Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbättra framgången för interphase fluorescence in situ hybridisering upptäckt på benmärg utstryk från flera myelom patienter.
Abstract
Fluorescens in situ hybridization (FISH) detektion är en oumbärlig metod i genetisk risk stratifiering i multipelt myelom (MM), som är en av de vanligaste hematologiska maligniteter. Den identifierande egenskapen hos MM är ackumulerade maligna plasmaceller i benmärgen. FISH rapporter för MM fokuserar främst på renade eller identifierade klonurvalet plasmaceller, snarare än alla nukleära celler, genom sortering med anti-CD138 magnetiska pärlor eller märkning med cytoplasmic immunoglobulin ljuskedje κ eller λ. Benmärg interphase atomkärnor erhålls vanligtvis från färska benmärg celler. Tillfredsställande anrikning av plasmacellsprover kräver dock stora mängder färsk heparin antikoagulerad benmärg, som inte kan erhållas vid svår benmärgsextraktion eller en benmärgstorr kran. Häri etablerar vi en ny metod för att förbättra framgången för FISH upptäckt på färgade eller unstained benmärg utstryk. Benmärgsfläckar är lättare att få tag på än antikoagulanerade benmärgsprover.
Introduction
Multipelt myelom (MM) är en elakartad plasmacellssjukdom (PC) med stark biologisk heterogenitet och stora individuella skillnader i klinisk effekt, med överlevnadsperioder som sträcker sig från månader till årtionden. Cytogenetiska egenskaper är viktiga prognostiska indikatorer på MM. Riskstratifieringssystemet och individualiserade behandlingar baserade på genetiska egenskaper har blivit föremål av stort intresse för klinisk forskning om MM1. Avvikelserna hos datorer som testats i en fluorescens in situ-hybridiseringspanel (FISH) av benmärg (BM) inkluderar del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14 och 1p (CDKN2C) borttagning.
Standardmetafascytogenetik bör inkluderas i den första bedömningen av MM- patienter. Även om konventionella G-banded karyotyping erbjuder fördelen med en helkromosomanalys, leder det låga utbytet av denna metod till många falska negativa resultat2. Traditionellt har datorer betraktats som i stort sett oförmögna att dela eftersom de är slutfasen produkter av B lymfocyt differentiering. Detta gör det svårt att få delade bilder. Förbättrad cytogenetiska analys i MM med långsiktiga kulturer (6 dagar) och stimulering av kulturer av cytokiner kan vara en lovande metod för att identifiera cytogenetiska avvikelser hos nydiagnostiserade MM patienter3. Även när kulturtiden förlängdes till 6 dagar rapporterades dock cytogenetiska avvikelser korrekt i 30%-50% av MM patienter4. Dessutom kännetecknas MM av komplexa cytogenetiska avvikelser som återspeglar dess prognostiska heterogenitet. Upplösningen av traditionella kromosom ränder teknik är dock låg, vilket lätt kan leda till missad upptäckt av kromosomal avvikelser i MM.
Interfasfisk, helst efter CD138-positiv magnetisk pärlbaserad PC-sortering eller märkning med cytoplasmisk immunglobulin ljuskedja κ/λ, är oumbärlig vid analysen av MM5,6. Ett CD138-positivt valt prov rekommenderas starkt för optimerat utbyte av tumörceller. Korrekt mängd cytogenetiska avvikelser kräver dock minst 4 ml antikoagulerad BM för PC-sortering. Dessutom ökar kombinationerna av antingen CD138 immunomagnetisk pärlsortering med FISH eller cytoplasmic κ/λ ljuskedjeimglobulin med FISH-testning (cIg-FISH) många experimentella kostnader och är tidskrävande.
Vanligtvis bedöms PC-förhållandet först från morfologisk undersökning av färgade BM fläckar eller BM biopsi avsnitt7,8. BM-prover av högsta kvalitet (första märgaspiratprover) används för morfologiska tester, medan de som skickas för FISH eller annan detektion ofta är sekundära aspirationsprover med höga utspädningsförhållanden med perifert blod.
Redan på 1990-talet visade flera studier att BM-utstryk kan användas direkt för interstitiella FISH-undersökningar, vilket har visat sig vara en tillförlitlig och repeterbar metod9. En elegant studie baserad på cell morfologi och esterase cytochemistry i kombination med FISK av perifert blod och BM utstryk bekräftade dess stora kliniska betydelse för att klargöra kromosomal avvikelser hos patienter med granulocytic och lymfatisk leukemi10.
Häri tillhandahåller vi en ny metod för att förbättra framgången för interphase FISH upptäckt i MM patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av etikkommittén vid Zhongnan Hospital of Wuhan University (nr 2019065). Exemplaren samlades in från en MM-patient vid institutionen för hematologi, Zhongnan Hospital of Wuhan University (Kina).
1. Förberedelse av BM-fläckarna
- Placera den första 0,2 ml BM-lösningen på en ren engångsglasrutschbana.
- Sprid BM-fläckarna till jämn tjocklek med skarpa svansar genom att snabbt ta bort BM. Torka sedan naturligt.
- Täck BM-filmerna med 1 ml Wright-Giemsa-lösning i cirka 10 s vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 ml fosfatbuffert till diabilderna.
OBS: Var noga med att förhindra att färglösningen torkar eller rinner av rutschkanorna. - Blanda färglösningen försiktigt och behåll den i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj rutschkanorna med rent vatten och torka dem i luft vid rumstemperatur.
- Använd framåtriktad ljusmikroskopi för att upptäcka maligna datorer. Datorerna bör vara väl spridda.
2. FISKförbehandling av BM-utstryk
- Täck det hybridiserade området med fixativ lösning i 10 minuter för att missfärga och fixa datorerna.
- För att förbereda färsk fixativ lösning, blanda metanol med glaciär ättiksyra i ett volymförhållande på 3:1.
- Skölj bilden med avjoniserat vatten (dH2O) och torka den i luft vid rumstemperatur.
- Förvärm en burk som innehåller 2x SSC-buffert till 56 °C i ett vattenbad. Späd bufferten till 20x SSC före användning.
- För att bereda 20x SSC, blanda noggrant 176 g natriumklorid och 88 g natriumcitrat med 800 ml dH2O. Mät pH-värdet och justera till pH 5,3 ± 0,2. Lägg sedan till dH2O för att få den slutliga volymen till 1 L.
- Tvätta det beredda BM-utstryket i den förvärmda 2x SSC-bufferten i 10 minuter, följt av att doppa det i avjoniserat vatten vid rumstemperatur.
- Dehydrera utstryket i en etanolgradient (70%, 85% och 100% etanol, vardera i 1 min). Lufttorka utstryket i 10 minuter.
3. BM smutsa FISK och tvätt
OBS: Alla steg utfördes i ett mörkt rum för att förhindra fluorescenssläckning.
- Tillsätt TP53/centromer av kromosom 17 (CEP17) sondblandning till hybridiseringsområdet och täck den med ett täckslip. Tryck försiktigt med finspetsiga pincett för att ta bort luftbubblor underifrån.
- Försegla alla sidor av täckslipet med gummicement för att säkerställa god täthet.
- Efter stelning av gummicementet placerar du bilden på en automatisk FISH-maskin. Utför denaturation vid 78 °C i 5 min, följt av hybridisering vid 37 °C över natten.
- Plocka upp bilden från FISH-maskinen. Använd finspetsiga pincett för att försiktigt ta bort gummicementet.
- Sänk ned rutschkanan i 2x SSC i rumstemperatur i cirka 1 eller 2 minuter för att tvätta av täckdraget.
- Tvätta rutschkanan i 68 °C förvärmd 0,4x SSC/0,3% NP-40 buffert i ett vattenbad i 2 min.
- Förbered 0,4x SSC/0,3% NP-40-lösning genom att noggrant blanda 20 ml 20x SSC (pH 5,3) med 950 ml dH2O. Tillsätt sedan 3 ml NP-40 och blanda noggrant tills det är helt upplöst. Mät pH-värdet och justera till 7,0-7,5 med NaOH. Lägg sedan till dH2O för att få den slutliga volymen av den totala lösningen till 1 L.
- Tvätta rutschkanorna med 2x SSC i ett 37 °C vattenbad i 1 min. Ställ upprätt i mörkret för att torka ordentligt i 10 min.
- Tillsätt 10 μL DAPI till det hybridiserade området och täck med ett täckskydd.
4. FISKANALYS och avbildning
- Visa den hybridiserade bilden med ett lämpligt filter som är inställt på ett fluorescensmikroskop.
- Använd ett monokromatiskt blått fluoroforoptiskt filter för att observera cellkärnans fluorescensintensitet. Ta cellkärnbilder under en DAPI-filteruppsättning.
- Använd en kromosomcentromersond för att visa hur många kromosomer en cell innehåller. Etikett CEP17 med grön fluorescens. Använd ett spektrumgrönt fluoroforoptiskt filter för att observera platsen för CEP17. Ta en CEP17-signalbild under den gröna filteruppsättningen.
- Märk TP53-genen med orange fluorescens. Använd ett spektrum orange fluoroforoptiskt filter för att observera TP53. Ta en TP53-signalbild under den här uppsättningen.
- Sammanfoga dessa tre bilder och undersöka dem för numeriska avvikelser.
