Summary
Hier presenteren we een protocol voor het verbeteren van het succes van interfase fluorescentie in situ hybridisatiedetectie op beenmerguitstrijkjes van patiënten met multipel myeloom.
Abstract
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) detectie is een onmisbare methode in genetische risicostratificatie bij multipel myeloom (MM), wat een van de meest voorkomende hematologische maligniteiten is. Het identificerende kenmerk van MM is geaccumuleerde kwaadaardige plasmacellen in het beenmerg. FISH-rapporten voor MM richten zich voornamelijk op gezuiverde of geïdentificeerde klonale plasmacellen, in plaats van alle kerncellen, door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ of λ. Beenmerg interfase kernen worden meestal verkregen uit verse beenmergcellen. Voor een bevredigende verrijking van plasmacelmonsters zijn echter grote hoeveelheden vers heparine-anti-gecoaguleerd beenmerg nodig, die niet kunnen worden verkregen in het geval van moeilijke beenmergextractie of een droge beenmergkraan. Hierin stellen we een nieuwe methode vast om het succes van FISH-detectie op bevlekte of niet-gekleurde beenmerguitstrijkjes te verbeteren. Beenmerguitstrijkjes zijn gemakkelijker te verkrijgen dan anticoaguleerde beenmergspecimens.
Introduction
Multipel myeloom (MM) is een kwaadaardige plasmacelziekte (PC) met een sterke biologische heterogeniteit en grote individuele verschillen in klinische werkzaamheid, met overlevingsperioden variërend van maanden tot decennia. Cytogenetische kenmerken zijn belangrijke prognostische indicatoren van MM. Het risicostratificatiesysteem en geïndividualiseerde behandelingen op basis van genetische kenmerken zijn onderwerpen van intense interesse geworden in klinisch onderzoek naar MM1. De afwijkingen van pc's getest in een fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) paneel van beenmerg (BM) omvatten del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification en 1p (CDKN2C) deletie.
Standaard metafasecytogenetica moet worden opgenomen in de eerste beoordeling van MM-patiënten. Hoewel conventionele G-gestreepte karyotypering het voordeel biedt van een hele chromosoomanalyse, leidt de lage opbrengst van deze methode tot veel vals negatieve resultaten2. Traditioneel worden pc's beschouwd als grotendeels niet in staat om te splitsen omdat ze de eindproducten zijn van B-lymfocytendifferentiatie. Dit maakt het moeilijk om gesplitste afbeeldingen te verkrijgen. Verbeterde cytogenetische analyse in MM met langetermijnculturen (6 dagen) en stimulatie van culturen door cytokines kan een veelbelovende methode zijn voor het identificeren van cytogenetische afwijkingen bij nieuw gediagnosticeerde MM-patiënten3. Zelfs wanneer de kweektijd werd verlengd tot 6 dagen, werden cytogenetische afwijkingen echter nauwkeurig gemeld bij 30% -50% van de MM-patiënten4. Bovendien wordt MM gekenmerkt door complexe cytogenetische aberraties die de prognostische heterogeniteit weerspiegelen. De resolutie van traditionele chromosoombandtechnologie is echter laag, wat gemakkelijk kan leiden tot gemiste detectie van chromosomale afwijkingen in MM.
Interfase FISH, bij voorkeur na CD138-positieve magnetische kraalgebaseerde PC-sortering of markering met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ/λ, is onmisbaar bij de analyse van MM5,6. Een CD138-positief geselecteerd monster wordt sterk aanbevolen voor de geoptimaliseerde opbrengst van tumorcellen. Nauwkeurige kwantificering van cytogenetische afwijkingen vereist echter ten minste 4 ml antistollings BM voor pc-sortering. Bovendien verhogen de combinaties van CD138 immunomagnetische kraalsortering met FISH of cytoplasmatische κ / λ lichte keten immunoglobuline met FISH-testen (cIg-FISH) tal van experimentele kosten en zijn tijdrovend.
Meestal wordt de PC-ratio eerst beoordeeld aan de hand van het morfologisch onderzoek van gekleurde BM-uitstrijkjes of BM-biopsiesecties7,8. BM-monsters van de hoogste kwaliteit (eerste mergaspiraatmonsters) worden gebruikt voor morfologische tests, terwijl die welke voor FISH of andere detectie worden verzonden, vaak de secundaire aspiraatmonsters zijn met hoge verdunningsverhoudingen met perifeer bloed.
Al in de jaren 1990 toonden meerdere studies aan dat BM-uitstrijkjes direct kunnen worden gebruikt voor interstitiële FISH-onderzoeken, wat een betrouwbare en herhaalbare methode is gebleken9. Een elegante studie op basis van celmorfologie en esterasecytochemie in combinatie met FISH van perifeer bloed en BM-uitstrijkjes bevestigde de grote klinische betekenis ervan voor het ophelderen van chromosomale afwijkingen bij patiënten met granulocytaire en lymfatische leukemie10.
Hierin bieden we een nieuwe methode voor het verbeteren van het succes van interfase FISH-detectie bij MM-patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd volgens de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de ethische commissie van het Zhongnan-ziekenhuis van de Universiteit van Wuhan (nr. 2019065). De monsters werden verzameld bij een MM-patiënt op de afdeling Hematologie, Zhongnan Hospital van de Wuhan University (China).
1. Bereiding van de BM-uitstrijkjes
- Plaats de eerste 0,2 ml BM-oplossing op een schone glazen wegwerpschuif.
- Verdeel de BM-uitstrijkjes tot uniforme dikte met scherpe staarten door de BM snel te verwijderen. Droog vervolgens op natuurlijke wijze.
- Bedek de BM-folies met 1 ml Wright-Giemsa-oplossing gedurende ongeveer 10 s bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 ml fosfaatbuffer toe aan de dia's.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de verfoplossing niet uitdroogt of van de dia's afstroomt. - Meng de kleurstofoplossing voorzichtig en houd deze gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
- Spoel de glaasjes af met schoon water en droog ze in lucht op kamertemperatuur.
- Gebruik forward light microscopie om kwaadaardige pc's te detecteren. De pc's moeten goed verspreid zijn.
2. VIS voorbewerking van de BM-uitstrijkjes
- Bedek het gehybridiseerde gebied met een fixatieve oplossing gedurende 10 minuten om de pc's te verkleuren en te repareren.
- Om een verse fixatieve oplossing te bereiden, mengt u methanol met ijsazijn in een volumeverhouding van 3:1.
- Spoel de glijbaan af met gedeïoniseerd water (dH2O) en droog het in lucht bij kamertemperatuur.
- Verwarm een pot met 2x SSC buffer voor op 56 °C in een waterbad. Verdun de buffer voor gebruik vers tot 20x SSC.
- Om 20x SSC te bereiden, mengt u 176 g natriumchloride en 88 g natriumcitraat grondig met 800 ml dH2O. Meet de pH en stel deze in op pH 5,3 ± 0,2. Voeg vervolgens dH2O toe om het uiteindelijke volume op 1 L te brengen.
- Was het voorbereide BM-uitstrijkje gedurende 10 minuten in de voorverwarmde 2x SSC-buffer, daarna dompel het bij kamertemperatuur in gedeïoniseerd water.
- Droog het uitstrijkje uit in een ethanolgradiënt (70%, 85% en 100% ethanol, elk gedurende 1 minuut). Droog het uitstrijkje gedurende 10 minuten aan de lucht.
3. BM uitstrijkje FISH en wassen
OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd in een donkere kamer om fluorescentie te voorkomen.
- Voeg het TP53/centromeer van chromosoom 17 (CEP17) sondemengsel toe aan het hybridisatiegebied en bedek het met een coverslip. Druk zachtjes met een fijn puntig pincet om luchtbellen van onderaf te verwijderen.
- Sluit alle zijden van de afdekplaat af met rubbercement om een goede dichtheid te garanderen.
- Na het stollen van het rubbercement plaatst u de schuif op een automatische FISH-machine. Voer denaturatie uit bij 78 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door hybridisatie bij 37 °C 's nachts.
- Pak de glijbaan uit de FISH-machine. Gebruik een fijn puntig pincet om het rubbercement voorzichtig te verwijderen.
- Dompel de glijbaan ongeveer 1 of 2 minuten onder in 2x SSC bij kamertemperatuur om de afdekplaat eraf te wassen.
- Was de schuif in 68 °C voorverwarmde 0,4x SSC/0,3% NP-40 buffer in een waterbad gedurende 2 min.
- Bereid 0,4x SSC/0,3% NP-40-oplossing door 20 ml 20x SSC (pH 5,3) grondig te mengen met 950 ml dH2O. Voeg vervolgens 3 ml NP-40 toe en meng grondig totdat het volledig is opgelost. Meet de pH en stel in op 7,0-7,5 met NaOH. Voeg vervolgens dH2O toe om het uiteindelijke volume van de totaaloplossing op 1 l te brengen.
- Was de glijbanen met 2x SSC gedurende 1 min in een waterbad van 37 °C. Zet rechtop in het donker om 10 min goed te drogen.
- Voeg 10 μL DAPI toe aan het gehybridiseerde gebied en bedek met een coverslip.
4. FISH-analyse en beeldvorming
- Bekijk de gehybridiseerde dia met behulp van een geschikte filterset op een fluorescentiemicroscoop.
- Gebruik een monochromatisch blauw fluorofoor optisch filter om de fluorescentie-intensiteit van de celkern te observeren. Maak celkernbeelden onder een DAPI-filterset.
- Gebruik een chromosoom centromeersonde om te laten zien hoeveel chromosomen een cel bevat. Label CEP17 met groene fluorescentie. Gebruik een spectrumgroen fluorofoor optisch filter om de locatie van CEP17 te observeren. Neem een CEP17-signaalbeeld onder de groene filterset.
- Label het TP53-gen met oranje fluorescentie. Gebruik een spectrum oranje fluorofoor optisch filter om TP53 te observeren. Neem een TP53-signaalbeeld onder deze set.
- Voeg deze drie beelden samen en onderzoek ze op numerieke afwijkingen.
OPMERKING: In een normale interfasecel worden twee oranje en twee groene signalen waargenomen in een kern met blauwe fluorescentie, wat wijst op één paar normaal chromosoom 17 (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij de eerste morfologische beoordeling van een nieuw gediagnosticeerde MM-patiënt bleek 15% van de pc's in een BM-uitstrijkje grotere en donkerdere kernen te hebben, samen met grotere hoeveelheden cytoplasma dan normale pc's (figuur 2A). De eerste buis heparine anti-gecoaguleerde BM gedetecteerd door de immunofenotype techniek onthulde slechts 2,3% van de monoklonale afwijkende pc's. CD138 immunomagnetische kraal sortering in combinatie met FISH of de cIg-FISH techniek is essentieel voor het verkrijgen van een nauwkeurig FISH-resultaat. Geaspireerde BM is echter beperkt in het geval dat het een droge kraan is. BM-uitstrijkjes werden gebruikt om interfase FISH te testen. Een representatieve binucleated PC in BM-film werd gelokaliseerd door een fluorescentiemicroscooptrap Vernier-remklauw (figuur 2B). FISH werd toegepast op de BM-uitstrijkjes om te testen op TP53 en CEP17. De FISH-resultaten toonden vier oranje en vier groene signalen in één interfase PC-kern (figuur 2C), wat suggereert dat vier kopieën van chromosoom 17 gelokaliseerd waren in de metafase PC-kernen. Karyotyperingsresultaten werden verkregen door de kweektijd tot 3 dagen te verlengen en verder te analyseren met behulp van FISH-analysesoftware (figuur 2D). De nauwkeurigheid van de interfase FISH-resultaten op de BM-uitstrijkjes werd verder geverifieerd.
Figuur 1: Normale signalen van de TP53/CEP17 FISH probe voor interfase cellen (1000x). De fluorescentie-intensiteit van de celkern was blauw, de TP53 was oranje en de CEP17 was groen. In die 3 normale interfasecellen verschenen zowel twee oranje als twee groene signalen in de blauw fluorescerende kern, wat duidt op twee paren van het normale chromosoom 17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologie en genetische beelden van beenmerg (BM) bij patiënten met multipel myeloom (MM). (A) Myeloomcellen met geclusterde verdeling aangegeven door de pijlen (
) na Wright-Giemsa-kleuring van het BM-uitstrijkje (1000×). (B) Binucleaat plasmacytoïde cellen aangegeven door pijlen (
) op een grijswaardenopname gemaakt door een zwart-witcamera op een fluorescentiemicroscoop (1000×). (C) TP53/ centromeer van chromosoom 17 (CEP17) fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) sondetest voor het BM-uitstrijkje. FISH onthult vier TP53 - en vier CEP17-signalen in elke kern (→) (1000×). (D) Abnormaal chromosoomkaryogram toont twee paar chromosoom 17 in één kern (
). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De toepassing van FISH op genetische risicostratificatie in MM is essentieel. Het kritieke deel van FISH-rapporten zijn niet alle kerncellen, maar klonale pc's die specifiek zijn gezuiverd of geïdentificeerd door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ of λ. Interphase FISH na PC-sortering of cIg-FISH bleek significant te zijn in de diagnose van MM vanwege het relatief lagere aandeel pc's in de BM. Deze methoden hebben echter enkele tekortkomingen, waaronder complexe processen, hoge monstereisen en hoge experimentele kosten. Vijftig pc's kunnen snel worden gelokaliseerd door een microscoop-trap Vernier-remklauw. BM-uitstrijkjes zijn veel gemakkelijker te verkrijgen dan bm-monsters met antistollingsmiddel, omdat het verkrijgen van anti-gecoaguleerde BM complexe procedures vereist om de kern te verkrijgen. Daarom hebben we een overtuigende methode voor BM-uitstrijkje FISH vastgesteld voor de detectie van MM-cellen.
Ten eerste moeten BM-uitstrijkjes worden gemaakt door een ervaren morfologische analist. Om de BM in uitstrijkjes te verspreiden, wordt de spreader onder een hoek van 30°-45° voor het aspiraat geplaatst en naar achteren getrokken om contact te maken met de vloeistof11. Vervolgens wordt de spreader gelijkmatig naar voren bewogen in een gestage beweging. De dichtheid van het BM-uitstrijkje moet zo worden afgestemd dat de lengte ongeveer driekwart van de dia is12. De BM-folie moet smaller zijn dan de dia om te garanderen dat cellen aan alle randen kunnen worden gedetecteerd13. De selectie van het hybridisatiegebied en de lokalisatie van pc's was van cruciaal belang in ons protocol, en dit vereist een ervaren morfologische analist. Voor BM-uitstrijkjes die minder pc's bevatten, moeten de pc's worden gelokaliseerd met behulp van een voorwaartse fluorescentiemicroscoop olie-onderdompelingsobjectief en Vernier-remklauwen op het objectieve podium, en hun foto's kunnen worden gemaakt door monochrome opnamen. Als de pc's bijvoorbeeld bij morfologisch onderzoek slechts 3% van de totale kerncellen in een BM-film uitmaakten, moet een goed gedispergeerd hybride gebied van 8 mm x 8 mm niet minder dan 50 pc's bevatten voor een FISH-test. Na FISH-hybridisatie moeten fluorescentiesignalen in ten minste 50 pc's worden geteld door een ervaren analist14.
Een beperking van deze techniek is echter de vereiste voor verse BM-uitstrijkjes. Als de BM-uitstrijkjes langer dan 2 jaar worden bewaard, kunnen de resulterende FISH-beelden onduidelijk zijn, wat resulteert in een verkeerde interpretatie.
Alles bij elkaar kan het bovengenoemde BM-uitstrijkje FISH op grote schaal worden gebruikt voor patiënten met hematologische maligniteiten wanneer BM-extractie moeilijk is of BM droge kraan optreedt, zelfs bij hypoproliferatieve ziekten met minder kerncellen. We hopen dat meer patiënten met hematologische maligniteiten baat kunnen hebben bij deze methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door het Innovatiefonds van WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
