Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Verbesserung des Erfolgs des Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsnachweises bei Knochenmarkabstrichen von Patienten mit multiplem Myelom vor.
Abstract
Der Nachweis der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine unverzichtbare Methode bei der genetischen Risikostratifizierung beim multiplen Myelom (MM), einem der häufigsten hämatologischen Malignome. Das identifizierende Merkmal von MM sind angesammelte bösartige Plasmazellen im Knochenmark. FISH-Berichte für MM konzentrieren sich hauptsächlich auf gereinigte oder identifizierte klonale Plasmazellen und nicht auf alle kernhaltigen Zellen, indem sie mit Anti-CD138-Magnetkügelchen sortiert oder mit zytoplasmatischer Immunglobulin-Leichtkette κ oder λ markiert werden. Knochenmark-Interphasenkerne werden in der Regel aus frischen Knochenmarkzellen gewonnen. Eine zufriedenstellende Anreicherung von Plasmazellproben erfordert jedoch große Mengen an frischem Heparin-antikoaguliertem Knochenmark, das bei schwieriger Knochenmarkextraktion oder einem trockenen Knochenmarkhahn nicht erhalten werden kann. Hierin etablieren wir eine neuartige Methode, um den Erfolg des FISH-Nachweises auf gefärbten oder ungefärbten Knochenmarkabstrichen zu verbessern. Knochenmarkabstriche sind leichter zu erhalten als antikoagulierte Knochenmarkproben.
Introduction
Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne Plasmazellerkrankung (PC) mit starker biologischer Heterogenität und großen individuellen Unterschieden in der klinischen Wirksamkeit, mit Überlebenszeiten von Monaten bis Jahrzehnten. Zytogenetische Merkmale sind wichtige prognostische Indikatoren für MM. Das Risikostratifizierungssystem und individualisierte Behandlungen, die auf genetischen Merkmalen basieren, sind zu Themen von intensivem Interesse in der klinischen Forschung zu MM1 geworden. Zu den Aberrationen von PCs, die in einem Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungspanel (FISH) aus Knochenmark (BM) getestet wurden, gehören del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) Verstärkung/Verstärkung und 1p (CDKN2C) Deletion.
Die Standard-Metaphasenzytogenetik sollte in die Erstbeurteilung von MM-Patienten einbezogen werden. Obwohl die konventionelle G-Band-Karyotypisierung den Vorteil einer Ganzchromosomenanalyse bietet, führt die geringe Ausbeute dieser Methode zu vielen falsch negativen Ergebnissen2. Traditionell wurden PCs als weitgehend unfähig zur Spaltung angesehen, da sie die Endprodukte der B-Lymphozyten-Differenzierung sind. Dies macht es schwierig, geteilte Bilder zu erhalten. Eine verbesserte zytogenetische Analyse in MM mit Langzeitkulturen (6 Tage) und die Stimulation von Kulturen durch Zytokine können eine vielversprechende Methode zur Identifizierung zytogenetischer Anomalien bei neu diagnostizierten MM-Patienten sein3. Selbst wenn die Kulturzeit auf 6 Tage verlängert wurde, wurden zytogenetische Anomalien bei 30%-50% der MM-Patienten genau berichtet4. Darüber hinaus zeichnet sich MM durch komplexe zytogenetische Aberrationen aus, die seine prognostische Heterogenität widerspiegeln. Die Auflösung der traditionellen Chromosomenbanding-Technologie ist jedoch gering, was leicht zu einer verpassten Erkennung von Chromosomenanomalien in MM führen kann.
Interphase FISH, vorzugsweise nach CD138-positiver magnetischer Perlen-basierter PC-Sortierung oder Markierung mit zytoplasmatischer Immunglobulin-Leichtkette κ/λ, ist bei der Analyse von MM5,6 unverzichtbar. Für die optimierte Ausbeute an Tumorzellen wird dringend eine CD138-positive ausgewählte Probe empfohlen. Die genaue Quantifizierung zytogenetischer Aberrationen erfordert jedoch mindestens 4 ml antikoaguliertes BM für die PC-Sortierung. Darüber hinaus erhöhen die Kombinationen von entweder CD138-Immunmagnetperlensortierung mit FISH oder zytoplasmatischem κ/λ-Leichtketten-Immunglobulin mit FISH-Test (cIg-FISH) zahlreiche experimentelle Kosten und sind zeitaufwendig.
In der Regel wird das PC-Verhältnis zunächst aus der morphologischen Untersuchung von gefärbten BM-Abstrichen oder BM-Biopsieabschnitten beurteilt7,8. BM-Proben von höchster Qualität (erste Markaspiratproben) werden für morphologische Tests verwendet, während diejenigen, die zum FISH- oder anderen Nachweis geschickt werden, oft die sekundären Aspiratproben mit hohen Verdünnungsverhältnissen mit peripherem Blut sind.
Bereits in den 1990er Jahren zeigten mehrere Studien, dass BM-Abstriche direkt für interstitielle FISH-Untersuchungen verwendet werden können, was sich als zuverlässige und wiederholbare Methode erwiesen hat9. Eine elegante Studie, die auf Zellmorphologie und Esterasezytochemie in Kombination mit FISH aus peripherem Blut und BM-Abstrichen basierte, bestätigte ihre große klinische Bedeutung für die Aufklärung von Chromosomenanomalien bei Patienten mit granulozytärer und lymphatischer Leukämie10.
Hierin stellen wir eine neuartige Methode zur Verfügung, um den Erfolg des Interphasen-FISH-Detektions bei MM-Patienten zu verbessern.
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Protocol
Diese Studie wurde nach den Grundsätzen der Helsinki-Erklärung durchgeführt und von der Ethikkommission des Zhongnan-Krankenhauses der Universität Wuhan (Nr. 2019065) genehmigt. Die Proben wurden von einem MM-Patienten in der Abteilung für Hämatologie des Zhongnan-Krankenhauses der Universität Wuhan (China) entnommen.
1. Vorbereitung der BM-Abstriche
- Legen Sie die ersten 0,2 ml BM-Lösung auf einen sauberen Einweg-Glasobjektträger.
- Verteilen Sie die BM-Abstriche auf gleichmäßige Dicke mit scharfen Schwänzen, indem Sie den BM schnell entfernen. Dann natürlich trocknen.
- Decken Sie die BM-Folien mit 1 ml Wright-Giemsa-Lösung für ca. 10 s bei Raumtemperatur ab.
- Fügen Sie 1 ml Phosphatpuffer zu den Objektträgern hinzu.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Farbstofflösung nicht austrocknet oder von den Objektträgern abfließt. - Mischen Sie die Farbstofflösung vorsichtig und halten Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Objektträger mit sauberem Wasser ab und trocknen Sie sie an der Luft bei Raumtemperatur.
- Verwenden Sie die Vorwärtslichtmikroskopie, um bösartige PCs zu erkennen. Die PCs sollten gut verteilt sein.
2. FISH-Vorverarbeitung der BM-Abstriche
- Decken Sie den hybridisierten Bereich 10 Minuten lang mit Fixierlösung ab, um die PCs zu verfärben und zu fixieren.
- Zur Herstellung einer frischen Fixierlösung mischen Sie Methanol mit Eisessigsäure in einem Volumenverhältnis von 3:1.
- Spülen Sie den Objektträger mit entionisiertem Wasser (dH2O) ab und trocknen Sie ihn an der Luft bei Raumtemperatur.
- Ein Glas mit 2x SSC-Puffer in einem Wasserbad auf 56 °C vorheizen. Verdünnen Sie den Puffer vor Gebrauch frisch auf 20x SSC.
- Um 20x SSC herzustellen, mischen Sie 176 g Natriumchlorid und 88 g Natriumcitrat gründlich mit 800 ml dH2O. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn auf pH 5,3 ± 0,2 ein. Fügen Sie dann dH2O hinzu, um das endgültige Volumen auf 1 L zu bringen.
- Waschen Sie den vorbereiteten BM-Abstrich im vorgewärmten 2x SSC-Puffer für 10 min, gefolgt von einem Eintauchen in deionisiertes Wasser bei Raumtemperatur.
- Dehydrieren Sie den Abstrich in einem Ethanolgradienten (70%, 85% und 100% Ethanol, jeweils für 1 min). Trocknen Sie den Abstrich 10 Minuten lang an der Luft.
3. BM Abstrich FISH und Waschen
HINWEIS: Alle Schritte wurden in einem dunklen Raum durchgeführt, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern.
- Fügen Sie das TP53 / Zentromer des Chromosoms 17 (CEP17) Sondenmischung in den Hybridisierungsbereich hinzu und bedecken Sie es mit einem Deckglas. Drücken Sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um Luftblasen von unten zu entfernen.
- Versiegeln Sie alle Seiten des Deckglases mit Gummizement, um eine gute Dichtheit zu gewährleisten.
- Nach dem Erstarren des Gummizements den Schlitten auf eine automatische FISH-Maschine legen. Denaturierung bei 78 °C für 5 min, gefolgt von Hybridisierung bei 37 °C über Nacht.
- Nehmen Sie die Folie von der FISH-Maschine auf. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um den Gummizement vorsichtig zu entfernen.
- Tauchen Sie die Rutsche in 2x SSC bei Raumtemperatur für ca. 1 oder 2 min ein, um den Deckglas abzuwaschen.
- Waschen Sie den Objektträger in 68 °C vorgewärmtem 0,4x SSC/0,3% NP-40 Puffer in einem Wasserbad für 2 min.
- Bereiten Sie 0,4x SSC / 0,3% NP-40-Lösung vor, indem Sie 20 ml 20x SSC (pH 5,3) gründlich mit 950 ml dH2O mischen. Dann fügen Sie 3 ml NP-40 hinzu und mischen Sie gründlich, bis sie vollständig aufgelöst sind. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn mit NaOH auf 7,0-7,5 ein. Fügen Sie dann dH2O hinzu, um das endgültige Volumen der Gesamtlösung auf 1 L zu bringen.
- Waschen Sie die Dias mit 2x SSC in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 min. Im Dunkeln aufrecht aufgestellt, um 10 min gründlich zu trocknen.
- Geben Sie 10 μL DAPI in den hybridisierten Bereich und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.
4. FISH-Analyse und Bildgebung
- Betrachten Sie den hybridisierten Objektträger mit einem geeigneten Filterset auf einem Fluoreszenzmikroskop.
- Verwenden Sie einen monochromatischen blauen fluorophoren optischen Filter, um die Fluoreszenzintensität des Zellkerns zu beobachten. Nehmen Sie Zellkernbilder unter einem DAPI-Filtersatz auf.
- Verwenden Sie eine Chromosomenzentromersonde, um zu zeigen, wie viele Chromosomen eine Zelle enthält. Kennzeichnen Sie CEP17 mit grüner Fluoreszenz. Verwenden Sie einen optischen Spektrumfilter für grünes Fluorophor, um den Standort von CEP17 zu beobachten. Nehmen Sie ein CEP17-Signalbild unter dem grünen Filterset auf.
- Kennzeichnen Sie das TP53-Gen mit oranger Fluoreszenz. Verwenden Sie einen optischen Fluorophorfilter mit Spektrum, um TP53 zu beobachten. Nehmen Sie ein TP53-Signalbild unter diesem Set auf.
- Führen Sie diese drei Bilder zusammen und untersuchen Sie sie auf numerische Anomalien.
HINWEIS: In einer normalen Interphasenzelle werden zwei orange und zwei grüne Signale in einem Kern mit blauer Fluoreszenz beobachtet, was auf ein Paar des normalen Chromosoms 17 hinweist (Abbildung 1).
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Representative Results
In der ersten morphologischen Beurteilung eines neu diagnostizierten MM-Patienten wurde festgestellt, dass 15% der PCs in einem BM-Abstrich größere und dunklere Kerne zusammen mit größeren Mengen an Zytoplasma als normale PCs aufwiesen (Abbildung 2A). Die erste Röhre von Heparin antikoaguliertem BM, die mit der Immunphänotyp-Technik nachgewiesen wurde, zeigte nur 2,3% der monoklonalen aberranten PCs. Die CD138-Immunperlensortierung in Kombination mit FISH oder der cIg-FISH-Technik ist für die Erzielung eines genauen FISH-Ergebnisses unerlässlich. Die abgesaugte BM ist jedoch begrenzt, wenn es sich um einen trockenen Wasserhahn handelt. BM-Abstriche wurden verwendet, um Interphasen-FISH zu testen. Ein repräsentativer binukleierter PC in BM-Folie wurde durch einen Fluoreszenzmikroskop-Stufen-Vernier-Bremssattel lokalisiert (Abbildung 2B). FISH wurde auf die BM-Abstriche aufgetragen, um auf TP53 und CEP17 zu testen. Die FISH-Ergebnisse zeigten vier orange und vier grüne Signale in einem Interphasen-PC-Kern (Abbildung 2C), was darauf hindeutet, dass vier Kopien von Chromosom 17 in den Metaphasen-PC-Kernen lokalisiert waren. Die Ergebnisse der Karyotypisierung wurden durch Verlängerung der Kulturzeit auf bis zu 3 Tage erhalten und mit der FISH-Analysesoftware weiter analysiert (Abbildung 2D). Die Genauigkeit der Interphase-FISH-Ergebnisse auf den BM-Abstrichen wurde weiter überprüft.
Abbildung 1: Normalsignale der FISH-Sonde TP53/CEP17 für Interphasenzellen (1000x). Die Fluoreszenzintensität des Zellkerns war blau , der TP53 war orange und der CEP17 war grün. In diesen 3 normalen Interphasenzellen erschienen sowohl zwei orange als auch zwei grüne Signale im blau fluoreszierenden Kern, was auf zwei Paare des normalen Chromosoms 17 hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Morphologie und genetische Bilder von Knochenmark (BM) bei Patienten mit multiplem Myelom (MM). (A) Myelomzellen mit geclusterter Verteilung, die durch die Pfeile angezeigt werden () nach Wright-Giemsa-Färbung des BM-Abstrichs (
1000×). (B) Binukleate plasmazytoide Zellen, die durch Pfeile
() auf einem Graustufenbild angezeigt werden, das von einer Schwarz-Weiß-Kamera mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurde (1000×). (C) TP53/ Zentromer des Chromosoms 17 (CEP17) Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungssondentest (FISH) für den BM-Abstrich . FISH zeigt vier TP53- und vier CEP17-Signale in jedem Kern (→) (1000×). (D) Abnormes Chromosomenkaryogram zeigt zwei Paare von Chromosom 17 in einem Kern (
). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Anwendung von FISH auf die genetische Risikostratifizierung in MM ist von wesentlicher Bedeutung. Der kritische Teil der FISH-Berichte sind nicht alle kernhaltigen Zellen, sondern klonale PCs, die spezifisch gereinigt oder identifiziert wurden, indem sie mit Anti-CD138-Magnetkügelchen sortiert oder markiert wurden. Interphase FISH nach PC-Sortierung oder cIg-FISH erwies sich aufgrund des relativ geringen Anteils an PCs im BM als signifikant bei der Diagnose von MM. Diese Methoden weisen jedoch einige Mängel auf, darunter komplexe Prozesse, hohe Probenanforderungen und hohe experimentelle Kosten. Fünfzig PCs können mit einem Mikroskop-Stufe-Vernier-Bremssattel schnell lokalisiert werden. BM-Abstriche sind viel einfacher zu erhalten als gerinnungshemmende BM-Proben, da die Gewinnung von antikoaguliertem BM komplexe Verfahren erfordert, um den Kern zu erhalten. Dementsprechend haben wir eine überzeugende Methode für den BM-Abstrich FISH zum Nachweis von MM-Zellen etabliert.
Zuerst sollten BM-Abstriche von einem erfahrenen morphologischen Analytiker durchgeführt werden. Um den BM in Abstriche zu streuen, wird der Spreizer in einem Winkel von 30°-45° vor den Aspirator gestellt und zurückgezogen, um Kontakt mit der Flüssigkeit aufzunehmen11. Dann wird der Spreizer gleichmäßig in einer gleichmäßigen Bewegung vorwärts bewegt. Die Dichte des BM-Abstrichs muss so angepasst werden, dass die Länge etwa drei Viertel der Folie beträgt12. Der BM-Film muss schmaler als der Objektträger sein, um zu gewährleisten, dass Zellen an allen Kanten erkannt werden können13. Die Auswahl des Hybridisierungsbereichs und die Lokalisierung von PCs war in unserem Protokoll von entscheidender Bedeutung, und dies erfordert einen erfahrenen morphologischen Analytiker. Für BM-Abstriche, die weniger PCs enthalten, sollten die PCs mit einem Öl-Tauchobjektiv für das Vorwärtsfluoreszenzmikroskop und Vernier-Messschiebern auf der Objektivstufe lokalisiert werden, und ihre Bilder können durch monochrome Aufnahmen aufgenommen werden. Wenn beispielsweise die PCs nach morphologischer Untersuchung nur 3% der gesamten kernhaltigen Zellen in einem BM-Film ausmachten, sollte eine gut verteilte Hybridregion von 8 mm x 8 mm für einen FISH-Test nicht weniger als 50 PCs enthalten. Nach der FISH-Hybridisierung müssen Fluoreszenzsignale in mindestens 50 PCs von einem erfahrenen Analytiker gezählt werden14.
Eine Einschränkung dieser Technik ist jedoch die Anforderung an frische BM-Abstriche. Wenn die BM-Abstriche länger als 2 Jahre gelagert werden, können die resultierenden FISH-Bilder obskur sein, was zu Fehlinterpretationen führt.
Zusammengenommen kann der oben erwähnte BM-Abstrich FISH ausgiebig für Patienten mit hämatologischen Malignomen verwendet werden, wenn die BM-Extraktion schwierig ist oder BM-Dry-Tap auftritt, selbst bei hypoproliferativen Erkrankungen mit weniger kernhaltigen Zellen. Wir hoffen, dass mehr Patienten mit hämatologischen Malignomen von dieser Methode profitieren können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde vom Innovationsfonds des WNLO 2018WNLOKF023 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
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