OBS: I en normal interfascell observeras två orange och två gröna signaler inuti en kärna med blå fluorescens, vilket indikerar ett par normal kromosom 17 (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den första morfologiska bedömningen av en nydiagnostiserad MM patient, 15% av datorer i en BM utstryk konstaterades ha större och mörkare kärnor tillsammans med större mängder cytoplasma än normala datorer (figur 2A). Det första röret av heparin antikoagulerad BM upptäckt av immunophenotype tekniken visade endast 2,3% av monoklonal aberrant datorer. CD138 immunomagnetic pärla sortering i kombination med FISH eller cIg-FISH tekniken är avgörande för att erhålla en korrekt FISH resultat. Aspirerad BM är dock begränsad i händelse av att det är en torr kran. BM utstryk användes för att testa interphase FISH. En representativ binucleated PC i BM film lokaliserades av en fluorescens mikroskop steg Vernier caliper (figur 2B). FISH applicerades på BM-utstryken för att testa för TP53 och CEP17. FISH resultaten visade fyra orange och fyra gröna signaler i en interphase PC kärnan (figur 2C), vilket tyder på att fyra kopior av kromosom 17 var lokaliserade i metafas PC atomkärnor. Karyotyping resultat erhölls genom att förlänga kulturtiden upp till 3 dagar och analyseras ytterligare med hjälp av FISH analytisk programvara (figur 2D). Noggrannheten i de interfasiga FISH-resultaten på BM-utstryken kontrollerades ytterligare.
Bild 1: Normala signaler från TP53/CEP17 FISH-sonden för interfasceller (1000x). Fluorescensintensiteten i cellkärnan var blå, TP53 var orange och CEP17 var grön. I dessa 3 normala interphase celler uppträdde både två orange och två gröna signaler inuti den blå-fluorescing kärnan, vilket indikerar två par av den normala kromosom 17. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Morfologi och genetiska bilder av benmärg (BM) hos patienter med multipelt myelom (MM). A) Myelomceller med klustrad fördelning som anges av pilarna (
) efter Wright-Giemsa färgning av BM-utstryket (1000×). B) Binukleate plasmacytoidceller som indikeras av pilar (
) på en gråskala bild tagen av en svartvit kamera på ett fluorescensmikroskop (1000×). (C) TP53/ centromer av kromosom 17 (CEP17) fluorescens in situ hybridisering (FISH) sondtest för BM-utstryk. FISH avslöjar fyra TP53 och fyra CEP17 signaler i varje kärna (→) (1000×). (D) Onormal kromosomkaryogram visar två par kromosom 17 i en kärna (
). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillämpningen av FISH på genetisk riskstratifiering i MM är avgörande. Den kritiska delen av FISH rapporter är inte alla nukleära celler, men kloniska datorer specifikt renas eller identifieras genom sortering med anti-CD138 magnetiska pärlor eller märkning med cytoplasmic immunoglobulin ljuskedje κ eller λ. Interphase FISH efter PC sortering eller cIg-FISH befanns vara betydande i diagnos av MM på grund av att den relativt lägre andelen datorer i BM. Dessa metoder har dock vissa brister, inklusive komplexa processer, höga provkrav och höga experimentella kostnader. Femtio datorer kan snabbt lokaliseras med ett vernierkaliber i mikroskopstadiet. BM fläckar är mycket lättare att få än antikoagulantia BM prover eftersom att erhålla antikoagulerad BM kräver komplexa förfaranden för att få kärnan. Följaktligen etablerade vi en övertygande metod för BM utstryk FISH för detektion av MM celler.
För det första bör BM-utstryk göras av en erfaren morfologisk analytiker. För att sprida BM i fläckar placeras spridaren framför aspiraten i en vinkel på 30 °-45° och dras tillbaka för att komma i kontakt med vätskan11. Sedan flyttas spridaren framåt jämnt i en stadig rörelse. BM-utstrykets densitet måste skräddarsys så att längden är ungefär tre fjärdedelar av bilden12. BM-filmen måste vara smalare än bilden för att garantera att celler på alla kanter kan detekteras13. Valet av hybridiseringsområdet och lokaliseringen av datorer var avgörande i vårt protokoll, och detta kräver en erfaren morfologisk analytiker. För BM-utstryk som innehåller färre datorer bör datorerna lokaliseras med hjälp av ett framåtfluorescensmikroskop oljesänkningsmål och Vernier-bromsok på objektivstadiet, och deras bilder kan tas av monokroma bilder. Om datorerna till exempel endast stod för 3 % av de totala nukleära cellerna i en BM-film genom morfologisk undersökning, bör en väl spridd hybridregion på 8 mm x 8 mm innehålla inte mindre än 50 datorer för ett FISH-test. Efter FISH-hybridisering måste fluorescenssignaler i minst 50 datorer räknas av en erfaren analytiker14.
En begränsning av denna teknik är dock kravet på färska BM-fläckar. Om BM-fläckarna lagras i över 2 år kan de resulterande FISH-bilderna vara dunkla, vilket resulterar i feltolkning.
Sammantaget kan ovannämnda BM utstryk FISK användas i stor utsträckning för patienter med hematologiska maligniteter när BM extraktion är svårt eller BM torr kran uppstår, även i hypo-proliferative sjukdomar med färre nukleära celler. Vi hoppas att fler patienter med hematologiska maligniteter kan dra nytta av denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av WNLO:s innovationsfond 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
