Summary
Здесь мы представляем протокол для улучшения успеха обнаружения интерфазной флуоресцентной гибридизации in situ на мазках костного мозга у пациентов с множественной миеломой.
Abstract
Обнаружение флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) является незаменимым методом стратификации генетического риска при множественной миеломе (ММ), которая является одной из наиболее распространенных гематологических злокачественных новообразований. Идентифицирующей характеристикой ММ является накопление злокачественных плазматических клеток в костном мозге. Отчеты FISH для ММ в основном сосредоточены на очищенных или идентифицированных клональных плазматических клетках, а не на всех ядерных клетках, путем сортировки с помощью магнитных шариков против CD138 или маркировки цитоплазматической иммуноглобулиновой легкой цепью κ или λ. Межфазные ядра костного мозга обычно получают из свежих клеток костного мозга. Однако удовлетворительное обогащение образцов плазматических клеток требует большого количества свежего гепарина, антикоагулянтированного костного мозга, которое не может быть получено в случае затрудненного извлечения костного мозга или сухого крана костного мозга. Здесь мы устанавливаем новый метод для улучшения успеха обнаружения FISH на окрашенных или неокрашенных мазках костного мозга. Мазки костного мозга получить легче, чем антикоагулянтные образцы костного мозга.
Introduction
Множественная миелома (ММ) является злокачественным заболеванием плазматических клеток (ПК) с сильной биологической гетерогенностью и большими индивидуальными различиями в клинической эффективности, с периодами выживания от месяцев до десятилетий. Цитогенетические характеристики являются важными прогностическими показателями ММ. Система стратификации риска и индивидуализированные методы лечения, основанные на генетических характеристиках, стали темами, представляющими большой интерес в клинических исследованиях MM1. Аберрации ПК, протестированных в флуоресцентной панели гибридизации in situ (FISH) костного мозга (BM), включают del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), усиление/усиление 1q21 (CKS1B) и удаление 1p (CDKN2C).
Стандартная метафазная цитогенетика должна быть включена в первоначальную оценку пациентов с ММ. Хотя обычное G-полосное кариотипирование предлагает преимущество анализа всей хромосомы, низкий выход этого метода приводит ко многим ложноотрицательным результатам2. Традиционно ПК рассматривались как в значительной степени неспособные к расщеплению, потому что они являются конечными продуктами дифференцировки В-лимфоцитов. Это затрудняет получение разделенных изображений. Улучшенный цитогенетический анализ при ММ с долгосрочными культурами (6 дней) и стимуляция культур цитокинами могут быть перспективным методом выявления цитогенетических аномалий у вновь диагностированных пациентов с ММ3. Однако даже когда время культивирования было продлено до 6 дней, цитогенетические аномалии были точно зарегистрированы у 30%-50% пациентов с ММ4. Кроме того, ММ характеризуется сложными цитогенетическими аберрациями, которые отражают его прогностическую гетерогенность. Однако разрешение традиционной технологии полосирования хромосом низкое, что может легко привести к пропущенному обнаружению хромосомных аномалий в ММ.
Интерфазная FISH, предпочтительно после CD138-положительной магнитной шариковой сортировки ПК или маркировки цитоплазматического иммуноглобулина с легкой цепью κ/λ, незаменима при анализе MM5,6. CD138-положительный выбранный образец настоятельно рекомендуется для оптимизированного выхода опухолевых клеток. Однако для точного количественного определения цитогенетических аберраций требуется не менее 4 мл антикоагулянтного БМ для сортировки ПК. Кроме того, комбинации иммуномагнитной сортировки ШАРИКОВ CD138 с FISH или цитоплазматического иммуноглобулина с легкой цепью κ/λ с тестированием FISH (cIg-FISH) увеличивают многочисленные экспериментальные затраты и отнимают много времени.
Обычно соотношение ПК сначала оценивают по морфологическому исследованию окрашенных мазков БМ или участков биопсии БМ7,8. Образцы БМ самого высокого качества (образцы аспирата первого костного мозга) используются для морфологического тестирования, тогда как образцы, отправленные для FISH или другого обнаружения, часто являются вторичными образцами аспирата с высоким соотношением разбавления периферической кровью.
Еще в 1990-х годах многочисленные исследования показали, что мазки БМ могут быть непосредственно использованы для интерстициальных исследований FISH, что оказалось надежным и воспроизводимым методом9. Элегантное исследование, основанное на морфологии клеток и цитохимии эстеразы в сочетании с FISH периферической крови и мазками БМ, подтвердило его большое клиническое значение для выяснения хромосомных аномалий у пациентов с гранулоцитарным и лимфоцитарным лейкозом10.
Здесь мы предлагаем новый метод для улучшения успеха межфазного обнаружения FISH у пациентов с ММ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по этике больницы Чжуннань Уханьского университета (No 2019065). Образцы были собраны у пациента ММ в отделении гематологии больницы Чжуннань Уханьского университета (Китай).
1. Подготовка мазков БМ
- Поместите первые 0,2 мл раствора BM на чистую одноразовую стеклянную горку.
