Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

Aquí presentamos el protocolo para la reconstitución escalonada de células presentadoras de antígenos sintéticos utilizando bicapas lipídicas soportadas por perlas y su uso para interrogar la salida sináptica de las células T activadas.

Abstract

Las células presentadoras de antígenos (APC) presentan tres señales activadoras a las células T que participan en contacto físico: 1) antígeno, 2) coestimulación/corepresión y 3) citoquinas solubles. Las células T liberan dos tipos de partículas efectoras en respuesta a la activación: vesículas transsinápticas (tSV) y partículas de ataque supramolecular, que transfieren mensajeros intercelulares y median la citotoxicidad, respectivamente. Estas entidades son rápidamente internalizadas por apces que participan en contacto físico con células T, lo que hace que su caracterización sea desalentadora. Este artículo presenta el protocolo para fabricar y utilizar bicapas lipídicas soportadas por perlas (BSLB) como miméticas de células presentadoras de antígenos (APC) para capturar y analizar estas partículas transsinápticas. También se describen los protocolos para las mediciones absolutas de densidades de proteínas en las superficies celulares, la reconstitución de BSLB con tales niveles fisiológicos y el procedimiento de citometría de flujo para rastrear la liberación de partículas sinápticas por las células T. Este protocolo se puede adaptar para estudiar los efectos de proteínas individuales, mezclas de ligandos complejos, determinantes de virulencia de patógenos y fármacos en la producción efectora de las células T, incluidas las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, las células T reguladoras y las células T que expresan el receptor de antígenos quiméricos (CART).

Introduction

La sinapsis inmunológica (IS) es una estructura molecular fundamental formada en la interfaz de las células que participan en contacto físico que facilita el intercambio regulado de información de yuxtracrina. Se han descrito diferentes IS en la literatura, y un creciente cuerpo de evidencia sugiere que estos centros moleculares son una característica conservada de las redes celulares. Varias células inmunes, incluidas las células B, las células asesinas naturales, las células dendríticas, los macrófagos y las células T, intercambian información a través del ensamblaje de contactos de corta duración1. Los estudios multiómicos están avanzando en la comprensión de nuevos subconjuntos de leucocitos y células estromales que impulsan las redes celulares patógenas y expresan proteínas de superficie con funciones desconocidas. Como APC sintéticos, los BSLB permiten la investigación directa del papel funcional de las proteínas individuales en la integración de señales activadoras, a saber, antígenos y coestimulación/ corepresión, por parte de las células T y la liberación resultante de partículas efectoras denominadas señal cuatro.

Este documento describe los protocolos y los puntos técnicos críticos a considerar al usar BSLB para imitar la composición superficial de los APC modelo. Los protocolos para la medición cuantitativa de los receptores inmunes y otras proteínas de superficie en los APC se presentan junto con el protocolo para la reconstitución de apces sintéticos que contienen estas cantidades medidas. Luego, se presentan los pasos necesarios para coculturizar células T y BSLB junto con el protocolo para la medición cuantitativa de la transferencia transsináptica de partículas mediante citometría de flujo. Lo más notable es que los BSLB facilitan el estudio de una población de tSV derivada de la membrana plasmática denominada ectosomas sinápticos (SE). Los SE enriquecidos con receptores de antígenos de células T (TCR+) se eliminan en respuesta a la activación de TCR2 y son capturados eficientemente por BSLBs3, lo que representa una excelente lectura para evaluar las propiedades agonísticas de los antígenos y la composición de la membrana modelada. Los exosomas CD63+ y las partículas de ataque supramolecular (SMAP) también son liberados por las células T estimuladas y capturados por los BSLB. Se pueden utilizar como lecturas adicionales de la activación y la secreción de gránulos exocíticos y líticos resultante por las células T. La movilización de vesículas exocitíticas al polo que interactúa de la célula T también facilita la liberación direccional de citoquinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 en respuesta a la activación4,5,6,7,8. Aunque las citoquinas liberadas por células T también se pueden detectar en BSLB, actualmente se está desarrollando un estudio más dedicado para validar el análisis cuantitativo de la liberación de citoquinas en la sinapsis inmunológica.

Para interrogar cómo las composiciones específicas de la membrana influyen en la producción sináptica de las células T se requiere definir la densidad fisiológica del componente de membrana objetivo. Las cuantificaciones basadas en citometría de flujo de proteínas de superficie celular son un paso esencial en este protocolo y requieren: 1) el uso de anticuerpos con números conocidos de fluorocromos por anticuerpo (F / P), y 2) perlas de referencia que proporcionen una referencia estándar para interpolar moléculas de fluorocromo a partir de intensidades de fluorescencia medias (IMF) medidas.

Estos estándares de referencia consisten en cinco poblaciones de perlas, cada una de las cuales contiene un número creciente de fluorocromos solubles equivalentes (MESF), que abarcan el rango dinámico de detección de fluorescencia arbitraria. Estas poblaciones estándar producen picos de fluorescencia discretos, lo que facilita la conversión de unidades de fluorescencia arbitrarias en MESF mediante regresión lineal simple. Los MESF resultantes se utilizan junto con los valores de anticuerpos F / P para calcular el número promedio de moléculas unidas por célula (o BSLB en pasos posteriores). La aplicación de las áreas de superficie celular estimadas al número promedio de moléculas detectadas permite el cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/μm2. Este protocolo de cuantificación también se puede adaptar a la medición de densidades de proteínas en células T y a la reconstitución bioquímica de composiciones de membrana que median la formación de sinapsis homotípicas de células T (es decir, sinapsis T-T9). Si es necesario, la valencia de la unión a anticuerpos se puede estimar aún más mediante el uso de objetivos recombinantes marcados con números conocidos de fluorocromos por molécula. Luego, la valencia de unión a anticuerpos se puede calcular para la misma población de BSLB comparando simultáneamente el número de proteínas fluorescentes unidas y anticuerpos de cuantificación (utilizando dos fluorocromos de cuantificación diferentes y estándares MESF).

La reconstitución de membranas APC requiere el ensamblaje de bicapas lipídicas soportadas (SLB) sobre perlas de sílice1. Las existencias de liposomas que contienen diferentes especies de fosfolípidos se pueden aprovechar para formar una matriz lipídica-bicapa versátil, lo que permite el anclaje de proteínas recombinantes con diferente química de unión (la preparación de los liposomas se detalla en 10). Una vez que se define la densidad fisiológica (o densidades) del ligando relevante "en las células", se adapta el mismo protocolo de citometría de flujo para estimar la concentración de proteína recombinante necesaria para recubrir los BSLB con la densidad fisiológica objetivo. Se pueden utilizar dos sistemas de anclaje diferentes en combinación o por separado.

En primer lugar, el SLB que contiene un 12,5 mol% final de fosfolípidos que contienen Ni2+ es suficiente para proporcionar aproximadamente 10.000 sitios de unión a la etiqueta His por micra cuadrada10 y funciona bien para decorar los BSLB con la mayoría de las proteínas disponibles comercialmente cuyas densidades fisiológicas no exceden esta capacidad de carga máxima. El segundo sistema de carga aprovecha los fosfolípidos que contienen biotina (como mol%) para cargar anti-CD3e Fab biotinilado (o monómeros HLA / MHC) a través de puentes de estreptavidina. La combinación de estos dos métodos de decoración BSLB permite la adaptación flexible de BSLB como APC sintéticos. Para composiciones superficiales de APC altamente complejas, el mol% de fosfolípidos y proteínas se puede aumentar para cargar tantas proteínas como la pregunta en cuestión requiera. Una vez que se definen las concentraciones de trabajo de proteínas y mol% de fosfolípidos biotinilados, los BSLB se pueden ensamblar para interrogar la salida sináptica de las células T con citometría de flujo multiparamétrica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medición de densidades de proteínas de la superficie celular con citometría de flujo cuantitativa

