Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحضير الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز لدراسة إنتاج الجسيمات من المشابك المناعية للخلايا التائية

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

نقدم هنا بروتوكول إعادة التشكيل التدريجي للخلايا الاصطناعية التي تقدم المستضدات باستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز واستخدامها لاستجواب الإخراج المشبكي من الخلايا التائية المنشطة.

Abstract

تقدم الخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) ثلاث إشارات تنشيط للخلايا التائية المشاركة في الاتصال الجسدي: 1) المستضد ، 2) التحفيز / التكبت المشترك ، و 3) السيتوكينات القابلة للذوبان. تطلق الخلايا التائية نوعين من الجسيمات المستجيبة استجابة للتنشيط: الحويصلات عبر المشبكية (tSVs) وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ، التي تنقل الرسل بين الخلايا والسمية الخلوية الوسيطة ، على التوالي. يتم استيعاب هذه الكيانات بسرعة من قبل APCs المشاركة في اتصال جسدي مع الخلايا التائية ، مما يجعل توصيفها شاقا. تقدم هذه الورقة بروتوكول تصنيع واستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز (BSLBs) كمحاكاة للخلايا التي تقدم المستضدات (APC) لالتقاط وتحليل هذه الجسيمات عبر المشبكي. كما تم وصف بروتوكولات القياسات المطلقة لكثافات البروتين على أسطح الخلايا ، وإعادة تكوين BSLBs بهذه المستويات الفسيولوجية ، وإجراء قياس التدفق الخلوي لتتبع إطلاق الجسيمات المشبكية بواسطة الخلايا التائية. يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة آثار البروتينات الفردية ، ومخاليط الليغاند المعقدة ، ومحددات الضراوة المسببة للأمراض ، والأدوية على مخرجات المستجيب للخلايا التائية ، بما في ذلك الخلايا التائية المساعدة ، والخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا ، والخلايا التائية التنظيمية ، والخلايا التائية المعبرة عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CART).

Introduction

المشبك المناعي (IS) هو بنية جزيئية محورية تشكلت في واجهة الخلايا المشاركة في الاتصال المادي الذي يسهل التبادل المنظم للمعلومات juxtracrine. تم وصف ISs مختلفة في الأدبيات ، وتشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن هذه المحاور الجزيئية هي سمة محفوظة للشبكات الخلوية. تتبادل الخلايا المناعية المختلفة، بما في ذلك الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة والبلاعم والخلايا التائية، المعلومات عبر تجميع جهات الاتصال قصيرة العمر1. تعمل الدراسات متعددة الأطوار على تطوير فهم مجموعات فرعية جديدة من الكريات البيض والخلايا اللحمية التي تقود الشبكات الخلوية المسببة للأمراض وتعبر عن البروتينات السطحية ذات الوظائف غير المعروفة. كمدادات APC اصطناعية ، تسمح BSLBs بالتحقيق المباشر في الدور الوظيفي للبروتينات الفردية في دمج إشارات التنشيط ، أي المستضدات والتحفيز / التكبت المشترك ، بواسطة الخلايا التائية والإطلاق الناتج عن جزيئات المستجيب المشار إليها باسم الإشارة الرابعة.

تصف هذه الورقة البروتوكولات والنقاط التقنية الحرجة التي يجب مراعاتها أثناء استخدام BSLBs لمحاكاة التركيب السطحي ل APCs النموذجية. يتم تقديم بروتوكولات القياس الكمي للمستقبلات المناعية والبروتينات السطحية الأخرى على APCs جنبا إلى جنب مع بروتوكول إعادة تشكيل APCs الاصطناعية التي تحتوي على هذه الكميات المقاسة. بعد ذلك ، يتم تقديم الخطوات المطلوبة لزراعة الخلايا التائية و BSLB جنبا إلى جنب مع بروتوكول القياس الكمي لنقل الجسيمات عبر المشبكية باستخدام قياس التدفق الخلوي. والأكثر لفتا للنظر هو أن BSLBs تسهل دراسة مجموعة مشتقة من غشاء البلازما من tSVs تسمى الإكستومات المشبكية (SEs). يتم التخلص من SEs المخصب بمستقبلات مستضدات الخلايا التائية (TCR+) استجابة لمحفزات TCR2 ويتم التقاطها بكفاءة بواسطة BSLBs3 ، مما يمثل قراءة ممتازة لتقييم الخصائص الناهضة للمستضدات وتكوين الغشاء النموذجي. يتم إطلاق الإكسوسومات CD63+ وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي (SMAPs) أيضا بواسطة الخلايا التائية المحفزة والتقاطها بواسطة BSLBs. يمكن استخدامها كقراءات إضافية للتنشيط وإفراز الحبيبات الخارجية والليزتيكية الناتجة بواسطة الخلايا التائية. كما أن تعبئة الحويصلات الخارجية إلى القطب المتفاعل للخلية التائية تسهل أيضا الإطلاق الاتجاهي للسيتوكينات ، مثل IL-2 و IFN-γ و IL-10 استجابة للتنشيط 4،5،6،7،8. على الرغم من أنه يمكن أيضا اكتشاف السيتوكينات التي تطلق الخلايا التائية على BSLBs ، إلا أنه يجري حاليا تطوير دراسة أكثر تكريسا للتحقق من صحة التحليل الكمي لإطلاق السيتوكين في المشبك المناعي.

لاستجواب كيفية تأثير تركيبات غشائية محددة على الناتج المشبكي للخلايا التائية يتطلب تحديد الكثافة الفسيولوجية لمكون الغشاء المستهدف. تعد القياسات الكمية القائمة على قياس التدفق الخلوي لبروتينات سطح الخلية خطوة أساسية في هذا البروتوكول وتتطلب: 1) استخدام الأجسام المضادة ذات الأعداد المعروفة من الفلوروكرومات لكل جسم مضاد (F / P) ، و 2) الخرز القياسي الذي يوفر مرجعا قياسيا لاستيفاء جزيئات الفلوروكروم من متوسط كثافة التألق المقاسة (MFIs).

تتكون هذه المعايير المرجعية من خمس مجموعات من الخرز ، يحتوي كل منها على عدد متزايد من الفلوروكرومات القابلة للذوبان المكافئة (MESFs) ، والتي تمتد عبر النطاق الديناميكي للكشف الاعتباطي التعسفي. تنتج هذه المجموعات السكانية القياسية قمم فلورية منفصلة ، مما يسهل تحويل وحدات التألق التعسفية إلى MESFs عن طريق الانحدار الخطي البسيط. ثم يتم استخدام MESFs الناتجة جنبا إلى جنب مع قيم الأجسام المضادة F / P لحساب متوسط عدد الجزيئات المرتبطة لكل خلية (أو BSLB في خطوات لاحقة). ثم يتيح تطبيق مساحات سطح الخلية المقدرة على متوسط عدد الجزيئات المكتشفة حساب الكثافات الفسيولوجية كجزيئات/ميكرومتر2. يمكن أيضا تكييف بروتوكول القياس الكمي هذا لقياس كثافات البروتين على الخلايا التائية وإعادة التركيب الكيميائي الحيوي لتركيبات الغشاء التي تتوسط في تكوين نقاط الاشتباك العصبي للخلايا التائية المتجانسة (أي نقاط الاشتباك العصبي T-T9). إذا لزم الأمر ، يمكن زيادة تقدير تكافؤ ارتباط الأجسام المضادة باستخدام أهداف مؤتلفة تحمل أعدادا معروفة من الفلوروكروم لكل جزيء. بعد ذلك ، يمكن حساب التكافؤ المرتبط بالأجسام المضادة لنفس مجموعة BSLB عن طريق مقارنة عدد البروتينات الفلورية المرتبطة والأجسام المضادة الكمي في وقت واحد (باستخدام اثنين مختلفين من الفلوروكرومات الكمية ومعايير MESF).

تتطلب إعادة تكوين أغشية APC تجميع الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) على حبات السيليكا 1. يمكن تسخير مخزونات الجسيمات الشحمية التي تحتوي على أنواع مختلفة من الدهون الفوسفاتية لتشكيل مصفوفة متعددة الاستخدامات ثنائية الطبقة من الدهون ، مما يتيح تثبيت البروتينات المؤتلفة مع كيمياء ربط مختلفة (يتم تفصيل إعداد الجسيمات الشحمية في 10). بمجرد تحديد الكثافة الفسيولوجية (أو الكثافات) للرباط ذي الصلة "على الخلايا" ، يتم تكييف نفس بروتوكول قياس التدفق الخلوي لتقدير تركيز البروتين المؤتلف اللازم لطلاء BSLBs بالكثافة الفسيولوجية المستهدفة. يمكن استخدام نظامي تثبيت مختلفين إما مجتمعين أو بشكل منفصل.

أولا ، SLB الذي يحتوي على 12.5 مول ٪ من الدهون الفوسفاتية المحتوية على Ni2 + يكفي لتوفير ما يقرب من 10000 موقع ربط علامته لكل ميكرون مربع 10 ويعمل بشكل جيد لتزيين BSLBs بمعظم البروتينات المتاحة تجاريا والتي لا تتجاوز كثافاتها الفسيولوجية قدرة التحميل القصوى هذه. يسخر نظام التحميل الثاني الدهون الفوسفاتية المحتوية على البيوتين (مثل مول٪) لتحميل البيوتينيل المضاد ل CD3e Fab (أو مونومرات HLA / MHC) عبر جسور الستربتافيدين. ثم يتيح الجمع بين هاتين الطريقتين للزينة BSLB الخياطة المرنة ل BSLBs كمدادات APCs اصطناعية. بالنسبة للتركيبات السطحية APC المعقدة للغاية ، يمكن زيادة نسبة المول٪ من الدهون الفوسفاتية والبروتينات لتحميل أكبر عدد ممكن من البروتينات التي يتطلبها السؤال المطروح. بمجرد تحديد تركيزات العمل من البروتينات و mol٪ من الدهون الفوسفاتية البيوتينيل ، يمكن تجميع BSLBs لاستجواب الإخراج المشبكي للخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. قياس كثافة البروتين على سطح الخلية مع قياس التدفق الخلوي الكمي

