Summary
在这里，我们提出了一种方案，用于提高相间荧光 原位 杂交检测对多发性骨髓瘤患者骨髓涂片的成功率。
Abstract
荧光 原位 杂交（FISH）检测是多发性骨髓瘤（MM）遗传风险分层中不可或缺的方法，MM是最常见的血液系统恶性肿瘤之一。MM的识别特征是骨髓中积聚的恶性浆细胞。MM的FISH报告主要关注纯化或鉴定的克隆浆细胞，而不是所有有核细胞，通过用抗CD138磁珠分选或用细胞质免疫球蛋白轻链κ或λ标记。骨髓间期核通常从新鲜的骨髓细胞中获得。然而，浆细胞标本的令人满意的富集需要大量的新鲜肝素抗凝骨髓，这在骨髓提取困难或骨髓干抽取的情况下无法获得。在本文中，我们建立了一种新颖的方法，以提高对染色或未染色的骨髓涂片进行FISH检测的成功率。骨髓涂片比抗凝骨髓标本更容易获得。
Introduction
多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞（PC）疾病，具有很强的生物学异质性和临床疗效的个体差异，生存期从数月到数十年不等。细胞遗传学特征是MM的重要预后指标。基于遗传特征的风险分层系统和个体化治疗已成为MM1临床研究中备受关注的话题。在骨髓（BM） 荧光原位 杂交（FISH）面板中测试的PC的像差包括del 13q14（RB1），del 17p13（TP53），t（4;14）（IGH / FGFR3），t（11;14）（IGH / MYEOV），t（14;16）（IGH / MAF），t（14：20）（IGH / MAFB），1q21（CKS1B）增益/扩增和1p（CDKN2C）缺失。
在 MM 患者的初始评估中应包括标准的中期细胞遗传学。虽然传统的G带核型分析具有全染色体分析的优势，但该方法的低产量导致许多假阴性结果2。传统上，PC被认为在很大程度上无法分裂，因为它们是B淋巴细胞分化的终末期产物。这使得很难获得分割图像。通过长期培养（6 天）改进 MM 的细胞遗传学分析以及通过细胞因子刺激培养物可能是识别新诊断 MM 患者细胞遗传学异常的有希望的方法3。然而，即使将培养时间延长至6天，30%-50%的MM患者也准确报告了细胞遗传学异常4。此外，MM的特征在于复杂的细胞遗传学畸变，反映了其预后异质性。然而，传统染色体条带技术的分辨率较低，这很容易导致MM染色体异常的检测失误。
相间FISH，优选在CD138阳性磁珠基PC分选或用细胞质免疫球蛋白轻链κ/λ标记后，在MM5，6的分析中是必不可少的。强烈建议选择CD138阳性样品以优化肿瘤细胞的产量。然而，细胞遗传学畸变的准确定量需要至少 4 mL 抗凝 BM 进行 PC 分选。此外，CD138免疫磁珠分选与FISH或细胞质κ / λ轻链免疫球蛋白与FISH测试（cIg-FISH）的组合增加了许多实验成本并且非常耗时。
通常，PC比率首先通过染色的BM涂片或BM活检部分的形态学检查来评估7，8。最高质量的BM样本（第一个骨髓抽吸样本）用于形态学测试，而那些送去FISH或其他检测的标本通常是与外周血稀释比例高的二级抽吸物样本。
早在20世纪90年代，多项研究表明，BM涂片可以直接用于间质FISH检查，这已被证明是一种可靠且可重复的方法9。一项基于细胞形态学和酯酶细胞化学结合外周血FISH和BM涂片的优雅研究证实了其对阐明粒细胞和淋巴细胞白血病患者染色体异常的巨大临床意义10。
本文为提高MM患者相间FISH检测的成功率提供了一种新颖的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究根据《赫尔辛基宣言》的原则进行，并经武汉大学中南医院伦理委员会批准（第2019065号）。标本采集自武汉大学中南医院血液科的一名MM患者。
1. BM涂片的准备
- 将第一个0.2 mL BM溶液放在干净的一次性载玻片上。
- 通过快速去除BM，用锋利的尾巴将BM涂抹到均匀的厚度。然后，自然干燥。
- 在室温下用1 mL Wright-Giemsa溶液覆盖BM薄膜约10秒。
- 向载玻片中加入1mL磷酸盐缓冲液。
注意：注意防止染料溶液干燥或从载玻片上流出。 - 轻轻混合染料溶液，并在室温下保持15分钟。
- 用清水冲洗载玻片，并在室温下在空气中干燥。
- 使用正向光显微镜检测恶性 PC。电脑应分散良好。
2. 鱼类污染的鱼学预处理
- 用固定溶液覆盖杂交区域10分钟，使PC变色并固定。
- 为了制备新鲜的固定溶液，将甲醇与冰醋酸以3：1的体积比混合。
- 用去离子水（dH 2O）冲洗载玻片，并在室温下在空气中干燥。
- 在水浴中将含有2x SSC缓冲液的罐子预热至56°C。使用前将缓冲液新鲜稀释至20x SSC。
- 要制备20x SSC，将176g氯化钠和88g柠檬酸钠与800mLdH2O充分混合 ±。然后，加入dH2O，使最终体积达到1升。
- 将制备的BM涂抹液在预热的2x SSC缓冲液中洗涤10分钟，然后在室温下将其浸入去离子水中。
- 在乙醇梯度（70%，85%和100%乙醇，每个1分钟）中脱水涂片。将涂抹液风干 10 分钟。
3. BM污点鱼和洗涤
注：所有步骤均在暗室中进行，以防止荧光淬灭。
- 将17号染色体（CEP17）探针混合物的 TP53 /着丝粒添加到杂交区域，并用盖玻片覆盖。用细尖镊子轻轻按压，以清除下面的气泡。
- 用橡胶水泥密封盖玻片的所有侧面，以确保良好的密封性。
- 橡胶水泥凝固后，将滑块放在自动FISH机器上。在78°C下变性5分钟，然后在37°C下杂交过夜。
- 从鱼机上拿起幻灯片。使用细尖镊子轻轻去除橡胶水泥。
- 将载玻片在室温下浸入2x SSC中约1或2分钟，以洗掉盖玻片。
- 在68°C预热的0.4x SSC / 0.3%NP-40缓冲液中洗涤载玻片在水浴中2分钟。
- 通过将20 mL 20x SSC（pH 5.3）与950 mL dH 2O彻底混合，制备0.4x SSC / 0.3%NP-40溶液。然后，加入3毫升NP-40并充分混合直至完全溶解。测量pH值，并用NaOH调节至7.0-7.5。然后，加入dH2O，使整个溶液的最终体积达到1 L。
- 用2x SSC在37°C水浴中洗涤载玻片1分钟。在黑暗中直立，彻底干燥10分钟。
- 向杂交区域加入10μLDAPI并用盖玻片覆盖。
4. 鱼类分析和成像
- 使用荧光显微镜上的合适滤光片查看杂交载玻片。
- 使用单色蓝色荧光团滤光片观察细胞核的荧光强度。在DAPI过滤器集下拍摄细胞核图像。
- 使用染色体着丝粒探针显示细胞包含多少条染色体。用绿色荧光标记CEP17。使用光谱绿色荧光团滤光片观察CEP17的位置。在绿色滤光片组下拍摄CEP17信号图像。
- 用橙色荧光标记 TP53 基因。使用光谱橙色荧光团滤光片观察 TP53。在此集合下拍摄 TP53 信号图像。
- 合并这三个图像并检查它们是否存在数值异常。
注意：在正常的相间细胞中，在具有蓝色荧光的细胞核内观察到两个橙色和两个绿色信号，表明一对正常的17号染色体（图1）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在新诊断的MM患者的初始形态学评估中，发现BM涂片中15%的PC具有比正常PC更大，更暗的细胞核以及更多的细胞质（图2A）。通过免疫表型技术检测到的第一管肝素抗凝BM仅显示2.3%的单克隆异常PC.CD138免疫磁珠与FISH或cIg-FISH技术联合分选对于获得准确的FISH结果至关重要。但是，如果吸气BM是干式水龙头，则吸气BM是有限的。使用BM涂片来测试相间FISH。通过荧光显微镜载物台游标卡尺定位BM胶片中具有代表性的双核PC（图2B）。将FISH应用于BM涂片以测试TP53 和CEP17。FISH结果显示，一个相间PC核中有4个橙色和4个绿色信号（图2C），表明17号染色体的4个拷贝定位于中期PC核中。通过将培养时间延长至3天并获得核型分析结果，并使用FISH分析软件进行进一步分析（图2D）。进一步验证了相间FISH结果对BM涂片的准确性。
图 1：用于相间细胞的 TP53/CEP17 FISH 探针的正常信号 （1000x）。 细胞核的荧光强度为蓝色， TP53 为橙色，CEP17为绿色。在这3个正常的相间细胞中，蓝色荧光核内出现两个橙色和两个绿色信号，表明正常17号染色体的两对。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓（BM）的形态学和遗传图像。 （A）骨髓瘤细胞，在BM涂片（
1000×）的Wright-Giemsa染色后，箭头（）指示簇状分布。（B）在荧光显微镜（1000×）上由黑白相机拍摄的灰度图像上用箭头（
）表示的双核浆细胞样细胞。（C）TP53/17号染色体着丝粒（CEP17）荧光原位杂交（FISH）探针试验BM涂片。FISH在每个原子核（→）（1000×）中显示四个TP53和四个CEP17信号。（D）异常染色体核电图显示一个细胞核中有两对17号染色体（
）。请点击此处查看此图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FISH在MM的遗传风险分层中的应用至关重要。FISH报告的关键部分不是所有有核细胞，而是通过用抗CD138磁珠分选或用细胞质免疫球蛋白轻链κ或λ标记特异性纯化或鉴定的克隆PC。PC分选或cIg-FISH后的相间FISH在MM的诊断中具有显着意义，因为BM中PC的比例相对较低。然而，这些方法存在一些缺点，包括工艺复杂，样品要求高，实验成本高。50台PC可以通过显微镜级游标卡尺快速定位。BM 涂片比抗凝剂 BM 标本容易获得，因为获得抗凝 BM 需要复杂的程序来获得细胞核。因此，我们建立了一种令人信服的BM涂片FISH方法，用于检测MM细胞。
首先，BM涂片应由经验丰富的形态学分析师进行。为了将BM扩散成涂片，将吊具以30°-45°的角度放置在吸出物的前面，然后向后拉以与液体接触11。然后，吊具以稳定的运动均匀地向前移动。必须定制BM涂片的密度，使长度约为载玻片的四分之三12。BM薄膜必须比载玻片窄，以确保可以检测到所有边缘的细胞13。杂交区域的选择和PC的定位在我们的协议中至关重要，这需要经验丰富的形态学分析师。对于包含较少PC的BM涂片，应使用前向荧光显微镜油浸物镜和物镜台上游标卡尺进行定位，并且可以通过单色拍摄其图像。例如，如果通过形态学检查，PC仅占BM膜中总有核细胞的3%，则8 mm x 8 mm的分散良好的杂交区域应包含不少于50台PC以进行FISH测试。FISH 杂交后，经验丰富的分析师必须对至少 50 台 PC 中的荧光信号进行计数14。
然而，这种技术的局限性是需要新鲜的BM涂片。如果BM涂片存储超过2年，则生成的FISH图像可能会模糊不清，从而导致误解。
综上所述，上述BM涂片FISH可广泛用于BM提取困难或BM干龙头发生时血液系统恶性肿瘤患者，即使在有核细胞较少的低增殖性疾病中也是如此。我们希望更多的血液系统恶性肿瘤患者可以从这种方法中受益。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由WNLO 2018WNLOKF023创新基金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