  1. Preparar un tampón de citometría de flujo humano (hFCB) filtrado con 0,22 μm añadiendo EDTA (a una concentración final de 2 mM) y suero AB humano (hasta un 10% final) a solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 (ver Tabla 1). Filtre la solución con una unidad de filtro de poros de 0,22 μm para eliminar las impurezas séricas y almacenarla a 4 °C.
  2. Recuperar las células y sedimentarlas por centrifugación a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
  3. Lave las células dos veces con PBS. En cada paso de lavado, vuelva a suspender las células en PBS al volumen original (antes de la centrifugación) y gire hacia abajo a 300 × g durante 5 min en RT.
  4. Cuente las suspensiones de células teñidas de azul de tripano en un hemocitómetro11. Alternativamente, cuente las celdas utilizando la exclusión de corriente eléctrica. Para esto último, siga las instrucciones del fabricante de CASY-TT (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El contador de células CASY-TT permite la determinación del porcentaje de células viables, el tamaño de la célula y el volumen celular.
  5. Calcular el volumen de PBS que contiene una dilución 1:1.000 de colorante de viabilidad fijable eFluor 780 o similar (consulte la Tabla de materiales) necesario para resuspendir las células a una concentración de tinción de 107 células/ml.
  6. Resuspendir las células utilizando la solución de pbS de colorante de viabilidad e incubar en hielo durante 30 min.
  7. Retire el tinte de viabilidad agregando un volumen de hFCB helado. Girar hacia abajo a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: A partir de ahora, mantenga la cadena de frío intacta.
  8. Lave las células con hFCB que contenga una dilución 1:50 de la solución de bloqueo del receptor Fc (consulte la Tabla de materiales). Lleve el volumen a una concentración final de 107 células / ml e incube durante 15 minutos adicionales para lograr un bloqueo eficiente de FcgR.
  9. Distribuya 100 μL de la suspensión celular (es decir, 106 células) por pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U o con fondo en V. Mantenga las celdas en hielo y protegidas de la luz (cubra con papel de aluminio).
  10. Prepare una mezcla maestra de anticuerpos en hFCB definiendo las concentraciones óptimas de anticuerpos para cada anticuerpo conjugado con fluorocromo y, lo que es más importante, para los anticuerpos utilizados para determinar las densidades de proteínas de superficie. Por ejemplo, para la cuantificación de la expresión de ICAM-1 en poblaciones de células amigdalares, como se muestra en la Figura 1, prepare una mezcla que contenga diluciones 1:200 de anti-CD4, anti-CD19 y anti-CXCR5 junto con concentraciones saturantes de un anticuerpo anti-ICAM-1 con fluorocromos AF647 conocidos por anticuerpo (es decir, 10 μg / ml, que se definió mediante experimentos independientes de titulación de anticuerpos).
  11. Como controles adicionales, prepare una mezcla maestra de anticuerpos que contenga los controles de isotipo de anticuerpos relevantes (a las mismas concentraciones efectivas que sus contrapartes conjugadas con los mismos fluorocromos para la sustracción de fondo), es decir, use 10 μg / ml de un control de isotipo AF647 relevante.
    NOTA: En el ejemplo anterior, dicho control de isotipo se utiliza para restar la fluorescencia de fondo de la verdadera señal ICAM-1 en las células.
  12. Al cuantificar las densidades de proteínas en subconjuntos celulares presentes a bajas frecuencias dentro de los tejidos, prepare controles de fluorescencia menos uno (FMO) que contengan todos los anticuerpos de tinción excepto los marcadores de interés (ver más detalles en 12).
  13. Gire hacia abajo la placa de 96 pocillos que contiene las células a 300 × g durante 5 min a 4 °C, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 50 μL de la mezcla maestra de anticuerpos de cuantificación o de la mezcla maestra de anticuerpos de isotipo.
  14. Incubar las células durante al menos 30 min a 4 °C y 400 rpm utilizando un agitador de placas. Proteja las placas de la luz (cubra con papel de aluminio).
  15. Lave las células tres veces con hFCB y centrífuga a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
  16. Resuspend el pellet celular usando 200 μL de PBS (es decir, a una concentración final de 5 × 106 células/ml).
  17. Para adquisición:
    1. Si utiliza un cargador BD FACS estándar, transfiera las muestras a tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml (consulte la Tabla de materiales).
    2. Si utiliza muestreadores de alto rendimiento (HTS, también conocidos como lectores de placas), continúe inmediatamente con el paso 1.19.
  18. Antes de proceder con la adquisición de datos para los estándares MESF, verifique los límites máximos y mínimos de linealidad de intensidad de fluorescencia para los canales de cuantificación.
  19. Antes de la compensación, adquiera datos para los estándares MESF, asegurando que tanto las poblaciones más tenues como las más brillantes caigan en el rango lineal de medición.
  20. Adquirir las muestras de compensación. Mantenga los valores de voltaje del tubo fotomultiplicador (PMT) para los canales de cuantificación sin cambios para preservar el rango dinámico de detección. Realice ligeros ajustes en el voltaje PMT de otros canales antes de calcular las matrices de compensación.
  21. Calcular y aplicar la compensación.
  22. Adquiera y guarde un mínimo de 2 × 104 cuentas MESF totales para cada uno de los canales de cuantificación.
  23. Seleccionar la población de células individuales en función de sus áreas de dispersión de luz lateral y delantera (SSC-A y FSC-A, respectivamente, como se muestra en la Figura 1A (i)), seguido de la selección de eventos dentro del continuo de tiempo (Figura 1A (ii)) y bajo para el tiempo de vuelo (W) tanto en FSC como en SSC en comparación con sus alturas (es decir, FSC-W/FSC-H, seguido de la compuerta SSC-W/SSC-H como se muestra en la Figura 1A (iii) y (iv), respectivamente). Defina una puerta final de evento único que contenga eventos con distribución proporcional FSC-A versus FSC-H (Figura 1A (v)).
  24. Adquirir muestras de control (controles isotipados y FMO).
  25. Adquirir muestras y registrar hasta que se hayan adquirido un mínimo de 10.000 células diana.
    NOTA: la determinación robusta de densidades moleculares promedio requiere el análisis de varios donantes a través de experimentos independientes. Esto es crucial cuando se analizan subconjuntos celulares encontrados en frecuencias reducidas o derivados de material biológico escaso (por ejemplo, de biopsias de tejidos humanos).
  26. Lave el citómetro durante 5 minutos con una solución de limpieza FACS seguida de 5 minutos de agua ultrapura antes de apagar el instrumento. Si utiliza el HTS, siga las opciones de la pestaña HTS y el programa Clean Plate.
    NOTA: Para reducir el arrastre de muestra a muestra, active las opciones de lavado de muestras de alto rendimiento o lavado de muestras de alto rendimiento , que lavarán automáticamente el citómetro entre tubos o pozos. Antes de comenzar la adquisición, ejecute agua ultrapura durante 10 minutos a una alta velocidad de flujo para eliminar cualquier contaminante biológico sin lavar de la línea de muestra del citómetro.
  27. Exporte los archivos del estándar de citometría de flujo (FCS).

2. Análisis de regresión de intensidad de fluorescencia (IMF) de media (o mediana) sobrecorregidas por mesF

  1. Abra el software de análisis de citometría de flujo y cargue los archivos FCS del experimento. Seleccione la población de perlas en función de sus áreas de dispersión de luz lateral y delantera (SSC-A versus FSC-A), como se muestra en la Figura 1A (i).
  2. Controle la calidad de los datos comprobando la distribución de eventos individuales a lo largo del tiempo, como se indica en el paso 1.24.
    NOTA: Las burbujas crean brechas en la distribución de eventos a lo largo del tiempo; esto suele aparecer al comienzo de la adquisición utilizando el HTS. Evite seleccionar eventos que flanqueen brechas en el tiempo de adquisición, ya que estos agregan errores de medición debido a aberraciones ópticas.
  3. Concéntrese en los eventos individuales.
    1. Células
      1. Identificar células individuales primero en función de su distribución SSC-A y FSC-A (Figura 1A (i)), seguido de eventos bajos para W en las puertas secuenciales FSC-W/FSC-H (singletes-1, Figura 1A panel (iii)) y SSC-W/SSC-H (singletes-2; Figura 1A panel (iv)). Defina una puerta singlets-3 adicional seleccionando eventos con FSC-A y FSC-H proporcionales (Figura 1A, panel (v)). Finalmente, identifique las células vivas como aquellas negativas para el colorante de viabilidad fijable.
    2. Cuentas MESF
      1. Siga la misma discriminación de singletes-1 a singlets-3 que en el paso 2.3.1.1 (Figura 1B, paneles (i) a (v)). Identifique cada una de las poblaciones de MESF (en blanco, 1, 2, 3 y 4) en función de sus niveles de intensidad de fluorescencia (ver Figura 1B, panel (vi)).
  4. Extraiga la IMF de fracciones MESF en blanco y 1 a 4.
  5. Genere valores corregidos de IMF (cMFI) para las fracciones MESF 1 a 4 restando las IMF de la población de cuentas en blanco de cada fracción.
  6. Calcular la línea de mejor ajuste para la relación entre cMFIs y los valores MESF proporcionados por el proveedor (variable independiente, siendo fracción en blanco igual a cero).
  7. Extraer la pendiente (b en la ecuación siguiente) de la regresión lineal de MESF sobre cMFI (El panel de la Figura 1B (viii) muestra una regresión en la que y = a + bx; con a = 0).
  8. Extraer las intensidades de fluorescencia medianas (para distribuciones de fluorescencia bimodal) o medias (para distribuciones de fluorescencia normales o logarítmicas) de las poblaciones de interés (TFH y células B en el panel (vii) de la Figura 1A).
  9. Al igual que en los pasos 2.5-2.7, extraiga los valores de MFI de las celdas de control marcadas con isotipos.
  10. Si el F/P de los controles de isotipo es el mismo que el de los anticuerpos de cuantificación, corrija las IMF de las células teñidas restando las IMF de las células marcadas con isotipo.
  11. Si el F/P de los isotipos difiere del de los anticuerpos de cuantificación, extraiga el MESF de los isotipos dividiendo las IMF de las células marcadas con isotipo con la pendiente calculada en el paso 2.7. Reste el isotipo MESF de la cuantificación MESF antes de estimar los anticuerpos de cuantificación unidos.
  12. Dividir el MESF por el F/P de los anticuerpos de cuantificación para estimar el número de moléculas unidas por célula (Molec. como se muestra en el diagrama de flujo de la Figura 1C).
  13. Divida el número de moléculas unidas con el área de superficie celular estimada (CSA (μm2)) para extraer la densidad de proteínas como molc./μm2 (Figura 1C). Consulte la sección de resultados representativos para obtener más detalles.