- Распределите мазки БМ до равномерной толщины острыми хвостами, быстро удалив БМ. Затем высушите естественным путем.
- Покрыть пленки BM 1 мл раствора Райта-Гимса в течение примерно 10 с при комнатной температуре.
- Добавьте 1 мл фосфатного буфера на слайды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы раствор красителя не высох или не стекал с горок. - Аккуратно перемешайте раствор красителя и выдерживайте его в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Промойте горки чистой водой и высушите их на воздухе при комнатной температуре.
- Используйте прямую световую микроскопию для обнаружения злокачественных ПК. Пк должны быть хорошо рассредоточены.
2. Рыбная предварительная обработка мазков БМ
- Накройте гибридизированную область фиксирующим раствором на 10 мин, чтобы обесцвечивать и фиксировать ПК.
- Для приготовления свежего фиксирующего раствора смешайте метанол с ледниковой уксусной кислотой в объемном соотношении 3:1.
- Промойте горку деионизированной водой (dH2O) и высушите ее на воздухе при комнатной температуре.
- Разогрейте банку, содержащую 2x буфера SSC, до 56 °C на водяной бане. Перед использованием разбавьте буфер до 20x SSC.
- Чтобы приготовить 20x SSC, тщательно смешайте 176 г хлорида натрия и 88 г цитрата натрия с 800 мл dH2O. Измерьте рН и отрегулируйте рН 5,3 ± 0,2. Затем добавьте dH2O, чтобы довести конечный объем до 1 л.
- Вымойте приготовленный мазок BM в предварительно нагретом 2x SSC буфере в течение 10 мин, после чего окуните его в деионизированную воду комнатной температуры.
- Обезвоживать мазок в градиенте этанола (70%, 85% и 100% этанол, каждый в течение 1 мин). Высушите мазок на воздухе в течение 10 мин.
3. БМ мазок FISH и промывка
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги были выполнены в темной комнате, чтобы предотвратить закалку флуоресценции.
- Добавьте пробную смесь TP53/центромера хромосомы 17 (CEP17) в область гибридизации и накройте ее покровным листом. Осторожно надавите тонкоконечным пинцетом, чтобы удалить пузырьки воздуха снизу.
- Запечатайте все стороны крышки резиновым цементом, чтобы обеспечить хорошую герметичность.
- После затвердевания резинового цемента поместите затвор на автоматическую машину FISH. Выполняют денатурацию при 78 °C в течение 5 мин с последующей гибридизацией при 37 °C в течение ночи.
- Поднимите слайд с машины FISH. Используйте тонкоконечный пинцет, чтобы аккуратно удалить резиновый цемент.
- Погрузите слайд в 2x SSC при комнатной температуре примерно на 1 или 2 минуты, чтобы смыть крышку.
- Промывайте горку в 68 °C предварительно нагретом 0,4x SSC/0,3% NP-40 буфере на водяной бане в течение 2 мин.
- Приготовьте 0,4x SSC/0,3% раствор NP-40, тщательно перемешав 20 мл 20x SSC (pH 5,3) с 950 мл dH2O. Затем добавить 3 мл NP-40 и тщательно перемешать до полного растворения. Измерьте pH и отрегулируйте до 7,0-7,5 с NaOH. Затем добавляют dH2O, чтобы довести конечный объем общего раствора до 1 л.
- Мойте горки с 2x SSC на водяной бане 37 °C в течение 1 мин. Установите вертикально в темноте, чтобы тщательно высохнуть в течение 10 минут.
- Добавьте 10 мкл DAPI в гибридизированную область и накройте крышкой.
4. Анализ и визуализация FISH
- Просмотрите гибридный слайд с помощью подходящего фильтра, установленного на флуоресцентном микроскопе.
- Используйте монохроматический синий флуорофорный оптический фильтр для наблюдения за интенсивностью флуоресценции ядра клетки. Делайте снимки клеточного ядра под набором фильтров DAPI.
- Используйте зонд хромосомной центромеры, чтобы показать, сколько хромосом содержит клетка. Этикетка CEP17 с зеленой флуоресценцией. Используйте спектральный зеленый флуорофорный оптический фильтр для наблюдения за местоположением CEP17. Возьмите изображение сигналов CEP17 под зеленым фильтром.
- Пометьте ген TP53 оранжевой флуоресценцией. Используйте спектр оранжевого флуорофорного оптического фильтра для наблюдения за TP53. Возьмите изображение сигналов TP53 под этим набором.
- Объедините эти три изображения и изучите их на наличие числовых аномалий.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нормальной межфазной клетке внутри ядра наблюдаются два оранжевых и два зеленых сигнала с синей флуоресценцией, что указывает на одну пару нормальной хромосомы 17 (рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В первоначальной морфологической оценке недавно диагностированного пациента с ММ было обнаружено, что 15% ПК в мазке BM имеют более крупные и темные ядра наряду с большим количеством цитоплазмы, чем нормальные ПК (рисунок 2A). Первая трубка гепарина антикоагулянтированного БМ, обнаруженная методом иммунофенотипа, выявила только 2,3% моноклональных аберрантных ПК. Иммуномагнитная сортировка ШАРИКОВ CD138 в сочетании с FISH или методом cIg-FISH необходима для получения точного результата FISH. Тем не менее, атмосферный БМ ограничен в случае, если он является сухим краном. Мазки BM использовались для тестирования интерфазных FISH. Репрезентативный бинуклеированный ПК в пленке БМ локализовали с помощью люминесцентного микроскопа ступени суппорта Вернье (рисунок 2В). FISH был нанесен на мазки BM для тестирования на TP53 и CEP17. Результаты FISH показали четыре оранжевых и четыре зеленых сигнала в одном межфазном ядре ПК (рисунок 2C), предполагая, что четыре копии хромосомы 17 были локализованы в метафазных ядрах PC. Результаты кариотипирования были получены путем продления времени культивирования до 3 дней и дальнейшего анализа с использованием аналитического программного обеспечения FISH (рисунок 2D). Точность межфазных результатов FISH на мазках БМ была дополнительно проверена.
Рисунок 1: Нормальные сигналы зонда TP53/CEP17 FISH для межфазных ячеек (1000x). Интенсивность флуоресценции ядра клетки была синей, TP53 оранжевой, а CEP17 зеленой. В этих 3 нормальных интерфазных клетках внутри синего флуоресцентного ядра появились как два оранжевых, так и два зеленых сигнала, указывающих на две пары нормальной хромосомы 17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфология и генетические изображения костного мозга (БМ) у пациентов с множественной миеломой (ММ). (A) Клетки миеломы с кластеризованным распределением, обозначенным стрелками (
) после окрашивания мазка BM Райта-Гимса (1000×). (B) Бинуклеатные плазмоцитоидные клетки, обозначенные стрелками (
) на изображении в оттенках серого, сделанном черно-белой камерой на флуоресцентном микроскопе (1000×). (C) TP53/ центромера хромосомы 17 (CEP17) флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) зондовый тест для мазка BM. FISH обнаруживает четыре сигнала TP53 и четыре сигнала CEP17 в каждом ядре (→) (1000×). (D) Аномальная хромосомная кариограмма показывает две пары хромосомы 17 в одном ядре (
). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Применение FISH к стратификации генетического риска в ММ имеет важное значение. Критической частью отчетов FISH являются не все ядерные клетки, а клональные ПК, специально очищенные или идентифицированные путем сортировки магнитных шариков против CD138 или маркировки цитоплазматической иммуноглобулиновой легкой цепью κ или λ. Было обнаружено, что межфазная FISH после сортировки ПК или cIg-FISH имеет важное значение в диагностике ММ из-за относительно более низкой доли ПК в БМ. Однако эти методы имеют некоторые недостатки, в том числе сложные процессы, высокие требования к образцам и высокие экспериментальные затраты. Пятьдесят ПК могут быть быстро найдены с помощью суппорта Вернье на ступени микроскопа. Мазки БМ гораздо легче получить, чем образцы антикоагулянта БМ, потому что получение антикоагулянтного БМ требует сложных процедур для получения ядра. Соответственно, мы установили убедительный метод для БМ мазка FISH для обнаружения ММ клеток.
Во-первых, мазки БМ должны быть сделаны опытным морфологическим аналитиком. Чтобы распределить БМ на мазки, разбрасыватель помещают перед аспиратом под углом 30°-45° и оттягивают назад для контакта с жидкостью11. Затем распределитель перемещается вперед равномерно в устойчивом движении. Плотность мазка БМ должна быть скроена таким образом, чтобы длина составляла примерно три четверти слайда12. Пленка BM должна быть уже, чем слайд, чтобы гарантировать, что ячейки на всех краях могут быть обнаружены13. Выбор области гибридизации и локализация ПК имели решающее значение в нашем протоколе, а для этого требуется опытный морфологический аналитик. Для мазков BM, содержащих меньше ПК, ПК должны быть локализованы с помощью переднего флуоресцентного микроскопа масляного погружного объектива и суппортов Вернье на объективной сцене, и их изображения могут быть сделаны монохромными снимками. Например, если пк составляли только 3% от общего количества ядерных клеток в пленке БМ путем морфологического исследования, то хорошо дисперсная гибридная область размером 8 мм х 8 мм должна содержать не менее 50 ПК для теста FISH. После гибридизации FISH флуоресцентные сигналы не менее чем в 50 ПК должны быть подсчитаны опытным аналитиком14.
Однако ограничением этой методики является потребность в свежих мазках БМ. Если мазки BM хранятся более 2 лет, полученные изображения FISH могут быть неясными, что приводит к неправильной интерпретации.
Взятый вместе, вышеупомянутый мазок BM FISH может широко использоваться для пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями, когда экстракция БМ затруднена или происходит сухой кран БМ, даже при гипопролиферативных заболеваниях с меньшим количеством ядерных клеток. Мы надеемся, что больше пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями могут извлечь выгоду из этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Данный проект был поддержан Инновационным фондом WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
