Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור ההצלחה של פלואורסצנטיות בין פאזית בזיהוי הכלאה במקום על מריחות מח עצם מחולי מיאלומה נפוצים.
Abstract
פלואורסצנטיות בזיהוי הכלאה במקום (FISH) היא שיטה הכרחית בריבוד סיכונים גנטיים במיאלומה נפוצה (MM), שהיא אחת ממאירות המטולוגיות הנפוצות ביותר. המאפיין המזהה של MM מצטבר תאי פלזמה ממאירים במח העצם. דוחות דגים עבור MM מתמקדים בעיקר בתאי פלזמה קלונליים מטוהרים או מזוהים, ולא בכל התאים הגרעינים, על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. גרעינים אינטרפאזי מח עצם מתקבלים בדרך כלל מתאי מח עצם טריים. עם זאת, העשרה משביעת רצון של דגימות תאי פלזמה דורשת כמויות גדולות של מח עצם טרי נגד מח עצם, אשר לא ניתן להשיג במקרה של מיצוי מח עצם קשה או ברז יבש מח עצם. בזאת, אנו מקימים שיטה חדשנית כדי לשפר את ההצלחה של זיהוי דגים על כתמי מח עצם מוכתמים או לא מוכתמים. כתמי מח עצם קלים יותר להשגה מאשר דגימות מח עצם נוגדות קרישה.
Introduction
מיאלומה נפוצה (MM) היא מחלת תאי פלזמה ממאירים (PC) עם הטרוגניות ביולוגית חזקה והבדלים אישיים גדולים ביעילות קלינית, עם תקופות הישרדות הנעות בין חודשים לעשורים. מאפיינים ציטוגנטיים הם אינדיקטורים פרוגנוסטיים חשובים של MM. מערכת ריבוד הסיכון וטיפולים מותאמים אישית המבוססים על מאפיינים גנטיים הפכו לנושאים בעלי עניין רב במחקר קליני על MM1. הסטיות של מחשבים שנבדקו בפלואורסצנטיות בלוח היברידיזציה של סיטו (FISH) של מח העצם (BM) כוללות דל 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t (14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) רווח/הגברה, ומחיקת 1p (CDKN2C).
ציטוגנטיקה מטפאזה סטנדרטית צריכה להיכלל בהערכה הראשונית של חולי MM. למרות kryotyping רגיל G-פס מציע את היתרון של ניתוח כרומוזום שלם, התשואה הנמוכה של שיטה זו מובילה לתוצאות שליליות כוזבות רבות2. באופן מסורתי, מחשבים נתפסו כבלתי מסוגלים במידה רבה לפיצול מכיוון שהם המוצרים הסופיים של בידול לימפוציטים B. הדבר מקשה על השגת תמונות מפוצלות. ניתוח ציטוגנטי משופר ב- MM עם תרביות לטווח ארוך (6 ימים) וגירוי של תרבויות על ידי ציטוקינים עשוי להיות שיטה מבטיחה לזיהוי חריגות ציטוגנטיות בחולי MM שאובחנו לאחרונה3. גם כאשר זמן התרבות היה ממושך עד 6 ימים, עם זאת, חריגות ציטוגנטיות דווחו במדויק ב 30%-50% של חולי MM4. יתר על כן, MM מאופיין בסטיות ציטוגנטיות מורכבות המשקפות את ההטרוגניות הפרוגנוסטית שלו. עם זאת, הרזולוציה של טכנולוגיית פסים כרומוזום מסורתית היא נמוכה, אשר עלול בקלות להוביל לזיהוי חסר של חריגות כרומוזומלי ב- MM.
דג אינטרפאזה, רצוי לאחר CD138-חיובי חרוז מגנטי מבוסס מיון מחשב או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין cytoplasmic κ/λ, הוא הכרחי בניתוח של MM5,6. מדגם נבחר CD138 חיובי מומלץ מאוד עבור התשואה הממוטבת של תאים סרטניים. עם זאת, כמות מדויקת של סטיות ציטוגנטיות דורשת לפחות 4 מ"ל של BM אנטי-קולוגי למיון מחשב. בנוסף, השילובים של מיון חרוזים אימונומגנטיים CD138 עם FISH או אימונוגלובולין שרשרת אור ציטופלסמית κ /λ עם בדיקות דגים (cIg-FISH) להגדיל עלויות ניסיוניות רבות והם גוזלים זמן רב.
בדרך כלל, יחס המחשב מוערך תחילה מהבדיקה המורפולוגית של מריחות BM מוכתמות או מקטעי ביופסיה BM7,8. דגימות BM באיכות הגבוהה ביותר (דגימות שאיפה של מח ראשון) משמשות לבדיקות מורפולוגיות, ואילו אלה שנשלחו לדוג או לגילוי אחר הן לעתים קרובות דגימות שאיפה משניות עם יחס גבוה של דילול עם דם היקפי.
כבר בשנות ה-90 של המאה ה-20, מחקרים רבים הראו כי מריחות BM יכולות לשמש ישירות לבדיקות דגים ביניים, שהוכיחו את עצמן כשיטה אמינה וניתן לחזור עליהן9. מחקר אלגנטי המבוסס על מורפולוגיה של תאים וציטוכימיה אסטראז בשילוב עם FISH של דם היקפי וכתמי BM אישר את המשמעות הקלינית הגדולה שלו להבהרת חריגות כרומוזומליות בחולים עם לוקמיה גרנולוציטית ולימפוציטית10.
להלן, אנו מספקים שיטה חדשנית לשיפור ההצלחה של זיהוי דגים interphase בחולי MM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה נערך על פי עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים דז'ונגנן של אוניברסיטת ווהאן (מס ' 2019065). הדגימות נאספו מחולה MM במחלקה להמטולוגיה, בית החולים דז'ונגנן של אוניברסיטת ווהאן (סין).
1. הכנת מריחות BM
- מניחים את פתרון ה-0.2 מ"ל הראשון של BM על מגלשת זכוכית חד פעמית נקייה.
- מורחים את כתמי BM לעובי אחיד עם זנבות חדים על ידי הסרה מהירה של ה- BM. לאחר מכן, יבש באופן טבעי.
- לכסות את סרטי BM עם 1 מ"ל של פתרון רייט-Giemsa עבור כ 10 שניות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 1 מ"ל של מאגר פוספט לשקופיות.
הערה: יש להקפיד למנוע מתמיסת הצבע להתייבש או לזרום מהמגלשות. - מערבבים את תמיסת הצבע בעדינות ושומרים עליה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- שוטפים את המגלשות במים נקיים ומייבשים אותן באוויר בטמפרטורת החדר.
- השתמש במיקרוסקופיה של אור קדמי כדי לזהות מחשבים ממאירים. המחשבים צריכים להיות מפוזרים היטב.
2. דגים טרום עיבוד של כתמי BM
- לכסות את האזור ההיברידי עם פתרון קבוע במשך 10 דקות כדי לשנות צבע ולתקן את המחשבים.
- להכנת פתרון קבוע טרי, יש לערבב מתנול עם חומצה אצטית קרחונית ביחס נפח של 3:1.
- שטפו את המגלשה במים שעברו דה-יוניזציה (dH2O) וייבשו אותה באוויר בטמפרטורת החדר.
- מחממים צנצנת המכילה 2x SSC חוצץ עד 56 °C (56 °F) באמבט מים. יש לדלל את המאגר ל-20x SSC לפני השימוש.
- כדי להכין 20x SSC, לערבב ביסודיות 176 גרם של נתרן כלורי ו 88 גרם של נתרן ציטראט עם 800 מ"ל של dH2O. למדוד את ה- pH ולהתאים ל- pH 5.3 ± 0.2. לאחר מכן, הוסף dH2O כדי להביא את אמצעי האחסון הסופי ל- 1 L.
- לשטוף את משטח BM מוכן במאגר 2x SSC שחומם מראש במשך 10 דקות, ואחריו לטבול אותו לתוך מים deionized בטמפרטורת החדר.
- מייבשים את המריחה בשיפוע אתנול (70%, 85%, ו-100% אתנול, כל אחד למשך דקה אחת). מייבשים את ההמרחה במשך 10 דקות.
3. BM למרוח דגים ושטיפה
הערה: כל השלבים בוצעו בחדר חשוך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.
- הוסף את תערובת הבדיקה TP53/centromere של כרומוזום 17 (CEP17) לאזור ההיברידיות וכסה אותה בהחלקת כיסוי. לחץ בעדינות עם פינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר בועות אוויר מלמטה.
- לאטום את כל הצדדים של כיסוי כיסוי עם מלט גומי כדי להבטיח הידוק טוב.
- לאחר התגבשות של מלט הגומי, מניחים את השקופית על מכונת FISH אוטומטית. בצע denaturation ב 78 °C (78 °F) במשך 5 דקות, ואחריו הכלאה ב 37 °C (50 °F) לילה.
- תרים את השקופית ממכונת הדגים. השתמש פינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר את מלט הגומי בעדינות.
- יש לטבול את המגלשה ב-2x SSC בטמפרטורת החדר למשך כדקה או שתיים כדי לשטוף את המכסה.
- לשטוף את השקופית ב 68 °C (68 °C) מחומם מראש 0.4x SSC / 0.3% NP-40 חוצץ באמבט מים במשך 2 דקות.
- הכן פתרון 0.4x SSC/0.3% NP-40 על ידי ערבוב יסודי של 20 מ"ל של 20x SSC (pH 5.3) עם 950 מ"ל של dH2O. לאחר מכן, מוסיפים 3 מ"ל של NP-40 ומערבבים היטב עד להמסה מלאה. מדוד את ה- pH והתאם ל- 7.0-7.5 עם NaOH. לאחר מכן, הוסף dH2O כדי להביא את אמצעי האחסון הסופי של הפתרון הכולל ל- 1 L.
- לשטוף את השקופיות עם 2x SSC באמבט מים 37 °C (37 °F) במשך 1 דקות. מוגדר זקוף בחושך להתייבש ביסודיות במשך 10 דקות.
- הוסף 10 μL של DAPI לאזור ההיברידי וכסה עם כיסוי.
4. ניתוח הדגים והדמיה
- הצג את השקופית ההיברידית באמצעות ערכת מסננים מתאימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- השתמש במסנן אופטי פלואורופור כחול מונוכרומטי כדי לבחון את עוצמת הפלואורסצנטיות של גרעין התא. קח תמונות גרעין תא תחת ערכת מסננים של DAPI.
- השתמש בבדיקת צנטרומר כרומוזום כדי להראות כמה כרומוזומים תא מכיל. תווית CEP17 עם פלואורסצנטיות ירוקה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור ירוק ספקטרום כדי לבחון את המיקום של CEP17. צלמו תמונת אותות CEP17 מתחת לערכת המסננים הירוקה.
- סמן את הגן TP53 בפלואורסצנטיות כתומה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור כתום ספקטרום כדי לצפות TP53. קח תמונת אותות TP53 מתחת לערכה זו.
- מזג את שלוש התמונות הללו ובחן אותן לאיתור חריגות מספריות.
הערה: בתא בין-פאזי רגיל, שני אותות כתומים ושני אותות ירוקים נצפים בתוך גרעין עם פלואורסצנטיות כחולה, המציינים זוג אחד של כרומוזום 17 רגיל (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהערכה המורפולוגית הראשונית של חולה MM שאובחן לאחרונה, 15% מהמחשבים במריחת BM נמצאו בעלי גרעינים גדולים וכהים יותר יחד עם כמויות גדולות יותר של ציטופלסמה ממחשבים רגילים (איור 2A). הצינור הראשון של BM אנטי-קרישה הפרין שזוהה על ידי טכניקת אימונופנוטיפ חשף רק 2.3% מהמחשבים החריגים חד שבטיים. מיון חרוזים אימונומגנטיים CD138 בשילוב עם FISH או טכניקת cIg-FISH חיוני להשגת תוצאה מדויקת של FISH. עם זאת, BM שאפתנית מוגבלת במקרה של זה להיות ברז יבש. כתמי BM שימשו לבדיקת דגים בין-פאזיים. מחשב בינוקלציה מייצג בסרט BM עבר לוקליפר של מיקרוסקופ פלואורסצנטיות של שלב ורנייה (איור 2B). FISH הוחל על מריחות BM כדי לבדוק עבור TP53 ו- CEP17. תוצאות הדגים הראו ארבעה אותות כתומים וארבעה ירוקים בגרעין PC אינטרפאזי אחד (איור 2C), דבר המצביע על כך שארבעה עותקים של כרומוזום 17 היו מקומיים בגרעיני המחשב המטפאזי. תוצאות Karyotyping הושגו על ידי הארכת זמן התרבות עד 3 ימים וניתוח נוסף באמצעות תוכנת ניתוח FISH (איור 2D). הדיוק של תוצאות הדגים הבין-פאזיים בהכפשות BM אומת עוד יותר.
איור 1: אותות רגילים של הגשושית TP53/CEP17 FISH עבור תאים בין-פאזיים (1000x). עוצמת הפלואורסצנטיות של גרעין התא הייתה כחולה, TP53 היה כתום, וה- CEP17 היה ירוק. באותם 3 תאים אינטרפאזיים רגילים, שני אותות כתומים ושני אותות ירוקים הופיעו בתוך הגרעין הכחול-פלואורס, המציין שני זוגות של הכרומוזום הרגיל 17. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מורפולוגיה ותמונות גנטיות של מח עצם (BM) בחולי מיאלומה נפוצה (MM). (A) תאי מיאלומה עם התפלגות מקובצת המסומנת על ידי החצים (
) לאחר כתמי רייט-גימסה של כתם BM (1000×). (B) תאי פלסמה בינוקלאט המצוינים על ידי חצים (
) בתמונה בגווני אפור שצולמה על ידי מצלמה בשחור-לבן במיקרוסקופ פלואורסצנטי (1000×). (C) TP53/ צנטרומר של פלואורסצנטיות כרומוזום 17 (CEP17) במבחן בדיקה היברידית מיקום (FISH) עבור מריחת BM. דגים חושפים ארבעה אותות TP53 וארבעה CEP17 בכל גרעין (→) (1000×). (D) קריוגרמה כרומוזום חריג מראה שני זוגות של כרומוזום 17 בגרעין אחד (
). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היישום של דגים לריבוד סיכון גנטי ב- MM הוא חיוני. החלק הקריטי של דוחות FISH הוא לא כל התאים הגרעינים, אבל מחשבים קלונליים מטוהרים או מזוהים במיוחד על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. אינטרפאזה FISH לאחר מיון מחשב או cIg-FISH נמצאה משמעותית באבחון של MM בשל השיעור הנמוך יחסית של מחשבים ב- BM. עם זאת, לשיטות אלה יש כמה חסרונות, כולל תהליכים מורכבים, דרישות דגימה גבוהות ועלויות ניסיוניות גבוהות. חמישים מחשבים יכולים להיות ממוקמים במהירות על ידי קליפר ורנייה שלב מיקרוסקופ. מריחות BM הרבה יותר קל להשיג מאשר דגימות BM נוגד קרישה כי קבלת BM אנטי קרישה דורש הליכים מורכבים כדי להשיג את הגרעין. בהתאם לכך, הקמנו שיטה משכנעת עבור דג מריחת BM לאיתור תאי MM.
ראשית, הכפשות BM צריכות להיעשות על ידי אנליסט מורפולוגי מנוסה. כדי להפיץ את ה- BM למריחה, המפיץ ממוקם מול השאיפה בזווית של 30°-45° ונמשך לאחור כדי ליצור קשר עם הנוזל11. לאחר מכן, המפיץ מועבר קדימה באופן אחיד בתנועה קבועה. יש להתאים את הצפיפות של מריחת ה- BM כך שהאורך הוא כשלושה רבעים מהשקופית12. סרט ה- BM חייב להיות צר יותר מהשקופית כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות תאים בכל הקצוות13. בחירת אזור ההיברידיזציה ולוקליזציה של מחשבים אישיים הייתה קריטית בפרוטוקול שלנו, וזה דורש אנליסט מורפולוגי מנוסה. עבור מריחות BM המכילות פחות מחשבים אישיים, יש להפוך את המחשבים האישיים למקוליים באמצעות מטרת טבילה של שמן מיקרוסקופ פלואורסצנטיות קדמית ו-Vernier calipers בשלב המטרה, וניתן לצלם את התמונות שלהם על-ידי צילומי מונוכרום. לדוגמה, אם המחשבים היוו רק 3% מכלל התאים הגרעינים בסרט BM על ידי בדיקה מורפולוגית, אזור היברידי מפוזר היטב של 8 מ"מ x 8 מ"מ x 8 מ"מ צריך להכיל לא פחות מ 50 מחשבים לבדיקת דגים. לאחר הכלאת FISH, אותות פלואורסצנטיות בלפחות 50 מחשבים חייבים להיספר על ידי אנליסט מנוסה14.
עם זאת, מגבלה של טכניקה זו היא הדרישה להכפשות BM טריות. אם מריחות ה- BM מאוחסנות במשך למעלה משנתיים, תמונות הדגים המתקבלות עשויות להיות מעורפלות, וכתוצאה מכך פירוש שגוי.
יחד, דג מריחת BM הנ"ל יכול לשמש בהרחבה עבור חולים עם ממאירות המטולוגית כאשר מיצוי BM קשה או ברז יבש BM מתרחשת, אפילו במחלות היפו-התפשטות עם פחות תאים גרעיניים. אנו מקווים כי יותר חולים עם ממאירות המטולוגית יכול להפיק תועלת משיטה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי קרן החדשנות של WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