3. Especies de fosfolípidos funcionales para usar en la calibración de proteínas que recubren BSLBs

  1. Utilice 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) como el componente principal de la matriz lipídica que forma la bicapa lipídica soportada. Diluya todas las demás especies de lípidos en esta solución DOPC.
  2. Use entre 0.2 y 1 mol% de 0.4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) conjugado a colorantes, incluyendo ATTO 390, 488 o 565 (ver la Tabla de Materiales), para generar BSLB con fluorescencia intrínseca.
    NOTA: La fluorescencia intrínseca de los BSLB facilita la identificación de BSLB individuales y células individuales en experimentos de transferencia sináptica.
  3. Utilice 12,5 mol% de 0,4 mM de ácido iminodiacético DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil) succinil]) para anclar las proteínas marcadas con His. Mantenga constante el mol% de DGS-NTA(Ni) y realice 2 valoraciones de las proteínas marcadas con His a partir de 100 nM como la concentración más alta. Deje una condición sin proteína como control negativo para las cuantificaciones absolutas.
    NOTA: Las señales accesorias y las moléculas de adhesión, como ICAM-1, están diseñadas con una etiqueta de 12-His para aumentar la afinidad de la proteína por DGS-NTA(Ni).
  4. Use Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) para anclar proteínas biotiniladas a través de puentes biotin-streptavidin-biotin. Utilice una titulación en serie de 5 veces de 0,4 mM Biotinyl Cap PE que cubra entre 10 mol% y 0 mol% (como control negativo). Mantener constante la concentración de estreptavidina y proteínas biotiniladas (200 nM) tanto en experimentos de calibración como en la reconstitución de APC sintéticos para experimentos de transferencia sináptica.
    NOTA: Los análisis de regresión de densidades empíricas de proteínas biotiniladas sobre el mol% final de Biotinyl Cap PE en la matriz lipídica (que también contiene DGS-NTA(Ni) para anclar proteínas marcadas con His) definirán el mol% que se utilizará para reconstituir las densidades objetivo del antígeno.

4. Preparación de solución salina tamponada HEPES suplementada que contiene albúmina sérica al 1%

NOTA: Se requiere solución salina tamponada con HEPES suplementada que contenga 1% de albúmina sérica humana (HBS/HSA) o 1% de albúmina sérica bovina (HBS/BSA) en las etapas de lavado y carga de proteínas de BSLB (Tabla 1). Prepare una solución de stock de HBS 10x y el búfer de trabajo lo más fresco posible; mantener refrigerado y usar en el plazo de un mes. Si bien BSA es una alternativa más barata a HSA, proporciona un bloqueo eficiente de los lípidos quelantes de Ni13 y se recomienda para experimentos de alto rendimiento.

  1. Prepare una solución tampón madre 10x de HBS suplementado que contenga 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM de glucosa, 10 mM de CaCl2 y 20 mM de MgCl2.
    NOTA: Disolver MgCl2 es altamente exotérmico y un peligro de quemaduras. Agregue esta sal lentamente y sobre un gran volumen de disolvente. Evite preparar soluciones concentradas (es decir, 1 M) de estas sales, ya que tienden a precipitarse con el tiempo, lo que dificulta su adición precisa al tampón de trabajo.
  2. Filtre la solución 10x con una unidad de filtro de 0,22 μm y manténgala estéril a 4 °C.
  3. Para 500 ml de HBS/has, tome 50 ml de la solución suplementada de 10x HBS, ajuste el pH a 7.4 si es necesario y aumente el volumen a 483.4 ml con agua ultrapura.
  4. Agregue 16.6 ml de solución de HSA al 30% a los 483.4 ml de HBS, pH 7.4.
  5. Para 500 ml de HBS/BSA, disolver 5 g de BSA en HBS e incubar a 37 °C durante 30 min. Luego, mezcle suavemente en RT invirtiendo la botella periódicamente hasta que no haya cristales o grupos de proteínas visibles.
  6. Filtre la solución resultante del paso 4.5 utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm (consulte la Tabla de materiales) y guárdela a 4 °C.

5. Calibraciones de densidad de proteínas en BSLB

  1. Antes de tomar las perlas de sílice no funcionalizadas de 5,00 ±0,05 μm de diámetro, mezcle bien la solución madre y resuspenda cualquier grupo grande de cuentas sedimentadas en el fondo de los matraces.
    NOTA: Las cuentas de sílice tienden a sedimentarse rápidamente, lo que podría conducir a errores de conteo. Mezclar vigorosamente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen máximo de una micropipeta P1000.
  2. Diluya 1 μL de solución de perlas en 1.000 μL de PBS, cuente las perlas utilizando una cámara hemocitómetro y calcule su concentración por ml.
    NOTA: La tinción azul tripano no es necesaria para visualizar cuentas de sílice.
  3. Calcule el volumen de perlas de sílice necesarias para 5 × 105 BSLB finales por punto de la titulación.
  4. Transfiera el volumen requerido de perlas de sílice a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
  5. Lave las perlas de sílice tres veces con 1 ml de PBS estéril, centrifugue las perlas durante 15 s en una microcentrífuga de sobremesa a RT (a rpm fijas).
    NOTA: Al quitar la solución de lavado, evite molestar el pellet de perlas. Una pequeña columna tampón no afectará la propagación de los liposomas que componen la mezcla maestra de liposomas, ya que estos también están en PBS.
  6. Prepare tres volúmenes de la mezcla maestra de liposomas para ensamblar el BSLB en las perlas de sílice lavadas (por ejemplo, si el volumen total inicial de las perlas de sílice es de 20 μL, prepare un mínimo de 60 μL de la mezcla maestra de liposomas).
  7. Para valoraciones de Mol% de Biotinyl Cap PE
    1. Prepare las mezclas maestras de lípidos que contienen diluciones de 5 veces de Biotinyl Cap PE.
      1. Diluir el 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% en una matriz 100% DOPC.
      2. Mezcle cada punto de valoración de Biotinyl Cap PE mol% en una proporción de 1:1 (vol:vol) con una solución de 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) de tal manera que un 12,5 mol% final de lípidos que contienen Ni esté presente en todas las valoraciones.
        NOTA: El 12,5 mol% (vol:vol%) de lípidos que contienen Ni representa la composición lipídica mixta de BSLB en la que las proteínas marcadas con His también se pueden probar en calibraciones paralelas. Por ejemplo, dado que todas las existencias de liposomas se preparan a la misma concentración molar, para alcanzar la mezcla de mol% objetivo en 200 μL de mezcla final de liposomas, simplemente mezcle 100 μL de 25 mol% de DGS-NTA que contiene Ni con 100 μL de 100 mol% DOPC.
    2. Transfiera 5 × 105 perlas de sílice lavadas a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, de modo que se ensamble un punto de valoración de mol% de Biotinyl Cap PE por tubo.
    3. Agregue las mezclas maestras de valoración de mol% biotinyl Cap PE a las perlas de sílice lavadas y mezcle suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total. Evite la formación de burbujas, que en exceso destruyen la bicapa lipídica.
    4. Agregue gas argón (o nitrógeno) en el tubo que contiene los BSLB ahora en formación para desplazar el aire y proteger los lípidos de la oxidación durante la mezcla.
    5. Añadir argón a las reservas de lípidos de 0,4 mM antes del almacenamiento y manipular mediante una técnica estéril.
      NOTA: Conecte un tubo pequeño al cilindro de gas Argón/Nitrógeno. Antes de agregar gas a los tubos, ajuste el regulador del cilindro de gas para que la presión no sea superior a 2 psi. Conecte una punta de pipeta estéril al tubo de salida para dirigir la corriente de gas dentro de la culata de liposomas durante 5 s y cierre rápidamente la tapa. En el caso de las existencias de lípidos, selle la tapa del tubo con una película de parafina antes de almacenarla a 4 °C.
    6. Mueva los BSLB a un mezclador de laboratorio vertical de ángulo variable (consulte la Tabla de materiales) y mezcle durante 30 minutos en RT utilizando una mezcla orbital de 10 rpm.
      NOTA: Este paso evitará la sedimentación de las perlas durante la formación de la bicapa lipídica soportada.
    7. Gire las perlas centrifugando durante 15 s en RT en una minicentrífuga de sobremesa, y luego lave tres veces con 1 ml de HBS / HSA (BSA) para eliminar el exceso de liposomas.
    8. Bloquee los BSLB formados agregando 1 ml de caseína al 5% o BSA al 5% que contenga 100 μM de NiSO4 para saturar los sitios de NTA y 200 nM de estreptavidina para recubrir todos los sitios de anclaje de biotina en los BSLB de manera uniforme. Mezclar suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total e incubar en el mezclador vertical durante no más de 20 min a RT y 10 rpm.
    9. Gire hacia abajo los BSLB centrifugando durante 15 s en RT en una minicentrífuga de sobremesa, y luego lave tres veces con 1 ml de tampón HBS / HSA (BSA).
      NOTA: Mantenga las perlas lavadas verticalmente con un pequeño volumen de tampón de lavado que cubra los BSLB. Evite la deshidratación de los BSLB, ya que el aire destruirá la bicapa lipídica.
  8. Para la titulación de proteínas marcadas con His en 12.5 mol% de BSLB que contienen DGS-(Ni) NTA
    1. Prepare tres volúmenes de mezcla maestra de liposomas que contengan un 12,5 mol% final de DGS-NTA(Ni).
    2. Use la mezcla maestra de liposomas para resuspendir las cuentas de sílice lavadas y mezcle suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total. Evite la formación de burbujas, que en exceso dañan la bicapa lipídica.
    3. Agregue gas argón (o nitrógeno) en el tubo que contiene los BSLB ahora en formación para desplazar el aire y proteger los lípidos de la oxidación durante la mezcla.
    4. Añadir argón a las reservas de lípidos de 0,4 mM antes del almacenamiento y manipular mediante una técnica estéril.
    5. Mueva los BSLB al mezclador vertical y mezcle durante 30 minutos en RT utilizando la mezcla orbital a 10 rpm.
    6. Gire las perlas centrifugando durante 15 s en RT en una minicentrífuga de sobremesa, y luego lave tres veces con 1 ml de HBS / HSA (BSA) para eliminar el exceso de liposomas.
    7. Bloquee los BSLB formados agregando 1 ml de caseína al 5% (o BSA al 5%) que contenga 100 μM de NiSO4 para saturar los sitios de NTA en los BSLB. Mezcle suavemente e incube en el mezclador vertical durante no más de 20 minutos a RT y 10 rpm.
    8. Lave tres veces con HBS/HSA (BSA) para eliminar el exceso de solución de bloqueo.
    9. En una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U, prepare diluciones en serie de 2 veces de las proteínas.
      1. Preparar una concentración inicial de 100 nM para la proteína de interés en un volumen total de 200 μL de tampón HBS/HSA (BSA), distribuir 100 μL de esta solución en la primera columna, y los 100 μL restantes en la parte superior de la columna #2 que contiene 100 μL de tampón HBS/HSA (BSA).
      2. Continúe transfiriendo en serie 100 μL de la columna #2 a la columna #3 y repita según sea necesario para cubrir todos los puntos de valoración. Deje la última columna de la serie sin proteína, ya que esta se utilizará como referencia en blanco para la cuantificación.
    10. Resuspender los BSLB preparados en un volumen tal que 5 × 105 BSLB estén contenidos en 100 μL de tampón HBS/HSA (BSA).
    11. Transfiera 100 μL de la suspensión BSLB a los pozos de una segunda placa de 96 pocillos con fondo en U, de modo que cada pozo reciba 5 × 105 BSLB.
    12. Gire hacia abajo la segunda placa que contiene BSLB durante 2 minutos a 300 × g y RT y deseche el sobrenadante.
    13. Transfiera los volúmenes de 100 μL de la placa de titulación de proteínas a la placa que contiene los BSLB sedimentados. Mezcle suavemente, evite el exceso de generación de burbujas durante el pipeteo e incube durante 30 min a RT y 1.000 rpm utilizando un agitador de placas. Proteger de la luz con papel de aluminio.
    14. Lave la placa tres veces con tampón HBS/HSA (BSA) utilizando pasos de sedimentación de 300 × g durante 2 min a RT.
    15. Si la proteína recombinante utilizada en la calibración está directamente conjugada con fluorocromos y tiene valores conocidos de F/P, continúe con el paso 5.8.20.
    16. Si la proteína recombinante utilizada en la calibración no está etiquetada o conjugada con fluorocromos o no hay disponible un estándar de perla MESF, use anticuerpos conjugados Alexa Fluor 488 o 647 con valores conocidos de F / P para teñir el BSLB recubierto de proteína.
    17. Tinción con concentraciones saturantes de anticuerpos de cuantificación.
      NOTA: Dependiendo del nivel de expresión objetivo, estos oscilan entre 5 y 10 μg/mL.
    18. Mancha durante 30 min a RT y 1.000 rpm usando un agitador de placas. Proteger de la luz con papel de aluminio.
    19. Lavar dos veces con tampón HBS/HSA (BSA) y una vez con PBS utilizando pasos de sedimentación de 300 × g durante 2 min a RT.
      NOTA: Use PBS, pH 7.4 para resuspendir los BSLB lavados antes de la adquisición. No utilice tampones que contengan proteínas, ya que esto conduce a la formación de burbujas durante la mezcla automática de muestras con muestreadores de alto rendimiento.
    20. Adquirir los estándares MESF, asegurándose de que los picos más brillantes permanezcan en el rango de detección lineal para el detector de cuantificación (canal), como se muestra en la Figura 1B (vii).
    21. Adquiera las muestras manualmente o utilizando HTS. Si se utiliza este último, resuspenda BSLB en 100 μL de PBS y adquiere 80 μL utilizando un caudal entre 2,5 y 3,0 μL/s, un volumen de mezcla de 100 μL (o el 50% del volumen total si el volumen de resuspensión es menor), una velocidad de mezcla de 150 μL/s y cinco mezclas para garantizar que los BSLB sean monodispersados.
    22. Exporte los archivos FCS.
    23. Concéntrese en eventos individuales para los análisis (Figura 2A), ya que los dobletes o trillizos introducirán errores en la determinación. Utilice la identificación anidada de eventos individuales como se indica en el paso 1.2.3 del protocolo.
    24. Mida la IMF de cada fracción MESF (1-4) y reste la IMF de cuentas en blanco para extraer las IMF corregidas (cMFI).
    25. Realizar un análisis de regresión lineal para extraer la pendiente (b) de MESF sobre el cMFI calculado para los estándares MESF, que se utilizará en el paso 5.33.
    26. Extrae la IMF de cada punto de titulación y resta la IMF de perlas sin proteína para obtener cMFIs.
    27. Divida los cMFIs con la pendiente calculada en el paso 5.31 para extraer el MESF unido a BSLBs para cada punto de titulación.
    28. Divida mesF unido a BSLBs por el valor F/P del anticuerpo de cuantificación para extraer el número promedio de moléculas unidas por BSLB.
    29. Utilizando el diámetro de los BSLB (5,00 ± 0,05 μm), extraiga el área de superficie de la perla (SA = 4pr2) para calcular las densidades finales de proteína (molc./μm2) por punto de titulación (concentración de proteína).
    30. Realizar un nuevo análisis de regresión de la concentración de proteínas sobre la densidad de proteínas para calcular la pendiente (b) de la línea de mejor ajuste.
      NOTA: La concentración de 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni) confiere una capacidad máxima de anclaje de aproximadamente 10.000 molc./μm210 sin inducir la activación inespecífica de las células T ni afectar a la movilidad lateral de los SLB.

6. Realización de experimentos de transferencia sináptica entre células T y BSLB

  1. Antes de ejecutar el experimento de transferencia sináptica
    1. Adquirir BSLB no fluorescentes, BSLB con lípidos fluorescentes, células no teñidas (o perlas de compensación; consulte la Tabla de materiales) y células teñidas de un solo color (o perlas de compensación) para identificar las interacciones del espectro de fluorescencia del instrumento. Concéntrese en aquellos detectores con alta propagación de derrame para rediseñar el panel policromático, aumentar la sensibilidad y reducir el error de medición en detectores críticos (ver 14).
    2. Valore los anticuerpos de detección para encontrar la concentración óptima, lo que permite la detección de eventos positivos sin comprometer la detección de negativos.
      NOTA: Repita este paso cada vez que haya un cambio de lote de anticuerpos, ya que los valores de F / P y el brillo varían de un lote a otro.
    3. Opcional: Optimice los voltajes PMT adquiriendo la muestra en diferentes rangos de voltaje (es decir, un paseo de voltaje) para encontrar los PMT que conducen a una señal óptima sobre el ruido (es decir, la separación de negativos y positivos mientras se garantiza que la señal de la población más brillante permanezca en el rango lineal).
  2. Medición de la transferencia de salida de células T a BSLB
    1. Preparar RPMI 1640 suplementado (en adelante medio R10) que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 100 μM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Utilice el medio R10 para cultivar y expandir las células T.
    2. El día 1, aísle las células T de las cámaras de sangre periférica o del sistema de leucorreducción (LRS). Utilice kits de aislamiento y separación de células de inmunodensidad (consulte la Tabla de materiales) para el enriquecimiento de células T humanas CD4+ y CD8+ .
    3. Sembrar las células a una concentración final que oscile entre 1.5 y 2.0 × 106 células/ml, utilizando placas de 6 pocillos con no más de 5 ml de total por pozo.
    4. Activar las células T utilizando una proporción de 1:1 de perlas magnéticas de activación de células T humanas (anti-CD3/anti-CD28) (ver la Tabla de Materiales) y agregar 100 UI de IL-2 humana recombinante para apoyar la proliferación y supervivencia celular.
    5. El día 3, retire las perlas magnéticas activadoras utilizando columnas magnéticas (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que las perlas magnéticas permanezcan unidas a los lados del tubo antes de recuperar las células para pasos de lavado adicionales.
    6. Lave las perlas magnéticas una vez más con 5 ml de medio R10 fresco, mezcle bien y vuelva a colocarlas en el imán. Recupere este volumen y mezcle con las celdas recuperadas en el paso 6.2.5.
    7. Resuspend las células a 1.5-2 × 106 células/ml en R10 fresco que contiene 100 U/mL de IL-2. Reponer el medio después de 48 h, asegurándose de que la última adición de IL-2 sea 48 h antes del día de experimentación (días 7 a 14 de cultivo).
    8. El día del experimento de transferencia sináptica, prepare el medio de ensayo de transferencia sináptica (ver Tabla 1) complementando el medio RPMI 1640 libre de fenol rojo con 10% de FBS, 100 μM de aminoácidos no esenciales, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. No incluya IL-2 humana recombinante.
    9. Cuente las células utilizando la tinción azul tripano o la exclusión de corriente eléctrica y resuspóndalas a una concentración final de 2,5 × 106 células / ml en medio. Si se observa una muerte celular excesiva (>10%), elimine las células muertas / moribundas utilizando una mezcla de polisacárido y diatrizoato de sodio (consulte la Tabla de materiales) de la siguiente manera:
      1. Capa 15 mL de cultivo celular sobre 13 mL de la solución de diatrizoato de polisacárido-sodio.
      2. Centrífuga de 1.250 × g durante 20 min a RT con mínima aceleración y desaceleración. Recoger la capa celular (nube) en la interfaz entre el medio y la solución de diatrizoato de polisacárido-sodio.
      3. Lave las células al menos dos veces con un medio de ensayo de transferencia sináptica precalentado (preparado en el paso 6.2.7).
      4. Contar y resuspendir las células a una concentración final de 2,5 × 106/ml utilizando el medio de ensayo de transferencia sináptica. Cocultivo 100 μL de esta suspensión celular con BSLB (ver paso 6.2.15).
    10. Calcular el número de BSLB necesarios para el experimento; considere todas las diferentes mezclas maestras de proteínas y valoraciones de antígenos que se probarán (ya sea monómeros biotinilados HLA / MHC-péptidos o monobiotinilados anti-CD3ε Fab).
    11. Ensamble los BSLB siguiendo los mismos pasos de la sección 5 del protocolo, pero esta vez, combine todas las valoraciones de proteínas y lípidos necesarios para reconstituir una membrana APC compleja (Figura 3A). Mantenga las mismas relaciones vol:vol entre el volumen inicial de perlas de sílice y el volumen de mezcla de proteínas utilizada durante las calibraciones, así como los tiempos y temperaturas utilizados en la carga de BSLB. Por ejemplo, si se utilizaron 0,5 μL de perlas de sílice/pozo y 100 μL/pocillo de mezcla de proteínas para la calibración inicial, mantener relaciones de 5:1.000 vol:vol para preparar los BSLB para ser cocultivados con células T.
    12. Una vez que los BSLB se hayan cargado con la mezcla de proteínas de interés, lave los BSLB dos veces con HBS / HSA (BSA) para eliminar el exceso de proteínas no unidas. Use velocidades de sedimentación de 300 × g durante 2 min en RT en cada paso de lavado y deseche los sobrenadantes.
    13. Resuspend los 5 × 105 BSLB por pozo en 200 μL.
    14. Transfiera 100 μL por pozo a una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U para hacer un duplicado, de modo que la cantidad final de BSLB por pozo sea de 2.5 × 105.
    15. Gire hacia abajo los BSLB a 300 × g durante 2 min y RT y deseche el sobrenadante.
    16. Resuspendir los BSLB utilizando 100 μL de suspensión de células T; mezclar suavemente para evitar la formación de burbujas.
    17. Incubar los cocultivos durante 90 min a 37 °C.
      NOTA: Alternativamente, las células y las perlas se pueden resuspendir en tampón HBS / HSA (BSA) en lugar de RPMI libre de fenol-rojo para el cocultivo. En este caso, la incubación debe realizarse en una incubadora sin CO2 , ya que este gas acidificará rápidamente el tampón en ausencia de bicarbonato.
    18. Enfríe los cocultivos de células BSLB-T incubando primero las células en RT durante un mínimo de 15 minutos. Protégelos de la luz.
    19. Centrifugar las células durante 5 min a 500 × g y RT; deseche el sobrenadante.
    20. Resuspend las células en RT 2% BSA-PBS (Libre de Ca2+ y Mg2+) para el bloqueo. Coloque las celdas en hielo durante 45 min. Proteger de la luz.
    21. Mientras incuba las células, prepare la mezcla maestra de anticuerpos utilizando BSA al 2% filtrado por 0,22 μm en PBS como un tampón de tinción, lo que proporcionará un bloqueo adicional.
      NOTA: Algunos lotes de anticuerpos conjugados con colorantes Violeta Brillante tienden a unirse a BSLB de forma no específica. El bloqueo con 5% BSA-PBS ayuda a reducir este ruido. A partir de ahora, asegúrese de mantener la cadena de frío intacta.
    22. Girar hacia abajo los cocultivos a 500 × g durante 5 min y 4 °C. Antes de desechar los sobrenadantes, asegúrese brevemente de que el pellet esté presente inspeccionando el fondo de la placa de 96 pocillos con una luz de fondo.
    23. Usando una pipeta multicanal, resuspenda las células en la mezcla maestra de tinción que contiene concentraciones optimizadas de anticuerpos.
      NOTA: Utilice puntas de pipeta sin filtro para evitar la generación de burbujas y errores en la distribución de los volúmenes de tinción.
    24. Incluye células marcadas con isotipo y BSLB, BSLB fluorescentes y no fluorescentes, y células y BSLB teñidas solas. Respetar el número total de eventos por pozo para todos los controles (es decir, solo BSLB que contengan 5 × 105 BSLB/pozo, y solo controles celulares que contengan 5 × 105 células/pozo para evitar un aumento relativo de anticuerpos por evento teñido).
    25. Mezclar suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen e incubar durante 30 minutos en hielo. Proteger de la luz.
    26. Lave las células y los BSLB dos veces con BSA-PBS al 2% en frío, pH 7.4 y pasos de sedimentación de 500 × g durante 5 min a 4 °C. Resuspendir los cocultivos lavados en 100 μL de PBS y adquirirlos inmediatamente.
    27. Si se necesita fijación, arregle usando 0.5% p/v de PFA en PBS durante 10 min, lave una vez y manténgalo en PBS hasta la adquisición. Proteger de la luz.
    28. Antes de la compensación, adquiera los estándares MESF, asegurando que tanto las poblaciones más tenues como las más brillantes caigan en el rango lineal de medición.
    29. Adquiera muestras de compensación, calcule la compensación y aplique la matriz de compensación (enlace) al experimento.
    30. Adquirir y guardar un mínimo de 2 × 104 estándares MESF totales para cada uno de los canales de cuantificación.
    31. Para la adquisición utilizando muestreadores de alto rendimiento, establezca la adquisición de instrumentos en el estándar, establezca la adquisición de muestras en 80 μL (o el 80% del volumen total), la tasa de flujo de muestreo entre 2.0 y 3.0 μL / s, el volumen de mezcla de muestras de 50 μL (o el 50% del volumen total para evitar la formación de burbujas durante la mezcla), la mezcla de muestras de 150 μL / s y la mezcla por pozo entre 3 y 5.
    32. Adquirir un mínimo de 1 × 104 BSLB individuales por muestra (consulte los paneles de la Figura 3B (i) a (vi) para la estrategia de cierre de referencia).
    33. Lave el citómetro durante 5 minutos con una solución de limpieza seguida de 5 minutos de agua ultrapura antes de apagar el instrumento. Si utiliza el HTS, siga las opciones de la pestaña HTS y la opción Limpiar .
    34. Exportar archivos FCS.