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي البشري المصفى بسعة 0.22 ميكرومتر (hFCB) عن طريق إضافة EDTA (إلى تركيز نهائي 2 ملليمتر) ومصل AB البشري (إلى 10٪ نهائي) إلى محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، الرقم الهيدروجيني 7.4 (انظر الجدول 1). قم بتصفية المحلول باستخدام وحدة تصفية مسام 0.22 ميكرومتر لإزالة شوائب المصل وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  2. استعادة الخلايا وترسبتها عن طريق الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. في كل خطوة غسيل ، أعد تعليق الخلايا الموجودة في PBS إلى الحجم الأصلي (قبل الطرد المركزي) وقم بالدوران لأسفل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  4. عد معلقات الخلايا الملطخة باللون الأزرق في مقياس الدم11. بدلا من ذلك ، عد الخلايا باستخدام استبعاد التيار الكهربائي. بالنسبة لهذا الأخير ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة CASY-TT (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يسمح عداد الخلايا CASY-TT بتحديد النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة وحجم الخلية وحجمها.
  5. احسب حجم PBS الذي يحتوي على 1:1000 تخفيف صبغة قابلة للإصلاح eFluor 780 أو ما شابه ذلك (انظر جدول المواد) المطلوبة لإعادة تعليق الخلايا إلى تركيز تلطيخ يبلغ 107 خلية / مل.
  6. أعد تعليق الخلايا باستخدام محلول صبغة PBS القابلة للحياة واحتضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  7. قم بإزالة صبغة الجدوى عن طريق إضافة حجم واحد من hFCB المثلج البارد. تدور على ارتفاع 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا، حافظ على سلسلة التبريد دون انقطاع.
  8. اغسل الخلايا باستخدام hFCB يحتوي على تخفيف 1:50 من محلول حجب مستقبلات Fc (انظر جدول المواد). اجلب الحجم إلى تركيز نهائي يبلغ 107 خلية / مل واحتضنه لمدة 15 دقيقة إضافية لتحقيق حجب FcgR فعال.
  9. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (أي 106 خلايا) لكل بئر من لوحة U-bottom أو V-bottom 96-well . حافظ على الخلايا على الجليد وحمايتها من الضوء (قم بتغطيتها بورق الألومنيوم).
  10. قم بإعداد مزيج رئيسي من الأجسام المضادة في hFCB من خلال تحديد تركيزات الأجسام المضادة المثلى لكل جسم مضاد مقترن بالفلوروكروم ، والأهم من ذلك ، لتلك الأجسام المضادة المستخدمة لتحديد كثافة البروتين السطحي. على سبيل المثال، من أجل القياس الكمي لتعبير ICAM-1 على مجموعات خلايا اللوزتين، كما هو موضح في الشكل 1، قم بإعداد مزيج يحتوي على 1:200 تخفيفات من مضادات CD4 و anti-CD19 و anti-CXCR5 جنبا إلى جنب مع تركيزات مشبعة من جسم مضاد مضاد ICAM-1 مع فلوروكرومات AF647 المعروفة لكل جسم مضاد (أي 10 ميكروغرام / مل ، والتي تم تعريفها من خلال تجارب معايرة الأجسام المضادة المستقلة).
  11. كضوابط إضافية ، قم بإعداد مزيج رئيسي للأجسام المضادة يحتوي على عناصر التحكم ذات الصلة بالنمط المتماثل للأجسام المضادة (بنفس التركيزات الفعالة مثل نظيراتها المترافقة مع نفس الفلوروكرومات لطرح الخلفية) ، أي استخدام 10 ميكروغرام / مل من عنصر تحكم النمط المتماثل AF647 ذي الصلة.
    ملاحظة: في المثال أعلاه ، يتم استخدام عنصر تحكم متساوي النمط هذا لطرح تألق الخلفية من إشارة ICAM-1 الحقيقية على الخلايا.
  12. عند تحديد كثافات البروتين على مجموعات فرعية من الخلايا الموجودة بترددات منخفضة داخل الأنسجة ، قم بإعداد التألق ناقص واحد (FMO) يحتوي على جميع الأجسام المضادة الملطخة باستثناء علامات الاهتمام (انظر مزيد من التفاصيل في 12).
  13. قم بتدوير الصفيحة المكونة من 96 بئرا تحتوي على الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر إما من المزيج الرئيسي للأجسام المضادة الكمي أو المزيج الرئيسي للأجسام المضادة متساوي النوع.
  14. احتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 4 درجات مئوية و 400 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر اللوحة. حماية الألواح من الضوء (غطاء مع رقائق الألومنيوم).
  15. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام hFCB وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  16. أعد تعليق بيليه الخلية باستخدام 200 ميكرولتر من PBS (أي إلى تركيز نهائي من 5 × 106 خلية / مل).
  17. للاستحواذ:
    1. في حالة استخدام محمل BD FACS قياسي ، انقل العينات إلى أنابيب مستديرة القاع من البوليسترين سعة 5 مل (انظر جدول المواد).
    2. في حالة استخدام أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية (HTS، ويشار إليها أيضا باسم قارئات اللوحات)، فانتقل على الفور إلى الخطوة 1.19.
  18. قبل الشروع في الحصول على البيانات لمعايير MESF ، تحقق من الحدود القصوى والدنيا لخطوط كثافة التألق لقنوات القياس الكمي.
  19. قبل التعويض ، احصل على بيانات لمعايير MESF ، مما يضمن سقوط كل من السكان الأكثر قتامة وألمع في النطاق الخطي للقياس.
  20. الحصول على عينات التعويض. حافظ على قيم جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) لقنوات القياس الكمي دون تغيير للحفاظ على النطاق الديناميكي للكشف. قم بإجراء تعديلات طفيفة في جهد PMT للقنوات الأخرى قبل حساب مصفوفات التعويض.
  21. حساب وتطبيق التعويض.
  22. احصل على ما لا يقل عن 2 × 104 حبة MESF إجمالية لكل قناة من قنوات القياس الكمي.
  23. حدد مجموعة الخلايا المفردة استنادا إلى مناطق تشتت الضوء الجانبية والأمامية (SSC-A و FSC-A ، على التوالي ، كما هو موضح في الشكل 1A (i)) ، متبوعا باختيار الأحداث داخل الاستمرارية الزمنية (الشكل 1A (ii)) ومنخفضة لوقت الطيران (W) في كل من FSC و SSC مقارنة بارتفاعاتها (أي ، FSC-W/FSC-H، تليها بوابة SSC-W/SSC-H كما هو موضح في الشكل 1A (III) و (IV)، على التوالي). حدد بوابة نهائية أحادية الحدث تحتوي على أحداث ذات توزيع FSC-A متناسب مقابل FSC-H (الشكل 1A (v)).
  24. الحصول على عينات التحكم (عناصر التحكم التي تحمل علامة isotype و FMO).
  25. الحصول على عينات وتسجيلها حتى يتم الحصول على ما لا يقل عن 10000 خلية مستهدفة.
    ملاحظة: يتطلب التحديد القوي لمتوسط الكثافات الجزيئية تحليل العديد من الجهات المانحة عبر تجارب مستقلة. هذا أمر بالغ الأهمية عند تحليل أي من المجموعات الفرعية للخلايا الموجودة في ترددات منخفضة أو مشتقة من مواد بيولوجية نادرة (على سبيل المثال ، من خزعات الأنسجة البشرية).
  26. اغسل مقياس الخلايا الذي يعمل لمدة 5 دقائق باستخدام محلول تنظيف FACS متبوعا ب 5 دقائق من الماء فائق النقاء قبل إيقاف تشغيل الجهاز. إذا كنت تستخدم HTS ، فاتبع الخيارات الموجودة أسفل علامة التبويب HTS وبرنامج Clean Plate.
    ملاحظة: لتقليل ترحيل العينة إلى العينة، قم بتنشيط خيارات غسل العينات أو خيارات غسل العينات عالية الإنتاجية أو العينة عالية الإنتاجية ، والتي ستقوم تلقائيا بغسل مقياس الخلايا بين الأنابيب أو الآبار. قبل البدء في عملية الاستحواذ ، قم بتشغيل مياه فائقة النقاء لمدة 10 دقائق بمعدل تدفق مرتفع لإزالة أي ملوثات بيولوجية غير مغسولة من خط عينة مقياس الخلايا.
  27. تصدير ملفات معيار قياس التدفق الخلوي (FCS).

2. تحليل الانحدار المتوسط (أو المتوسط) لشدة التألق (MFI) المبالغة في تصحيح MESF

  1. افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي وقم بتحميل ملفات التجربة FCS. حدد مجموعة الخرز استنادا إلى مناطق تشتت الضوء الجانبية والأمامية (SSC-A مقابل FSC-A) ، كما هو موضح في الشكل 1A (i).
  2. التحكم في جودة البيانات عن طريق التحقق من توزيع الأحداث الفردية بمرور الوقت، كما هو موضح في الخطوة 1.24.
    ملاحظة: تخلق الفقاعات فجوات في توزيع الأحداث بمرور الوقت؛ يظهر هذا عادة في بداية الاستحواذ باستخدام هيئة تحرير الشام. تجنب اختيار الأحداث المحيطة بالفجوات في وقت الاكتساب لأنها تضيف أخطاء في القياس بسبب الانحرافات البصرية.
  3. ركز على الأحداث الفردية.
    1. خلايا
      1. تحديد الخلايا المفردة أولا استنادا إلى توزيعها فيما بين بلدان الجنوب (SSC-A) وFSC-A (الشكل 1A (I))، تليها الأحداث المنخفضة بالنسبة للحرف W في البوابتين المتتابعتين FSC-W/FSC-H (المفردات-1، الشكل 1A اللوحة (III)) وSSC-W/SSC-H (المفردات-2؛ الشكل 1 ألف اللوحة (رابعا)). حدد بوابة مفردة إضافية 3 عن طريق تحديد الأحداث ذات FSC-A و FSC-H المتناسبة (الشكل 1A ، اللوحة (v)). أخيرا ، حدد الخلايا الحية على أنها تلك السلبية لصبغة الجدوى القابلة للإصلاح.
    2. حبات MESF
      1. اتبع نفس التمييز بين المفردات -1 والمفردات -3 كما في الخطوة 2-3-1-1 (الشكل 1 باء، اللوحات من (ط) إلى (ت)). تحديد كل مجموعة من مجموعات MESF (فارغة و 1 و 2 و 3 و 4) بناء على مستويات كثافة التألق الخاصة بها (انظر الشكل 1B ، اللوحة (vi)).
  4. استخراج MFI من كسور MESF فارغة و 1 إلى 4.
  5. قم بإنشاء قيم MFI (cMFI) مصححة لكسور MESF من 1 إلى 4 عن طريق طرح مؤسسات التمويل الأصغر لمجموعات الخرز الفارغة من كل كسر.
  6. احسب الخط الأنسب للعلاقة بين cMFIs وقيم MESF التي يقدمها المورد (متغير مستقل ، كونه كسرا فارغا يساوي صفرا).
  7. استخراج الميل (b في المعادلة أدناه) للانحدار الخطي ل MESF على cMFI (توضح لوحة الشكل 1B (الثامن) انحدارا يكون فيه y = a + bx ؛ مع a = 0).
  8. استخراج الوسيط (لتوزيعات التألق ثنائي النمط) أو متوسط كثافة التألق (لتوزيعات التألق الطبيعية أو الطبيعية السجلية) من المجموعات السكانية ذات الأهمية (TFH والخلايا البائية في لوحة الشكل 1A (السابع)).
  9. كما هو الحال في الخطوات 2.5-2.7 ، قم باستخراج قيم MFI من خلايا التحكم ذات العلامات المتساوية.
  10. إذا كان F/P لعناصر التحكم في النمط المتماثل هو نفسه الأجسام المضادة الكمية، فقم بتصحيح مؤسسات التمويل الأصغر للخلايا الملطخة عن طريق طرح مؤسسات التمويل الأصغر من الخلايا المصنفة بالنمط المتساوي.
  11. إذا اختلف F/P للأنماط المتماثلة عن تلك الخاصة بالأجسام المضادة الكمية، فاستخرج MESF من الأنماط المتماثلة عن طريق قسمة مؤشرات الضعف الأصغر للخلايا الموسومة بالنمط المتماثل مع حساب المنحدر في الخطوة 2.7. اطرح Isotype MESF من القياس الكمي MESF قبل تقدير الأجسام المضادة الكمي المقيدة.
  12. قسم MESF على F/P للأجسام المضادة الكمي لتقدير عدد الجزيئات المرتبطة لكل خلية (Molec. الخلية كما هو موضح في مخطط التدفق في الشكل 1C).
  13. قسم عدد الجزيئات المرتبطة مع مساحة سطح الخلية المقدرة (CSA (μm2)) لاستخراج كثافة البروتينات على شكل موليك./μm2 (الشكل 1C). ارجع إلى قسم النتائج التمثيلية لمزيد من التفاصيل.

3. أنواع الدهون الفوسفاتية الوظيفية لاستخدامها في معايرة البروتينات التي تغطي BSLBs

  1. استخدم 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) كمكون رئيسي لمصفوفة الدهون التي تشكل الطبقة الثنائية للدهون المدعومة. تمييع جميع أنواع الدهون الأخرى في محلول DOPC هذا.
  2. استخدم ما بين 0.2 و 1 مول ٪ من 0.4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) مقترنة بالأصباغ ، بما في ذلك ATTO 390 أو 488 أو 565 (انظر جدول المواد) ، لتوليد BSLBs مع التألق الداخلي.
    ملاحظة: يسهل التألق الجوهري ل BSLBs تحديد BSLBs المفردة والخلايا المفردة في تجارب النقل المتشابك.
  3. استخدم 12.5٪ مول٪ من 0.4 mM DGS-NTA (NI) ( 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl]) لتثبيت البروتينات الموسومة به. حافظ على ثبات نسبة المولي من DGS-NTA(Ni) وقم بإجراء معايرة 2 أضعاف للبروتينات الموسومة بعلامة His-التي تبدأ ب 100 نانومتر كأعلى تركيز. اترك حالة واحدة بدون بروتين كعنصر تحكم سلبي للكميات المطلقة.
    ملاحظة: تم تصميم الإشارات الملحقة وجزيئات الالتصاق ، مثل ICAM-1 ، بعلامة 12-His لزيادة تقارب البروتين ل DGS-NTA (Ni).
  4. استخدم Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) لتثبيت البروتينات البيوتينيل عبر جسور البيوتين-ستربتافيدين-البيوتين. استخدم معايرة بالتحليل الحجمي التسلسلي 5 أضعاف من 0.4 mM Biotinyl Cap PE يغطي ما بين 10 مول٪ و 0 مول٪ (كعنصر تحكم سلبي). حافظ على تركيز الستربتافيدين والبروتينات البيوتينيل ثابتة (200 نانومتر) في كل من تجارب المعايرة وإعادة تكوين APCs الاصطناعية لتجارب النقل المتشابك.
    ملاحظة: ستحدد تحليلات الانحدار للكثافات التجريبية للبروتينات البيوتينيل على نسبة المولي النهائية من Biotinyl Cap PE في مصفوفة الدهون (التي تحتوي أيضا على DGS-NTA (Ni) لتثبيت البروتينات الموسومة به) نسبة المول التي سيتم استخدامها لإعادة تشكيل الكثافات المستهدفة للمستضد.

4. تحضير محلول ملحي مخزن مؤقتا HEPES يحتوي على 1٪ من ألبومين المصل

ملاحظة: مطلوب ملحي مكمل مخزن مؤقتا ب HEPES يحتوي على 1٪ من ألبومين المصل البشري (HBS / HSA) أو 1٪ من ألبومين مصل البقر (HBS / BSA) في خطوات الغسيل وتحميل البروتين من BSLBs (الجدول 1). قم بإعداد حل مخزون HBS 10x والمخزن المؤقت العامل طازجا قدر الإمكان ؛ يحفظ في الثلاجة ويستخدم في غضون شهر واحد. في حين أن BSA هو بديل أرخص ل HSA ، إلا أنه يوفر انسدادا فعالا للدهون المخلبة Ni-chelating 13 ويوصى به للتجارب عالية الإنتاجية.

  1. قم بإعداد محلول مخزن مؤقت للمخزون 10x من HBS المكمل الذي يحتوي على 200 mM HEPES و 7 mM Na2HPO4 و 1400 mM NaCl و 50 mM KCl و 60 mM glucose و 10 mM CaCl2 و 20 mM MgCl2.
    ملاحظة: إذابة MgCl2 طاردة للحرارة للغاية وخطر الحرق. أضف هذا الملح ببطء وعلى كمية كبيرة من المذيبات. تجنب تحضير المحاليل المركزة (أي 1 متر) من هذه الأملاح لأنها تميل إلى الترسب بمرور الوقت ، مما يجعل إضافتها الدقيقة إلى المخزن المؤقت العامل صعبة.
  2. قم بتصفية محلول 10x باستخدام وحدة مرشح 0.22 ميكرومتر وابقيه معقما عند 4 درجات مئوية.
  3. بالنسبة إلى 500 مل من HBS / has ، خذ 50 مل من محلول HBS المكمل 10x ، واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 إذا لزم الأمر ، واجعل الحجم يصل إلى 483.4 مل بماء فائق النقاء.
  4. أضف 16.6 مل من محلول HSA بنسبة 30٪ إلى 483.4 مل من HBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4.
  5. بالنسبة ل 500 مل من HBS / BSA ، قم بإذابة 5 جم من BSA في HBS واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم اخلطي بلطف في RT عن طريق قلب الزجاجة بشكل دوري حتى لا تكون هناك بلورات أو كتل بروتين مرئية.
  6. قم بتصفية المحلول الناتج من الخطوة 4.5 باستخدام وحدة مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.

5. معايرة كثافة البروتين على BSLBs

  1. قبل أخذ حبات السيليكا غير الوظيفية التي يبلغ قطرها 5.00 ±0.05 ميكرومتر ، امزج محلول المخزون جيدا وأعد تعليق أي كتل كبيرة من الخرز المترسب في قاع القوارير.
    ملاحظة: تميل حبات السيليكا إلى الرواسب بسرعة ، مما قد يؤدي إلى أخطاء العد. امزج بقوة عن طريق سحب نصف الحد الأقصى لحجم الماصة الدقيقة P1000 لأعلى ولأسفل.
  2. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من محلول الخرز في 1000 ميكرولتر من PBS ، وقم بحساب الخرز باستخدام غرفة قياس الدم ، واحسب تركيزها لكل مل.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة إلى تلطيخ التربان الأزرق لتصور حبات السيليكا.
  3. احسب حجم حبات السيليكا اللازمة ل 5 × 105 BSLBs نهائية لكل نقطة من المعايرة.
  4. انقل الحجم المطلوب من حبات السيليكا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل.
  5. اغسل حبات السيليكا ثلاث مرات ب 1 مل من PBS المعقمة ، وقم بالطرد المركزي للخرز لمدة 15 ثانية على جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة في RT (عند دورة ثابتة في الدقيقة).
    ملاحظة: عند إزالة محلول الغسيل، تجنب إزعاج حبيبات الخرز. لن يؤثر عمود المخزن المؤقت الصغير على انتشار الجسيمات الشحمية التي تشكل المزيج الرئيسي للجسمات الشحمية لأنها موجودة أيضا في PBS.
  6. قم بإعداد ثلاثة مجلدات من المزيج الرئيسي للجسم الشحمي لتجميع BSLB على حبات السيليكا المغسولة (على سبيل المثال ، إذا كان الحجم الإجمالي الأولي لخرز السيليكا هو 20 ميكرولتر ، فقم بإعداد ما لا يقل عن 60 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للليبوسوم).
  7. لمعايرة البيوتينيل كاب بي إي مول٪
    1. تحضير الخلطات الرئيسية للدهون التي تحتوي على 5 أضعاف التخفيفات من بيوتينيل كاب PE.
      1. قم بتخفيف 0.4 mM Biotinyl Cap PE mol٪ في مصفوفة DOPC 100٪.
      2. امزج كل نقطة معايرة Biotinyl Cap PE mol٪ عند نسبة 1: 1 (vol: vol) بمحلول 0.4 mM 25٪ DGS-NTA (Ni) بحيث يوجد 12.5٪ مول نهائي من الدهون المحتوية على Ni في جميع المعايرة بالمعايرة.
        ملاحظة: تمثل نسبة 12.5٪ مول (vol:vol٪) من الدهون المحتوية على Ni تركيبة الدهون المختلطة من BSLBs التي يمكن أيضا اختبار البروتينات الموسومة عليها في معايرات متوازية. على سبيل المثال ، نظرا لأن جميع مخزونات الجسيمات الشحمية يتم تحضيرها بنفس التركيز المولي ، للوصول إلى خليط mol٪ المستهدف في 200 ميكرولتر من مزيج الجسيمات الشحمية النهائي ، ما عليك سوى خلط 100 ميكرولتر من 25 mol ٪ من DGS-NTA المحتوي على Ni مع 100 ميكرولتر من 100 mol ٪ DOPC.
    2. نقل 5 × 105 حبات سيليكا مغسولة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل ، بحيث يتم تجميع نقطة معايرة واحدة من Biotinyl Cap PE mol٪ لكل أنبوب.
    3. أضف خلطات البيوتينيل كاب بي إي مول٪ الرئيسية للمعايرة إلى حبات السيليكا المغسولة واخلطها بلطف عن طريق سحب نصف الحجم الإجمالي لأعلى ولأسفل. تجنب تشكيل فقاعات ، والتي تدمر بشكل زائد الطبقة الثنائية للدهون.
    4. أضف غاز الأرجون (أو النيتروجين) على الأنبوب الذي يحتوي على BSLBs التي تتشكل الآن لإزاحة الهواء وحماية الدهون من الأكسدة أثناء الخلط.
    5. أضف الأرجون إلى مخزون الدهون 0.4 مللي متر قبل التخزين وتعامل معه باستخدام تقنية معقمة.
      ملاحظة: قم بتوصيل أنبوب صغير بأسطوانة غاز الأرجون/النيتروجين. قبل إضافة الغاز إلى الأنابيب ، اضبط منظم أسطوانة الغاز بحيث لا يزيد الضغط عن 2 رطل لكل بوصة مربعة. قم بتوصيل طرف ماصة معقم بأنبوب المخرج لتوجيه تيار الغاز داخل مخزون الجسيمات الشحمية لمدة 5 ثوان وأغلق الغطاء بسرعة. في حالة مخزون الدهون ، أغلق غطاء الأنبوب بفيلم البارافين قبل تخزينه عند 4 درجات مئوية.
    6. انقل BSLBs إلى خلاط مختبري عمودي متغير الزاوية (انظر جدول المواد) واخلطه لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام خلط مداري يبلغ 10 دورات في الدقيقة.
      ملاحظة: هذه الخطوة سوف تمنع ترسيب الخرز أثناء تشكيل الطبقة الثنائية الدهون المدعومة.
    7. قم بتدوير الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من HBS / HSA (BSA) لإزالة الجسيمات الشحمية الزائدة.
    8. قم بحظر BSLBs المشكلة عن طريق إضافة 1 مل من الكازين بنسبة 5٪ أو 5٪ BSA التي تحتوي على 100 ميكرومتر من NiSO4 لتشبع مواقع NTA و 200 نانومتر من الستربتافيدين لتغطية جميع مواقع تثبيت البيوتين على BSLBs بشكل موحد. اخلطي بلطف عن طريق سحب نصف الحجم الإجمالي لأعلى ولأسفل واحتضنيه في الخلاط الرأسي لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة عند RT و 10 دورات في الدقيقة.
    9. قم بتدوير BSLBs عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA).
      ملاحظة: حافظ على الخرز المغسول عموديا مع حجم صغير من المخزن المؤقت للغسيل الذي يغطي BSLBs. تجنب جفاف BSLBs لأن الهواء سيدمر الطبقة الثنائية للدهون.
  8. لمعايرة البروتينات الموسومة على 12.5٪ مول٪ من BSLBs المحتوية على DGS-(Ni) NTA
    1. تحضير ثلاثة مجلدات من المزيج الرئيسي للشحم يحتوي على 12.5 مول النهائي من DGS-NTA (Ni).
    2. استخدم المزيج الرئيسي للجسمات الشحمية لإعادة تعليق حبات السيليكا المغسولة واخلطها بلطف عن طريق سحب نصف الحجم الإجمالي لأعلى ولأسفل. تجنب تشكيل الفقاعات ، والتي تلحق الضرر الزائد بالطبقة الثنائية للدهون.
    3. أضف غاز الأرجون (أو النيتروجين) على الأنبوب الذي يحتوي على BSLBs التي تتشكل الآن لإزاحة الهواء وحماية الدهون من الأكسدة أثناء الخلط.
    4. أضف الأرجون إلى مخزون الدهون 0.4 مللي متر قبل التخزين وتعامل معه باستخدام تقنية معقمة.
    5. انقل BSLBs إلى الخلاط الرأسي واخلطها لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام الخلط المداري عند 10 دورات في الدقيقة.
    6. قم بتدوير الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من HBS / HSA (BSA) لإزالة الجسيمات الشحمية الزائدة.
    7. قم بحظر BSLBs المشكلة عن طريق إضافة 1 مل من الكازين بنسبة 5٪ (أو 5٪ BSA) التي تحتوي على 100 ميكرومتر من NiSO4 لتشبع مواقع NTA على BSLBs. امزج بلطف واحتضن في الخلاط الرأسي لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة عند RT و 10 دورة في الدقيقة.
    8. يغسل ثلاث مرات باستخدام HBS / HSA (BSA) لإزالة محلول الحجب الزائد.
    9. في لوحة U-bottom 96-well الجديدة ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية 2 أضعاف للبروتينات.
      1. قم بإعداد تركيز بدء قدره 100 نانومتر للبروتين ذي الأهمية في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA) ، وقم بتوزيع 100 ميكرولتر من هذا المحلول في العمود الأول ، و 100 ميكرولتر المتبقية أعلى العمود رقم 2 الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA).
      2. استمر في نقل 100 ميكرولتر بشكل متسلسل من العمود #2 إلى العمود #3 وكرر ذلك حسب الضرورة لتغطية جميع نقاط المعايرة. اترك العمود الأخير من السلسلة بدون بروتين ، حيث سيتم استخدامه كمرجع فارغ للقياس الكمي.
    10. أعد تعليق BSLBs المعدة في وحدة تخزين بحيث يتم احتواء 5 × 105 BSLB في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA).
    11. انقل 100 ميكرولتر من نظام تعليق BSLB إلى آبار صفيحة ثانية ذات 96 بئرا ذات قاع U ، بحيث يتلقى كل بئر 5 × 105 BSLBs.
    12. قم بتدوير اللوحة الثانية التي تحتوي على BSLBs لمدة 2 دقيقة عند 300 × جم و RT وتخلص من supernatant.
    13. انقل أحجام 100 ميكرولتر من لوحة معايرة البروتين إلى اللوحة التي تحتوي على BSLBs الرسوبية. اخلطي بلطف ، وتجنب توليد الفقاعات الزائد أثناء السحب ، واحتضنيها لمدة 30 دقيقة عند RT و 1000 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر اللوحة. حماية من الضوء مع رقائق الألومنيوم.
    14. اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA) باستخدام خطوات ترسيب تبلغ 300 × جم لمدة 2 دقيقة في RT.
    15. إذا كان البروتين المؤتلف المستخدم في المعايرة مقترنا مباشرة بالفلوروكرومات وله قيم F/P معروفة، فانتقل إلى الخطوة 5.8.20.
    16. إذا كان البروتين المؤتلف المستخدم في المعايرة غير مصنف أو مقترنا بالفلوروكروم أو لم يكن هناك معيار خرزة MESF متاح ، فاستخدم الأجسام المضادة المقترنة Alexa Fluor 488 أو 647 مع قيم F / P المعروفة لتلطيخ BSLB المغلف بالبروتين.
    17. وصمة عار مع تركيزات مشبعة من الأجسام المضادة الكمية.
      ملاحظة: اعتمادا على مستوى التعبير المستهدف ، تتراوح هذه بين 5 و 10 ميكروغرام / مل.
    18. قم باللصق لمدة 30 دقيقة عند RT و 1000 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر اللوحة. حماية من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
    19. يغسل مرتين باستخدام المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA) ومرة واحدة باستخدام PBS باستخدام خطوات ترسيب تبلغ 300 × جم لمدة 2 دقيقة في RT.
      ملاحظة: استخدم PBS، الرقم الهيدروجيني 7.4 لإعادة تعليق BSLBs المغسولة قبل الاستحواذ. لا تستخدم المخازن المؤقتة التي تحتوي على البروتين ، لأن هذا يؤدي إلى تكوين فقاعات أثناء الخلط التلقائي للعينات مع أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية.
    20. الحصول على معايير MESF ، والتأكد من بقاء ألمع القمم في نطاق الكشف الخطي لكاشف القياس الكمي (القناة) ، كما هو موضح في الشكل 1B (السابع ).
    21. الحصول على العينات يدويا أو باستخدام هيئة تحرير الشام. في حالة استخدام هذا الأخير ، أعد تعليق BSLBs في 100 ميكرولتر من PBS واحصل على 80 ميكرولتر باستخدام معدل تدفق يتراوح بين 2.5 و 3.0 ميكرولتر / ثانية ، وحجم خلط يبلغ 100 ميكرولتر (أو 50٪ من الحجم الإجمالي إذا كان حجم إعادة التعليق أقل) ، وسرعة خلط 150 ميكرولتر / ثانية ، وخمسة خلطات لضمان تشتت BSLBs أحاديا.
    22. تصدير ملفات FCS.
    23. ركز على الأحداث الفردية للتحليلات (الشكل 2 أ) ، حيث أن الثنائيات أو التوائم الثلاثة ستؤدي إلى خطأ في التحديد. استخدم التعريف المتداخل للأحداث الفردية كما هو موضح في خطوة البروتوكول 1.2.3.
    24. قم بقياس مؤشر MFI لكل كسر MESF (1-4) واطرح MFI من الخرز الفارغ لاستخراج مؤسسات التمويل الأصغر المصححة (cMFI).
    25. قم بإجراء تحليل الانحدار الخطي لاستخراج الميل (ب) من MESF فوق cMFI المحسوب لمعايير MESF ، والتي سيتم استخدامها في الخطوة 5.33.
    26. استخراج MFI لكل نقطة معايرة وطرح MFI من الخرز بدون بروتين للحصول على cMFIs.
    27. قسم cMFIs مع الميل المحسوب في الخطوة 5.31 لاستخراج MESF المرتبط ب BSLBs لكل نقطة معايرة.
    28. قسم MESF المرتبط ب BSLBs على قيمة F / P للجسم المضاد الكمي لاستخراج متوسط عدد الجزيئات المرتبطة لكل BSLB.
    29. باستخدام قطر BSLBs (5.00 ± 0.05 ميكرومتر) ، قم باستخراج مساحة سطح الخرز (SA = 4pr2) لحساب الكثافات النهائية للبروتين (molec./μm2) لكل نقطة معايرة (تركيز البروتين).
    30. قم بإجراء تحليل انحدار جديد لتركيز البروتين على كثافة البروتين لحساب الميل (ب) للخط الأكثر ملاءمة.
      ملاحظة: يمنح تركيز 12.5 مول٪ من DGS-NTA (Ni) قدرة تثبيت قصوى تبلغ حوالي 10000 موليك./μm210 دون الحث على التنشيط غير المحدد للخلايا التائية أو التأثير على الحركة الجانبية ل SLBs.

6. إجراء تجارب نقل متشابك بين الخلايا التائية و BSLBs

  1. قبل تشغيل تجربة النقل المتشابك
    1. احصل على BSLBs غير الفلورية ، BSLBs مع الدهون الفلورية ، الخلايا غير الملطخة (أو حبات التعويض ؛ انظر جدول المواد) ، والخلايا الملونة أحادية اللون (أو حبات التعويض) لتحديد تفاعلات طيف التألق للأداة. ركز على أجهزة الكشف ذات الانتشار غير المباشر المرتفع لإعادة تصميم اللوحة متعددة الألوان ، وزيادة الحساسية ، وتقليل خطأ القياس على أجهزة الكشف الحرجة (انظر 14).
    2. معايرة الأجسام المضادة للكشف للعثور على التركيز الأمثل ، مما يتيح الكشف عن الأحداث الإيجابية دون المساس بالكشف عن السلبيات.
      ملاحظة: كرر هذه الخطوة كلما كان هناك تغيير في كمية الأجسام المضادة حيث تختلف قيم F/P والسطوع من دفعة إلى أخرى.
    3. اختياري: قم بتحسين جهد PMT عن طريق الحصول على العينة في نطاقات جهد مختلفة (أي أن الجهد يمشي) للعثور على PMTs مما يؤدي إلى الإشارة المثلى على الضوضاء (أي فصل السلبيات والإيجابيات مع ضمان بقاء إشارة ألمع السكان في النطاق الخطي).
  2. قياس نقل إخراج الخلايا التائية إلى BSLBs
    1. تحضير RPMI 1640 المكمل (هنا R10 المتوسطة) التي تحتوي على 10 ٪ من مصل البقر الجنيني المعطل حراريا (FBS) ، 100 ميكرومتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 10 mM HEPES ، 2 mM L-glutamine ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، 100 U / ml من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. استخدم وسيط R10 لزراعة الخلايا التائية وتوسيعها.
    2. في اليوم 1 ، اعزل الخلايا التائية عن غرف الدم المحيطي أو نظام تقليل الكريات البيض (LRS). استخدم مجموعات عزل الخلايا المناعية وفصلها (انظر جدول المواد) لإثراء الخلايا التائية CD4+ و CD8+ البشرية.
    3. زرع الخلايا بتركيز نهائي يتراوح بين 1.5 و 2.0 × 106 خلية / مل ، باستخدام ألواح 6 آبار لا تزيد عن 5 مل في المجموع لكل بئر.
    4. قم بتنشيط الخلايا التائية باستخدام نسبة 1: 1 من تنشيط الخلايا التائية البشرية (anti-CD3 / anti-CD28) الخرز المغناطيسي (انظر جدول المواد) وإضافة 100 وحدة دولية من IL-2 البشري المؤتلف لدعم تكاثر الخلايا والبقاء على قيد الحياة.
    5. في اليوم 3 ، قم بإزالة الخرز المغناطيسي المنشط باستخدام أعمدة مغناطيسية (انظر جدول المواد). تأكد من بقاء الخرز المغناطيسي متصلا بجانبي الأنبوب قبل استعادة الخلايا للحصول على خطوات غسيل إضافية.
    6. اغسل الخرز المغناطيسي مرة أخرى ب 5 مل من وسط R10 الطازج ، واخلطه جيدا ، وضعه مرة أخرى في المغناطيس . استعادة هذا الحجم وخلط مع الخلايا المستردة في الخطوة 6.2.5.
    7. أعد تعليق الخلايا إلى 1.5-2 × 106 خلية/مل في R10 طازج يحتوي على 100 يو/مل من IL-2. قم بتجديد الوسط بعد 48 ساعة ، مع التأكد من أن آخر إضافة ل IL-2 هي 48 ساعة قبل يوم التجريب (الأيام 7 إلى 14 من الثقافة).
    8. في يوم تجربة النقل المتشابك ، قم بإعداد وسيط فحص النقل المشبكي (انظر الجدول 1) عن طريق استكمال وسط RPMI 1640 الخالي من الفينول الأحمر مع 10٪ FBS ، و 100 ميكرومتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 2 mM L-glutamine ، و 1 mM من بيروفات الصوديوم ، و 100 U / ml من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. لا تقم بتضمين IL-2 البشري المؤتلف.
    9. عد الخلايا باستخدام إما تلطيخ التربان الأزرق أو استبعاد التيار الكهربائي وإعادة تعليقها إلى تركيز نهائي من 2.5 × 106 خلية / مل في الوسط. إذا لوحظ موت الخلايا المفرط (>10٪) ، فقم بإزالة الخلايا الميتة / الميتة باستخدام مزيج من السكريات ودياتريزوات الصوديوم (انظر جدول المواد) على النحو التالي:
      1. طبقة 15 مل من زراعة الخلايا فوق 13 مل من محلول دياتريزوات الصوديوم متعدد السكاريد.
      2. جهاز طرد مركزي لمسافة 1,250 × جم لمدة 20 دقيقة في RT مع الحد الأدنى من التسارع وخفض التسارع. اجمع طبقة الخلية (السحابة) في الواجهة بين الوسط ومحلول دياتريزوات السكريات والصوديوم.
      3. اغسل الخلايا مرتين على الأقل باستخدام وسيط فحص نقل Synaptic قبل التسخين (تم إعداده في الخطوة 6.2.7).
      4. عد الخلايا وأعد تعليقها إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 × 106 / مل باستخدام وسيط فحص النقل المتشابك. الزراعة المشتركة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية هذا مع BSLBs (انظر الخطوة 6.2.15).
    10. حساب عدد BSLBs اللازمة للتجربة ؛ النظر في جميع الخلطات الرئيسية المختلفة للبروتين ومعايرة المستضدات التي سيتم اختبارها (إما مونومرات HLA / MHC-peptide البيوتينيل الأحادي أو أحادي البيوتينيل المضاد ل CD3ε Fab).
    11. قم بتجميع BSLBs باتباع نفس الخطوات من قسم البروتوكول 5 ولكن هذه المرة ، قم بدمج جميع معايرة البروتينات والدهون المطلوبة لإعادة تكوين غشاء APC معقد (الشكل 3A). حافظ على نفس المجلد: علاقات المجلد بين حجم حبات السيليكا الأولي وحجم مزيج البروتين المستخدم أثناء المعايرة ، وكذلك الأوقات ودرجات الحرارة المستخدمة في تحميل BSLBs. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام 0.5 ميكرولتر من حبات / بئر السيليكا و 100 ميكرولتر / بئر من مزيج البروتين للمعايرة الأولية ، فحافظ على نسب 5: 1000 vol: vol لإعداد BSLBs ليتم زراعتها مع الخلايا التائية.
    12. بمجرد تحميل BSLBs بمزيج البروتين المثير للاهتمام ، اغسل BSLBs مرتين باستخدام HBS / HSA (BSA) لإزالة البروتينات الزائدة غير المقيدة. استخدم سرعات ترسيب تبلغ 300 × جم لمدة 2 دقيقة في RT في كل خطوة غسيل وتخلص من المواد الفائقة.
    13. إعادة تعليق 5 × 105 BSLBs لكل بئر في 200 ميكرولتر.
    14. انقل 100 ميكرولتر لكل بئر إلى لوحة جديدة من 96 بئرا ذات قاع U لعمل نسخة مكررة ، بحيث تكون الكمية النهائية من BSLB لكل بئر 2.5 × 105.
    15. قم بتدوير BSLBs عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة و RT وتخلص من supernatant.
    16. إعادة تعليق BSLBs باستخدام 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية ؛ تخلط بلطف لمنع تشكيل فقاعات.
    17. احتضان الثقافات المشتركة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إعادة تعليق الخلايا والخرز في المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA) بدلا من RPMI الخالي من الفينول الأحمر للزراعة المشتركة. في هذه الحالة ، يجب إجراء الحضانة في حاضنة غير CO2 لأن هذا الغاز سوف يحمض المخزن المؤقت بسرعة في حالة عدم وجود بيكربونات.
    18. قم بتبريد مزارع الخلايا BSLB-T عن طريق احتضان الخلايا أولا في RT لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. حمايتهم من الضوء.
    19. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 500 × g و RT ؛ تخلص من السوبرناتانت.
    20. أعد تعليق الخلايا في RT 2٪ BSA-PBS (Ca2+ و Mg2+-free) للحظر. ضع الخلايا على الجليد لمدة 45 دقيقة. حماية من الضوء.
    21. أثناء احتضان الخلايا ، قم بإعداد المزيج الرئيسي للأجسام المضادة باستخدام BSA 2٪ المصفى بنسبة 2٪ من الثلج البارد 0.22 ميكرومتر في PBS كمخزن مؤقت للتلطيخ ، مما سيوفر حظرا إضافيا.
      ملاحظة: تميل بعض دفعات الأجسام المضادة المقترنة بأصباغ البنفسج اللامع إلى الارتباط ب BSLBs بشكل غير محدد. يساعد الحظر باستخدام 5٪ BSA-PBS على تقليل هذه الضوضاء. من الآن فصاعدا ، تأكد من الحفاظ على سلسلة التبريد دون انكسار.
    22. قم بتدوير الثقافات المشتركة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية. قبل التخلص من السوبرناتونات، تأكد لفترة وجيزة من وجود الكريات عن طريق فحص الجزء السفلي من اللوحة المكونة من 96 بئرا باستخدام إضاءة خلفية.
    23. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أعد تعليق الخلايا في المزيج الرئيسي الملون الذي يحتوي على تركيزات الأجسام المضادة المحسنة.
      ملاحظة: استخدم أطراف الماصة بدون مرشح لمنع توليد الفقاعات والأخطاء في توزيع أحجام التلطيخ.
    24. قم بتضمين الخلايا ذات العلامات المتساوية و BSLBs ، و BSLBs الفلورية وغير الفلورية ، والخلايا و BSLBs الملطخة وحدها. احترم العدد الإجمالي للأحداث لكل بئر لجميع عناصر التحكم (أي BSLBs فقط التي تحتوي على 5 × 105 BSLB / well ، وعناصر التحكم الخلوية فقط التي تحتوي على 5 × 105 خلية / بئر لتجنب الزيادة النسبية للأجسام المضادة لكل حدث ملطخ).
    25. اخلطي بلطف عن طريق سحب نصف الحجم لأعلى ولأسفل واحتضنيه لمدة 30 دقيقة على الثلج. حماية من الضوء.
    26. اغسل الخلايا و BSLBs مرتين باستخدام 2٪ من BSA-PBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وخطوات الترسيب من 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الزراعات المشتركة المغسولة في 100 ميكرولتر من PBS واحصل عليها على الفور.
    27. إذا كانت هناك حاجة إلى التثبيت ، فقم بالإصلاح باستخدام 0.5٪ w / v من PFA في PBS لمدة 10 دقائق ، واغسله مرة واحدة ، واحتفظ به في PBS حتى الاستحواذ. حماية من الضوء.
    28. قبل التعويض ، احصل على معايير MESF ، مما يضمن سقوط كل من السكان الأكثر قتامة وألمع في النطاق الخطي للقياس.
    29. الحصول على عينات التعويض وحساب التعويض وتطبيق مصفوفة التعويض (الرابط) على التجربة.
    30. الحصول على ما لا يقل عن 2 × 104 إجمالي معايير MESF لكل قناة من قنوات القياس الكمي.
    31. للاقتناء باستخدام أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية ، قم بتعيين اكتساب الأدوات إلى المعيار ، واضبط اكتساب العينة على 80 ميكرولتر (أو 80٪ من الحجم الكلي) ، ومعدل تدفق العينة بين 2.0 و 3.0 ميكرولتر / ثانية ، وحجم خلط العينة من 50 ميكرولتر (أو 50٪ من الحجم الإجمالي لتجنب تكوين الفقاعة أثناء الخلط) ، وخلط العينات من 150 ميكرولتر / ثانية ، والخلط لكل بئر بين 3 و 5.
    32. الحصول على ما لا يقل عن 1 × 104 BSLBs مفردة لكل عينة (راجع لوحات الشكل 3B (i) - (vi) للحصول على استراتيجية البوابة المرجعية).
    33. اغسل مقياس الخلايا لمدة 5 دقائق بمحلول تنظيف متبوعا ب 5 دقائق من الماء فائق النقاء قبل إيقاف تشغيل الجهاز. إذا كنت تستخدم هيئة تحرير الشام، فاتبع الخيارات الموجودة ضمن علامة التبويب HTS والخيار تنظيف .
    34. تصدير ملفات FCS.

7. قياس النقل المتشابك للجسيمات إلى BSLB

  1. افتح التجربة FCS من الملفات. حدد مجموعة الخلايا و BSLBs بناء على مناطق تشتت الضوء الجانبية والأمامية (SSC-A مقابل FSC-A) ، كما هو موضح في الشكل 3B (i).
  2. حدد الأحداث داخل نافذة الاكتساب المستمر (الشكل 3B (ii)).
  3. التركيز على الأحداث الفردية لكل من الخلايا و BSLB ؛ تحديد الخلايا المفردة أولا استنادا إلى انخفاض W في البوابات المتسلسلة FSC-W/FSC-H (مفردة-1، الشكل 3B اللوحة (III)) و SSC-W/SSC-H (مفردات-2; الشكل 3 باء اللوحة (رابعا)). حدد بوابة مفردة إضافية 3 عن طريق تحديد الأحداث ذات FSC-A وFSC-H المتناسبة (الشكل 3B ، اللوحة (v)).
  4. استخراج MFI من كسور MESF فارغة و 1 إلى 4 ومن خلايا مفردة و MESF لكل عينة تجربة.
  5. قم بإنشاء قيم MFI (cMFI) مصححة لكسور MESF من 1 إلى 4 عن طريق طرح MFI لمجتمع الخرز الفارغ من كل كسر.
  6. إنشاء cMFIs ل BSLBs والخلايا الفردية (راجع لوحة الشكل 3C (i)).
  7. استخدم الإشارة من BSLB الملطخة بالأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل لتصحيح MFI من BSLB الملطخة بالأجسام المضادة ضد علامات الخلايا التائية ذات الصلة. استخدم cMFI لحساب النسبة المئوية للنقل المتشابك المعياري (NST٪) باستخدام المعادلة الموضحة في لوحة الشكل 3C (ii).
  8. إذا كنت مهتما بدلا من ذلك بالجسيمات المنقولة على وجه التحديد استجابة لمشغل TCR ، فاطرح الإشارة من BSLBs الخالية من MFI ل BSLBs الناهضة. استخدم cMFI هذا لحساب NST٪ المدفوع ب TCR باستخدام المعادلة الموضحة في لوحة الشكل 3C (ii).
  9. إذا كنت مهتما بتحديد العدد الإجمالي للجزيئات المنقولة كشحنة جسيمات عبر واجهة T cell-BSLB ، فاحصل على حبات MESF القياسية باستخدام نفس إعدادات الأداة وجلسة اقتناء للمزارع المشتركة بين الخلايا التائية و BSLB.
  10. تحليل مجموعات حبات MESF واستخراج cMFIs الخاصة بهم كما هو موضح في خطوات البروتوكول 5.8.15 إلى 5.8.17. احسب ميل الخط الأنسب لتحليل انحدار MESF على cMFI.
  11. استخدم الميل المحسوب لاستخراج عدد MESF المودع على BSLBs. استخدم cMFIs المحسوبة إما باستخدام عناصر تحكم isotype أو BSLB فارغة كفراغات لاستخراج عدد MESF المنقول خصيصا إلى BSLBs المحفزة.
  12. احسب عدد جزيئات العلامات المنقولة إلى BSLBs بقسمة MESFs المحسوبة (المتوسطة) لكل BSLB على قيمة F/P للجسم المضاد الكمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FCM لتحديد كمية البروتين المطلق على سطح الخلية
تتطلب إعادة تكوين BSLBs التي تقدم كثافات فسيولوجية للروابط تقدير كثافة البروتين الكلية على المجموعة الفرعية للخلايا النموذجية. لإعادة تشكيل BSLBs ، قم بتضمين أي روابط ذات صلة من المتوقع أن تلعب دورا في محور الإشارة ذي الأهمية إلى جانب البروتينات التي تدعم الالتصاق والتفاعل الوظيفي بين BSLB والخلايا ، مثل ICAM-1 والجزيئات المكلفة ، على سبيل المثال ، مستقبلات CD40 و CD58 و B7 (CD80 و CD86). يمكن إضافة بروتينات إضافية اعتمادا على السؤال المطروح ، بما في ذلك جزيئات المحاكاة المكلفة مثل ICOSL3 و PD-L1 و PD-L215. بالنسبة لأي جزيئات أخرى ، أعد تكوين BSLBs باستخدام الكثافات الجزيئية التي يتم تحديدها عن طريق التحليل المباشر للخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي. بالنسبة للأجسام المضادة المترافقة مباشرة ، يوفر BioLegend قيم F / P لكل رقم لوت الأجسام المضادة. يمكن أيضا تصنيف الأجسام المضادة في المنزل وتحديد نسب F / P بواسطة قياس الطيف الضوئي ، مما يوفر بديلا عندما لا تكون هناك أجسام مضادة تجارية مقترنة بالفلوروكروم المطلوب. نظرا لأننا نستخدم نفس الأجسام المضادة لمعايرة عدد البروتينات المؤتلفة على سطح الخلايا و BSLBs ، فليست هناك حاجة لتصحيح التكافؤ المرتبط بالأجسام المضادة لأن هذا لا يزال ثابتا. إذا كان التكافؤ المرتبط بالأجسام المضادة مطلوبا ، فاستخدم كل من البروتينات المؤتلفة والأجسام المضادة مع F / P المعروفة لتزيين BSLBs ومقارنة جزيئات البروتينات المؤتلفة المحملة بعدد الأجسام المضادة المرتبطة بعد التلطيخ في ظل ظروف التشبع.

يمكن تقدير جزيئات الأجسام المضادة المرتبطة لكل خلية باستخدام قياس مخصص للتدفق الخلوي أحادي اللون أو لوحة متعددة الألوان من الأجسام المضادة تهدف إلى تقدير كثافة البروتين المطلقة على مجموعة فرعية نادرة نسبيا من الخلايا داخل نسيج ذي أهمية ، مثل اللوزتين الحنكية. ويبين الشكل 1 قياسات تمثيلية لكثافات ICAM-1 في الخلايا البائية CXCR5+ والخلايا التائية الجريبية (TFH) كمثال. يمكن استخدام نفس بروتوكول التلطيخ ومبادئ تحليل التدفق الخلوي الموضحة في الشكل 1A لقياس كثافة البروتين على الخلايا الظهارية أو الخلايا اللحمية أو الخلايا الوحيدة أو الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية (moDCs) أو على الخلايا الليمفاوية B و T في الأنسجة البشرية والفئران الأخرى. بالنسبة للأنسجة المختلفة عن الدم واللوزتين ، يجب توخي الحذر عند عزل الخلايا باستخدام كوكتيلات البروتياز ، لأن التعرض المطول للخلايا لإنزيمات الهضم يقلل من مستويات التعبير عن سطح الخلية.

ركز عملية الاستحواذ والتحليلات على الخلايا الحية المفردة داخل نافذة الاكتساب المستمر (الشكل 1A ii) ، حيث أن الأحداث خارج الاستمرارية الزمنية تشتت الضوء بشكل شاذ ، مما يعرض للخطر القياس الكمي. لزيادة دقة التحديدات ، قلل من التلطيخ غير المحدد ل APCs عن طريق الحجب الفعال ل FcγRs. يتيح المصل البشري و EDTA الموجودان في hFCB حجب FcγR الفعال أثناء استخلاب Ca2 + الحر لتقليل التجميع التلقائي للخلايا أثناء التلاعب بها وتلطيخها (تظهر الأسهم السوداء في الشكل 1A (iii) و (iv) الثنائيات المتبقية في تعليق خلايا اللوزتين).

يعد تتبع أداء الأداة باستخدام خرز الإعداد والتتبع والبرنامج (أو ما شابه ذلك ؛ انظر جدول المواد) أمرا بالغ الأهمية لتكرار القياسات الكمية بمرور الوقت ، خاصة في الخطوات اللاحقة عندما يتم قياس النقل المشبكي للجسيمات إلى BSLB باستخدام مؤسسات التمويل الأصغر فقط (أي بالنسبة للفلوروكرومات التي لا توجد معايير MESF لها). وبالمثل ، تحقق من النطاق الخطي (أي الحد الأدنى للخطية والحد الأقصى الخطي) لوحدات التألق التعسفية لكاشف القياس الكمي الذي سيتم استخدامه جنبا إلى جنب مع معايير MESF بحيث تحافظ كل نقطة معايرة على العلاقة الخطية بين التألق وعدد الفلوروكرومات.

يعد إعداد عينات "فارغة" للتألق ، أو عينات توفر فكرة عن ضوضاء تلطيخ الخلفية ، ضرورية لطرح إشارة الفلورسنت غير المحددة. تعد عناصر التحكم في النمط المتماثل و / أو العينات الخالية بيولوجيا (مثل الضربات القاضية) ضرورية لتصحيح إشارة الخلفية للخلايا واستخراج الإشارة الحقيقية المشتقة من الأجسام المضادة الكمي (الشكل 1A اللوحة (الثامن)). وبالمثل ، تستخدم حبات MESF القياسية مجموعة فارغة مخصصة لطرح إشارة الخلفية من كل مجموعة خرز إيجابية حقا (لوحات الشكل 1B (السابع) و (الثامن)). بمجرد إجراء تحليلات الانحدار واستخراج المنحدر الذي يحدد العلاقة بين MESF ومؤسسات التمويل الأصغر المصححة ، يتبع التحويل إلى كثافات جزيئية مطلقة عمليات رياضية بسيطة (الشكل 1C).

لتقدير CSA في الشكل 1C ، تم استخدام استبعاد التيار الكهربائي (CASY-TT) لاستخراج قياسات حجم الخلية وقطرها من آلاف الخلايا. يختلف CSA الناتج المقدر من حساب مساحة السطح للكرات (4pr2) باختلاف حالة تنشيط الخلايا ، حيث تبلغ القيم المرصودة 170.37 ± 4.91 μm2 للخلايا البائية غير المنشطة و 234.52 ± 1.53 μm2 و 318 ± 24.45 μm2 للخلايا التائية غير المنشطة والمنشطة ، على التوالي. هذه CSAs قابلة للمقارنة مع تلك التي تقدرها تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد لمعامل الانكسار للخلايا الليمفاوية غير النشطة16.

بمجرد تحديد نطاق الكثافات الفسيولوجية (على سبيل المثال ، من خلال مقارنة الكثافات السطحية على الخلايا التي تخضع لبرامج تنشيط مختلفة) ، يمكن استخدام BSLBs لنمذجة تلك الأسطح. يمكن استخدام معايرة مونومرات مستضدات HLA-peptide المستضدية الحيوية التي توفرها منشأة NIH tetramer (أو monobiotinylated monomeric anti-CD3ε-Fab) جنبا إلى جنب مع ICAM-1 12-His لإعادة تشكيل غشاء APC الأساسي. يمكن استخدام البروتينات التجارية الموسومة ب 6 و 9 و 12 و 14 لتزيين سطح BSLB (انظر الشكل 2A للحصول على أمثلة مع ICAM-1 12-His). توفر معايرة البروتين جنبا إلى جنب مع تحليلات FCM الكمية منهجية قوية لإعادة تشكيل أسطح APC الفسيولوجية واختبار تأثيرها على الإخراج المشبكي لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية.

لدراسة مخرجات نقاط الاشتباك العصبي للخلايا التائية، استخدم نسبة 1:1 BSLB-to-T الخلوية لضمان أن تتفاعل خلية واحدة مع BSLB واحد في المتوسط خلال الفترة المدروسة. لقد لاحظنا أن نقل المواد يتناسب مع وقت الحضانة ، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات للكشف عن الجزيئات المنقولة بكميات منخفضة عبر واجهة cell:BSLB. وبالتالي ، فإن تصميم اللوحة المناسب أمر بالغ الأهمية لزيادة حساسية وموثوقية الكشف عن المواد عبر المشبكية ، كما هو الحال في tSVs ، يتراوح الإخراج بين 25 و 36 حويصلة / خلية / 20 دقيقة 2,3. اختبر أولا الامتداد الطيفي لكل جسم مضاد ودهون تحمل علامة الفلوروكروم. عند ملاحظة امتداد مرتفع ، نوصي بمعايرة الأجسام المضادة الملطخة والنسبة المئوية للدهون الفلورية المكونة ل BSLB ، بالإضافة إلى المشي بجهد PMT لتقليل خطأ الانتشار على العينات التعويضية وتعزيز نسبة الإشارة على الضوضاء ، على التوالي (راجع 12،14،17 للحصول على مقدمة مخصصة للموضوع).

يعد استخدام ضوابط القياس الكمي ، بما في ذلك BSLBs الخالية (التي تفتقر إلى المستضد أو مضاد CD3 Fab) وإما الخلايا القاضية أو العينات ذات العلامات المتساوية 18 ، ضروريا لقياس نقل tSV المستجيب بدقة ، مثل SEs ، وكذلك جزيئات الهجوم فوق الجزيئي المنبعثة داخل الشق المشبكي. استخدم بروتينات سطح الخلية عالية الوفرة مثل CD4 أو CD2 أو CD45 إلى جانب الدهون الفلورية الاصطناعية (مترافقات DOPE Atto) لتحديد عدد الخلايا المفردة و BSLB عند تفكك المترافقات على أساس بارد. ركز التحليلات على المتوسط الهندسي أو المتوسط لشدة التألق في BSLB والخلايا المفردة (يستخدم CD4 في الشكل 3B). SEs هي نوع متخصص من tSV مشتق من غشاء البلازما (PM) ، ويتضح نقلها إلى BSLB من خلال كسب إشارة علامة على BSLBs مع فقدان ثابت للإشارة على سطح الخلايا المتفاعلة (راجع TCR على BSLBs كما هو موضح في الشكل 2B ، الأسهم البنفسجية). تعد BSLBs الخالية التي تفتقر إلى المستضد أو مضاد CD3 مرجعا ممتازا لتتبع الاكتساب المحدد ل TCR (وعلامات الخلايا التائية الأخرى) على BSLB الناتجة عن تحفيز الخلايا المتفاعلة عبر مجمع TCR الخاص بها.

Figure 1
الشكل 1: التحديد الكمي المطلق للبروتينات على سطح المدرعات. (أ) مثال على قياسات قياس التدفق الخلوي الكمي ل ICAM-1 على سطح الخلايا البائية اللوزتين (Foll. Bc) والخلايا التائية المساعدة (TFH). (ط-سابعا) استراتيجية بوابة لتحليل واحد CXCR5 + Bc و TFH معزولة من اللوزتين الحنكية البشرية. تظهر استراتيجية البوابة المتسلسلة لتحديد الأحداث الحية الفردية الواردة في نافذة الاستحواذ المستمرة. (iii-iv) تشير الأسهم السوداء إلى الثنائيات. (viii) المدرج التكراري المتراكب الذي يظهر التعبير السطحي للخلية ICAM-1 (المدرج التكراري للبطاطس) مقارنة بعناصر تحكم FMO (المدرج التكراري الرمادي) وعناصر التحكم FMO الموسومة بأنماط متساوية ذات صلة (المدرج التكراري الأسود، والتي تتداخل مع المدرج التكراري الرمادي) للسكان المبينين في (سابعا). تشير الأسهم إلى اتجاه استراتيجية البوابة المتداخلة المستخدمة لتحديد الخلايا البائية CXCR5+ (Bc; CD19+) وTFH (CD4+). (ب) يتطلب استخراج الجزيئات المطلقة على سطح خلايا اللوزتين من مؤسسة التمويل الأصغر تحليلات الانحدار للحبات المعيارية MESF التي تم الحصول عليها باستخدام نفس إعداد الأداة مثل الخلايا المبينة في A. (ط-ف) تظهر استراتيجية البوابة المتسلسلة لتحديد الأحداث الحية الفردية الواردة في نافذة الاستحواذ المستمرة. (سادسا) بوابات وقياس مؤسسات التمويل الأصغر من مختلف مجموعات MESF القياسية. (سابعا) تظهر المدرج التكراري المتراكب لمجموعات MESF المحددة في (vi). تمثل القيم المعروضة في أعلى اليمين مؤسسات التمويل الأصغر لكل مجموعة من مجموعات MESF الخمسة (فارغة و 1 و 2 و 3 و 4). (ثامنا) الانحدار الخطي ل MESF على cMFI لمجموعات MESF المبينة في (سابعا). يظهر المنحدر (ب) لاستخراج MESF المرتبط بالخلايا من البيانات الموجودة في A. (ج) عند استخراج عدد الجزيئات، اتبع عمليات رياضية بسيطة تبدأ بتطبيق الميل المحسوب في (ثامنا) من قياس MESF cMFI (cMFIM) وقيم MESF المرجعية (MESFR). لاستخراج MESF المرتبط بالخلايا (MESFcells)، قسم مؤشر MFI للخلايا المصحح (cMFIcells) على الميل المحسوب. ثم، لحساب عدد الجزيئات المرتبطة بالخلايا (Molec. الخلايا)، وتقسيم خلايا MESFcells على F/P للكشف (الكمي) الأجسام المضادة. أخيرا ، لحساب الكثافة الجزيئية على سطح الخلايا (Dcells) ، قم بتقسيم Molec. الخلايا حسب مساحة سطح الخلية المقدرة (CSAE). الاختصارات: X = متغير مستقل; Y = متغير تابع (التألق المقاس) ، cMFIM = قياس MFI المصحح ؛ MESFR = قيم MESF المرجعية؛ MESFcells = MESF المقدرة لكل خلية; cMFIcells = خلايا MFI المصححة؛ موليك. الخلايا = الجزيئات المقدرة لكل خلية. Dcells = الكثافة المقدرة على الخلايا; CSAE = مساحة سطح الخلية المقدرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعادة تشكيل BSLB مع ICAM-1 المؤتلف وقياس نقل الجسيمات إلى BSLBs. (A ، i-vi) تحليل التدفق الخلوي ل BSLBs المعاد تشكيله مع زيادة كثافة ICAM-1 12-His الأحادي المؤتلف (rICAM-1). (ط-ف) كما هو الحال في الشكل 1 ، ركز استراتيجية البوابة على BSLBs واحدة ضمن نافذة الاستحواذ المستمرة. لاحظ الفجوة مباشرة قبل بوابة الاستمرارية الزمنية ، والتي تم استبعادها لمنع أخطاء القياس. (vi) غالبا ما تؤدي نوعية البروتين الجيدة إلى طلاء متجانس ل BSLB بتركيزات عالية ، مع ملاحظة توزيعات التألق الضيقة (انخفاض معامل التباين ، انظر الرسوم البيانية في vi). (ب) تحليلات الانحدار للتركيز المرجعي ICAM-1 (CR) على الكثافة المقاسة (DM). استخدم المنحدر لحساب التركيزات المستهدفة من البروتين (CT) لتحقيق كثافة الخلايا (Dcells) المقاسة في التجارب في الشكل 1. الاختصارات: 12-له = 12-هيستيدين العلامة; DM = قياس الكثافات الجزيئية; CR = التركيزات المرجعية ل rICAM-1 ؛ CT = التركيز المستهدف (سيتم استيفاؤه)؛ Dcells = الكثافات المقاسة في الخلايا (انظر أيضا الشكل 1C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قياس الجسيمات المشبكية للخلايا التائية المنقولة إلى BSLBs. (A؛ i-v) مخطط التدفق يوضح الخطوات الحاسمة للزراعة المشتركة للخلايا التائية مع BSLBs التي تعيد تشكيل أغشية النموذج والقياس اللاحق لنقل الجسيمات باستخدام قياس التدفق الخلوي. (iv) تظهر الرسوم البيانية الزرقاء والصفراء الداكنة التوزيع النسبي للخلايا و BSLBs في مخططات قياس التدفق الخلوي ثنائي المعلمات. (v) المدرج التكراري لتوزيع التألق الذي يعرض الكسب النسبي للتألق من BSLBs الناهض (الأصفر الداكن) مقارنة ب BSLBs الخالية (الرمادي). (ب) تجربة نقل متشابك نموذجية. (ط-سادسا) تظهر استراتيجية البوابة لتحديد BSLBs والخلايا الفردية داخل نافذة الاستحواذ المستمر. تشير الأسهم البنفسجية إلى اتجاه التحليل ، والذي يستمر في C. (C) (i) ركز التحليلات على MFI للخلايا المفردة (الزرقاء) و BSLBs المفردة (الصفراء). (ii) معادلات لحساب النقل المتشابك العادي (NST٪ ، أعلى) و Tmax٪ (أسفل) من cMFI المحسوبة ل BSLB والخلايا. (ثالثا إلى سادسا) تظهر المدرج التكراري المتراكب تغير توزيعات كثافة التألق للخلايا (الظلال الزرقاء) و BSLBs (الظلال الصفراء) عبر كثافات مختلفة من الخلايا التائية المنشطة المضادة ل CD3ε-Fab ، بما في ذلك عدم التنشيط (الرمادي) والتنشيط إما مع 250 (قيمة اللون الناعم) أو 1000 (قيمة اللون العالية) molec./μm2. تمثل الأرقام بقيم ألوان مختلفة النسبة المئوية NST٪ المقاسة للرسوم البيانية BSLB الموضحة باللون الأصفر. تظهر المدرج التكراري المتراكب التسلسل الهرمي الشامل في النقل المشبكي لحويصلات الخلايا التائية الموجبة لعلامات مختلفة. بالنسبة لهذا التكوين من BSLBs (200 molec./μm2 من ICAM-1 وزيادة كثافة مضادات CD3ε-Fab) ، يتم نقل tSVs إلى BSLB مع TCR + (iii) > CD81 + (iv) > CD4 + (v) > CD28 + (vi). وكما هو مبين في مقالات سابقة، فإن TCR وCD81 هما مكونان من SEs ويتم نقلهما بكفاءة أعلى نسبيا إلى CD4، على الرغم من التعبير عن الأخير بمستويات سطحية أعلى نسبيا. يؤدي سفك SE إلى فقدان سطح الخلية CD81 و TCR وكسب هذه الإشارات على BSLBs (الأسهم الأرجوانية المفتوحة ل 250 molec./μm2 ، والأسهم الأرجوانية المغلقة ل 1000 molec./μm2 في المدرج التكراري الأصفر). (د) يؤدي التبريد غير السليم للمترافقات إلى تمزيق الخلايا SLB من حبات السيليكا كما يتضح من مقارنة حبات الإدخال (المخطط ثنائي المعلمة الأيسر) والاقترانات المعرضة للتبريد السريع إلى 4 درجات مئوية من 37 درجة مئوية (المخطط ثنائي المعلمة الأيمن). قارن أيضا مع لوحة الشكل 3B (vi). الاختصارات: PRF1 = البيرفورين 1; NST٪ = نقل متشابك طبيعي; Tmax٪ = النسبة المئوية من الحد الأقصى للنقل المرصود (في حالة التحكم أو المرجع) ؛ tSVs: الحويصلات عبر المتشابكة. SEs: الإكستومات المتشابكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BSLBs هي أدوات متعددة الاستخدامات لدراسة إخراج الجسيمات من الخلايا التائية التي يتم تحفيزها باستخدام أغشية APC النموذجية. تسمح مرونة الطريقة بإعادة تكوين تركيبات الأغشية المعقدة والاختزالية لدراسة آثار الأربطة وإشاراتها على إفراز tSVs وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ومكوناتها. لقد اختبرنا هذه التقنية على العديد من الخلايا التائية ، بما في ذلك TH و CTL و Tregs و CART15 المنشطة مسبقا. يعمل هذا البروتوكول أيضا لقياس إطلاق الجسيمات المشبكية للخلايا التائية المعزولة حديثا والهادئة . أحد القيود المفروضة على استخدام الخلايا التائية المعزولة حديثا هو أن هذه المجموعات الهادئة تنتج ملفا مختلفا للجسيمات عبر المشبكية ، والتي ترتبط بتكوين سطح الخلية (انظر 15 لمزيد من التفاصيل).

كلوحة بسيطة لقياس التدفق الخلوي ، نوصي باستخدام استنساخ IP26 المضاد ل TCR ، واستنساخ مضاد CD81 5A6 ، واستنساخ مضاد للبيرفورين (PRF1) B-D48 أو استنساخ مضاد ل CD40L 24-31 ، والدهون المحتوية على ATTO 390 أو ATTO 565 (لمنح BSLBs تألقا جوهريا). للمساعدة في تمييز الخلايا المفردة من BSLBs المفردة والاقترانات ، نوصي باستخدام استنساخ OKT4 المضاد ل CD4 و / أو استنساخ مضاد CD45 HI30 ، والذي يتم نقله إلى BSLBs بمستويات محدودة على الرغم من التعبير عنه بمستويات عالية جدا على سطح الخلية (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل حول الفلوروكروم والأجسام المضادة الأخرى التي تم التحقق منها). يمكن تصميم الألواح التي تحتوي على عدد أكبر من الفلوروكرومات ولكنها تتطلب تقييما منهجيا لامتداد الطيف الفلوري لكل فلوروكروم يتم تحليله. لزيادة الحساسية ، جرب معايرة مختلفة للأجسام المضادة الكمي التي تتراوح من 0.5 ميكروغرام إلى 20 ميكروغرام / مل النهائي ، وكرر كلما تم استخدام مخزونات جديدة من الأجسام المضادة. لضمان تكرار القياسات المطلقة والنسبية لنقل الجسيمات، قم بمعايرة وحساب قدرة الربط لكل كمية جديدة من الدهون الفوسفاتية البيوتينيل والمحتوية على النينيوتين، لأنها قد تختلف اختلافا كبيرا من الكثير إلى الكثير. يعد التبريد التدريجي لمترافقات الخلايا التائية BSLB أمرا بالغ الأهمية لزيادة حساسية الكشف عن الجسيمات ذات الوفرة المنخفضة. يؤدي التبريد السريع للمزارع المشتركة إلى تدمير BSLBs ، كما يتضح من الخسارة الكبيرة في تألق الدهون (الشكل 3D).

يمكن استخدام مقاييس مختلفة لقياس ناتج الجسيمات من نقاط الاشتباك العصبي المناعية للخلايا التائية اعتمادا على السؤال التجريبي المطروح. على سبيل المثال ، عندما يتوقع وجود اختلافات طفيفة في مستويات التعبير الأساسية للبروتينات السطحية المصنفة في SEs الناشئة ، يمكن استخدام مقياس نقل متشابك طبيعي (NST٪) (الشكل 3C لوحة (ii) المعادلة العليا). هذا الأخير يحدد كميا النسبة المئوية لإشارة MFI على BSLBs كدالة لإجمالي MFI المشترك للخلايا والخرز. أحد التحذيرات من هذا النهج هو تحليل العلامات المنقولة التي لم يتم التعبير عنها على PM، مثل مكونات جسيمات الهجوم فوق الجزيئي19. نظرا لأن هذه العناصر تصل إلى BSLBs عن طريق مسارات مستقلة عن عبور PM ، مثل exocytosis داخل الخلايا ، لا ينصح بحساب NST٪ لأن النتيجة سيتم تضخيمها لأن البسط سيتم تقسيمه على قاسم صغير نسبيا (مستوى تعبير سطح الخلية). بدلا من ذلك، استخدم مؤسسات التمويل الأصغر المصححة لمقارنة ترسب البيرفورين والجرانزيمات بين BSLBs الخالية وBSLBs التي تقدم كثافات متزايدة من المستضد أو مضاد CD3 Fab. بدلا من ذلك ، لتتبع العناصر داخل الخلايا المنقولة إلى BSLBs ، استخدم للمقارنة إما الجزيئات المطلقة المقدرة المنقولة أو النسبة المئوية للإشارة فيما يتعلق بالحد الأقصى للإشارة المنقولة إلى BSLBs (Tmax٪) (الشكل 3C لوحة (ii) المعادلة السفلية). بالنسبة ل Tmax٪ ، استخدم إما cMFI أو الجزيئات المقاسة على عينة BSLB (أو الحالة) التي تقدم أعلى كثافة مستضد كمرجع Tmax. عند تحليل الجهات المانحة المختلفة ، استخدم Tmax الخاص بالجهات المانحة لإجراء المقارنات. عند دراسة المواد المنقولة استجابة للتشغيل المحدد ل TCR ، يمكن أيضا تصحيح مؤسسات التمويل الأصغر إلى مستوى نقل الخلفية الذي لوحظ على BSLBs سالبة المستضد (فارغة).

يعد تقدير العدد المطلق للجزيئات المنقولة إلى BSLBs طريقة أكثر قوة ، لأن هذا ينطوي على معايرة MESF مع قياس الجزيئات كنقطة نهاية ومقارنة أفضل للتجارب المستقلة. يوفر Tmax٪ تطبيعا مشابها عبر التجارب المستقلة وهو مفيد بشكل خاص عند استخدام FCM متعدد الألوان للعلامات داخل الخلايا ، مثل البيرفورين والجرانزيمات ، أو للعلامات التي لا يتوفر لها معيار MESF. Tmax٪ هي ببساطة النسبة المئوية للإشارة في أي حالة معينة إلى الحالة ذات أعلى نقل في حالة التحكم (على سبيل المثال ، ضوابط المركبات / غير المعالجة لدراسات الأدوية ، والحمض النووي الريبي دليل التحكم لمكتبات CRISPR / Cas9). علاوة على ذلك ، يمكن استخدام Tmax٪ لكل من cMFIs والعدد المطلق من الجزيئات وكان مفيدا بشكل خاص للمقارنات جنبا إلى جنب لآثار حذف الجينات على الناتج المشبكي للخلايا التائية. هذا الأخير واضح عندما يؤدي تحرير الجينات إلى تباين كبير في النطاق الديناميكي للتعبير عن المستقبلات المناعية بين المتبرعين المستقلين والتجارب ، مما قد يؤثر على القياسات المطلقة و NST٪.

وقد سهلت BSLBs التقاط وتوصيف المخرجات المتشابكة لأنواع الخلايا التائية المختلفة، والتي يصعب عزلها بسبب استيعابها السريع بواسطة APCs2. يوفر الاستقرار المادي ل BSLBs أيضا منصة لفرز الخلايا المنشطة بالتألق من BSLBs التي تم مسحها بواسطة الخلايا التائية ، مما يتيح التوصيف الكيميائي الحيوي لمستحضرات الجسيمات عالية النقاء بواسطة تقنيات قياس الطيف الكتلي وتسلسل الحمض النووي. هذا الأخير يسهل التوصيف التفصيلي للرسل بين الخلايا التي تلقيها الخلايا التائية في ظل مجموعة واسعة من الظروف التجريبية. يمكن معالجة أسئلة مختلفة ، بما في ذلك كيفية تغير رسل الجسيمات هذه بين أنواع الخلايا التائية المختلفة وحالات التنشيط ، وكيف تؤثر مستقبلات المستضدات القانونية وغير القانونية (أي مستقبلات المستضدات الخيمرية) ، وكيف تؤثر إشارات الغشاء الناهضة والمعادية على تكوين الجسيمات. نحن نعمل حاليا على تطوير هذه التكنولوجيا بشكل أكبر للتوصيف الكمي للسيتوكينات التي تفرز في المشبك المناعي للخلايا التائية المحفزة. هذا الأخير يتطلب دراسة متأنية لمجموعات من مستقبلات السيتوكين المؤتلفة والأجسام المضادة ، مما يوفر التقاطا فعالا للإنترلوكينات والإنترفيرون والكيموكينات المودعة على BSLBs بعد تنشيط الخلايا التائية. يمكن تكييف BSLBs لنمذجة التركيب السطحي ل APCs الأخرى التي يشتبه في أنها تؤدي إلى إطلاق tSV بواسطة الخلايا التائية ، مثل الخلايا المناعية اللحمية والفطرية. يمكن أيضا تكييف BSLBs لفحص المركبات الدوائية الجديدة التي تسعى إلى التعديل الإيجابي والسلبي لآلية إفراز exocytic و tSV لعلاج السرطان والأمراض الأخرى. وأخيرا، يمكن أيضا استخدام BSLBs لاكتشاف محددات الضراوة التي تعدل وظيفة الخلايا التائية في الأمراض المعدية20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgments

نحن ممتنون لأعضاء مختبرنا ومجتمع معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم على المناقشات العلمية البناءة ، وخاصة مدير مرفق قياس التدفق الخلوي جوناثان ويبر. تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z ، ومنحة ERC المتقدمة (SYNECT AdG 670930) ، وصندوق كينيدي لأبحاث الروماتيزم (KTRR) (الثلاثة إلى MLD). تم دعم PFCD من قبل زمالة EMBO طويلة الأجل (ALTF 1420-2015 ، بالتعاون مع المفوضية الأوروبية (LTFCOFUND2013 ، GA-2013-609409) وماري Sklodowska-Curie Actions) وزمالة أكسفورد-بريستول مايرز سكويب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 182 ،
تحضير الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز لدراسة إنتاج الجسيمات من المشابك المناعية للخلايا التائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Céspedes, P. F., Dustin, M. L.… More

Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter