Summary
Aquí, presentamos un protocolo para mejorar el éxito de la detección de hibridación de fluorescencia in situ interfásica en frotis de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple.
Abstract
La detección de hibridación fluorescente in situ (FISH) es un método indispensable en la estratificación del riesgo genético en el mieloma múltiple (MM), que es una de las neoplasias hematológicas malignas más comunes. La característica identificativa de MM son las células plasmáticas malignas acumuladas en la médula ósea. Los informes FISH para MM se centran principalmente en células plasmáticas clonales purificadas o identificadas, en lugar de todas las células nucleadas, mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con cadena ligera de inmunoglobulina citoplasmática κ o λ. Los núcleos de interfase de la médula ósea generalmente se obtienen de células frescas de la médula ósea. Sin embargo, el enriquecimiento satisfactorio de las muestras de células plasmáticas requiere grandes cantidades de médula ósea fresca anticoagulada con heparina, que no se puede obtener en el caso de una extracción difícil de la médula ósea o un grifo seco de médula ósea. Aquí, establecemos un método novedoso para mejorar el éxito de la detección de FISH en frotis de médula ósea teñidos o no manchados. Los frotis de médula ósea son más fáciles de obtener que las muestras de médula ósea anticoaguladas.
Introduction
El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad maligna de células plasmáticas (PC) con una fuerte heterogeneidad biológica y grandes diferencias individuales en la eficacia clínica, con períodos de supervivencia que van desde meses hasta décadas. Las características citogenéticas son importantes indicadores pronósticos de la MM. El sistema de estratificación del riesgo y los tratamientos individualizados basados en características genéticas se han convertido en temas de intenso interés en la investigación clínica sobre MM1. Las aberraciones de los PC probados en un panel de hibridación fluorescente in situ (FISH) de médula ósea (BM) incluyen del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) ganancia/amplificación y deleción 1p (CDKN2C).
La citogenética metafásica estándar debe incluirse en la evaluación inicial de los pacientes con MM. Aunque el cariotipo convencional con banda G ofrece el beneficio de un análisis cromosómico completo, el bajo rendimiento de este método conduce a muchos resultados falsos negativos2. Tradicionalmente, las PC han sido vistas como en gran medida incapaces de dividirse porque son los productos de la etapa final de la diferenciación de linfocitos B. Esto dificulta la obtención de imágenes divididas. La mejora del análisis citogenético en MM con cultivos a largo plazo (6 días) y la estimulación de cultivos por citoquinas pueden ser un método prometedor para identificar anomalías citogenéticas en pacientes con MM recién diagnosticados3. Sin embargo, incluso cuando el tiempo de cultivo se prolongó a 6 días, las anomalías citogenéticas se informaron con precisión en el 30%-50% de los pacientes con MM4. Además, la MM se caracteriza por aberraciones citogenéticas complejas que reflejan su heterogeneidad pronóstica. Sin embargo, la resolución de la tecnología tradicional de bandas cromosómicas es baja, lo que puede conducir fácilmente a la detección errónea de anomalías cromosómicas en MM.
La interfase FISH, preferiblemente después de la clasificación o marcado de PC basada en perlas magnéticas CD138 positivas con cadena ligera de inmunoglobulina citoplasmática κ/λ, es indispensable en el análisis de MM5,6. Se recomienda encarecidamente una muestra seleccionada CD138 positiva para el rendimiento optimizado de las células tumorales. Sin embargo, la cuantificación precisa de las aberraciones citogenéticas requiere al menos 4 ml de BM anticoagulado para la clasificación de PC. Además, las combinaciones de clasificación de perlas inmunomagnéticas CD138 con FISH o inmunoglobulina de cadena ligera citoplasmática κ/λ con pruebas FISH (cIg-FISH) aumentan numerosos costos experimentales y consumen mucho tiempo.
Por lo general, la relación de PC se evalúa primero a partir del examen morfológico de frotis de BM teñido o secciones de biopsia de BM7,8. Las muestras BM de la más alta calidad (primeras muestras de aspirado de médula) se utilizan para pruebas morfológicas, mientras que las enviadas para FISH u otra detección son a menudo las muestras de aspirado secundario con altas proporciones de dilución con sangre periférica.
Ya en la década de 1990, múltiples estudios demostraron que los frotis de BM se pueden usar directamente para los exámenes intersticiales de FISH, lo que ha demostrado ser un método confiable y repetible9. Un elegante estudio basado en la morfología celular y la citoquímica de la esterasa combinado con FISH de sangre periférica y frotis de BM confirmó su gran importancia clínica para dilucidar anomalías cromosómicas en pacientes con leucemia granulocítica y linfocítica10.
Aquí, proporcionamos un método novedoso para mejorar el éxito de la detección de FISH interfásico en pacientes con MM.
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Protocol
Este estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (No. 2019065). Los especímenes fueron recolectados de un paciente mm en el Departamento de Hematología del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (China).
1. Preparación de los frotis de BM
- Coloque los primeros 0,2 ml de solución de BM en un portaobjetos de vidrio desechable limpio.
- Extienda las manchas de BM a un grosor uniforme con colas afiladas retirando rápidamente el BM. Luego, secar naturalmente.
- Cubra las películas BM con 1 ml de solución Wright-Giemsa durante aproximadamente 10 s a temperatura ambiente.
- Agregue 1 ml de tampón de fosfato a las diapositivas.
NOTA: Tenga cuidado de evitar que la solución de tinte se seque o fluya de los portaobjetos. - Mezcle la solución de tinte suavemente y manténgala durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Enjuague los toboganes con agua limpia y séquelos al aire a temperatura ambiente.
- Utilice la microscopía de luz directa para detectar equipos malignos. Los PC deben estar bien dispersos.
2. Preprocesamiento fish de los frotis BM
- Cubra el área hibridada con solución fijadora durante 10 minutos para decolorar y arreglar las PC.
- Para preparar una solución fijadora fresca, mezcle metanol con ácido acético glacial en una proporción de volumen de 3: 1.
- Enjuague el portaobjetos con agua desionizada (dH2O) y séquelo al aire a temperatura ambiente.
- Precaliente un frasco que contenga 2 tampones SSC a 56 °C en un baño de agua. Diluya el búfer recién a 20 veces SSC antes de usarlo.
- Para preparar 20x SSC, mezcle bien 176 g de cloruro de sodio y 88 g de citrato de sodio con 800 ml de dH2O. Mida el pH y ajuste a pH 5.3 ± 0.2. Luego, agregue dH2O para llevar el volumen final a 1 L.
- Lave el frotis de BM preparado en el tampón SSC 2x precalentado durante 10 minutos, seguido de sumergirlo en agua desionizada a temperatura ambiente.
- Deshidratar el frotis en un gradiente de etanol (70%, 85% y 100% etanol, cada uno durante 1 min). Seque al aire el frotis durante 10 min.
3. BM untar FISH y lavado
NOTA: Todos los pasos se realizaron en una habitación oscura para evitar el enfriamiento de la fluorescencia.
- Añadir la mezcla de sonda TP53/centrómero del cromosoma 17 (CEP17) al área de hibridación y cubrirla con un coverlip. Presione suavemente con pinzas de punta fina para eliminar las burbujas de aire de debajo.
- Selle todos los lados de la cubierta con cemento de goma para garantizar una buena estanqueidad.
- Después de la solidificación del cemento de goma, coloque la corredera en una máquina automática FISH. Realizar la desnaturalización a 78 °C durante 5 min, seguida de hibridación a 37 °C durante la noche.
- Recoja la diapositiva de la máquina FISH. Use pinzas puntiagudas finas para quitar el cemento de goma suavemente.
- Sumerja la corredera en 2x SSC a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 o 2 minutos para lavar la cubierta.
- Lave el tobogán en un búfer NP-40 0.4x SSC / 0.3% 68 ° C precalentado en un baño de agua durante 2 min.
- Prepare la solución 0.4x SSC/0.3% NP-40 mezclando a fondo 20 mL de 20x SSC (pH 5.3) con 950 mL de dH2O. Luego, agregue 3 ml de NP-40 y mezcle bien hasta que se disuelva por completo. Mida el pH y ajuste a 7.0-7.5 con NaOH. Luego, agregue dH2O para llevar el volumen final de la solución total a 1 L.
- Lave los toboganes con 2x SSC en un baño de agua de 37 °C durante 1 min. Coloque en posición vertical en la oscuridad para que se seque completamente durante 10 minutos.
- Añadir 10 μL de DAPI al área hibridada y cubrir con una cubierta.
4. Análisis e imágenes fish
- Vea la diapositiva hibridada utilizando un conjunto de filtros adecuado en un microscopio de fluorescencia.
- Utilice un filtro óptico de fluoróforo azul monocromático para observar la intensidad de fluorescencia del núcleo celular. Tome imágenes del núcleo celular bajo un conjunto de filtros DAPI.
- Use una sonda de centrómero cromosómico para mostrar cuántos cromosomas contiene una célula. Etiquete CEP17 con fluorescencia verde. Utilice un filtro óptico de fluoróforo verde de espectro para observar la ubicación de CEP17. Tome una imagen de señales CEP17 debajo del conjunto de filtros verdes.
- Etiquete el gen TP53 con fluorescencia naranja. Utilice un filtro óptico de fluoróforo naranja de espectro para observar TP53. Tome una imagen de señales TP53 debajo de este conjunto.
- Combine estas tres imágenes y examínelas en busca de anomalías numéricas.
NOTA: En una célula interfase normal, se observan dos señales naranjas y dos verdes dentro de un núcleo con fluorescencia azul, lo que indica un par de cromosomas 17 normales (Figura 1).
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Representative Results
En la evaluación morfológica inicial de un paciente MM recién diagnosticado, se encontró que el 15% de los PC en un frotis de BM tenían núcleos más grandes y oscuros junto con mayores cantidades de citoplasma que los PC normales (Figura 2A). El primer tubo de BM anticoagulante de heparina detectado por la técnica del inmunofenotipo reveló solo el 2,3% de los PC aberrantes monoclonales. La clasificación inmunomagnética de perlas CD138 en combinación con FISH o la técnica cIg-FISH es esencial para obtener un resultado preciso de FISH. Sin embargo, la BM aspirada es limitada en el caso de que sea un grifo seco. Se utilizaron frotis de BM para probar FISH entre fases. Un PC binucleado representativo en la película BM fue localizado por un calibrador Vernier de etapa de microscopio de fluorescencia (Figura 2B). FISH se aplicó a los frotis de BM para detectar TP53 y CEP17. Los resultados de FISH mostraron cuatro señales naranjas y cuatro verdes en un núcleo de PC interfase (Figura 2C), lo que sugiere que cuatro copias del cromosoma 17 se localizaron en los núcleos de PC de metafase. Los resultados del cariotipo se obtuvieron extendiendo el tiempo de cultivo hasta 3 días y se analizaron más a fondo utilizando el software analítico FISH (Figura 2D). La precisión de los resultados de FISH de interfase en los frotis de BM se verificó aún más.
Figura 1: Señales normales de la sonda TP53/CEP17 FISH para células interfase (1000x). La intensidad de fluorescencia del núcleo celular era azul, el TP53 era naranja y el CEP17 era verde. En esas 3 células interfase normales, aparecieron dos señales naranjas y dos verdes dentro del núcleo azul-fluorescente, lo que indica dos pares del cromosoma 17 normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología e imágenes genéticas de la médula ósea (BM) en pacientes con mieloma múltiple (MM). (A) Células de mieloma con distribución agrupada indicadas por las flechas (
) después de la tinción de Wright-Giemsa del frotis de BM (1000×). (B) Células plasmocitoides binucleadas indicadas por flechas (
) en una imagen en escala de grises tomada por una cámara en blanco y negro en un microscopio de fluorescencia (1000×). (C) TP53/ centrómero del cromosoma 17 (CEP17) prueba de sonda de hibridación fluorescente in situ (FISH) para el frotis de BM. FISH revela cuatro señales TP53 y cuatro CEP17 en cada núcleo (→) (1000×). (D) El cariograma cromosómico anormal muestra dos pares de cromosomas 17 en un núcleo (
). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La aplicación de FISH a la estratificación del riesgo genético en MM es esencial. La parte crítica de los informes fish no son todas las células nucleadas, sino los PC clonales específicamente purificados o identificados mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con inmunoglobulina citoplasmática de cadena ligera κ o λ. Se encontró que la interfase FISH después de la clasificación de PC o cIg-FISH era significativa en el diagnóstico de MM debido a la proporción relativamente menor de PC en el BM. Sin embargo, estos métodos tienen algunas deficiencias, incluidos procesos complejos, altas demandas de muestras y altos costos experimentales. Cincuenta PC pueden ser localizados rápidamente por una pinza Vernier en etapa de microscopio. Los frotis de BM son mucho más fáciles de obtener que las muestras de BM anticoagulantes porque la obtención de BM anticoagulante requiere procedimientos complejos para obtener el núcleo. En consecuencia, establecimos un método convincente para el frotis de BM FISH para la detección de células MM.
Primero, los frotis de BM deben ser realizados por un analista morfológico experimentado. Para extender el BM en frotis, el esparcidor se coloca delante del aspirado en un ángulo de 30°-45° y se tira hacia atrás para hacer contacto con el fluido11. Luego, el esparcidor se mueve hacia adelante uniformemente en un movimiento constante. La densidad del frotis de BM debe adaptarse de modo que la longitud sea de aproximadamente tres cuartas partes de la diapositiva12. La película BM debe ser más estrecha que la diapositiva para garantizar que se puedan detectar celdas en todos los bordes13. La selección del área de hibridación y la localización de PC fue crítica en nuestro protocolo, y esto requiere un analista morfológico experimentado. Para los frotis de BM que contienen menos PC, los PC deben localizarse mediante el uso de un objetivo de inmersión en aceite de microscopio de fluorescencia hacia adelante y pinzas Vernier en el escenario objetivo, y sus imágenes se pueden tomar mediante tomas monocromáticas. Por ejemplo, si los PC representaron solo el 3% del total de células nucleadas en una película BM mediante examen morfológico, una región híbrida bien dispersa de 8 mm x 8 mm debe contener no menos de 50 PC para una prueba FISH. Después de la hibridación fish, las señales de fluorescencia en al menos 50 PC deben ser contadas por un analista experimentado14.
Sin embargo, una limitación de esta técnica es el requisito de frotis de BM frescos. Si las manchas de BM se almacenan durante más de 2 años, las imágenes FISH resultantes pueden ser oscuras, lo que resulta en una mala interpretación.
En conjunto, el frotis de BM FISH mencionado anteriormente se puede usar ampliamente para pacientes con neoplasias hematológicas malignas cuando la extracción de BM es difícil o se produce un grifo seco de BM, incluso en enfermedades hipoproliferativas con menos células nucleadas. Esperamos que más pacientes con neoplasias hematológicas malignas puedan beneficiarse de este método.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado por el Fondo de Innovación de WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
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