7. Medición de la transferencia sináptica de partículas a BSLB

  1. Abra los archivos FCS del experimento. Seleccione la población de células y BSLB en función de sus áreas de dispersión de luz lateral y delantera (SSC-A versus FSC-A), como se muestra en la Figura 3B (i).
  2. Seleccione los eventos dentro de la ventana de adquisición continua (Figura 3B (ii)).
  3. Centrarse en los eventos individuales de ambas células y BSLB; identificar células individuales primero basadas en W bajo en las compuertas secuenciales FSC-W/FSC-H (singletes-1, Figura 3B panel (iii)) y SSC-W/SSC-H (singletes-2; Figura 3B panel (iv)). Defina una puerta singlets-3 adicional seleccionando eventos con FSC-A y FSC-H proporcionales (Figura 3B, panel (v)).
  4. Extraiga la IMF de fracciones mesf en blanco y 1 a 4 y de células individuales y MESF para cada muestra de experimento.
  5. Genere valores corregidos de IMF (cMFI) para las fracciones MESF 1 a 4 restando la IMF de la población de cuentas en blanco de cada fracción.
  6. Generar cMFIs para BSLB y celdas individuales (consulte el panel (i ) de la Figura 3C ).
  7. Utilice la señal de BSLB teñida con anticuerpos de control de isotipo para corregir la IMF de BSLB teñida con anticuerpos contra los marcadores de células T relevantes. Utilice cMFI para calcular el porcentaje de transferencia sináptica normalizada (NST%) utilizando la ecuación que se muestra en el panel (ii) de la Figura 3C .
  8. Si está interesado, en cambio, en las partículas transferidas específicamente en respuesta a la activación de TCR, reste la señal de los BSLB nulos de la IMF de los BSLB agonísticos. Utilice este cMFI para calcular el NST% impulsado por TCR utilizando la ecuación que se muestra en el panel (ii) de la Figura 3C .
  9. Si está interesado en determinar el número total de moléculas transferidas como carga de partículas a través de la interfaz T cell-BSLB, adquiera cuentas de referencia MESF utilizando la misma configuración del instrumento y la misma sesión de adquisición para cocultivos T cell-BSLB.
  10. Analice las poblaciones de perlas MESF y extraiga sus cMFIs como se indica en los pasos del protocolo 5.8.15 a 5.8.17. Calcular la pendiente de la línea de mejor ajuste para el análisis de regresión de MESF sobre cMFI.
  11. Utilice la pendiente calculada para extraer el número de MESF depositados en los BSLB. Utilice los cMFI calculados utilizando controles de isotipo o BSLB nulos como espacios en blanco para extraer el número de MESF transferidos específicamente a los BSLB estimulantes.
  12. Calcule el número de moléculas de marcadores transferidos a BSLB dividiendo los MESF calculados (promedio) por BSLB por el valor F/P del anticuerpo de cuantificación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FCM para la cuantificación absoluta de proteínas en la superficie celular
La reconstitución de BSLB que presentan densidades fisiológicas de ligandos requiere la estimación de densidades totales de proteínas en el subconjunto celular modelado. Para reconstituir los BSLB, incluya cualquier ligando relevante que se espera que desempeñe un papel en el eje de señalización de interés junto con las proteínas que apoyan la adhesión y la interacción funcional entre BSLB y las células, como ICAM-1 y moléculas coestimuladoras, por ejemplo, receptores CD40, CD58 y B7 (CD80 y CD86). Se pueden agregar proteínas adicionales dependiendo de la pregunta en cuestión, incluidas moléculas coestimuladoras como ICOSL3, PD-L1 y PD-L215. Para cualquier otra molécula, reconstituya BSLB utilizando densidades moleculares determinadas mediante el análisis directo de células con citometría de flujo cuantitativa. Para los anticuerpos conjugados directamente, BioLegend proporciona valores de F/P para cada número de lote de anticuerpos. Los anticuerpos también se pueden etiquetar internamente y las relaciones F/P se determinan mediante espectrofotometría, proporcionando una alternativa cuando no hay anticuerpos comerciales conjugados al fluorocromo deseado. Dado que utilizamos los mismos anticuerpos para calibrar el número de proteínas recombinantes en la superficie de las células y los BSLB, no hay necesidad de corregir la valencia de unión a anticuerpos, ya que esto permanece constante. Si se requiere la valencia de unión a anticuerpos, use proteínas recombinantes y anticuerpos con F/P conocidos para decorar los BSLB y comparar las moléculas de proteínas recombinantes cargadas con el número de anticuerpos unidos después de la tinción en condiciones de saturación.

Las moléculas de anticuerpos unidos por célula se pueden estimar utilizando una medición citométrica de flujo monocromática dedicada o un panel policromático de anticuerpos destinado a estimar densidades absolutas de proteínas en un subconjunto relativamente infrecuente de células dentro de un tejido de interés, como las amígdalas palatinas. La Figura 1 muestra mediciones representativas de densidades de ICAM-1 en células B CXCR5+ y células T foliculares (TFH) como ejemplo. El mismo protocolo de tinción y los mismos principios de análisis de citometría de flujo que se muestran en la Figura 1A se pueden utilizar para medir las densidades de proteínas en células epiteliales, células estromales, monocitos, células dendríticas derivadas de monocitos (MoDC), o en linfocitos B y T en otros tejidos humanos y de ratón. Para los tejidos diferentes de la sangre y las amígdalas, se debe tener precaución al aislar las células utilizando cócteles de proteasa, ya que la exposición prolongada de las células a las enzimas de digestión reduce los niveles de expresión de la superficie celular.

Enfocar la adquisición y los análisis en células individuales y vivas dentro de la ventana de adquisición continua (Figura 1A ii), ya que los eventos fuera del continuo de tiempo dispersan aberrantemente la luz, comprometiendo la cuantificación. Para aumentar la precisión de las determinaciones, reduzca la tinción inespecífica de apces mediante el bloqueo eficiente de FcγRs. El suero humano y el EDTA presentes en hFCB permiten un bloqueo eficiente de FcγR mientras se quela Ca2+ libre para reducir la agregación espontánea de células durante su manipulación y tinción (las flechas negras en la Figura 1A (iii) y (iv) muestran dobletes restantes en suspensiones de células amigdalares).

Realizar un seguimiento del rendimiento del instrumento mediante el uso de las perlas de configuración y seguimiento y el software (o similar; consulte la Tabla de materiales) es fundamental para la reproducibilidad de las cuantificaciones a lo largo del tiempo, especialmente en pasos posteriores cuando la transferencia sináptica de partículas a BSLB se mide utilizando solo IMF (es decir, para fluorocromos para los que no existen estándares MESF). Del mismo modo, verifique el rango lineal (es decir, linealidad mínima y linealidad máxima) de las unidades de fluorescencia arbitrarias para el detector de cuantificación que se utilizará junto con los estándares MESF, de modo que cada punto de calibración mantenga la relación lineal entre la fluorescencia y el número de fluorocromos.

La preparación de muestras "en blanco" para la fluorescencia, o muestras que proporcionan una idea del ruido de tinción de fondo, son esenciales para restar la señal fluorescente inespecífica. Los controles de isotipo y/o las muestras biológicamente nulas (por ejemplo, knockouts) son esenciales para corregir la señal de fondo de las células y extraer la verdadera señal derivada de los anticuerpos de cuantificación (Figura 1A panel (viii)). Del mismo modo, las cuentas MESF estándar utilizan una población en blanco dedicada para restar la señal de fondo de cada población de cuentas verdaderamente positiva (paneles de la Figura 1B (vii) y (viii)). Una vez realizados los análisis de regresión y extraída la pendiente que define la relación entre MESF y las IMF corregidas, la conversión a densidades moleculares absolutas sigue operaciones matemáticas simples (Figura 1C).

Para estimar la CSA en la Figura 1C, se utilizó la exclusión de corriente eléctrica (CASY-TT) para extraer mediciones del volumen y diámetro celular de miles de células. El CSA resultante estimado a partir del cálculo del área de superficie para esferas (4pr2) varía con el estado de activación de las células, con valores observados de 170,37 ± 4,91 μm2 para células B no activadas y 234,52 ± 1,53 μm2 y 318 ± 24,45 μm2 para células T no activadas y activadas, respectivamente. Estos CSA son comparables a los estimados por técnicas de imagen como la tomografía tridimensional de índice de refracción de linfocitos no activados16.

Una vez que se ha definido el rango de densidades fisiológicas (por ejemplo, comparando densidades de superficie en células sometidas a diferentes programas de activación), los BSLB se pueden usar para modelar esas superficies. Una titulación de monómeros biotinilados antigénicos HLA-péptidos proporcionados por la instalación de tetrámeros de los NIH (o anti-CD3ε-Fab monomérico monomemérico monobiotinilado) se puede utilizar junto con ICAM-1 12-His para reconstituir una membrana APC canónica. Las proteínas comerciales marcadas con 6, 9, 12 y 14 His se pueden usar para decorar la superficie de BSLB (ver Figura 2A para ejemplos con ICAM-1 12-His). Las valoraciones de proteínas junto con los análisis cuantitativos de FCM proporcionan una metodología robusta para reconstituir las superficies fisiológicas de APC y probar su efecto en la producción sináptica de diferentes subconjuntos de células T.

Para estudiar la salida de las sinapsis de células T, use una proporción de 1: 1 BSLB a células T para garantizar que, en promedio, una célula interactúe con una BSLB durante el período estudiado. Hemos observado que la transferencia de material es proporcional al tiempo de incubación, proporcionando una plataforma versátil para detectar moléculas transferidas en bajas cantidades a través de la interfaz célula:BSLB. Por lo tanto, un diseño de panel adecuado es fundamental para aumentar la sensibilidad y la fiabilidad de la detección de material transsináptico, ya que en el caso de los tSV, la salida varía entre 25 y 36 vesículas/celda/20 min2,3. Pruebe primero el derrame espectral de cada anticuerpo y lípido marcado con fluorocromo. Cuando se observa un alto derrame, recomendamos la titulación de los anticuerpos de tinción y el porcentaje de lípidos fluorescentes que componen el BSLB, así como las caminatas de voltaje PMT para reducir el error de propagación en las muestras compensadas y mejorar la relación de señal sobre ruido, respectivamente (consulte 12,14,17 para una introducción dedicada al tema).

El uso de controles de cuantificación, incluyendo BSLB nulos (carentes de antígeno o anti-CD3 Fab) y células knockout o muestras marcadas con isotipo18, es esencial para medir con precisión la transferencia de tSV efector, como los SE, así como las partículas de ataque supramolecular liberadas dentro de la hendidura sináptica. Utilice proteínas de superficie celular muy abundantes como CD4, CD2 o CD45 junto con lípidos fluorescentes sintéticos (conjugados DOPE Atto) para identificar la población de células individuales y BSLB tras la disociación de conjugados a base de frío. Centrar los análisis en la media geométrica o mediana de las intensidades de fluorescencia en BSLB y células individuales (CD4 se utiliza en la Figura 3B). Los SE son un tipo especializado de tSV derivado de la membrana plasmática (PM), y su transferencia a BSLB se evidencia por la ganancia de señal de marcador en BSLB con la pérdida constante de señal en la superficie de las células que interactúan (consulte TCR en BSLB como se muestra en la Figura 2B, flechas violetas). Los BSLB nulos que carecen de antígeno o anti-CD3 son una excelente referencia para realizar un seguimiento de la ganancia específica de TCR (y otros marcadores de células T) en BSLB como resultado de estimular las células que interactúan a través de su complejo TCR.

Figure 1
Figura 1: Cuantificación absoluta de proteínas en la superficie de las APC. (A) Ejemplo de mediciones cuantitativas de citometría de flujo de ICAM-1 en la superficie de células B amigdalares (Foll. Bc) y células T auxiliares (TFH). (i-vii) Estrategia de gating para el análisis de CXCR5+ Bc y TFH aislados de amígdalas palatinas humanas. Se muestra la estrategia de cierre secuencial para identificar eventos únicos y en vivo contenidos dentro de la ventana continua de adquisición. (iii-iv) las flechas negras indican dobletes. viii) histogramas superpuestos que muestran la expresión de la superficie celular de ICAM-1 (histogramas de color verde azulado) en comparación con los controles FMO (histogramas grises) y los controles FMO etiquetados con isotipos relevantes (histogramas negros, que se superponen con los histogramas grises) de las poblaciones mostradas en (vii). Las flechas indican la dirección de la estrategia de cierre anidada utilizada para identificar las células B CXCR5+ (Bc; CD19+) y TFH (CD4+). (B) La extracción de moléculas absolutas en la superficie de las células amigdalares de la IMF requiere análisis de regresión de las perlas de referencia MESF adquiridas utilizando la misma configuración de instrumento que las células que se muestran en A. (i-v) Se muestra la estrategia de cierre secuencial para identificar eventos únicos y en vivo contenidos dentro de la ventana continua de adquisición. vi) Gating y medición de IMF de diferentes poblaciones estándar de MESF. vii) se muestran histogramas superpuestos de las poblaciones mesf identificadas en el inciso vi). Los valores que se muestran en la parte superior derecha representan las IMF para cada una de las 5 poblaciones mesf (en blanco, 1, 2, 3 y 4). (viii) Regresión lineal de MESF sobre cMFI para las poblaciones de MESF mostradas en (vii). Se muestra la pendiente (b) para extraer MESF unido a celdas de los datos en A. (C) En la extracción del número de moléculas, siga operaciones matemáticas simples comenzando con la aplicación de la pendiente calculada en (viii) a partir de valores medidos de MESF cMFI (cMFIM) y mesF de referencia (MESFR). Para extraer el MESF unido a células (MESFcells), divida la IMF corregida de las células (cMFIcells) por la pendiente calculada. Luego, para calcular el número de moléculas unidas a las células (Molec. células), dividen las células MESF por el F/P del anticuerpo de detección (cuantificación). Finalmente, para calcular la densidad molecular en la superficie de las células (Dcells), divida Molec. células por el área de superficie celular estimada (CSAE). Abreviaturas: X = variable independiente; Y = variable dependiente (fluorescencia medida), cMFIM = IMF corregida medida; MESFR = valores MESF de referencia; MESFcells = MESF estimado por célula; cMFIcells = células MFI corregidas; Molec. células = moléculas estimadas por célula. Dcells = densidad estimada en las células; CSAE = área de superficie celular estimada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Reconstitución de BSLB con ICAM-1 recombinante y medición de la transferencia de partículas a BSLBs. (A, i-vi) Análisis de citometría de flujo de BSLB reconstituidos con aumento de densidades de ICAM-1 12-His monomérico recombinante (rICAM-1). (i-v) Al igual que en la Figura 1, enfocar la estrategia de gating en BSLB individuales dentro de la ventana continua de adquisición. Tenga en cuenta el espacio inmediatamente antes de la puerta del continuo de tiempo, que se excluyó para evitar errores de medición. (vi) La buena calidad de la proteína a menudo resulta en el recubrimiento homogéneo de BSLB a altas concentraciones, con la observación de distribuciones de fluorescencia estrechas (bajo coeficiente de variación, ver histogramas en vi). (B) Análisis de regresión de la concentración de referencia (CR) de ICAM-1 sobre la densidad medida (DM). Utilice la pendiente para calcular las concentraciones objetivo de proteína (CT) para lograr la densidad de células (Dcells) medida en los experimentos de la Figura 1. Abreviaturas: 12-His = 12-histidines tag; DM = densidades moleculares medidas; CR = concentraciones de referencia del rICAM-1; CT = concentración objetivo (a interpolar); Dcells = densidades medidas en células (ver también Fig. 1C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Medición de partículas sinápticas de células T transferidas a BSLB. (A; i-v) Diagrama de flujo que muestra los pasos críticos para el co-cultivo de células T con BSLB reconstituyendo membranas modelo y la posterior medición de la transferencia de partículas con citometría de flujo. (iv) Los diagramas azul y amarillo oscuro muestran la distribución relativa y la ubicación de las células y BSLB en gráficos de citometría de flujo biparamétrico. (v) Histogramas de distribución de fluorescencia que muestran la ganancia relativa de fluorescencia de BSLB agonísticos (amarillo oscuro) en comparación con BSLB nulos (gris). (B) Experimento ejemplar de transferencia sináptica. (i-vi) Se muestra la estrategia de cierre para identificar BSLB y celdas individuales dentro de la ventana de adquisición continua. Las flechas violetas indican la dirección del análisis, que continúa en C. (C) (i) Enfocar los análisis en la IMF de células individuales (azul) y BSLB individuales (amarillo). (ii) Ecuaciones para calcular la transferencia sináptica normalizada (NST%, arriba) y Tmax% (abajo) a partir del cMFI calculado para BSLB y células. (iii-vi) Histogramas superpuestos que muestran el cambio de las distribuciones de intensidad de fluorescencia para células (tonos azules) y BSLB (tonos amarillos) en diferentes densidades de las células T activando anti-CD3ε-Fab, incluyendo no activante (gris) y activando con 250 (valor de color suave) o 1,000 (alto valor de color) molec./μm2. Los números en diferentes valores de color representan el NST% medido para los histogramas BSLB que se muestran en amarillo. Los histogramas superpuestos muestran la jerarquía general en la transferencia sináptica de vesículas de células T positivas para diferentes marcadores. Para esta composición de BSLBs (200 molec./μm2 de ICAM-1 y densidades crecientes de anti-CD3ε-Fab), los tSV se transfieren a BSLB con TCR+(iii) > CD81+(iv) > CD4+(v) > CD28+(vi). Como se demostró en artículos anteriores, TCR y CD81 son componentes de los SE y se transfieren con eficiencias comparativamente más altas a CD4, a pesar de que este último se expresa a niveles de superficie comparativamente más altos. El desprendimiento de SE resulta en la pérdida de la superficie celular CD81 y TCR y la ganancia de estas señales en BSLB (flechas púrpuras abiertas para 250 molec./μm2, y flechas púrpuras cerradas para 1.000 molec./μm2 en histogramas amarillos). (D) El enfriamiento inadecuado de los conjugados conduce a que las células extraigan el SLB de las perlas de sílice como se ve al comparar las perlas de entrada (gráfica biparamétrica izquierda) y los conjugados sometidos a un enfriamiento rápido a 4 ° C desde 37 ° C (gráfica biparamétrica derecha). Compare también con el panel de la Figura 3B (vi). Abreviaturas: PRF1 = perforina 1; NST% = transferencia sináptica normalizada; Tmax% = porcentaje de transferencia máxima observada (en condición de control o referencia); tSVs: vesículas transsinápticas; SE: ectosomas sinápticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Búferes utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Los BSLB son herramientas versátiles para estudiar la producción de partículas de células T estimuladas con membranas modelo APC. La flexibilidad del método permite la reconstitución de composiciones de membrana complejas y reduccionistas para estudiar los efectos de los ligandos y sus señales sobre la secreción de tSVs y partículas de ataque supramolecular y sus componentes. Hemos probado esta tecnología en varias células T, incluyendo TH, CTL, Tregs y CART15 preactivadas. Este protocolo también funciona para la medición de la liberación de partículas sinápticas de células T recién aisladas y inactivas. Una limitación del uso de células T recién aisladas es que estas poblaciones inactivas producen un perfil diferente de partículas transsinápticas, que se correlaciona con su composición de la superficie celular (ver 15 para más detalles).

Como panel de citometría de flujo simple, recomendamos el uso de clon anti-TCR IP26, clon anti-CD81 5A6, clon antiperforina (PRF1) B-D48 o clon anti-CD40L 24-31, y lípidos que contienen ATTO 390 o ATTO 565 (para conferir a los BSLB una fluorescencia intrínseca). Para ayudar a discriminar células individuales de BSLB individuales y conjugados, recomendamos el uso de clon anti-CD4 OKT4 y / o clon anti-CD45 HI30, que se transfieren a BSLB a niveles limitados a pesar de expresarse a niveles muy altos en la superficie celular (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles sobre fluorocromos y otros anticuerpos validados). Se pueden diseñar paneles con un mayor número de fluorocromos, pero requieren una evaluación sistemática del derrame del espectro de fluorescencia de cada fluorocromo analizado. Para aumentar la sensibilidad, pruebe diferentes valoraciones de anticuerpos de cuantificación que van desde 0,5 μg a 20 μg/ml final, y repita cada vez que se utilicen nuevas reservas de anticuerpos. Para garantizar la reproducibilidad de las mediciones absolutas y relativas de la transferencia de partículas, titule y calcule la capacidad de unión de cada nuevo lote de fosfolípidos biotinilados y que contienen Ni, ya que pueden diferir significativamente de un lote a otro. El enfriamiento gradual de los conjugados células T-BSLB es fundamental para aumentar la sensibilidad de detección de partículas con baja abundancia. El rápido enfriamiento de los cocultivos conduce a la destrucción de los BSLB, como lo demuestra la pérdida significativa de fluorescencia lipídica (Figura 3D).

Se pueden utilizar diferentes métricas para medir la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T dependiendo de la pregunta experimental en cuestión. Por ejemplo, cuando se esperan diferencias menores en los niveles de expresión basales de las proteínas de superficie clasificadas en SE en ciernes, se puede usar una métrica de transferencia sináptica normalizada (NST%) (Figura 3C panel (ii) ecuación superior). Este último cuantifica el porcentaje de señal MFI en BSLB como una función del MFI total combinado de células y cuentas. Una salvedad de este enfoque es el análisis de marcadores transferidos no expresados en el PM, como los componentes de las partículas de ataque supramolecular19. Como estos elementos llegan a los BSLB por vías independientes del tránsito de PM, como la exocitosis de almacenamiento intracelular, no se recomienda el cálculo del NST% ya que el resultado se inflará porque el numerador se dividirá por un denominador comparativamente pequeño (nivel de expresión de la superficie celular). En su lugar, use IMF corregidas para comparar la deposición de perforina y granzimas entre BSLB nulos y BSLB que presentan densidades crecientes de antígeno o anti-CD3 Fab. Alternativamente, para rastrear los elementos intracelulares transferidos a BSLB, use para comparar las moléculas absolutas estimadas transferidas o el porcentaje de señal con respecto a la señal máxima transferida a BSLB (Tmax%) (Figura 3C panel (ii) ecuación inferior). Para Tmax%, use cMFI o moléculas medidas en la muestra (o condición) de BSLB que presenten la mayor densidad de antígenos como Tmax de referencia. Al analizar diferentes donantes, use Tmax específico del donante para las comparaciones. Al estudiar el material transferido en respuesta a la activación específica del TCR, las IMF también se pueden corregir al nivel de transferencia de fondo observado en los BSLB negativos para antígenos (nulos).

Estimar el número absoluto de moléculas transferidas a BSLB es un método más robusto, ya que esto implica la calibración MESF con la medición de moléculas como punto final y una mejor comparación de experimentos independientes. Tmax% ofrece una normalización similar en experimentos independientes y es particularmente útil cuando se utiliza FCM policromática para marcadores intracelulares, como perforina y granzimas, o para marcadores para los que no hay un estándar MESF disponible. Tmax% es simplemente el porcentaje de señal en cualquier condición dada a la condición con la mayor transferencia en la condición de control (por ejemplo, controles de vehículos / no tratados para estudios de medicamentos, GUÍA DE CONTROL de ARN para bibliotecas CRISPR / Cas9). Además, Tmax% se puede utilizar tanto para cMFI como para un número absoluto de moléculas y ha sido particularmente útil para las comparaciones lado a lado de los efectos de las deleciones de genes en la producción sináptica de las células T. Esto último es evidente cuando la edición de genes conduce a una alta variabilidad en el rango dinámico de expresión del receptor inmune entre donantes y experimentos independientes, lo que podría afectar las mediciones absolutas y NST%.

Los BSLB han facilitado la captura y caracterización de la salida sináptica de diferentes tipos de células T, que de otro modo son difíciles de aislar debido a su rápida internalización por APC2. La estabilidad física de los BSLB también proporciona una plataforma para la clasificación celular activada por fluorescencia de los BSLB que han sido estudiados por las células T, lo que permite la caracterización bioquímica de preparaciones de partículas altamente puras mediante espectrometría de masas y tecnologías de secuenciación de ácidos nucleicos. Este último facilita la caracterización detallada de los mensajeros intercelulares arrojados por las células T bajo una amplia gama de condiciones experimentales. Se pueden abordar diferentes preguntas, incluida la forma en que estos mensajeros de partículas cambian entre los diferentes tipos de células T y estados de activación, cómo los receptores de antígenos canónicos y no canónicos (es decir, los receptores de antígenos quiméricos) y cómo las señales de membrana agonísticas y antagónicas influyen en la composición de partículas. Actualmente estamos desarrollando esta tecnología para la caracterización cuantitativa de las citoquinas secretadas en la sinapsis inmune de las células T estimuladas. Este último requiere el estudio cuidadoso de combinaciones de receptores de citoquinas recombinantes y anticuerpos, proporcionando una captura eficiente de interleucinas, interferones y quimiocinas depositadas en BSLB después de la activación de las células T. Los BSLB se pueden adaptar para modelar la composición superficial de otros APC sospechosos de desencadenar la liberación de tSV por las células T, como las células inmunes e innatas y estromales. Los BSLB también se pueden adaptar para detectar nuevos compuestos farmacológicos que buscan la modulación positiva y negativa de la maquinaria de secreción exociótica y tSV para el tratamiento del cáncer y otras patologías. Finalmente, los BSLB también se pueden utilizar para descubrir determinantes de virulencia que modulan la función de las células T en enfermedades infecciosas20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Acknowledgments

Estamos agradecidos con los miembros de nuestro laboratorio y la comunidad del Instituto Kennedy de Reumatología por las discusiones científicas constructivas, especialmente con nuestro gerente de instalaciones de citometría de flujo Jonathan Webber. Este trabajo fue financiado por Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, la ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) y el Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (los tres a MLD). PFCD fue apoyado por EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, en conjunto con la Comisión Europea (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) y Marie Sklodowska-Curie Actions) y una beca Oxford-Bristol Myers Squibb.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Tags

Inmunología e Infección Número 182
Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Céspedes, P. F., Dustin, M. L.… More

Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter