivering i viss utsträckning modifierade den nånde banan utan att ändra beteendeutfallet (figur 3G-I ). Kinematisk analys indikerar subtila förändringar i rörelsekontroll genom ipsilateral manipulation. Slutligen visar kroppshållningsanalys en förskjutning i kroppsvinkeln under kontralateral D1SPNs-aktivering (figur 3L). Det framhävs att även denna enkla uppgift har många komponenter som möjliggör korrekt rörelseutförande för att uppnå ett mål.

Figure 1
Figur 1: Experimentell inställning (A) Scheman för beteendekammaren. En kammare gjord med akrylplåt med följande mått i cm: 18,5 (h) x 8,5 (b) x 20 (d) med ett framfönster 1 (w) x 5 (h) och en liten hylla 8,5 (b) x 4 (d). (B) Fotografi av LED-kanyl (vänster) och trådlös mottagare (höger). (C) Sidovy av en mus med den implanterade LED-kanylen ansluten till mottagaren medan du utför uppgiften att nå grepp (den vita pilspetsen visar mottagaren, asterisken visar tandcementet som håller kanylen och den tomma pilspetsen visar pelleten). (D) Skiss av experimentupplägget. Två höghastighetskameror registrerar räckvidden i två dimensioner, medan en tredje samlade en panoramautsikt över uppgiften, inklusive musens placering från spegeln under kammaren. Djur var fria att välja sin föredragna tass, och stimuleringssidor hänvisar alltid till sidan av den föredragna tassen. (E) Kamerornas exakta position och representativ bild av varje kamera under en testperiod. Denna siffra har anpassats från referens23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kinematisk analys av nåbeteende. (A) Tidslinje för experimentet från dag-0 (d0) till dag-25 (d25). (B) Prestanda under reach-to-grasp-uppgiften över tid mätt som pelletshämtningsnoggrannhet (totalt antal framgångsrika grepp/totalt antal försök x 100). (C) Exempel på banspårning från en höghastighetsvideo. (D) Individuella banor för tassen under träffen och missade försök. (E) Total sträcka som tassen tillryggalagt under träffen och missade försök. (F) Acceleration av tassen genom banan i träffen och missade försök ritade som avstånd kontra. hastighet. (G) Sammanfattning av ändpunktsavstånd i träffar = 3,16 mm, missar 6,08 mm (Mann-Whitney-Wilcoxon-testetmissade vs. träff U = 4184, p<0,0001, n = 28 möss). (H) Skillnader i kroppsvinkel i de två typerna av försök, missar = 8,4±5,3°, träffar 6,7±4° (Mann-Whitney-Wilcoxon test U = 6437, P = 0,0243, n = 28 möss). (I) Scheman över de tre typerna av fel. (J) Proportionerna av de tre typer av fel som mössen gjort under kontrollförhållandena. Denna siffra har anpassats från referens23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Optogenetisk aktivering av kontralaterala och ipsilaterala D1 SPN under nå-till-grepp-beteende. (B) Framgångsgrad jämfört med icke-stimuleringsförsök. C) Förändring av tillryggalagd sträcka jämfört med kontrollförhållanden. (D), (G) Tvådimensionella tomter av vägar gjorda av tassen med och utan optogen stimulering. (E) , (H) Den totala sträcka som tassen tillryggalagt under framdrivningsrörelser. F) , (I) Sammanfattning av fördelningen av de olika typerna av fel. D1 kontralateral: Initialt fel eller typ I (kontroll = 18,2±11,6 %, stimulering = 79,9±8,2 % Fishers exakta test, s<0,0001). (J) Exempel på PCA-analys av banorna under kontrollförhållanden jämfört med kontralateral aktivering av D1SPN. Det skuggade området representerar klustret för varje tillstånd, och stjärnan är klustercentroiden. (K) Sammanfattning av överlappningen mellan kluster av de olika försöksbetingelserna. (L) Förändringar i kroppsvinkeln. Denna siffra har ändrats från referens23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Användningen av optogenetisk manipulation av neuronala populationer i väldefinierade beteendeparadigmer främjar vår kunskap om mekanismerna bakom motorstyrning 7,23. Trådlösa metoder är särskilt lämpliga för uppgifter som kräver tester på flera djur eller fri rörlighet34,35. Men när tekniker och enheter förfinas bör det vara det bästa alternativet för alla beteendeuppgifter i kombination med optogenetik34,36.

Den nuvarande metoden har många fördelar eftersom miniatyriserade lysdioder ger en pålitlig ljuskälla med hög intensitet, och implantat kan användas i studier som kräver stimulering under flera dagar. Ändå kan införande av en optisk fiber för opsinstimulering mekaniskt skada hjärnvävnad, orsaka infektioner och ibland inflammation vid platsen för kanula37. Långvarig högfrekvent optogenetisk stimulering har visat sig producera värme och kan orsaka fototoxitet37. Det är möjligt att minska fototoxiciteten genom att använda rödförskjutna effektor opsiner som aktiveras med rött eller till och med nära infrarött ljus, vilket minskar värmeproduktionen38.

Eftersom stiften för att ansluta mottagaren förblir utanför skallen kan möss ibland orsaka förskjutning eller lossning av kanylen om tandcement inte appliceras korrekt; Detta leder ofta till skador på hjärnvävnad och minskar antalet ämnen som ska beaktas för vidare analys. Den senaste utvecklingen har introducerat fiberlös optogenetik, som använder partiklar som kan avge synligt ljus genom uppkonverteringsluminescens som svar på nära infrarött ljus som tränger djupt in i hjärnvävnaden36. Fiberlösa enheter ger möjlighet att stimulera optogenetiskt över längre tidsramar i fritt uppträdande djur med omärkliga implantat35. Detta möjliggör obegränsad rörelse även i vattenlabyrinter, att ha flera djur inrymda tillsammans (för att undvika effekterna av social isolering) och att studera djur i mer naturalistiska miljöer35,36.

Även med alla fördelar som fiberlös optogenetik erbjuder, står den fortfarande inför biokompatibilitet och värmeproduktionsutmaningar. Effektiviteten av fotonkonvertering begränsar också den. Slutligen krävs ytterligare förbättringar för hög utsläppseffektivitet34,36.

Kombinationen av detta paradigm med höghastighets videografi möjliggör kinematisk analys under olika experimentella förhållanden. Detta ger känslig upptäckt av även subtila effekter över distinkta komponenter i beteende och motorstyrning. I takt med att mer analytiska verktyg utvecklas är det möjligt att ha kinematisk analys online och en djupgående karakterisering av motoriskt beteende i olika sammanhang. En grundlig kvantifiering av musens rörelsekinematik har nyligen publicerats av Becker et al.25.

Möjligheten att selektivt manipulera neuronala populationer i fritt rörliga djur med minimalt invasiva tekniker gör att man kan dissekera bidraget från specifika neuronala typer i exakta beteendeuppgifter23. Reach-to-grasp-uppgiften är ett översättningsbart paradigm för motoriskt beteende13,19. Det är känt att bevarade hjärnstrukturer deltar i de olika faserna av förvärv, lärande och utförande av uppgiften 7,12,23. Att avslöja de neurala kretsarna som ligger till grund för detta beteende kommer att öka förståelsen för motorstyrning. Flera studier belyser vikten av bi-hemisfärisk kontroll över enmanuella uppgifter, särskilt när hög fingerfärdighet behövs 20,21,22. Den kinematiska analysen i kombination med optogenetiska manipuleringar möjliggör undersökning av de olika mekanismerna för detta komplexa beteende. Det kan hjälpa till att analysera bidraget från sensorisk-motorisk återkoppling under normala förhållanden och sjukdomsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga avslöjanden.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av UNAM-PAPIIT-projektet IA203520. Vi tackar IFC:s djuranläggning för deras hjälp med underhåll av muskolonier och beräkningsenheten för IT-support, särskilt till Francisco Perez-Eugenio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaesthesia machine RWD R583S Isoflurane vaporizer
Anesket PiSA Ketamine
Breadboard Thorlabs MB3090/M Solid aluminum optical breadboard
Camera lense Canon 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system BrainVision MiCAM02 Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution PiSA Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber In house
Drill bit #105 Dremel 2 615 010 5AE Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets Bio-Serv F05301
Ethyl Alcohol J.T.  Baker 9000-02 Ethanol
Eyespears Ultracell 40400-8 Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso VetOne V1 502017-250 Isoflurane
Glass capillaries Drumond Scientific 3-000-203-G/X Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide Farmacom Antiseptic
High-speed camera BrainVision MiCAM02-CMOS Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter Teleopto
Insulin syringe
LED cannula Teleopto TelC-c-l-d LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL Eppendorf Z740436
Micro-pipette puller Sutter P-87 Horizontal puller
Microscope LSM780 Zeiss Confocal microscope
Microtome
Mock receiver Teleopto
NanoJect II Drumond Scientific 3-000-204 Micro injector
Oxygen tank Infra na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA Addgene 20297 Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde Sigma P-6148
Phosphate saline buffer Sigma P-4417 Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL ThermoFisher AM12635 0.5-10 uL  volume
Pisabental PiSA Sodium pentobarbital
Plexiglass commercial Acrylic sheet
Povidone iodine Farmacom Antiseptic
Procin PiSA Xylacine
Puralube Perrigo pharma 1228112 Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool Kmoon Mini grinder Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus Stoelting 51730D Digital apparatus
Super-Bond C&B Sun Medical Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line Gensat 036916-UCD Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
TPI Vibratome 1000 plus Peico Microtome
Vectashield mounting media with DAPI Vector laboratories H-1200 Mounting media
Wireless receiver Teleopto TELER-1-P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738 (2018).
  2. Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
  3. MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
  4. Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
  5. Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720 (2019).
  6. Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41 (2018).
  7. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  8. Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
  9. Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
  10. Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. Neural coordination during reach-to-grasp. Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).
  11. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  12. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  13. Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
  14. Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
  15. Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
  16. Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
  17. Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
  18. d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
  19. Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
  20. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742 (2011).
  21. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
  22. Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
  23. Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651 (2021).
  24. Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
  25. Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
  26. Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
  27. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  28. Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
  29. Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  30. Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238 (2014).
  31. Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
  32. Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834 (2017).
  33. Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
  34. Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
  35. Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
  36. Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961 (2016).
  37. Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
  38. Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).

Tags

Neurovetenskap utgåva 177
<em>In vivo</em> Trådlös optogenetisk kontroll av skickligt motoriskt beteende
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O.,… More

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter