Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

Abstract

Antijen sunan hücreler (APC'ler) fiziksel temas halinde olan T hücrelerine üç aktive edici sinyal sunar: 1) antijen, 2) costimülasyon / corepression ve 3) çözünür sitokinler. T hücreleri aktivasyona yanıt olarak iki tür efektör parçacık salgılar: hücrelerarası habercileri aktaran ve sitotoksikliğe aracılık eden trans-sinaptik veziküller (tSV' ler) ve supramoleküler saldırı parçacıkları. Bu varlıklar, T hücreleriyle fiziksel temas halinde olan APC'ler tarafından hızla içselleştirilir ve karakterizasyonlarını korkutucu hale getirir. Bu makale, bu trans-sinaptik parçacıkları yakalamak ve analiz etmek için boncuk destekli Lipid Bilayer'leri (BSLB' ler) antijen sunan hücre (APC) mimetikleri olarak imal etmek ve kullanmak için protokol sunmaktadır. Ayrıca, hücre yüzeylerindeki protein yoğunluklarının mutlak ölçümleri, BSLB'lerin bu fizyolojik düzeylerle yeniden uzlaştırılması ve T hücreleri tarafından sinaptik parçacık salınımını izlemek için akış sitometri prosedürü için protokoller açıklanmıştır. Bu protokol, yardımcı T hücreleri, sitotoksik T lenfositleri, düzenleyici T hücreleri ve kimerik antijen reseptör ifade eden T hücreleri (CART) dahil olmak üzere, bireysel proteinlerin, karmaşık ligand karışımlarının, patojen virülans belirleyicilerinin ve ilaçların T hücrelerinin efektör çıkışı üzerindeki etkilerini incelemek için uyarlanabilir.

Introduction

İmmünolojik sinaps (IS), jukstracrine bilgilerinin düzenlenmiş alışverişini kolaylaştıran fiziksel temasla uğraşan hücrelerin arayüzünde oluşan önemli bir moleküler yapıdır. Literatürde farklı IS'ler tanımlanmıştır ve giderek büyüyen bir kanıt kütlesi, bu moleküler merkezlerin hücresel ağların korunmuş bir özelliği olduğunu göstermektedir. B hücreleri, doğal öldürücü hücreler, dendritik hücreler, makrofajlar ve T hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücreleri, kısa ömürlü kontakların montajı yoluyla bilgi alışverişinde bulunur1. Multimomik çalışmalar, patojenik hücresel ağları yönlendiren lökositlerin ve stromal hücrelerin yeni alt kümelerinin anlaşılmasını ve bilinmeyen işlevlere sahip yüzey proteinlerini ifade etmeyi ilerletmektedir. Sentetik APC'ler olarak BSLB'ler, tek tek proteinlerin aktif sinyallerin, yani antijenlerin ve costimülasyon/corepression'un T hücreleri tarafından entegrasyonundaki fonksiyonel rolünün doğrudan araştırılmasına ve sonuç olarak sinyal dört olarak adlandırılan efektör parçacıkların salınmasına izin verir.

Bu makalede, model APC'lerin yüzey bileşimini taklit etmek için BSLB'leri kullanırken dikkate alınması gereken protokoller ve kritik teknik noktalar açıklanmaktadır. APC'ler üzerindeki bağışıklık reseptörlerinin ve diğer yüzey proteinlerinin nicel ölçümüne ilişkin protokoller, bu ölçülen miktarları içeren sentetik APC'lerin yeniden uzlaştırılması protokolü ile birlikte sunulmaktadır. Daha sonra, T hücrelerinin ve BSLB'nin birlikte kullanılması için gereken adımlar, akış sitometrisi kullanılarak trans-sinaptik parçacık transferinin nicel ölçümü için protokol ile birlikte sunulur. En dikkat çekici şekilde, BSLB'ler sinaptik ektozomlar (SE) olarak adlandırdığı plazma membran türevi bir tSV popülasyonunu incelemeyi kolaylaştırır. T hücre antijen reseptörü ile zenginleştirilmiş (TCR+) SE'ler TCR tetiklemesine yanıt olarak dökülür2 ve BSLBs3 tarafından verimli bir şekilde yakalanır, antijenlerin ve modellenmiş membran bileşiminin agonistik özelliklerini değerlendirmek için mükemmel bir okuma temsil eder. CD63+ eksozomlar ve supramoleküler atak parçacıkları (SMAP' ler) da uyarılmış T hücreleri tarafından salınır ve BSLB'ler tarafından yakalanır. Aktivasyonun ek okumaları ve T hücreleri tarafından elde edilen ekzosit ve litik granül salgılanması olarak kullanılabilirler. Ekzosit veziküllerinin T hücresinin etkileşim kutbuna harekete geçirilmesi, aktivasyona yanıt olarak IL-2, IFN-γ ve IL-10 gibi sitokinlerin yönlü salınımını da kolaylaştırır4,5,6,7,8. T hücreli salınan sitokinler BSLB'lerde de tespit edilebilse de, immünolojik sinapsta sitokin salınımının nicel analizini doğrulamak için şu anda daha özel bir çalışma geliştirilmektedir.

Spesifik membran bileşimlerinin T hücrelerinin sinaptik çıkışını nasıl etkilediğini sorgulamak için hedef membran bileşeninin fizyolojik yoğunluğunun tanımlanması gerekir. Hücre yüzeyi proteinlerinin akış sitometrisi bazlı nicelikleri bu protokolde önemli bir adımdır ve şunları gerektirir: 1) antikor başına bilinen florokrom sayısına sahip antikorların kullanımı (F/P) ve 2) ölçülen ortalama floresan yoğunluklarından (MFI' ler) florokrom moleküllerinin enterpolasyonunun standart bir referansı olan kıyaslama boncuklarının kullanılması.

Bu kıyaslama standartları, her biri keyfi floresan algılamanın dinamik aralığını kapsayan, giderek artan sayıda eşdeğer çözünür florokrom (MESF) içeren beş boncuk popülasyonudur. Bu standart popülasyonlar ayrı floresan zirveleri verir ve basit doğrusal regresyon ile keyfi floresan birimlerinin MESF'lere dönüştürülmesini kolaylaştırır. Elde eden MOF'lar daha sonra hücre başına ortalama bağlı molekül sayısını (veya sonraki adımlarda BSLB'yi) hesaplamak için antikor F/P değerleriyle birlikte kullanılır. Tahmini hücre yüzey alanlarının tespit edilen moleküllerin ortalama sayısına uygulanması, fizyolojik yoğunlukların molekül/μm2 olarak hesaplanmasını sağlar. Bu niceleme protokolü ayrıca T hücreleri üzerindeki protein yoğunluklarının ölçümüne ve homotipik T hücre sinapslarının oluşumuna aracılık eden membran bileşimlerinin biyokimyasal olarak yeniden oluşturulmasına (yani T-T sinapsları9) uyarlanabilir. Gerekirse, molekül başına bilinen florokrom sayısı ile etiketlenmiş rekombinant hedefler kullanılarak antikor bağlamanın valency'si daha da tahmin edilebilir. Daha sonra, antikor bağlayıcı valency, bağlı floresan proteinlerin ve nicelik antikorlarının sayısı (iki farklı nicelik florokromu ve MESF standardı kullanılarak) aynı anda karşılaştırılarak aynı BSLB popülasyonu için hesaplanabilir.

APC membranlarının yeniden uzlaştırılması, desteklenen lipid bilayerlerinin (SLB' ler) silika boncuklar üzerinde birleşmesini gerektirir1. Farklı fosfolipid türleri içeren lipozom stokları, çok yönlü bir lipid-bilayer matrisi oluşturmak için kullanılabilir ve rekombinant proteinlerin farklı bağlayıcı kimya ile tutturulmasını sağlar (lipozomların hazırlanması 10'da ayrıntılıdır). İlgili ligandın fizyolojik yoğunluğu (veya yoğunlukları" "hücreler üzerinde" tanımlandıktan sonra, aynı akış sitometri protokolü, BSLB'leri hedef fizyolojik yoğunlukla kaplamak için gereken rekombinant protein konsantrasyonu tahmin etmek için uyarlanır. İki farklı ankraj sistemi kombinasyon halinde veya ayrı ayrı kullanılabilir.

İlk olarak, Ni2+içeren fosfolipidlerin son 12,5 mol'unu içeren SLB, kare mikron10 başına yaklaşık 10.000 His-tag bağlama bölgesi sağlamak için yeterlidir ve BSLB'leri fizyolojik yoğunlukları bu maksimum yükleme kapasitesini aşmayan ticari olarak mevcut proteinlerin çoğuyla süslemek için iyi çalışır. İkinci yükleme sistemi, biyotinilasyonlu anti-CD3e Fab'ı (veya HLA/MHC monomerlerini) streptavidin köprüleri üzerinden yüklemek için biyotin içeren fosfolipidlerden (mol% olarak) yararlanır. Bu iki BSLB dekorasyon yönteminin kombinasyonu daha sonra BSLB'lerin sentetik APC'ler olarak esnek bir şekilde uyarlandırını sağlar. Son derece karmaşık APC yüzey bileşimleri için, fosfolipidlerin ve proteinlerin mol% 'i, eldeki sorunun gerektirdiği kadar protein yüklemek için artırılabilir. Proteinlerin çalışma konsantrasyonları ve biyotinillenmiş fosfolipidlerin mol% 'i tanımlandıktan sonra, BSLB'ler çokparametrik akış sitometrisi ile T hücrelerinin sinaptik çıkışını sorgulamak için monte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre yüzeyi protein yoğunluklarının nicel akış sitometrisi ile ölçülması

