Summary
Her presenterer vi en protokoll for å forbedre suksessen til interfase fluorescens in situ hybridiseringsdeteksjon på benmargssmør fra flere myelomapasienter.
Abstract
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) deteksjon er en uunnværlig metode i genetisk risikostratifisering i multippel myeloma (MM), som er en av de vanligste hematologiske maligniteter. Den identifiserende egenskapen til MM er akkumulerte ondartede plasmaceller i benmarg. FISH-rapporter for MM fokuserer hovedsakelig på rensede eller identifiserte kloniske plasmaceller, i stedet for alle nukleerte celler, ved å sortere med anti-CD138 magnetiske perler eller markere med cytoplasmatisk immunoglobulin lyskjede κ eller λ. Benmarg interfasekjerner er vanligvis hentet fra friske benmargsceller. Imidlertid krever tilfredsstillende berikelse av plasmacelleprøver store mengder fersk heparin antikoagulert benmarg, som ikke kan oppnås i tilfelle vanskelig benmargsutvinning eller en benmargstørr kran. Heri etablerer vi en ny metode for å forbedre suksessen med FISKEdeteksjon på fargede eller uoppdagede benmargssmør. Benmargssmør er lettere å oppnå enn antikoagulerte benmargsprøver.
Introduction
Multiple myeloma (MM) er en ondartet plasmacellesykdom (PC) med sterk biologisk heterogenitet og store individuelle forskjeller i klinisk effekt, med overlevelsesperioder fra måneder til tiår. Cytogenetiske egenskaper er viktige prognostiske indikatorer på MM. Risikostratifiseringssystemet og individualiserte behandlinger basert på genetiske egenskaper har blitt temaer av intens interesse for klinisk forskning på MM1. Avvikene av PCer testet i et fluorescens in situ hybridiseringspanel (FISH) av benmarg (BM) inkluderer del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) forsterkning/forsterkning og sletting av 1p (CDKN2C).
Standard metafasecytogenetikk bør inngå i den første vurderingen av MM-pasienter. Selv om konvensjonell G-banded karyotyping gir fordelen av en hel kromosomanalyse, fører det lave utbyttet av denne metoden til mange falske negative resultater2. Tradisjonelt har PCer blitt sett på som i stor grad ute av stand til å splitte fordi de er sluttfaseproduktene av B-lymfocyttdifferensiering. Dette gjør det vanskelig å få tak i delte bilder. Forbedret cytogenetisk analyse i MM med langsiktige kulturer (6 dager) og stimulering av kulturer ved cytokiner kan være en lovende metode for å identifisere cytogenetiske abnormiteter hos nylig diagnostiserte MM-pasienter3. Selv når kulturtiden ble forlenget til 6 dager, ble imidlertid cytogenetiske abnormiteter nøyaktig rapportert hos 30% -50% av MM-pasientene4. Videre er MM preget av komplekse cytogenetiske avvik som gjenspeiler dens prognostiske heterogenitet. Imidlertid er oppløsningen av tradisjonell kromosombåndteknologi lav, noe som lett kan føre til manglende påvisning av kromosomale abnormiteter i MM.
Interfase FISK, helst etter CD138-positiv magnetisk perlebasert PC-sortering eller merking med cytoplasmatisk immunoglobulin lyskjede κ/λ, er uunnværlig i analysen av MM5,6. En CD138-positiv utvalgt prøve anbefales på det sterkeste for det optimaliserte utbyttet av tumorceller. Imidlertid krever nøyaktig kvantisering av cytogenetiske avvik minst 4 ml antikoagulert BM for PC-sortering. I tillegg øker kombinasjonene av enten CD138 immunomagnetisk perlesortering med FISK eller cytoplasmatisk κ/λ lyskjedeimmunoglobulin med FISKE-testing (cIg-FISH) mange eksperimentelle kostnader og er tidkrevende.
Vanligvis vurderes PC-forholdet først fra den morfologiske undersøkelsen av fargede BM-smør eller BM biopsi seksjoner7,8. BM-prøver av høyeste kvalitet (første margaspiratprøver) brukes til morfologisk testing, mens de som sendes til FISK eller annen deteksjon ofte er sekundære aspiratprøver med høye forhold mellom fortynning og perifert blod.
Allerede på 1990-tallet viste flere studier at BM-smørere kan brukes direkte til interstitielle FISH-undersøkelser, som har vist seg å være en pålitelig og repeterbar metode9. En elegant studie basert på cellemorfologi og esterase cytokjemi kombinert med FISK av perifert blod og BM smører bekreftet sin store kliniske betydning for å belyse kromosomale abnormiteter hos pasienter med granulocytisk og lymfocytisk leukemi10.
Heri gir vi en ny metode for å forbedre suksessen til interfase FISKEdeteksjon hos MM-pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til prinsippene i Helsinki-erklæringen og godkjent av etikkkomiteen ved Zhongnan Hospital of Wuhan University (nr. 2019065). Prøvene ble samlet inn fra en MM-pasient ved Institutt for hematologi, Zhongnan Hospital of Wuhan University (Kina).
1. Tilberedning av BM-smørene
- Plasser den første 0,2 ml BM-oppløsningen på en ren engangsglasssklie.
- Spred BM-smørene til ensartet tykkelse med skarpe haler ved å fjerne BM raskt. Tørk deretter naturlig.
- Dekk BM-filmene med 1 ml Wright-Giemsa-oppløsning i ca. 10 s ved romtemperatur.
- Tilsett 1 ml fosfatbuffer i lysbildene.
MERK: Pass på at fargestoffløsningen tørker eller strømmer av skredene. - Bland fargestoffløsningen forsiktig og vedlikehold den i 15 min ved romtemperatur.
- Skyll lysbildene med rent vann og tørk dem i luft ved romtemperatur.
- Bruk fremre lysmikroskopi for å oppdage ondartede PCer. PCene bør være godt spredt.
2. FISKE forbehandling av BM-smørene
- Dekk det hybridiserte området med fikseringsløsning i 10 minutter for å misfarge og fikse PCene.
- For å forberede fersk fikseringsløsning, bland metanol med iseddiksyre i et volumforhold på 3:1.
- Skyll lysbildet med deionisert vann (dH2O) og tørk det i luft ved romtemperatur.
- Forvarm en krukke som inneholder 2x SSC buffer til 56 °C i et vannbad. Fortynn bufferen til 20x SSC før bruk.
- For å forberede 20x SSC, bland grundig 176 g natriumklorid og 88 g natriumsitrat med 800 ml dH2O. Mål pH og juster til pH 5,3 ± 0,2. Deretter legger du til dH2O for å bringe det endelige volumet til 1 L.
- Vask det tilberedte BM-smøret i den forvarmede 2x SSC-bufferen i 10 minutter, etterfulgt av å dyppe den i deionisert vann ved romtemperatur.
- Dehydrer smøret i en etanolgradient (70%, 85% og 100% etanol, hver i 1 min). Lufttørk smøret i 10 min.
3. BM smør FISK og vasking
MERK: Alle trinnene ble utført i et mørkt rom for å forhindre fluorescensslukking.
- Tilsett TP53/centromere av kromosom 17 (CEP17) sondeblanding til hybridiseringsområdet og dekk den med en deksleslip. Trykk forsiktig med finspissede pinsett for å fjerne luftbobler fra undersiden.
- Forsegle alle sider av dekslene med gummisement for å sikre god tetthet.
- Etter størkning av gummisementen, plasser lysbildet på en automatisk FISKEmaskin. Utfør denaturering ved 78 °C i 5 minutter, etterfulgt av hybridisering ved 37 °C over natten.
- Plukk opp skredet fra FISH-maskinen. Bruk finspissede pinsett for å fjerne gummisementen forsiktig.
- Senk sklien ned i 2x SSC ved romtemperatur i ca. 1 eller 2 min for å vaske av dekslene.
- Vask skredet i 68 °C forvarmet 0,4x SSC/0,3 % NP-40-buffer i et vannbad i 2 minutter.
- Forbered 0,4x SSC/0,3% NP-40-oppløsning ved å blande 20 ml 20x SSC (pH 5,3) grundig med 950 ml dH2O. Tilsett deretter 3 ml NP-40 og bland grundig til den er fullstendig oppløst. Mål pH og juster til 7,0-7,5 med NaOH. Deretter legger du til dH2O for å bringe det endelige volumet av den totale løsningen til 1 L.
- Vask skliene med 2x SSC i et 37 °C vannbad i 1 min. Sett oppreist i mørket for å tørke grundig i 10 minutter.
- Tilsett 10 μL DAPI i det hybridiserte området og dekk med en coverlip.
4. FISKEanalyse og avbildning
- Vis det hybridiserte lysbildet ved hjelp av et passende filtersett på et fluorescensmikroskop.
- Bruk et monokromatisk blått fluorofor optisk filter for å observere fluorescensintensiteten til cellekjernen. Ta cellekjernebilder under et DAPI-filtersett.
- Bruk en kromosom centromere sonde for å vise hvor mange kromosomer en celle inneholder. Etikett CEP17 med grønn fluorescens. Bruk et spektrum grønt fluorofor optisk filter for å observere plasseringen av CEP17. Ta et CEP17-signalbilde under det grønne filtersettet.
- Merk TP53-genet med oransje fluorescens. Bruk et spektrum oransje fluorofor optisk filter for å observere TP53. Ta et bilde av TP53-signaler under dette settet.
- Slå sammen disse tre bildene og undersøk dem for numeriske abnormiteter.
MERK: I en normal interfasecelle observeres to oransje og to grønne signaler inne i en kjerne med blå fluorescens, noe som indikerer ett par normalt kromosom 17 (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den første morfologiske vurderingen av en nylig diagnostisert MM-pasient ble 15% av PCene i et BM-smør funnet å ha større og mørkere kjerner sammen med større mengder cytoplasma enn vanlige PCer (figur 2A). Det første røret av heparin antikoagulert BM oppdaget av immunofenotype teknikken avslørte bare 2,3% av monoklonal avvikende PCer. CD138 immunomagnetisk perle sortering i kombinasjon med FISH eller cIg-FISH teknikken er avgjørende for å oppnå et nøyaktig FISH resultat. Aspirert BM er imidlertid begrenset i tilfelle det er en tørr kran. BM smør ble brukt til å teste interfase FISK. En representativ binucleated PC i BM-film ble lokalisert av et fluorescensmikroskoptrinn Vernier-kaliper (figur 2B). FISH ble påført BM-smørene for å teste for TP53 og CEP17. FISH-resultatene viste fire oransje og fire grønne signaler i en interfase PC-kjerne (figur 2C), noe som tyder på at fire kopier av kromosom 17 ble lokalisert i metafase PC-kjernen. Karyotypingsresultater ble oppnådd ved å forlenge kulturtiden opptil 3 dager og videre analysert ved hjelp av FISH analytisk programvare (figur 2D). Nøyaktigheten av de interfasede FISH-resultatene på BM-smørene ble ytterligere verifisert.
Figur 1: Normale signaler fra TP53/CEP17 FISH-sonden for interfaseceller (1000x). Fluorescensintensiteten til cellekjernen var blå, TP53 var oransje, og CEP17 var grønn. I de 3 normale interfasecellene oppstod både to oransje og to grønne signaler inne i den blå-fluorescerende kjernen, noe som indikerer to par av det normale kromosomet 17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologi og genetiske bilder av benmarg (BM) hos pasienter med myelomatose (MM). (A) Myeloma celler med gruppert distribusjon indikert av pilene (
) etter Wright-Giemsa farging av BM smøring (1000×). (B) Binucleate plasmacytoidceller indikert med piler (
) på et gråtonebilde tatt av et svart-hvitt kamera på et fluorescensmikroskop (1000×). (C) TP53/centromere av kromosom 17 (CEP17) fluorescens in situ hybridisering (FISH) sondetest for BM-smøret. FISH avslører fire TP53 - og fire CEP17-signaler i hver kjerne (→) (1000×). (D) Unormalt kromosom karyogram viser to par kromosom 17 i en kjerne (
). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen av FISH til genetisk risikostratifisering i MM er avgjørende. Den kritiske delen av FISH-rapporter er ikke alle nukleerte celler, men kloniske PCer renset eller identifisert ved å sortere med anti-CD138 magnetiske perler eller merking med cytoplasmatisk immunoglobulin lyskjede κ eller λ. Interfase FISK etter PC-sortering eller cIg-FISH ble funnet å være signifikant i diagnosen MM på grunn av den relativt lavere andelen PCer i BM. Imidlertid har disse metodene noen mangler, inkludert komplekse prosesser, høye prøvekrav og høye eksperimentelle kostnader. Femti PCer kan raskt plasseres av et mikroskop-trinns Vernier-kaliper. BM smør er mye lettere å oppnå enn antikoagulant BM prøver fordi oppnå anti-koagulert BM krever komplekse prosedyrer for å oppnå kjernen. Følgelig etablerte vi en overbevisende metode for BM smørFISK for påvisning av MM-celler.
For det første bør BM-smøring gjøres av en erfaren morfologisk analytiker. For å spre BM-en i smør, plasseres sprederen foran aspireren i en vinkel på 30°-45° og trekkes tilbake for å komme i kontakt med væsken11. Deretter flyttes sprederen jevnt fremover i en jevn bevegelse. Tettheten til BM-smøringen må skreddersys slik at lengden er omtrent tre fjerdedeler av skredet12. BM-filmen må være smalere enn lysbildet for å garantere at celler på alle kanter kan oppdages13. Valget av hybridiseringsområdet og lokalisering av PCer var kritisk i vår protokoll, og dette krever en erfaren morfologisk analytiker. For BM-smørere som inneholder færre PCer, bør PCene lokaliseres ved hjelp av et fremover fluorescensmikroskopoljeinnlevelsesmål og Vernier-kalipere på objektivstadiet, og bildene deres kan tas av monokrome bilder. For eksempel, hvis PCene utgjorde bare 3% av de totale nukleerte cellene i en BM-film ved morfologisk undersøkelse, bør en godt spredt hybridregion på 8 mm x 8 mm inneholde ikke mindre enn 50 PCer for en FISH-test. Etter FISH-hybridisering må fluorescenssignaler i minst 50 PC-er telles av en erfaren analytiker14.
En begrensning av denne teknikken er imidlertid kravet til friske BM-smør. Hvis BM-smørene er lagret i over 2 år, kan de resulterende FISH-bildene være uklare, noe som resulterer i feiltolkning.
Samlet sett kan ovennevnte BM smørFISK brukes mye til pasienter med hematologiske maligniteter når BM-ekstraksjon er vanskelig eller BM tørrkran oppstår, selv i hypoprolifererende sykdommer med færre nukleerte celler. Vi håper at flere pasienter med hematologisk malignitet kan dra nytte av denne metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av Innovasjonsfondet i WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
