Summary
Nous présentons ici un protocole pour améliorer le succès de la détection de l’hybridation in situ par fluorescence interphasique sur les frottis de moelle osseuse de patients atteints de myélome multiple.
Abstract
La détection de l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une méthode indispensable dans la stratification du risque génétique dans le myélome multiple (MM), qui est l’une des tumeurs malignes hématologiques les plus courantes. La caractéristique d’identification du MM est l’accumulation de plasmocytes malins dans la moelle osseuse. Les rapports FISH pour MM se concentrent principalement sur les plasmocytes clonaux purifiés ou identifiés, plutôt que sur toutes les cellules nucléées, en triant avec des billes magnétiques anti-CD138 ou en marquant avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ ou λ. Les noyaux interphasiques de la moelle osseuse sont généralement obtenus à partir de cellules fraîches de la moelle osseuse. Cependant, un enrichissement satisfaisant des échantillons de plasmocytes nécessite de grandes quantités de moelle osseuse fraîche anti-coagulée à l’héparine, ce qui ne peut être obtenu en cas d’extraction difficile de la moelle osseuse ou d’un robinet sec de moelle osseuse. Ici, nous établissons une nouvelle méthode pour améliorer le succès de la détection de FISH sur les frottis de moelle osseuse colorés ou non colorés. Les frottis de moelle osseuse sont plus faciles à obtenir que les échantillons de moelle osseuse anticoagulés.
Introduction
Le myélome multiple (MM) est une maladie maligne à plasmocytes (PC) avec une forte hétérogénéité biologique et de grandes différences individuelles dans l’efficacité clinique, avec des périodes de survie allant de mois à des décennies. Les caractéristiques cytogénétiques sont des indicateurs pronostiques importants de la MM. Le système de stratification des risques et les traitements individualisés basés sur les caractéristiques génétiques sont devenus des sujets d’intérêt intense dans la recherche clinique sur le MM1. Les aberrations des PC testés dans un panel d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) de moelle osseuse (BM) comprennent del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification et 1p (CDKN2C).
La cytogénétique métaphasique standard doit être incluse dans l’évaluation initiale des patients atteints de MM. Bien que le caryotypage conventionnel à bande G offre l’avantage d’une analyse chromosomique entière, le faible rendement de cette méthode conduit à de nombreux résultats faussement négatifs2. Traditionnellement, les PC ont été considérés comme largement incapables de se diviser parce qu’ils sont les produits finaux de la différenciation des lymphocytes B. Cela rend difficile l’obtention d’images fractionnées. L’amélioration de l’analyse cytogénétique dans la MM avec des cultures à long terme (6 jours) et la stimulation des cultures par des cytokines peuvent être une méthode prometteuse pour identifier les anomalies cytogénétiques chez les patients atteints de MM nouvellement diagnostiqués3. Même lorsque le temps de culture a été prolongé à 6 jours, cependant, des anomalies cytogénétiques ont été rapportées avec précision chez 30% à 50% des patients atteints de MM4. De plus, le MM est caractérisé par des aberrations cytogénétiques complexes qui reflètent son hétérogénéité pronostique. Cependant, la résolution de la technologie traditionnelle de bandes chromosomiques est faible, ce qui peut facilement conduire à une détection manquée d’anomalies chromosomiques dans le MM.
Le FISH interphasé, de préférence après tri ou marquage à base de billes magnétiques CD138 positif à base de billes magnétiques avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ/λ, est indispensable dans l’analyse de MM5,6. Un échantillon sélectionné CD138 positif est fortement recommandé pour le rendement optimisé des cellules tumorales. Cependant, une quantification précise des aberrations cytogénétiques nécessite au moins 4 mL de BM anticoagulé pour le tri PC. De plus, les combinaisons de tri immunomagnétique de billes CD138 avec FISH ou d’immunoglobuline cytoplasmique à chaîne légère κ/λ avec test FISH (cIg-FISH) augmentent de nombreux coûts expérimentaux et prennent beaucoup de temps.
Habituellement, le rapport PC est d’abord évalué à partir de l’examen morphologique des frottis BM colorés ou des sections de biopsie BM7,8. Les échantillons BM de la plus haute qualité (premiers échantillons d’aspiration de moelle) sont utilisés pour les tests morphologiques, tandis que ceux envoyés pour FISH ou autre détection sont souvent les échantillons d’aspiration secondaire avec des rapports élevés de dilution avec le sang périphérique.
Dès les années 1990, de nombreuses études ont montré que les frottis de BM peuvent être directement utilisés pour les examens interstitiels FISH, ce qui s’est avéré être une méthode fiable et reproductible9. Une étude élégante basée sur la morphologie cellulaire et la cytochimie de l’estérase combinée à FISH de sang périphérique et à des frottis de BM a confirmé sa grande importance clinique pour élucider les anomalies chromosomiques chez les patients atteints de leucémie granulocytaire et lymphocytaire10.
Ici, nous fournissons une nouvelle méthode pour améliorer le succès de la détection interphasée fish chez les patients MM.
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Protocol
Cette étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (n° 2019065). Les échantillons ont été prélevés sur un patient MM du département d’hématologie de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (Chine).
1. Préparation des frottis BM
- Placez les premiers 0,2 mL de solution BM sur une lame de verre jetable propre.
- Étalez les frottis BM à une épaisseur uniforme avec des queues pointues en retirant rapidement le BM. Ensuite, séchez naturellement.
- Couvrir les films BM avec 1 mL de solution Wright-Giemsa pendant environ 10 s à température ambiante.
- Ajouter 1 mL de tampon phosphate aux lames.
REMARQUE: Prenez soin d’empêcher la solution de colorant de sécher ou de s’écouler des lames. - Mélanger doucement la solution de colorant et la maintenir pendant 15 min à température ambiante.
- Rincez les lames à l’eau claire et séchez-les à l’air à température ambiante.
- Utilisez la microscopie optique avancée pour détecter les PC malins. Les PC doivent être bien dispersés.
2. PRÉtraitement FISH des frottis BM
- Couvrez la zone hybridée avec une solution fixative pendant 10 minutes pour décolorer et réparer les PC.
- Pour préparer une solution fixatrice fraîche, mélanger le méthanol avec de l’acide acétique glacial dans un rapport volumique de 3: 1.
- Rincez la lame à l’eau désionisée (dH2O) et séchez-la à l’air à température ambiante.
- Préchauffer un pot contenant 2x tampon SSC à 56 °C au bain-marie. Diluer fraîchement le tampon à 20x SSC avant utilisation.
- Pour préparer 20x SSC, mélanger soigneusement 176 g de chlorure de sodium et 88 g de citrate de sodium avec 800 mL de dH2O. Mesurer le pH et ajuster à pH 5,3 ± 0,2. Ensuite, ajoutez dH2O pour porter le volume final à 1 L.
- Lavez le frottis BM préparé dans le tampon SSC 2x préchauffé pendant 10 minutes, puis trempez-le dans de l’eau désionisée à température ambiante.
- Déshydratez le frottis dans un gradient d’éthanol (70%, 85% et 100% d’éthanol, chacun pendant 1 min). Sécher le frottis à l’air libre pendant 10 min.
3. BM frottis FISH et lavage
REMARQUE: Toutes les étapes ont été effectuées dans une pièce sombre pour éviter la trempe par fluorescence.
- Ajouter le mélange de sonde TP53/centromère du chromosome 17 (CEP17) à la zone d’hybridation et le recouvrir d’un couvercle. Appuyez doucement avec une pince à épiler finement pointue pour éliminer les bulles d’air par en dessous.
- Scellez tous les côtés du couvercle avec du ciment en caoutchouc pour assurer une bonne étanchéité.
- Après solidification du ciment en caoutchouc, placez la glissière sur une machine FISH automatique. Effectuer une dénaturation à 78 °C pendant 5 min, suivie d’une hybridation à 37 °C pendant la nuit.
- Récupérez la glissière de la machine FISH. Utilisez une pince à épiler finement pointue pour enlever doucement le ciment en caoutchouc.
- Immergez la glissière dans 2x SSC à température ambiante pendant environ 1 ou 2 min pour laver le couvercle.
- Laver la lame dans un tampon 0,4x SSC/0,3 % NP-40 préchauffé à 68 °C au bain-marie pendant 2 min.
- Préparer une solution de NP-40 à 0,4 % de SSC/0,3 % en mélangeant soigneusement 20 mL de SSC 20 x (pH 5,3) avec 950 mL de dH2O. Ensuite, ajoutez 3 mL de NP-40 et mélangez bien jusqu’à dissolution complète. Mesurez le pH et ajustez-le à 7,0-7,5 avec NaOH. Ensuite, ajoutez du dH2O pour porter le volume final de la solution totale à 1 L.
- Lavez les lames avec 2x SSC dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 min. Mettre debout dans l’obscurité pour bien sécher pendant 10 min.
- Ajouter 10 μL de DAPI à la zone hybridée et couvrir avec un couvercle.
4. Analyse et imagerie FISH
- Visualisez la diapositive hybridée à l’aide d’un filtre approprié sur un microscope à fluorescence.
- Utilisez un filtre optique fluorophore bleu monochromatique pour observer l’intensité de fluorescence du noyau cellulaire. Prenez des images de noyau cellulaire sous un ensemble de filtres DAPI.
- Utilisez une sonde centromère chromosomique pour montrer combien de chromosomes une cellule contient. Étiquette CEP17 avec fluorescence verte. Utilisez un filtre optique fluorophore vert à spectre pour observer l’emplacement du CEP17. Prenez une image de signaux CEP17 sous le jeu de filtres verts.
- Étiquetez le gène TP53 avec une fluorescence orange. Utilisez un filtre optique fluorophore orange à spectre pour observer TP53. Prenez une image de signaux TP53 sous cet ensemble.
- Fusionnez ces trois images et examinez-les à la recherche d’anomalies numériques.
REMARQUE: Dans une cellule interphasée normale, deux signaux orange et deux signaux verts sont observés à l’intérieur d’un noyau à fluorescence bleue, indiquant une paire de chromosomes 17 normaux (Figure 1).
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Representative Results
Lors de l’évaluation morphologique initiale d’un patient atteint de MM nouvellement diagnostiqué, 15 % des PC d’un frottis de BM présentaient des noyaux plus gros et plus sombres ainsi que de plus grandes quantités de cytoplasme que les PC normaux (Figure 2A). Le premier tube de BM anti-coagulé à l’héparine détecté par la technique de l’immunophénotype n’a révélé que 2,3% des PC aberrants monoclonaux. Le tri immunomagnétique des billes CD138 en combinaison avec FISH ou la technique cIg-FISH est essentiel pour obtenir un résultat FISH précis. Cependant, le BM aspiré est limité dans le cas où il s’agit d’un robinet sec. Des frottis de BM ont été utilisés pour tester le FISH interphasé. Un PC binucléé représentatif dans un film BM a été localisé par un étrier Vernier à l’étage du microscope à fluorescence (Figure 2B). FISH a été appliqué sur les frottis BM pour tester TP53 et CEP17. Les résultats de FISH ont montré quatre signaux orange et quatre signaux verts dans un noyau PC interphasé (Figure 2C), suggérant que quatre copies du chromosome 17 étaient localisées dans les noyaux PC métaphasiques. Les résultats du caryotypage ont été obtenus en prolongeant le temps de culture jusqu’à 3 jours et analysés à l’aide du logiciel d’analyse FISH (Figure 2D). L’exactitude des résultats FISH interphasiques sur les frottis BM a été vérifiée plus avant.
Figure 1 : Signaux normaux de la sonde TP53/CEP17 FISH pour les cellules interphasiques (1000x). L’intensité de fluorescence du noyau cellulaire était bleue, le TP53 était orange et le CEP17 était vert. Dans ces 3 cellules interphasiques normales, deux signaux orange et deux signaux verts sont apparus à l’intérieur du noyau bleu-fluorescent, indiquant deux paires du chromosome 17 normal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologie et images génétiques de la moelle osseuse (BM) chez les patients atteints de myélome multiple (MM). (A) Cellules myélomateuses à distribution groupée indiquée par les flèches (
) après coloration de Wright-Giemsa du frottis BM (1000×). (B) Cellules plasmocytoïdes binucléées indiquées par des flèches (
) sur une image en niveaux de gris prise par une caméra en noir et blanc sur un microscope à fluorescence (1000×). (C) TP53/ centromère du chromosome 17 (CEP17) test de la sonde d’hybridation in situ (FISH) pour le frottis BM. FISH révèle quatre signaux TP53 et quatre signaux CEP17 dans chaque noyau (→) (1000×). (D) Un caryogramme chromosomique anormal montre deux paires de chromosomes 17 dans un noyau (
). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’application de FISH à la stratification des risques génétiques dans le MM est essentielle. La partie critique des rapports FISH n’est pas toutes les cellules nucléées, mais les PC clonaux spécifiquement purifiés ou identifiés par tri avec des billes magnétiques anti-CD138 ou marquage avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ ou λ. L’interphase FISH après le tri PC ou cIg-FISH s’est avérée significative dans le diagnostic de MM en raison de la proportion relativement plus faible de PC dans le BM. Cependant, ces méthodes présentent certaines lacunes, notamment des processus complexes, des exigences élevées en matière d’échantillons et des coûts expérimentaux élevés. Cinquante PC peuvent être rapidement localisés par un étrier Vernier à l’étage microscope. Les frottis de BM sont beaucoup plus faciles à obtenir que les échantillons de BM anticoagulants, car l’obtention de BM anticoagulé nécessite des procédures complexes pour obtenir le noyau. En conséquence, nous avons établi une méthode convaincante pour le frottis BM FISH pour la détection des cellules MM.
Tout d’abord, les frottis de BM doivent être effectués par un analyste morphologique expérimenté. Pour étaler le BM en frottis, l’épandeur est placé devant l’aspiration à un angle de 30°-45° et tiré vers l’arrière pour entrer en contact avec le fluide11. Ensuite, l’épandeur est déplacé uniformément vers l’avant dans un mouvement régulier. La densité du frottis BM doit être adaptée de manière à ce que la longueur soit d’environ les trois quarts de la glissière12. Le film BM doit être plus étroit que la lame pour garantir que les cellules sur tous les bords peuvent être détectées13. Le choix de la zone d’hybridation et la localisation des PC ont été essentiels dans notre protocole, ce qui nécessite un analyste morphologique expérimenté. Pour les frottis BM contenant moins de PC, les PC doivent être localisés en utilisant un objectif d’immersion à l’huile du microscope à fluorescence avant et des étriers Vernier sur la scène de l’objectif, et leurs images peuvent être prises par des prises de vue monochromes. Par exemple, si les PC ne représentaient que 3 % du total des cellules nucléées dans un film BM par examen morphologique, une région hybride bien dispersée de 8 mm x 8 mm devrait contenir pas moins de 50 PC pour un test FISH. Après l’hybridation FISH, les signaux de fluorescence dans au moins 50 PC doivent être comptés par un analyste expérimenté14.
Cependant, une limitation de cette technique est l’exigence de frottis de BM frais. Si les frottis BM sont stockés pendant plus de 2 ans, les images FISH résultantes peuvent être obscures, ce qui entraîne une mauvaise interprétation.
Pris ensemble, le FRottis BM FISH mentionné ci-dessus peut être largement utilisé pour les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques lorsque l’extraction BM est difficile ou que le robinet SEC BM se produit, même dans les maladies hypo-prolifératives avec moins de cellules nucléées. Nous espérons que davantage de patients atteints de tumeurs malignes hématologiques pourront bénéficier de cette méthode.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par le Fonds d’innovation de WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
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