  1. Steril fosfat tamponlu saline (PBS), pH 7.4'e EDTA (son 2 mM konsantrasyonuna) ve insan AB serumu (son %10'a) ekleyerek 0,22 μm filtreli insan akış sitometri tamponu (hFCB) hazırlayın (bkz. Tablo 1). Serum safsızlıklarını gidermek ve 4 °C'de saklamak için çözeltiyi 0,22 μm gözenek filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.
  2. Hücreleri kurtarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleme ile tortulayın.
  3. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkama adımında, PBS'deki hücreleri orijinal hacme (santrifüjlemeden önce) yeniden biriktirin ve RT'de 5 dakika boyunca 300 × g'da aşağı doğru döndürün.
  4. Hemositometrede trypan mavi lekeli hücre süspansiyonlarını sayın11. Alternatif olarak, elektrik akımı hariç tutma kullanarak hücreleri sayın. İkincisi için CASY-TT üreticisinin talimatlarına uyun (Bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: CASY-TT hücre sayacı, yüzde uygulanabilir hücrelerin, hücre boyutunun ve hücre hacminin belirlenmesini sağlar.
  5. Hücreleri 107 hücre/mL boyama konsantrasyonuna yeniden canlandırmak için gereken 1:1.000 SabitlenebilirLik Boyası eFluor 780 veya benzeri bir seyreltme içeren PBS hacmini hesaplayın (Bkz. Malzeme Tablosu).
  6. Canlı boya-PBS çözeltisini kullanarak hücreleri yeniden kullanın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  7. Bir hacim buz gibi hFCB ekleyerek canlılık boyasını çıkarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da aşağı doğru döndürün.
    NOT: Bundan sonra soğuk zinciri kesintisiz tutun.
  8. Hücreleri Fc Reseptör Engelleme Çözeltisinin 1:50 seyreltilmesini içeren hFCB ile yıkayın (bkz. Malzeme Tablosu). Hacmi 107 hücre/mL'lik son konsantrasyona getirin ve etkili FcgR engellemesi elde etmek için 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.
  9. U-bottom veya V-bottom 96-well plakasının kuyusu başına 100 μL hücre süspansiyonu (yani 106 hücre) dağıtın. Hücreleri buzda tutun ve ışıktan koruyun (alüminyum Folyo ile örtün).
  10. Her florokrom konjuge antikor için ve en önemlisi yüzey protein yoğunluklarını belirlemek için kullanılan antikorlar için en uygun antikor konsantrasyonlarını tanımlayarak hFCB'de bir antikor ana karışımı hazırlayın. Örneğin, bademcik hücre popülasyonları üzerinde ICAM-1 ekspresyonunun nicelleştirilmesi için, Şekil 1'de gösterildiği gibi, antikor başına bilinen AF647 florokromlarına sahip bir anti-ICAM-1 antikorunun doygunluk konsantrasyonları ile birlikte 1:200 anti-CD4, anti-CD19 ve anti-CXCR5 seyreltmeleri içeren bir karışım hazırlayın (yani, bağımsız antikor titrasyon deneyleri ile tanımlanan 10 μg/mL).
  11. Ek kontroller olarak, ilgili antikor izotip kontrollerini içeren bir antikor ana karışımı hazırlayın (arka plan çıkarma için aynı florokromlarla konjuge edilen benzerleriyle aynı etkili konsantrasyonlarda ), yani ilgili bir AF647 izotip kontrolünün 10 μg/mL'sini kullanın.
    NOT: Yukarıdaki örnekte, hücrelerdeki gerçek ICAM-1 sinyalinden arka plan floresanını çıkarmak için böyle bir izotip kontrolü kullanılır.
  12. Dokularda düşük frekanslarda bulunan hücre alt kümelerindeki protein yoğunluklarını ölçerken, ilgi çekici belirteçler dışındaki tüm boyama antikorlarını içeren floresan eksi bir (FMO) kontrolleri hazırlayın ( 12'deki diğer ayrıntılara bakın).
  13. 300 × g'daki hücreleri içeren 96 kuyu plakasını 4 °C'de 5 dakika boyunca aşağı çevirin, süpernatant atın ve hücreleri nicelik antikor ana karışımının veya izotip antikor ana karışımının 50 μL'sinde yeniden biriktirin.
  14. Bir plaka çalkalayıcı kullanarak hücreleri 4 °C ve 400 rpm'de en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Plakaları ışıktan koruyun (alüminyum folyo ile örtün).
  15. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da hFCB ve santrifüj kullanarak üç kez yıkayın.
  16. Hücre peletini 200 μL PBS kullanarak yeniden biriktirin (yani, 5 × 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona).
  17. Satın alma için:
    1. Standart bir BD FACS Yükleyici kullanıyorsanız, numuneleri 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere aktarın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Yüksek aktarım hızı örnekleyicileri (plaka okuyucuları olarak da adlandırılır) kullanıyorsanız, hemen 1.19 adımına geçin.
  18. MESF standartları için veri toplama işlemine geçmeden önce, nicelik kanalları için floresan yoğunluğu doğrusallığı maksimum ve minimum sınırları kontrol edin.
  19. Telafiden önce, MESF standartları için veri alın ve hem en loş hem de en parlak popülasyonların doğrusal ölçüm aralığına düşmesini sağlayın.
  20. Tazminat örneklerini alın. Dinamik algılama aralığını korumak için nicelik kanallarının fotomultiplier boru (PMT) voltaj değerlerini değiştirmeden saklayın. Telafi matrislerini hesaplamadan önce diğer kanalların PMT voltajında hafif ayarlamalar yapın.
  21. Tazminatı hesaplayın ve uygulayın.
  22. Nicelik kanallarının her biri için en az 2 × 104 toplam MESF boncuk alın ve kaydedin.
  23. Şekil 1A 'da (i)'de gösterildiği gibi, yan ve ileri ışık saçılma alanlarına (sırasıyla SSC-A ve FSC-A) göre tek hücre popülasyonu seçin, ardından zaman sürekliliği içindeki olayların seçimi (Şekil 1A (ii)) ve yüksekliklerine kıyasla hem FSC hem de SSC'de uçuş süresi (W) için düşük (W) FSC-W/FSC-H, ardından sırasıyla Şekil 1A (iii) ve (iv) 'de gösterildiği gibi SSC-W/SSC-H gating. FSC-A ile FSC-H dağılımı arasındaki olayları içeren son bir tek olay kapısı tanımlayın (Şekil 1A (v)).
  24. Kontrol örnekleri alın (İzotip etiketli ve FMO kontrolleri).
  25. En az 10.000 hedef hücre elde edilene kadar numune alın ve kaydedin.
    NOT: Ortalama moleküler yoğunlukların sağlam bir şekilde belirlenmesi, bağımsız deneylerde birkaç donörun analizini gerektirir. Bu, azaltılmış frekanslarda bulunan veya kıt biyolojik malzemeden (örneğin, insan doku biyopsilerinden) elde edilen hücre alt kümelerini analiz ederken çok önemlidir.
  26. Aleti kapatmadan önce 5 dakika boyunca çalışan sitometreyi bir FACS temizleme çözeltisi ve ardından 5 dakika ultra saf su ile yıkayın. HTS kullanıyorsanız, HTS ve Temiz Plaka programı altındaki seçenekleri izleyin.
    NOT: Numuneden numuneye taşımayı azaltmak için sit (sampler) yıkama veya yüksek verimli örnekleyici yıkama seçeneklerini etkinleştirin, bu da sitometreyi tüpler veya kuyular arasında otomatik olarak yıkar. Satın almaya başlamadan önce, yıkanmamış biyolojik kirleticileri sitometre numune hattından çıkarmak için yüksek debide 10 dakika ultra saf su çalıştırın.
  27. Akış Sitometri Standardı (FCS) dosyalarını dışa aktarın.

2. MESF aşırı düzeltilmiş ortalama (veya ortanca) floresan yoğunluğu (MFI) regresyon analizleri

  1. Akış sitometri analiz yazılımını açın ve deneme FCS dosyalarını yükleyin. Şekil 1A'da (i) gösterildiği gibi, boncuk popülasyonlarını yanlarına ve ileri ışık saçılma alanlarına (SSC-A ve FSC-A) göre seçin.
  2. Adım 1.24'te belirtildiği gibi, zaman içinde tek olayların dağılımını denetleyerek veri kalitesini kontrol edin.
    NOT: Kabarcıklar, olayların zaman içinde dağılımında boşluklar oluşturur; bu genellikle HTS kullanılarak edinmenin başlangıcında görünür. Optik sapmalar nedeniyle ölçüm hataları ekledikçe, edinme süresindeki boşlukları kuşatan olayları seçmekten kaçının.
  3. Tek olaylara odaklanın.
    1. Hücre
      1. Tek hücreleri önce SSC-A ve FSC-A dağılımlarına göre tanımlayın (Şekil 1A (i)), ardından sıralı kapılarda W için düşük olaylar FSC-W/FSC-H (singlets-1, Şekil 1A paneli (iii)) ve SSC-W/SSC-H (singlets-2; Şekil 1A panel (iv)). Orantılı FSC-A ve FSC-H (Şekil 1A, panel (v)) içeren olayları seçerek ek bir singlets-3 kapısı tanımlayın. Son olarak, canlı hücreleri sabitlenebilir canlılık boyası için negatif hücreler olarak tanımlayın.
    2. MESF boncukları
      1. 2.3.1.1 adımında olduğu gibi singlets-1'den singlets-3 ayrımcılığına (Şekil 1B, paneller (i) ila (v)) aynı singlet'ları izleyin. MESF popülasyonlarının her birini (boş, 1, 2, 3 ve 4) floresan yoğunluk düzeylerine göre tanımlayın (bkz. Şekil 1B, panel (vi)).
  4. MESF kesirlerinin MFI'sını boş ve 1'den 4'e çıkarın.
  5. Boş boncuk popülasyonunun MFI'lerini her kesirden çıkararak 1 ile 4 arasında MESF kesirleri için düzeltilmiş MFI (cMFI) değerleri oluşturun.
  6. cMFI'ler ile satıcı tarafından sağlanan MESF değerleri arasındaki ilişki için en uygun satırı hesaplayın (bağımsız değişken, sıfıra eşit kesir boştur).
  7. MESF'in cMFI üzerindeki doğrusal regresyonunun eğimini (aşağıdaki denklemde b ) ayıklayın (Şekil 1B paneli (viii), y = a + bx; a = 0 ile bir gerileme gösterir).
  8. Ortanca (bimodal floresan dağılımları için) veya ortalama (normal veya günlük-normal floresan dağılımları için) floresan yoğunluklarını ilgi popülasyonlarından çıkarın ( Şekil 1A panelinde (vii)'deki TFH ve B hücreleri).
  9. 2.5-2.7 adımlarında olduğu gibi, MFI değerlerini izotip etiketli kontrol hücrelerinden çıkarın.
  10. İzotip kontrollerinin F/P'si nicelik antikorları ile aynıysa, MMI'leri İzotip etiketli hücrelerden çıkararak lekeli hücrelerin MBI'lerini düzeltin.
  11. İzotiplerin F/P'si nicelik antikorlarından farklıysa, izotip etiketli hücrelerin MMI'lerini adım 2.7'de hesaplanan eğimle bölerek MESF'yi izotiplerden çıkarın. İlişkili nicellik antikorlarını tahmin etmeden önce Izotip MESF'i nicelik MESF'sinden çıkarın.
  12. Hücre başına bağlı molekül sayısını tahmin etmek için MESF'yi nicelik antikorlarının F/P'sine bölün (Molec. Şekil 1C'nin akış diyagramında gösterildiği gibi hücre).
  13. Proteinlerin yoğunluğunu molec./μm2 (Şekil 1C) olarak çıkarmak için bağlı moleküllerin sayısını tahmini hücre yüzey alanına (CSA (μm2)) bölün. Daha fazla ayrıntı için temsili sonuçlar bölümüne bakın.

3. BSLB'leri kaplayan proteinlerin kalibrasyonunda kullanılacak fonksiyonel fosfolipid türleri

  1. Desteklenen lipid bilayerini oluşturan lipid matrisinin ana bileşeni olarak 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin) kullanın. Bu DOPC çözeltisinde diğer tüm lipit türlerini seyreltin.
  2. 0,4 mM DOPE'un (1,2-Dioleoyl-sn-glisero-3-fosephoethanolamine) 0,2 ila 1 mol%'unu, IÇ floresanlı BSLB'ler oluşturmak için ATTO 390, 488 veya 565 ( Bkz. Malzeme Tablosu) dahil olmak üzere boyalara eşleştirilmiş olarak kullanın.
    NOT: BSLB'lerin iç floresan, sinaptik transfer deneylerinde tek BSLB'lerin ve tek hücrelerin tanımlanmasını kolaylaştırır.
  3. His etiketli proteinleri tutturmak için 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-[(N-(5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) süksinil]) %12,5 mol kullanın. DGS-NTA(Ni)'nin mol%'unu sabit tutun ve en yüksek konsantrasyon olarak 100 nM ile başlayan His etiketli proteinlerin 2 kat titrasyonunu gerçekleştirin. Mutlak nicelikler için negatif kontrol olarak proteinsiz bir durum bırakın.
    NOT: Aksesuar sinyalleri ve ICAM-1 gibi yapışma molekülleri, DGS-NTA(Ni) için proteinin benzeşimini artırmak için 12-His etiketi ile tasarlanmıştır.
  4. Biyotintinli proteinleri biotin-streptavidin-biotin köprüleri üzerinden tutturmak için Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfothoethanolamine-N-(kapak biyotinil)) kullanın. %10 mol ile %0 mol (negatif kontrol olarak) arasında 0,4 mM Biyotinil Kapak PE kapsayan 5 katlı seri titrasyon kullanın. Streptavidin ve biyotinilasyonlu proteinlerin konsantrasyonunu hem kalibrasyon deneylerinde hem de sinaptik transfer deneyleri için sentetik APC'lerin yeniden uzlaştırılmasında sabit tutun (200 nM).
    NOT: Lipid matrisinde Biotinyl Cap PE'nin son mol'u üzerinde biyotinillenmiş proteinlerin ampirik yoğunluklarının regresyon analizleri (ayrıca Onun etiketli proteinlerini tutturmak için DGS-NTA(Ni) içerir) antijenin hedef yoğunluklarını yeniden inşa etmek için kullanılacak mol% 'u tanımlayacaktır.

4. % 1 serum albümin içeren takviyeli HEPES tamponlu salin hazırlanması

NOT: BSLB'lerin yıkama ve protein yükleme adımlarında %1 insan serum albümini (HBS/HSA) veya %1 sığır serum albümini (HBS/BSA) içeren hepes tamponlu salin gereklidir (Tablo 1). 10x HBS stok çözeltisi ve çalışma tamponunu mümkün olduğunca taze hazırlayın; soğutmaya devam edin ve bir ay içinde kullanın. BSA, HSA'ya daha ucuz bir alternatif olsa da, Ni-şelat lipidlerinin verimli bir şekilde tıkanmasını sağlar13 ve yüksek verimli deneyler için önerilir.

  1. 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM glikoz, 10 mM CaCl2 ve 20 mM MgCl2 içeren 10x stok tampon çözeltisi hazırlayın.
    NOT: MgCl2'yi çözmek oldukça eksotermiktir ve yanık tehlikesidir. Bu tuzu yavaşça ve büyük miktarda çözücüye ekleyin. Bu tuzların konsantre çözeltilerini (yani 1 M) hazırlamaktan kaçının, çünkü zaman içinde çökelme eğilimindedirler, bu da çalışma tamponuna kesin katkılarını zorlaştırır.
  2. 10x çözeltiyi 0,22 μm filtre ünitesi kullanarak filtreleyin ve 4 °C'de steril tutun.
  3. 500 mL HBS/ has için, takviye edilen 10x HBS çözeltisinin 50 mL'sini alın, gerekirse pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ultra saf su ile hacmi 483,4 mL'ye ayarlayın.
  4. 483,4 mL HBS, pH 7,4'e 16,6 mL%30 HSA çözeltisi ekleyin.
  5. 500 mL HBS/BSA için, HBS'de 5 g BSA çözün ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yanın. Daha sonra, görünür protein kristalleri veya kümeler görünmeyene kadar şişeyi periyodik olarak ters çevirerek RT'de hafifçe karıştırın.
  6. Elde edilen çözeltiyi 0,22 μm filtre ünitesi kullanarak adım 4,5'ten filtreleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 °C'de saklayın.

5. BSLB'lerde protein yoğunluğu kalibrasyonları

  1. 5.00 ±0.05 μm çapında işlevsel olmayan silika boncuklarını almadan önce, stok çözeltisini iyice karıştırın ve şişelerin dibine çökelmiş büyük boncuk yığınlarını yeniden depolayın.
    NOT: Silika boncukları hızlı bir şekilde çökelme eğilimindedir, bu da sayma hatalarına neden olabilir. Bir P1000 mikropipette maksimum hacminin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak kuvvetlice karıştırın.
  2. 1.000 μL PBS'de 1 μL boncuk çözeltisini seyreltin, boncukları bir hemositometre odası kullanarak sayın ve mL başına konsantrasyonlarını hesaplayın.
    NOT: Silika boncuklarını görselleştirmek için trypan mavisi boyamaya gerek yoktur.
  3. Titrasyon noktası başına 5 × 105 nihai BSLB için gereken silika boncuklarının hacmini hesaplayın.
  4. Gerekli miktarda silika boncukları steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Silika boncuklarını 1 mL steril PBS ile üç kez yıkayın, rt'de (sabit rpm'de) bir tezgah üstü mikrosantrifüjde boncukları 15 sn sn santrifüj haline alın.
    NOT: Yıkama sokunu çıkarırken boncuk peletini rahatsız etmekten kaçının. Küçük bir tampon kolon, lipozom ana karışımını oluşturan lipozomların yayılmasını etkilemez, çünkü bunlar PBS'de de vardır.
  6. BSLB'yi yıkanmış silika boncuklarına monte etmek için üç hacim liposome master karışımı hazırlayın (örneğin, silika boncuklarının ilk toplam hacmi 20 μL ise, lipozom ana karışımının en az 60 μL'lik bir kısmını hazırlayın).
  7. Biotinyl Cap PE mol% titrasyonları için
    1. Biotinyl Cap PE'nin 5 kat seyreltmelerini içeren lipid ana karışımlarını hazırlayın.
      1. 0.4 mM Biotinyl Cap PE mol%'u %100 DOPC matrisinde seyreltin.
      2. Her Biotinyl Cap PE mol% titrasyon noktasını 1:1 (vol:vol) oranında 0.4 mM% 25 DGS-NTA (Ni) çözeltisi ile karıştırın, böylece Ni içeren lipitlerin son% 12.5'i tüm titrasyonlarda bulunur.
        NOT: Ni içeren lipitlerin %12,5'i (vol:vol%), BSLB'lerin karışık lipit bileşimini temsil eder ve bu da Onun etiketli proteinlerinin paralel kalibrasyonlarda test edilebilir. Örneğin, tüm lipozom stokları aynı azı dişi konsantrasyonunda hazırlandığından, 200 μL nihai lipozom karışımında hedef mol% karışımına ulaşmak için, Ni içeren DGS-NTA'nın% 25'inin 100 μL'sini 100 mol% DOPC ile karıştırın.
    2. 5 × 105 yıkanmış silika boncukları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın, böylece tüp başına bir Biotinyl Cap PE mol% titrasyon noktası monte edilir.
    3. Yıkanmış silika boncuklara Biotinyl Cap PE mol% titrasyon ana karışımlarını ekleyin ve toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. Lipid bilayer'i fazla miktarda tahrip eden kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
    4. Havayı yerinden etmek ve lipitleri karıştırma sırasında oksidasyondan korumak için şimdi oluşturan BSLB'leri içeren tüpe Argon (veya Azot) gazı ekleyin.
    5. Argon'ı depolamadan önce 0,4 mM lipit stoklarına ekleyin ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin.
      NOT: Argon/Nitrojen gaz silindirine küçük bir boru bağlayın. Tüplere gaz eklemeden önce, gaz silindiri regülatörünü basıncın 2 psi'den yüksek olmayacak şekilde ayarlayın. Sıvılaşma stoğunun içindeki gaz akışını 5 sn'ye yönlendirmek için steril bir pipet ucunu çıkış borusuna bağlayın ve kapağı hızla kapatın. Lipit stokları durumunda, 4 ° C'de saklamadan önce tüpün kapağını parafin filmi ile kapatın.
    6. BSLB'leri dikey, değişken açılı bir laboratuvar mikserine taşıyın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 10 rpm'lik bir yörüngesel karıştırma kullanarak RT'de 30 dakika karıştırın.
      NOT: Bu adım, desteklenen lipid bilayer oluşumu sırasında boncukların çökeltisini önleyecektir.
    7. Bir tezgah üstü minicentrifuge üzerinde RT'de 15 sn santrifüjleme yaparak boncukları aşağı çevirin ve ardından fazla lipozomları gidermek için 1 mL HBS / HSA (BSA) ile üç kez yıkayın.
    8. NTA sahalarını doyurmak için 100 μM NiSO4 içeren 1 mL%5 kazein veya %5 BSA ve BSLB'lerdeki tüm biyotin-ankraj alanlarını düzgün bir şekilde kaplamak için 200 nM streptavidin ekleyerek oluşan BSLB'leri engelleyin. Toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetle çevirerek hafifçe karıştırın ve rt ve 10 rpm'de 20 dakikadan daha uzun olmayan dikey karıştırıcıda kuluçkaya yatırın.
    9. BSLB'leri bir tezgah üstü minimerrifuge üzerinde RT'de 15 sn santrifüjle aşağı çevirin ve ardından 1 mL HBS/HSA (BSA) tamponu ile üç kez yıkayın.
      NOT: BSLB'leri kaplayan az miktarda yıkama tamponu ile yıkanmış boncukları dikey olarak tutun.
  8. DGS-(Ni) NTA içeren BSLB'lerin% 12,5'inde Etiketli proteinlerin titrasyonu için
    1. DGS-NTA(Ni)'nin son %12,5'ini içeren üç cilt lipozom ana karışımı hazırlayın.
    2. Yıkanmış silika boncuklarını yeniden depolamak için lipozom ana karışımını kullanın ve toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın. Lipid bilayer'e fazla hasar veren kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
    3. Havayı yerinden etmek ve lipitleri karıştırma sırasında oksidasyondan korumak için şimdi oluşturan BSLB'leri içeren tüpe Argon (veya Azot) gazı ekleyin.
    4. Argon'ı depolamadan önce 0,4 mM lipit stoklarına ekleyin ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin.
    5. BSLB'leri dikey karıştırıcıya taşıyın ve 10 rpm'de yörüngesel karıştırma kullanarak RT'de 30 dakika karıştırın.
    6. Bir tezgah üstü minicentrifuge üzerinde RT'de 15 sn santrifüjleme yaparak boncukları aşağı çevirin ve ardından fazla lipozomları gidermek için 1 mL HBS / HSA (BSA) ile üç kez yıkayın.
    7. BSLB'lerdeki NTA sitelerini doyurmak için 100 μM NiSO4 içeren 1 mL%5 kazein (veya% 5 BSA) ekleyerek oluşan BSLB'leri engelleyin.
    8. Fazla engelleme solüsyonını çıkarmak için HBS/HSA (BSA) kullanarak üç kez yıkayın.
    9. Yeni bir U-bottom 96-well plakasında proteinlerin 2 kat seri seyreltmelerini hazırlayın.
      1. Toplam 200 μL HBS/HSA (BSA) tampon hacminde ilgi alanı proteini için 100 nM başlangıç konsantrasyonu hazırlayın, bu çözeltinin 100 μL'lik kısmını ilk sütuna dağıtın ve kalan 100 μL'yi 100 μL HBS/HSA (BSA) tampon içeren #2 sütununun üzerine dağıtın.
      2. 100 μL'yi 2 numaralı sütundan #3 sütununa seri olarak aktararak devam edin ve tüm titrasyon noktalarını kapsayacak şekilde gerektiği gibi tekrarlayın. Serinin son sütununu proteinsiz bırakın, çünkü bu nicelik için boş referans olarak kullanılacaktır.
    10. Hazırlanan BSLB'leri 100 μL HBS/HSA (BSA) tamponunda 5 × 105 BSLB içerecek şekilde yeniden diriltin.
    11. BSLB süspansiyonunun 100 μL'sini ikinci bir U-bottom 96 kuyu plakasının kuyularına aktarın, böylece her biri 5 × 105 BSLB alır.
    12. BSLB'leri içeren ikinci plakayı 300 × g ve RT'de 2 dakika döndürün ve süpernatant atın.
    13. 100 μL hacimleri protein titrasyon plakasından çökelmiş BSLB'leri içeren tabağa aktarın. Alüminyum folyo ile ışıktan koruyun.
    14. RT'de 2 dakika boyunca 300 × g çökeltme adımları kullanarak plakayı HBS/HSA (BSA) tamponu ile üç kez yıkayın.
    15. Kalibrasyonda kullanılan rekombinant protein doğrudan florokromlara eşlenmişse ve bilinen F/P değerlerine sahipse, 5.8.20 adımına geçin.
    16. Kalibrasyonda kullanılan rekombinant protein etiketlenmemişse veya florokromlara eşlenmişse veya MESF boncuk standardı mevcut değilse, protein kaplı BSLB'yi lekelamak için bilinen F/P değerlerine sahip Alexa Fluor 488 veya 647 konjuge antikorları kullanın.
    17. Nicelik antikorlarının doygunluk konsantrasyonları ile leke.
      NOT: Hedef ifade düzeyine bağlı olarak, bunlar 5 ila 10 μg /mL arasındadır.
    18. RT'de 30 dakika ve plaka çalkalayıcı kullanarak 1.000 rpm leke. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
    19. HBS/HSA (BSA) tamponu ile iki kez ve PBS ile bir kez RT'de 2 dakika boyunca 300 × g'lik sedimasyon adımları kullanarak yıkayın.
      NOT: Satın almadan önce yıkanmış BSLB'leri yeniden kullanmak için PBS, pH 7.4 kullanın. Protein içeren tamponlar kullanmayın, çünkü bu, numunelerin yüksek verimli örnekleyicilerle otomatik olarak karıştırılması sırasında kabarcıkların oluşumuna yol açar.
    20. Şekil 1B'de (vii) gösterildiği gibi, en parlak tepelerin nicelik dedektörü (kanal) için doğrusal algılama aralığında kalmasını sağlayarak MESF standartlarını alın.
    21. Örnekleri el ile veya HTS kullanarak alın. İkincisini kullanıyorsanız, BSLB'leri 100 μL PBS'de yeniden diriltin ve 2,5 ila 3,0 μL/ s arasında bir akış hızı kullanarak 80 μL elde edin, 100 μL karıştırma hacmi (veya resüspensyon hacmi daha azsa toplam hacmin% 50'si), 150 μL / s karıştırma hızı ve BSLB'lerin monodispersed olmasını sağlamak için beş karışım.
    22. FCS dosyalarını dışa aktar.
    23. Çiftler veya üçüzler belirlemede hata getireceği için analizler için tek olaylara odaklanın (Şekil 2A). İletişim kuralı adım 1.2.3'te belirtildiği gibi tek olayların iç içe tanımlamayı kullanın.
    24. Her MESF fraksiyonunun (1-4) MFI'sını ölçün ve düzeltilmiş MFI'leri (cMFI) ayıklamak için boş boncukların MFI'sını çıkarın.
    25. 5.33. adımda kullanılacak olan MESF standartları için hesaplanan cMFI üzerinden MESF eğimini (b) ayıklamak için doğrusal bir regresyon analizi gerçekleştirin.
    26. Her titrasyon noktasının MFI'sını çıkarın ve cMFI'leri elde etmek için proteinsiz boncukların MFI'lerini çıkarın.
    27. Her titrasyon noktası için BSLB'lere bağlı MESF'yi ayıklamak için cMPI'ları adım 5.31'de hesaplanan eğimle bölün.
    28. BSLB başına bağlı ortalama molekül sayısını ayıklamak için BSLB'lere bağlı MESF'yi nicelik antikorunun F/P değerine bölün.
    29. BSLB'lerin çapını (5,00 ± 0,05 μm) kullanarak, titrasyon noktası başına proteinin (molec./μm2) son yoğunluklarını (protein konsantrasyonu) hesaplamak için boncuk yüzey alanını (SA = 4pr2) çıkarın.
    30. En uygun çizginin eğimini (b) hesaplamak için protein yoğunluğu üzerinde protein konsantrasyonunun yeni bir regresyon analizini gerçekleştirin.
      NOT: DGS-NTA(Ni)'nin %12,5'inin konsantrasyonu, T hücrelerinin spesifik olmayan aktivasyonunu teşvik etmeden veya SLB'lerin yanal hareketliliğini etkilemeden yaklaşık 10.000 molec./μm210 maksimum ankraj kapasitesi sağlar.

6. T hücreleri ve BSLB'ler arasında sinaptik transfer deneyleri yapmak

  1. Sinaptik aktarım deneyini çalıştırmadan önce
    1. Cihazın floresan spektrum etkileşimlerini tanımlamak için floresan olmayan BSLB'ler, floresan lipitli BSLB'ler, lekesiz hücreler (veya kompanzasyon boncukları; Malzeme Tablosuna bakın) ve tek renkli lekeli hücreler (veya kompanzasyon boncukları) alıp alın. Polikromatik paneli yeniden tasarlamak, hassasiyeti artırmak ve kritik dedektörlerdeki ölçüm hatasını azaltmak için yüksek dökülme yayılımı olan dedektörlere odaklanın (bkz. 14).
    2. En uygun konsantrasyonu bulmak için algılama antikorlarını titratlayarak negatiflerin algılanmasını tehlikeye atmadan pozitif olayların tespitini sağlar.
      NOT: F/P değerleri ve parlaklık toplu işlerden toplu işleme değiştiğinden, antikor lot değişikliği olduğunda bu adımı yineleyin.
    3. İsteğe bağlı: Numuneyi farklı voltaj aralıklarında (yani bir voltaj yürüyüşü) alarak PMT voltajlarını optimize ederek, gürültü üzerinde optimum sinyale yol açan PMT'leri (yani, en parlak popülasyonun sinyalinin doğrusal aralıkta kalmasını sağlarken negatiflerin ve pozitiflerin ayrılması) bulmak için optimize edin.
  2. BSLB'lere T hücre çıkış transferinin ölçümü
    1. Isı inaktive fetal sığır serumunun (FBS) %10'unu, 100 μM esansiyel olmayan amino asitleri içeren takviyeli RPMI 1640 (burada R10 ortamında) hazırlayın, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U/ml penisilin ve 100 μg/mL streptomisin. Kültür ve T hücrelerini genişletmek için R10 ortamını kullanın.
    2. 1. günde, T hücrelerini periferik kan veya lökoredüksiyon sistemi (LRS) odalarından izole edin. İnsan CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin zenginleştirilmesi için immünodensite hücre izolasyonu ve ayırma kitleri kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Hücreleri 1,5 ila 2,0 × 106 hücre/mL arasında değişen son konsantrasyonda, kuyu başına toplam 5 mL'den fazla olmayan 6 kuyu plakaları kullanarak tohumlayın.
    4. T hücrelerini 1:1 oranında insan T hücre aktivasyonu (anti-CD3/anti-CD28) manyetik boncuk kullanarak etkinleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve hücre çoğalmasını ve hayatta kalmasını desteklemek için 100 IU rekombinant insan IL-2 ekleyin.
    5. 3. günde, manyetik sütunlar kullanarak etkinleştirici manyetik boncukları çıkarın (Bkz. Malzeme Tablosu). Ek yıkama adımları için hücreleri kurtarmadan önce manyetik boncukların tüpün kenarlarına bağlı kalmasını sağlayın.
    6. Manyetik boncukları 5 mL taze R10 ortamı ile bir kez daha yıkayın, iyice karıştırın ve mıknatısa geri koyun. Bu birimi kurtarın ve 6.2.5 adımında kurtarılan hücrelerle karıştırın.
    7. 100 U/mL IL-2 içeren taze R10'da hücreleri 1,5-2 × 106 hücre/mL'ye yeniden biriktirin. 48 saat sonra ortamı yenile, IL-2'nin son ilavesinin deney gününden önce 48 saat olduğundan emin olun (kültürün 7 ila 14 gün).
    8. Sinaptik transfer deneyi gününde, Phenol Red-free RPMI 1640 ortamını % 10 FBS ile destekleyerek Sinaptik Transfer Tahlil ortamını hazırlayın (bkz. Tablo 1), 100 μM esansiyel olmayan amino asit, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U/ml penisilin ve 100 μg/mL streptomisin. Rekombinant insan IL-2'ye yer vermiyorsunuz.
    9. Trypan mavisi boyama veya elektrik akımı hariç tutma kullanarak hücreleri sayın ve orta alanda 2,5 × 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona yeniden harcayın. Aşırı hücre ölümü gözlenirse (%>10), polisakkarit ve sodyum diatrizoat karışımı kullanarak ölü/ölmekte olan hücreleri çıkarın ( Bkz. Malzeme Tablosu:
      1. Polisakkarit-sodyum diatrizoat çözeltisinin 13 mL'nin üzerine 15 mL hücre kültürü tabakası.
      2. Rt'de minimum hızlanma ve deacceleration ile 20 dakika boyunca 1.250 × g santrifüj. Hücre katmanını (bulut) ortam ve polisakkarit-sodyum diatrizoat çözeltisi arasındaki arayüzde toplayın.
      3. Hücreleri önceden ısıtılan Sinaptik Transfer Tahlil ortamıyla en az iki kez yıkayın (adım 6.2.7'de hazırlanmıştır).
      4. Sinaptik Transfer Tahlil ortamını kullanarak hücreleri 2,5 × 106/mL'lik son konsantrasyona sayın ve yeniden biriktirin. BSLB'ler ile bu hücre süspansiyonunun 100 μL'si ortak kültür (bkz. adım 6.2.15).
    10. Deneme için gereken BSLB sayısını hesaplayın; test edilecek tüm farklı protein ana karışımlarını ve antijen titrasyonlarını (biyotinillenmiş HLA / MHC-peptit monomerler veya monobiyotinillenmiş anti-CD3φ Fab) düşünün.
    11. Protokol bölüm 5'ten aynı adımları izleyerek BSLB'leri birleştirin, ancak bu sefer karmaşık bir APC zarını yeniden oluşturmak için gereken proteinlerin ve lipitlerin tüm titrasyonlarını birleştirin (Şekil 3A). Aynı vol'i koruyun: ilk silika boncuk hacmi ile kalibrasyonlar sırasında kullanılan protein karışımının hacmi ile BSLB'lerin yüklenmesinde kullanılan zaman ve sıcaklıklar arasındaki vol ilişkileri. Örneğin, ilk kalibrasyon için 0,5 μL silika boncuk/kuyu ve 100 μL/kuyu protein karışımı kullanılmışsa, BSLB'leri T hücreleriyle birlikte kültüre edilecek şekilde hazırlamak için 5:1.000 vol:vol oranlarını koruyun.
    12. BSLB'ler ilgi protein karışımı ile yüklendikten sonra, fazla ilişkisiz proteinleri çıkarmak için BSLB'leri HBS / HSA (BSA) ile iki kez yıkayın. Her yıkama adımında RT'de 2 dakika boyunca 300 × g çökeltme hızları kullanın ve süpernatantları atın.
    13. Kuyu başına 5 × 105 BSLB'× 200 μL'de yeniden satın.
    14. Kuyu başına 100 μL'yi, bir kopya yapmak için yeni bir U-bottom 96 kuyu plakasına aktarın, böylece kuyu başına son BSLB miktarı 2,5 × 105'tir.
    15. BSLB'leri 2 dakika ve RT için 300 × g'da döndürün ve süpernatant atın.
    16. BSLB'leri 100 μL T hücre süspansiyonu kullanarak yeniden diriltme; kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırın.
    17. 37 °C'de 90 dakika boyunca kokültürleri kuluçkaya yatırın.
      NOT: Alternatif olarak, hücreler ve boncuklar kokültür için Fenol-Red içermeyen RPMI yerine HBS/HSA (BSA) tamponunda yeniden kullanılabilir. Bu durumda, inkübasyon CO2 olmayan bir inkübatörde yapılmalıdır, çünkü bu gaz bikarbonat yokluğunda tamponu hızla asitleştirecektir.
    18. BSLB-T hücre kokültürlerini önce RT'deki hücreleri en az 15 dakika kuluçkaya yatırarak soğutun. Onları ışıktan koru.
    19. Hücreleri 500 × g ve RT'de 5 dakika santrifüj edin; üstnatant atın.
    20. Hücreleri blokaj için RT %2 BSA-PBS (Ca2+ ve Mg2+-free) olarak yeniden biriktirin. Hücreleri 45 dakika boyunca buza yerleştirin. Işıktan kork.
    21. Hücreleri kuluçkalarken, antikor ana karışımını PBS'de buz gibi 0,22 μm filtreli% 2 BSA kullanarak ekstra engelleme sağlayacak bir boyama tamponu olarak hazırlayın.
      NOT: Parlak Menekşe boyalarına konjuge edilen bazı antikor partileri, spesifik olmayan bir şekilde BSLB'lere bağlanma eğilimindedir. %5 BSA-PBS ile engelleme, bu gürültüyü azaltmaya yardımcı olur. Şu andan itibaren, soğuk zinciri kırılmadan tuttuğundan emin ol.
    22. 5 dakika ve 4 °C için 500 × g'da kokültürleri aşağı çevirin. Süpernatantları atmadan önce, arka ışık kullanarak 96 kuyu plakasının altını inceleyerek peletin mevcut olduğundan kısa bir süre emin olun.
    23. Çok kanallı bir pipet kullanarak, optimize edilmiş antikor konsantrasyonları içeren boyama ana karışımındaki hücreleri yeniden biriktirin.
      NOT: Boyama hacimlerinin dağılımında kabarcıkların ve hataların üretilmesini önlemek için filtresiz pipet uçlarını kullanın.
    24. İzotip etiketli hücreler ve BSLB'ler, floresan ve floresan olmayan BSLB'ler ve tek başına lekelenmiş hücreler ve BSLB'leri içerir. Tüm kontroller için kuyu başına toplam olay sayısına saygı gösterin (yani, lekeli olay başına antikorların göreceli olarak artmasını önlemek için yalnızca 5 × 105 BSLB/ kuyu içeren BSLB'ler ve sadece 5 × 105 hücre / kuyu içeren hücre kontrolleri).
    25. Hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın ve buzda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Işıktan kork.
    26. Hücreleri ve BSLB'leri buz gibi %2 BSA-PBS, pH 7,4 ve 500 × g'luk çökeltme adımlarını kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Yıkanmış kokültürleri 100 μL PBS'de yeniden satın alın ve hemen elde edin.
    27. Sabitleme gerekiyorsa, PBS'de %0,5 w/v PFA kullanarak 10 dakika boyunca sabitlayın, bir kez yıkayın ve edinceye kadar PBS'de tutun. Işıktan kork.
    28. Tazminat almadan önce, hem en loş hem de en parlak popülasyonların doğrusal ölçüm aralığına düşmesini sağlayan MESF standartlarını alın.
    29. Ücret örnekleri alın, telafiyi hesaplayın ve ücret matrisini (bağlantı) denemeye uygulayın.
    30. Nicelik kanallarının her biri için en az 2 × 104 toplam MESF standardı alın ve kaydedin.
    31. Yüksek verimli örnekleyiciler kullanarak satın alma için, cihaz alımını standart olarak ayarlayın, numune alımını 80 μL (veya toplam hacmin% 80'i), numune akış hızını 2,0 ila 3,0 μL / s arasında, numune karıştırma hacmini 50 μL (veya karıştırma sırasında kabarcık oluşumunu önlemek için toplam hacmin% 50'si), 150 μL / s numune karıştırma ve kuyu başına karıştırma 3 ila 5 arasında ayarlayın.
    32. Örnek başına en az 1 × 104 tek BSLB alın (referans gating stratejisi için Şekil 3B panellere (i)-(vi) bakın).
    33. Aleti kapatmadan önce 5 dakika boyunca çalışan sitometreyi bir temizleme çözeltisi ve ardından 5 dakika ultra saf su ile yıkayın. HTS kullanıyorsanız, HTS sekmesi altındaki seçenekleri ve Temizle seçeneğini izleyin.
    34. FCS dosyalarını dışa aktar.

7. Parçacıkların BSLB'ye sinaptik transferinin ölçülmesi

  1. Deneme FCS dosyalarını açın. Şekil 3B'de (i) gösterildiği gibi, yan ve ileri ışık saçılma alanlarına (SSC-A ve FSC-A)'ya göre hücre ve BSLB popülasyonu seçin.
  2. Sürekli alım penceresindeki olayları seçin (Şekil 3B (ii)).
  3. Hem hücrelerin hem de BSLB'nin tek olaylarına odaklanın; FSC-W/FSC-H (singlets-1, Şekil 3B panel (iii)) ve SSC-W/SSC-H (singlets-2) kapılarındaki düşük W'ye dayanarak ilk olarak tek hücreleri tanımlayın; Şekil 3B panel (iv)). Orantılı FSC-A ve FSC-H (Şekil 3B, panel (v)) içeren olayları seçerek ek bir singlets-3 kapısı tanımlayın.
  4. Mesf kesirlerinin MFI'sını boş ve 1'den 4'e ve her deneme örneği için tek hücrelerden ve MESF'den çıkarın.
  5. Boş boncuk popülasyonunun MFI'sını her kesirden çıkararak 1 ile 4 arasında MESF kesirleri için düzeltilmiş MFI (cMFI) değerleri oluşturun.
  6. Tek BSLB'ler ve hücreler için cMFI'ler oluşturun ( Şekil 3C paneline (i)bakın).
  7. İlgili T hücre işaretçilerine karşı antikorlarla boyanmış BSLB'nin MFI'sını düzeltmek için izotip kontrol antikorları ile boyanmış BSLB'den gelen sinyali kullanın. Şekil 3C panelinde (ii) gösterilen denklemi kullanarak normalleştirilmiş sinaptik aktarım yüzdesini (%NST) hesaplamak için cMFI kullanın.
  8. Bunun yerine, TCR tetiklemesine yanıt olarak özel olarak aktarılan parçacıklarla ilgileniyorsanız, sinyali agonistik BSLB'lerin MFI'sinden boş BSLB'lerden çıkarın. Şekil 3C panelinde (ii) gösterilen denklemi kullanarak TCR güdümlü NST% hesaplamak için bu cMFI'yi kullanın.
  9. T hücre-BSLB arayüzünde parçacık yükü olarak aktarılan toplam molekül sayısını belirlemekle ilgileniyorsanız, T hücre-BSLB kokültürleri için aynı cihaz ayarlarını ve alım seansını kullanarak MESF kıyaslama boncuklarını alıp alın.
  10. MESF boncuk popülasyonlarını analiz edin ve protokol adım 5.8.15 ila 5.8.17'de belirtildiği gibi cMFI'lerini çıkarın. CMFI üzerinden MESF'in regresyon analizi için en uygun çizginin eğimini hesaplayın.
  11. BSLB'lere yatırılan MESF sayısını ayıklamak için hesaplanan eğimi kullanın.
  12. BSLB başına hesaplanan (ortalama) MESF'leri nicelleşme antikorunun F/P değerine bölerek BSLB'lere aktarılan belirteçlerin molekül sayısını hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre yüzeyinde mutlak protein nicelemesi için FCM
Ligandların fizyolojik yoğunluklarını sunan BSLB'lerin yeniden uzlaştırılması, modellenen hücre alt kümesindeki toplam protein yoğunluklarının tahminini gerektirir. BSLB'leri yeniden inşa etmek için, BSLB ile hücreler arasındaki yapışmayı ve fonksiyonel etkileşimi destekleyen proteinlerin yanı sıra, örneğin CD40, CD58 ve B7 reseptörleri (CD80 ve CD86) gibi ilgili ligandları da ekleyin. ICOSL3, PD-L1 ve PD-L215 gibi costimulatory moleküller de dahil olmak üzere eldeki soruya bağlı olarak ek proteinler eklenebilir. Diğer moleküller için, hücrelerin kantitatif akış sitometrisi ile doğrudan analiz edilmesiyle belirlenen moleküler yoğunlukları kullanarak BSLB'leri yeniden inşa edin. Doğrudan konjuge antikorlar için BioLegend, her antikor lot numarası için F/P değerleri sağlar. Antikorlar ayrıca şirket içinde etiketlenebilir ve spektrofotometri ile belirlenen F/P oranları, istenen florokroma konjuge edilmiş ticari antikor olmadığında bir alternatif sağlar. Hücrelerin ve BSLB'lerin yüzeyindeki rekombinant proteinlerin sayısını kalibre etmek için aynı antikorları kullandığımızdan, antikor bağlayıcı valency'yi düzeltmeye gerek yoktur, çünkü bu sabit kalır. Antikor bağlayıcı hassasiyet gerekiyorsa, BSLB'leri süslemek ve yüklü rekombinant proteinlerin moleküllerini doygunluk koşullarında lekelendikten sonra bağlı antikorların sayısıyla karşılaştırmak için hem rekombinant proteinleri hem de bilinen F/P'li antikorları kullanın.

Hücre başına bağlı antikor molekülleri, özel bir monokromatik akış sitometrik ölçümü veya palatin bademcikleri gibi ilgi çekici bir dokudaki hücrelerin nispeten seyrek bir alt kümesindeki mutlak protein yoğunluklarını tahmin etmeyi amaçlayan çok renkli bir antikor paneli kullanılarak tahmin edilebilir. Şekil 1 örnek olarak CXCR5+ B hücrelerinde ve foliküler T hücrelerinde (TFH) ICAM-1 yoğunluklarının temsili ölçümlerini göstermektedir. Şekil 1A'da gösterilen aynı boyama protokolü ve akış sitometrisi analiz ilkeleri epitel hücreleri, stromal hücreler, monositler, monosit türevli dendritik hücreler (moDC' ler) veya diğer insan ve fare dokularındaki B ve T lenfositlerindeki protein yoğunluklarını ölçmek için kullanılabilir. Kan ve bademciklerden farklı dokular için, hücrelerin sindirme enzimlerine uzun süre maruz kalması hücre yüzeyi ekspresyon seviyelerini azalttığı için, proteaz kokteylleri kullanarak hücreleri izole ederken dikkatli olunmalıdır.

Süreklilik dışındaki olaylar ışığı anormal bir şekilde dağıtır ve nicelleştirmeyi tehlikeye atarak, sürekli alım penceresindeki tek canlı hücrelere odaklanın ve analizler (Şekil 1A II). Belirlemelerin doğruluğunu artırmak için FCΦR'lerin etkili bir şekilde engellenmesiyle APC'lerin spesifik olmayan lekelenmelerini azaltın. hFCB'de bulunan insan serumu ve EDTA, manipülasyon ve boyama sırasında hücrelerin kendiliğinden toplanmasını azaltmak için serbest Ca2+ şelatlama yaparken etkili FcφR engelleme sağlar ( Şekil 1A 'daki siyah oklar (iii) ve (iv) bademcik hücrelerinin süspansiyonlarında kalan çiftleri gösterir).

Boncukları ve yazılımı (veya benzerlerini kullanarak) kurulum ve izleme boncuklarını kullanarak cihaz performansını takip etmek (veya benzerleri; Malzeme Tablosuna bakın), özellikle parçacıkların BSLB'ye sinaptik aktarımı sadece MMI'ler kullanılarak ölçüldüğünde (örneğin, MESF standartlarının olmadığı florokromlar için) zaman içinde niceliklerin tekrarlanabilirliği için kritik öneme sahiptir. Benzer şekilde, her kalibrasyon noktasının floresan ve florokrom sayısı arasındaki doğrusal ilişkiyi tutması için MESF standartlarının yanında kullanılacak nicelik dedektörü için rasgele floresan birimlerinin doğrusal aralığını (yani doğrusallık minimum ve doğrusallık maksimum) kontrol edin.

Floresan için "boş" örneklerin hazırlanması veya arka plan boyama gürültüsü hakkında bir fikir veren numuneler, spesifik olmayan floresan sinyali çıkarmak için gereklidir. İzotip kontrolleri ve/veya biyolojik olarak boş numuneler (örneğin, nakavtlar), hücrelerin arka plan sinyalini düzeltmek ve nicelik antikorlarından elde edilen gerçek sinyali çıkarmak için gereklidir (Şekil 1A paneli (viii)). Benzer şekilde, standart MESF boncukları, her gerçekten pozitif boncuk popülasyonundan arka plan sinyalini çıkarmak için özel bir boş popülasyon kullanır (Şekil 1B paneller (vii) ve (viii)). Regresyon analizleri yapıldıktan ve MESF ile düzeltilmiş MBI'ler arasındaki ilişkiyi tanımlayan eğim çıkarıldıktan sonra, mutlak moleküler yoğunluklara dönüşüm basit matematiksel işlemleri takip eder (Şekil 1C).

Şekil 1C'de CSA'yı tahmin etmek için, binlerce hücreden hücre hacmi ve çap ölçümlerini çıkarmak için elektrik akımı dışlama (CASY-TT) kullanılmıştır. Küreler için yüzey alanının hesaplanmasından (4pr2) tahmin edilen CSA, hücrelerin aktivasyon durumuna göre değişir, aktif olmayan B hücreleri için 170,37 ± 4,91 μm2 ve aktif olmayan ve aktif olmayan T hücreleri için 234,52 ± 1,53 μm2 ve 318 ± 24,45 μm2 değerlerine sahiptir. Bu CSA'lar, aktif olmayan lenfositlerin üç boyutlu kırma indeks tomografisi16 gibi görüntüleme teknikleri ile tahmin edilenlerle karşılaştırılabilir.

Fizyolojik yoğunluk aralığı tanımlandıktan sonra (örneğin, farklı aktivasyon programlarından geçen hücrelerdeki yüzey yoğunlukları karşılaştırılarak), BSLB'ler bu yüzeyleri modellemek için kullanılabilir. NIH tetramer tesisi (veya monobiotinylated monomerik anti-CD3φ-Fab) tarafından sağlanan biyotinillenmiş antijenik HLA-peptit monomerlerinin titrasyonu, kanonik bir APC membranını yeniden inşa etmek için ICAM-1 12-His ile birlikte kullanılabilir. 6, 9, 12 ve 14 His ile etiketlenmiş ticari proteinler BSLB yüzeyini süslemek için kullanılabilir (örneğin ICAM-1 12-His ile şekil 2A'ya bakın). Protein titrasyonları ve nicel FCM analizleri, fizyolojik APC yüzeylerini yeniden inşa etmek ve farklı T hücre alt kümelerinin sinaptik çıktısı üzerindeki etkilerini test etmek için sağlam bir metodoloji sağlar.

T hücre sinapslarının çıktısını incelemek için, ortalama olarak bir hücrenin çalışılan süre boyunca bir BSLB ile etkileşime girmesini sağlamak için 1:1 BSLB-T hücre oranı kullanın. Malzeme transferinin kuluçka süresiyle orantılı olduğunu ve hücre boyunca düşük miktarlarda aktarılan molekülleri tespit etmek için çok yönlü bir platform sağladığını gözlemledik:BSLB arayüzü. Uygun bir panel tasarımı, tSV'lerde olduğu gibi trans-sinaptik malzemenin tespitinin hassasiyetini ve güvenilirliğini artırmak için kritik öneme sahiptir, çıkış 25 ila 36 vezikül / hücre / 20 min2,3 arasında değişir. Önce florokrom etiketli her antikor ve lipitin spektral dökülmesini test edin. Yüksek dökülme gözlendiğinde, lekelenme antikorlarının titrasyonu ve BSLB'yi oluşturan floresan lipitlerin yüzdesinin yanı sıra, telafi edilen numunelerdeki yayılma hatasını azaltmak ve gürültü oranı üzerindeki sinyali geliştirmek için PMT voltaj yürüyüşlerini öneririz (konuya özel bir giriş için 12,14,17'ye bakın).

Null BSLB'ler (antijen veya anti-CD3 Fab eksikliği) ve nakavt hücreleri veya izotip etiketli örnekler18 dahil olmak üzere nicelleştirme kontrollerinin kullanılması, SE'ler gibi efektör tSV'nin yanı sıra sinaptik yarık içinde salınan supramoleküler saldırı parçacıklarının transferini doğru bir şekilde ölçmek için gereklidir. Konjugelerin soğuk bazlı ayrışması üzerine tek hücre ve BSLB popülasyonunu tanımlamak için sentetik floresan lipitlerin (DOPE Atto konjugeleri) yanında CD4, CD2 veya CD45 gibi oldukça bol hücre yüzeyi proteinleri kullanın. Analizleri tek BSLB ve hücrelerdeki floresan yoğunluklarının geometrik ortalamasına veya ortancasına odaklamak (CD4 Şekil 3B'de kullanılır). SE'ler plazma membranından (PM) elde edilen özel bir tSV türüdür ve BSLB'ye transferleri, etkileşime giren hücrelerin yüzeyinde tutarlı sinyal kaybı ile BSLB'lerde işaretleyici sinyalin kazanımı ile kanıtlanmaktadır (Şekil 2B'de gösterildiği gibi BSLB'lerdeki TCR'ye bakın, mor oklar). Antijen veya anti-CD3'ten yoksun null BSLB'ler, TCR kompleksleri aracılığıyla etkileşime giren hücrelerin uyarılmasından kaynaklanan BSLB'deki TCR'nin (ve diğer T hücre işaretleyicilerinin) spesifik kazancını izlemek için mükemmel bir referanstır.

Figure 1
Şekil 1: APC'lerin yüzeyindeki proteinlerin mutlak nicelemesi. (A) Bademcikler B hücrelerinin yüzeyinde ICAM-1'in nicel akış sitometrisi ölçümlerinin örneği (Foll. Bc) ve yardımcı T hücreleri (TFH). (i-vii) İnsan palatin bademciklerinden izole edilmiş tek CXCR5+ Bc ve TFH analiz etmek için gating stratejisi. Gösterilen, sürekli edinme penceresinde bulunan tek, canlı olayları tanımlamak için sıralı gating stratejisidir. (iii-iv) siyah oklar çiftleri gösterir. (viii), ICAM-1'in (deniz mavisi histogramları) hücre yüzeyi ekspresyonunu gösteren histogramları, (vii) gösterilen popülasyonların ilgili izotipleri (gri histogramlarla örtüşen siyah histogramlar) ile etiketlenmiş FMO kontrolleri (gri histogramlar) ve FMO kontrollerine kıyasla kapladı. Oklar, CXCR5+ B hücrelerini tanımlamak için kullanılan iç içe geçiş stratejisinin yönünü gösterir (M.Ö. CD19+) ve TFH (CD4+). (B) Bademcik hücrelerinin yüzeyindeki mutlak moleküllerin MFI'den çıkarılması, A'da gösterilen hücrelerle aynı enstrüman ayarı kullanılarak elde edilen MESF kıyaslama boncuklarının regresyon analizlerini gerektirir. (i-v) Gösterilen, sürekli edinme penceresinde bulunan tek, canlı olayları tanımlamak için sıralı gating stratejisidir. (vi) Farklı standart MESF popülasyonlarından MPI'ların gating ve ölçümü. (vii) olarak tanımlanan MESF popülasyonlarının kaplad histogramları gösterilmiştir. Sağ üstte görüntülenen değerler, 5 MESF popülasyonunun (boş, 1, 2, 3 ve 4) her biri için MFI'leri temsil eder. (viii) (vii) içinde gösterilen MESF popülasyonları için MESF'nin cMFI üzerinde doğrusal gerilemesi. Gösterilen eğim (b) A'daki verilerden hücrelere bağlı MESF'yi ayıklamak için. (C) Molekül sayısının ekstraksiyonunda, (viii) olarak hesaplanan eğimin ölçülen MESF cMFI'den (cMFIM) uygulanmasıyla başlayan basit matematiksel işlemleri izleyin ve MESF değerlerine (MESFR) başvurun. Hücrelere (MESFcells) bağlı MESF'yi ayıklamak için, hücrelerin düzeltilmiş MFI'sını (cMFIcells) hesaplanan eğime bölün. Daha sonra hücrelere bağlı molekül sayısını hesaplamak için (Molec. hücreler), MESFcells'i algılama (nicelik) antikorunun F/P'lerine bölün. Son olarak, hücrelerin yüzeyindeki (Dcells) moleküler yoğunluğu hesaplamak için Molec'i bölün. tahmini hücre yüzey alanına (CSAE) göre hücreler. Kısaltmalar: X = bağımsız değişken; Y = bağımlı değişken (ölçülen floresan), cMFIM = ölçülen düzeltilmiş MFI; MESFR = referans MESF değerleri; MESFcells = hücre başına tahmini MESF; cMFIcells = düzeltilmiş MFI hücreleri; . hücreler = hücre başına tahmini moleküller. Dcells = hücreler üzerindeki tahmini yoğunluk; CSAE = tahmini Hücre Yüzey Alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: BSLB'nin rekombinant ICAM-1 ile yeniden kavrulması ve BSLB'lere partikül transferinin ölçümü. (A, i-vi) Rekombinant monomerik ICAM-1 12-His (rICAM-1) yoğunluklarının artmasıyla yeniden oluşan BSLB'lerin akış sitometri analizi. (i-v) Şekil 1'de olduğu gibi, gating stratejisini sürekli edinme penceresindeki tek BSLB'lere odakla. Ölçüm hatalarını önlemek için hariç tutulan zaman sürekliliği kapısından hemen önceki boşluğa dikkat edin. (vi) İyi protein kalitesi genellikle dar floresan dağılımlarının gözlemlenmesiyle BSLB'nin yüksek konsantrasyonlarda homojen kaplamasıyla sonuçlanır (düşük Değişim Katsayısı, vi'deki histogramlara bakın). (B) ICAM-1 referans konsantrasyonunun (CR) ölçülen yoğunluk (DM) üzerindeki regresyon analizleri. Şekil 1'deki deneylerde ölçülen hücrelerin (Dcell) yoğunluğunu elde etmek için hedef protein konsantrasyonlarını (CT) hesaplamak için eğimi kullanın. Kısaltmalar: 12-His = 12-histidines etiketi; DM = ölçülen moleküler yoğunluklar; CR = rICAM-1'in referans konsantrasyonları; CT = hedef konsantrasyonu (enterpolasyonlu olacak); Dcells = hücrelerde ölçülen yoğunluklar (ayrıca bkz. Şekil 1C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: BSLB'lere aktarılan T hücre sinaptik parçacıklarının ölçümü. (A; i-v) Model membranlarını yeniden oluşturan BSLB'lerle T hücrelerinin birlikte kültleşmesi ve daha sonra akış sitometrisi ile parçacık transferinin ölçülması için kritik adımları gösteren akış diyagramı. (iv) Mavi ve koyu sarı diyagramlar, iki yönlü akış sitometrisi çizimlerinde hücrelerin ve BSLB'lerin göreli dağılımını ve konumunu gösterir. (v) Boş BSLB'lere (gri) kıyasla agonistik BSLB'lerin (koyu sarı) floresan kazancını gösteren floresan dağılım histogramları. (B) Örnek sinaptik transfer deneyi. (i-vi) Gösterilen, sürekli edinme penceresindeki tek BSLB'leri ve hücreleri tanımlamak için gating stratejisidir. Menekşe okları, C. (C) (i) olarak devam eden analiz yönünü gösterir, analizleri tek hücrelerin (mavi) ve tek BSLB'lerin (sarı) MFI'sına odaklayın. (ii) BSLB ve hücreler için hesaplanan cMFI'den normalleştirilmiş sinaptik transferi (NST%, üst) ve Tmax% (altta) hesaplamak için denklemler. (iii-vi) Hücreler (mavi tonları) ve BSLB'ler (sarı tonlar) için floresan yoğunluk dağılımlarının, aktive edilmeyen (gri) ve 250 (yumuşak renk değeri) veya 1.000 (yüksek renk değeri) molec./μm2 ile aktive edilmeyen (gri) dahil olmak üzere, ANTI-CD3φ-Fab'ı aktive eden T hücresinin farklı yoğunluklarında değişimini gösteren histogramlar. Farklı renk değerlerindeki sayılar, sarı renkle gösterilen BSLB histogramları için ölçülen NST% değerini temsil eder. Kaplanmış histogramlar, farklı belirteçler için pozitif olan T hücre veziküllerinin sinaptik aktarımındaki aşırı hiyerarşiyi gösterir. BSLB'lerin bu bileşimi için (ICAM-1'in 200 molec./μm2'si ve CD3φ-Fab karşıtlığının artan yoğunlukları), tSV'ler CD28+(vi) > CD4+(v) > TCR+(iii) > CD81+(iv) ile BSLB'ye aktarılır. Önceki makalelerde gösterildiği gibi, TCR ve CD81 SE'lerin bileşenleridir ve nispeten daha yüksek yüzey seviyelerinde ifade edilmesine rağmen, CD4'e nispeten daha yüksek verimliliklerle aktarılır. SE dökülmesi hücre yüzeyi CD81 ve TCR'nin kaybına ve bu sinyallerin BSLB'lerde kazanılmalarına neden olur (250 molec için mor oklar açın./μm2 ve sarı histogramlarda 1.000 molec./μm2 için kapalı mor oklar). (D) Konjugelerin yanlış soğutulması, giriş boncuklarının (sol biparametrik arsa) karşılaştırılmasından görüldüğü gibi SLB'yi silika boncuklardan koparan hücrelere ve 37 °C'den (sağ biparametrik arsa) 4 °C'ye kadar hızlı soğutmaya maruz kalan konjugelere yol açar. Şekil 3B panel (vi) ile de karşılaştırın. Kısaltmalar: PRF1 = perforin 1; NST% = normalleştirilmiş sinaptik transfer; Tmax yüzde = gözlemlenen maksimum aktarımın yüzdesi (kontrol veya referans koşulunda); tSV'ler: trans-sinaptik veziküller; SE'ler: sinaptik ektozomlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu iletişim kuralında kullanılan arabellekler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BSLB'ler, model APC membranları ile uyarılan T hücrelerinin partikül çıkışını incelemek için çok yönlü araçlardır. Yöntemin esnekliği, ligandların ve sinyallerinin TSV'lerin ve supramoleküler saldırı parçacıklarının ve bileşenlerinin salgılanması üzerindeki etkilerini incelemek için karmaşık ve indirgemeci membran bileşimlerinin yeniden inşasını sağlar. Bu teknolojiyi önceden devreye konmuş TH, CTL, Tregs ve CART15 dahil olmak üzere çeşitli T hücreleri üzerinde test ettik. Bu protokol ayrıca taze izole edilmiş ve sessiz T hücrelerinin sinaptik parçacık salınımının ölçümü için de çalışır. Yeni izole edilmiş T hücrelerini kullanmanın bir sınırlaması, bu sessiz popülasyonların hücre yüzey bileşimiyle ilişkili farklı bir trans-sinaptik parçacık profili üretmesidir (daha fazla ayrıntı için bkz.

Basit bir akış sitometri paneli olarak, Anti-TCR klonu IP26, anti-CD81 klonu 5A6, anti-perforin (PRF1) klonu B-D48 veya anti-CD40L klonu 24-31 ve ATTO 390 veya ATTO 565 içeren lipitlerin (BSLB'lere içsel bir floresan vermek için) kullanılmasını öneririz. Tek BSLB'lerden ve konjugelerden tek hücrelerin ayırt edilmesine yardımcı olmak için, hücre yüzeyinde çok yüksek seviyelerde ifade edilmesine rağmen sınırlı seviyelerde BSLB'lere aktarılan anti-CD4 klonu OKT4 ve/veya anti-CD45 klonu HI30'un kullanılmasını öneririz (florokromlar ve diğer doğrulanmış antikorlar hakkında daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın). Daha yüksek sayıda florokroma sahip paneller tasarlanabilir, ancak analiz edilen her florokromun floresan spektrum dökülmesinin sistematik bir değerlendirmesini gerektirir. Duyarlılığı artırmak için, 0,5 μg ila 20 μg/mL final arasında değişen farklı nicel antikor titrasyonları deneyin ve yeni antikor stokları kullanıldığında tekrarlayın. Parçacık transferinin mutlak ve göreceli ölçümlerinin tekrarlanabilirliğini sağlamak için, her yeni biyotinilasyonlu ve Ni içeren fosfolipidlerin bağlama kapasitesini titratlayın ve hesaplayın, çünkü çok'tan çoka önemli ölçüde farklılık gösterebilirler. T hücreli BSLB konjugelerinin kademeli olarak soğuması, düşük bolluğa sahip parçacıkların algılanmasının hassasiyetini artırmak için kritik öneme sahiptir. Kokültürlerin hızlı soğuması, lipid floresanının önemli kaybı ile kanıtlanarak BSLB'lerin yok olmasına yol açar (Şekil 3D).

Eldeki deneysel soruya bağlı olarak T hücreli immün sinapsların partikül çıkışını ölçmek için farklı metrikler kullanılabilir. Örneğin, tomurcuklanan SE'lere ayrılmış yüzey proteinlerinin taban çizgisi ifade düzeylerinde küçük farklılıklar beklendiğinde, normalleştirilmiş bir sinaptik transfer (NST%) ölçümü kullanılabilir (Şekil 3C paneli (ii) üst denklem). İkincisi, BSLB'lerdeki yüzde MFI sinyalini, hücrelerin ve boncukların toplam, birleşik MFI'sının bir işlevi olarak ölçendir. Bu yaklaşımdan bir uyarı, supramoleküler saldırı parçacıklarının bileşenleri gibi PM'de ifade etmeyen transfer işaretçilerinin analizidir19. Bu öğeler BSLB'lere hücre içi depo eksositozu gibi PM transiti bağımsız yollarla ulaştığından, pay nispeten küçük bir paydaya (hücre yüzeyi ifade düzeyi) bölüneceğinden, sonuç şişirileceğinden NST% hesaplaması önerilmez. Bunun yerine, antijen veya anti-CD3 Fab'ın artan yoğunluklarını sunan boş BSLB'ler ve BSLB'ler arasındaki perforin ve granzimlerin birikmesini karşılaştırmak için düzeltilmiş MPI'ları kullanın. Alternatif olarak, BSLB'lere aktarılan hücre içi elementleri izlemek için, BSLB'lere (Tmax% ) aktarılan maksimum sinyalle ilgili olarak tahmini mutlak molekülleri veya sinyal yüzdesini karşılaştırmak için kullanın (Şekil 3C paneli (ii) alt denklem). Tmax% için, referans Tmax olarak en yüksek antijen yoğunluğunu sunan bslb örneğinde (veya durumunda) ölçülen cMFI veya molekülleri kullanın. Farklı donörleri analiz ederken, karşılaştırmalar için donöre özgü Tmax kullanın. TCR'nin spesifik tetiklenmesine yanıt olarak aktarılan materyal incelenirken, MFI'ler antijen negatif (null) BSLB'lerde gözlenen arka plan aktarımı seviyesine de düzeltilebilir.

BSLB'lere aktarılan moleküllerin mutlak sayısını tahmin etmek daha sağlam bir yöntemdir, çünkü bu, moleküllerin uç nokta olarak ölçülması ve bağımsız deneylerin daha iyi karşılaştırılması ile MESF kalibrasyonunu içerir. Tmax% bağımsız deneylerde benzer bir normalleştirme sunar ve özellikle perforin ve granzimler gibi hücre içi belirteçler veya MESF standardı bulunmayan belirteçler için polikromatik FCM kullanırken kullanışlıdır. Tmax% sadece kontrol durumunda en yüksek transfere sahip duruma herhangi bir durumdaki sinyal yüzdesi (örneğin, uyuşturucu çalışmaları için araç / tedavi edilmemiş kontroller, CRISPR / Cas9 kütüphaneleri için kontrol kılavuzu RNA'ları). Ayrıca, Tmax% hem cMMI'lar hem de mutlak sayıda molekül için kullanılabilir ve gen silmelerin T hücrelerinin sinaptik çıkışı üzerindeki etkilerinin yan yana karşılaştırmaları için özellikle yararlı olmuştur. İkincisi, gen düzenlemenin bağımsız donörler ve deneyler arasında bağışıklık reseptör ekspresyonunun dinamik aralığında yüksek değişkenliğe yol açtığında belirgindir ve bu da mutlak ve NST% ölçümlerini etkileyebilir.

BSLB'ler, farklı T hücre tiplerinin sinaptik çıktısının yakalanmasını ve karakterizasyonunu kolaylaştırmıştır, aksi takdirde APC'ler tarafından hızlı içselleştirmeleri nedeniyle izole edilmesi zordur2. BSLB'lerin fiziksel stabilitesi ayrıca T hücreleri tarafından incelenen BSLB'lerin floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamaları için bir platform sağlar, böylece kütle spektrometrisi ve nükleik asit dizileme teknolojileri tarafından son derece saf parçacık preparatlarının biyokimyasal olarak karakterize edilmesine olanak tanır. İkincisi, T hücreleri tarafından çok çeşitli deneysel koşullar altında dökülen hücreler arası habercilerin ayrıntılı karakterizasyonunu kolaylaştırır. Bu partikül habercilerin farklı T hücre tipleri ve aktivasyon durumları arasında nasıl değiştiği, kurallı ve nonkanonik antijen reseptörlerinin (yani kimerik antijen reseptörleri) ve agonistik ve antagonistik membran sinyallerinin parçacık bileşimini nasıl etkilediği gibi farklı sorular ele alınabilmektedir. Şu anda uyarılmış T hücrelerinin bağışıklık sinapslarında salgılanan sitokinlerin nicel karakterizasyonu için bu teknolojiyi daha da geliştiriyoruz. İkincisi, T hücre aktivasyonunu takiben BSLB'lerde biriken interlülinlerin, interferonların ve kemokinlerin verimli bir şekilde yakalanmasını sağlayan rekombinant sitokin reseptörleri ve antikor kombinasyonlarının dikkatli bir şekilde incelenmesini gerektirir. BSLB'ler, stromal ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri gibi TSV salınımını tetiklediklerinden şüphelenilen diğer APC'lerin yüzey bileşimini modellemek için uyarlanabilir. BSLB'ler ayrıca kanser ve diğer patolojilerin tedavisi için ekzosit ve tSV salgı makinelerinin pozitif ve negatif modülasyonunu arayan yeni farmakolojik bileşikleri taramak için uyarlanabilir. Son olarak, BSLB'ler bulaşıcı hastalıklarda T hücre fonksiyonunu modüle eden virülans belirleyicilerini keşfetmek için de kullanılabilir20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Laboratuvar üyelerimize ve Kennedy Romatoloji Enstitüsü topluluğuna, özellikle akış sitometri tesisi müdürümüz Jonathan Webber'e yapıcı bilimsel tartışmalar için minnettarız. Bu çalışma Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) ve Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (üçü de MLD'ye) tarafından finanse edildi. PFCD, Avrupa Komisyonu (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ve Marie Sklodowska-Curie Actions) ve Oxford-Bristol Myers Squibb Bursu ile birlikte EMBO Uzun Vadeli Burs (ALTF 1420-2015) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 182
T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Céspedes, P. F., Dustin, M. L.… More

Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter