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Immunology and Infection

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

Aqui apresentamos o protocolo para a reconstituição stepwise de células que apresentam antígenos sintéticos usando Bicamadas lipídicas apoiadas por contas e seu uso para interrogar a saída sináptica de células T ativadas.

Abstract

As células que apresentam antígenos (APCs) apresentam três sinais de ativação para células T envolvidas no contato físico: 1) antígeno, 2) costimulação/corepressão e 3) citocinas solúveis. As células T liberam dois tipos de partículas efeitos em resposta à ativação: vesículas transsintálicas (tSVs) e partículas de ataque supramolecular, que transferem mensageiros intercelulares e mediam a citotoxicidade, respectivamente. Essas entidades são rapidamente internalizadas por APCs engajados no contato físico com células T, tornando sua caracterização assustadora. Este artigo apresenta o protocolo para fabricar e usar bicamadas lipídicas apoiadas por contas (BSLBs) como miméticas de células que apresentam antígenos (APC) para capturar e analisar essas partículas trans-sinápticas. Também são descritos os protocolos para as medições absolutas de densidades proteicas nas superfícies celulares, a reconstituição de BSLBs com tais níveis fisiológicos e o procedimento de citometria de fluxo para rastreamento da liberação de partículas sinápticas por células T. Este protocolo pode ser adaptado para estudar os efeitos de proteínas individuais, misturas complexas de ligantes, determinantes de virulência de patógenos e drogas na saída de células T, incluindo células T auxiliares, linfócitos T citotóxicos, células T regulatórias e células T que expressam receptor de antígeno quimérico (CART).

Introduction

A sinapse imunológica (IS) é uma estrutura molecular fundamental formada na interface de células envolvidas em contato físico que facilita a troca regulada de informações juxtracrinas. Diferentes ISs foram descritos na literatura, e um conjunto crescente de evidências sugere que esses hubs moleculares são uma característica conservada das redes celulares. Várias células imunes, incluindo células B, células assassinas naturais, células dendríticas, macrófagos e células T, trocam informações através da montagem de contatos de curta duração1. Estudos multiómicos estão avançando na compreensão de novos subconjuntos de leucócitos e células estromais que conduzem redes celulares patogênicas e expressam proteínas superficiais com funções desconhecidas. Como APCs sintéticos, os BSLBs permitem a investigação direta do papel funcional das proteínas individuais na integração de sinais de ativação, ou seja, antígenos e costimulação/corepressão, por células T e a consequente liberação de partículas de efeitos referidas como sinal quatro.

Este artigo descreve os protocolos e pontos técnicos críticos a serem considerados ao usar BSLBs para imitar a composição superficial dos APCs do modelo. Os protocolos para a medição quantitativa de receptores imunológicos e outras proteínas superficiais em APCs são apresentados juntamente com o protocolo para a reconstituição de APCs sintéticos contendo essas quantidades medidas. Em seguida, as etapas necessárias para coculturar células T e BSLB são apresentadas juntamente com o protocolo para a medição quantitativa da transferência de partículas trans-sinápticas usando citometria de fluxo. Mais notavelmente, os BSLBs facilitam o estudo de uma população derivada de membrana plasmática de tSVs denominadas ectomosse sináptico (ECtos). As SEs enriquecidas com receptor de antígeno de células T (TCR+) são lançadas em resposta ao Acionamento TCR2 e capturadas eficientemente por BSLBs3, representando uma excelente leitura para avaliar as propriedades agonizantes dos antígenos e a composição da membrana modelada. Exosomos CD63+ e partículas de ataque supramolecular (SMAPs) também são liberados por células T estimuladas e capturados por BSLBs. Eles podem ser usados como leituras adicionais da ativação e a secreção de grânulo exolítico e lítico resultante por células T. A mobilização de vesículas exocióticas ao polo interagente da célula T também facilita a liberação direcional de citocinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 em resposta à ativação4,5,6,7,8. Embora citocinas liberadas por células T também possam ser detectadas em BSLBs, um estudo mais dedicado está atualmente em desenvolvimento para validar a análise quantitativa da liberação de citocinas na sinapse imunológica.

Para questionar como as composições de membranas específicas influenciam a saída sináptica das células T requer a definição da densidade fisiológica do componente da membrana alvo. Quantificações baseadas em citometria de fluxo de proteínas superficiais celulares são um passo essencial neste protocolo e exigem: 1) o uso de anticorpos com números conhecidos de fluorochromes por anticorpo (F/P), e 2) contas de referência fornecendo uma referência padrão para interpolar moléculas fluorocromáticas a partir de intensidades de fluorescência média medida (MFIs).

Esses padrões de referência consistem em cinco populações de contas, cada uma contendo um número crescente de fluorocromes solúveis equivalentes (MESFs), que abrangem a faixa dinâmica de detecção arbitrária de fluorescência. Essas populações padrão produzem picos de fluorescência discreta, facilitando a conversão de unidades de fluorescência arbitrária em MESFs por simples regressão linear. Os MESFs resultantes são então usados juntamente com valores de anticorpos F/P para calcular o número médio de moléculas ligadas por célula (ou BSLB em etapas posteriores). A aplicação de áreas estimadas da superfície celular ao número médio de moléculas detectadas permite então o cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/μm2. Este protocolo de quantificação também pode ser adaptado à medição de densidades proteicas em células T e à reconstituição bioquímica de composições de membrana mediando a formação de sinapses celulares T homotípicas (ou seja, sinapses T-T). Se necessário, a valência da ligação de anticorpos pode ser estimada usando alvos recombinantes rotulados com números conhecidos de fluorochromes por molécula. Em seguida, a valência de ligação de anticorpos pode ser calculada para a mesma população BSLB, comparando simultaneamente o número de proteínas fluorescentes ligadas e anticorpos de quantificação (usando dois fluorochromes de quantificação diferentes e padrões MESF).

A reconstituição das membranas APC requer a montagem de bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) em contas de sílica1. Os estoques lipossomos contendo diferentes espécies fosfolipídicas podem ser aproveitados para formar uma versátil matriz lipídica-bicamada, permitindo a ancoragem de proteínas recombinantes com diferentes químicas de ligação (a preparação de lipossomos é detalhada em 10). Uma vez definida a densidade fisiológica (ou densidades) do ligante relevante "sobre células", o mesmo protocolo de citometria de fluxo é adaptado para estimar a concentração de proteína recombinante necessária para cobrir BSLBs com a densidade fisiológica alvo. Dois sistemas de ancoragem diferentes podem ser usados em combinação ou separadamente.

Primeiro, o SLB contendo 12,5% finais de fosfolipídios contendo Ni2+, é suficiente para fornecer aproximadamente 10.000 locais de ligação de sua etiqueta por micron10 quadrado e funciona bem para decorar BSLBs com a maioria das proteínas disponíveis comercialmente cujas densidades fisiológicas não excedem essa capacidade máxima de carregamento. O segundo sistema de carregamento aproveita fosfolipídios contendo biotina (como mol) para carregar os monomers anti-CD3e fab biotinilados (ou monômeros HLA/MHC) através de pontes streptavidinas. A combinação desses dois métodos de decoração BSLB permite, então, a alfaiataria flexível de BSLBs como APCs sintéticos. Para composições superficiais APC altamente complexas, o mol% de fosfolipídios e proteínas pode ser aumentado para carregar quantas proteínas a questão em questão exige. Uma vez definidas as concentrações de trabalho de proteínas e mol% de fosfolipídios biotinilados, os BSLBs podem ser montados para interrogar a saída sináptica de células T com citometria de fluxo multiparamétrico.

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Protocol

1. Medição das densidades proteicas da superfície celular com citometria quantitativa de fluxo

  1. Prepare 0,22 μm filtrado tampão de citometria de fluxo humano (hFCB) adicionando EDTA (a uma concentração final de 2 mM) e soro AB humano (até 10% final para salina tamponada de fosfato estéril (PBS), pH 7.4 (ver Tabela 1). Filtre a solução usando uma unidade de filtro de poros de 0,22 μm para remover impurezas do soro e armazenar a 4 °C.
  2. Recupere as células e os sedimente por centrifugação a 300 × g por 5 min a temperatura ambiente (TR).
  3. Lave as células duas vezes com PBS. Em cada etapa de lavagem, resuspenme as células em PBS para o volume original (antes da centrifugação) e gire para baixo a 300 × g por 5 min no RT.
  4. Conte suspensões de células manchadas de azul em um hemocitómetro11. Alternativamente, conte células usando exclusão elétrica de corrente. Para este último, siga as instruções do fabricante CASY-TT (consulte a tabela de materiais).
    NOTA: O contador de células CASY-TT permite a determinação de por cento de células viáveis, tamanho celular e volume celular.
  5. Calcule o volume de PBS contendo diluição de 1:1.000 de Diluição fixável dilável dilável eFluor 780 ou similar (ver a Tabela de Materiais) necessário para resuspensar as células para uma concentração de coloração de 107 células/mL.
  6. Resuspend as células usando a solução de corante-PBS viabilidade e incubar no gelo por 30 minutos.
  7. Remova o corante de viabilidade adicionando um volume de hFCB gelado. Gire a 300 × g para 5 min a 4 °C.
    NOTA: De agora em diante, mantenha a corrente fria ininterrupta.
  8. Lave as células com hFCB contendo diluição de 1:50 da Solução de Bloqueio do Receptor fc (ver a Tabela de Materiais). Leve o volume para uma concentração final de 107 células/mL e incubar por mais 15 minutos para obter um bloqueio FcgR eficiente.
  9. Distribua 100 μL da suspensão celular (ou seja, 106 células) por poço de uma placa de fundo U ou fundo V de 96 poços. Mantenha as células no gelo e protegidas da luz (cubra com papel alumínio).
  10. Prepare uma mistura mestre de anticorpos em hFCB definindo as concentrações ideais de anticorpos para cada anticorpo conjugado fluorocromo, e o mais importante, para os anticorpos usados para determinar densidades de proteínas superficiais. Por exemplo, para quantificação da expressão ICAM-1 em populações de células anúnges, como mostrado na Figura 1, prepare uma mistura contendo 1:200 diluições de anti-CD4, anti-CD19 e anti-CXCR5 juntamente com concentrações saturadas de um anticorpo anti-ICAM-1 com fluororomes af647 conhecidos por anticorpo (i.e., 10 μg/mL, que foi definido por experimentos independentes de titulação de anticorpos).
  11. Como controles adicionais, prepare uma mistura mestre de anticorpos contendo os controles isótipos de anticorpos relevantes (nas mesmas concentrações eficazes que suas contrapartes conjugadas com os mesmos fluorochromes para subtração de fundo), ou seja, use 10 μg/mL de um controle isótipo AF647 relevante.
    NOTA: No exemplo acima, tal controle de isótipo é usado para subtrair fluorescência de fundo do verdadeiro sinal ICAM-1 nas células.
  12. Ao quantificar as densidades proteicas nos subconjuntos celulares presentes em baixas frequências dentro dos tecidos, prepare controles de fluorescência menos um (FMO) contendo todos os anticorpos de coloração, exceto os marcadores de interesse (veja mais detalhes em 12).
  13. Gire a placa de 96 poços contendo as células a 300 × g por 5 min a 4 °C, descarte o supernatante e resuspenque as células em 50 μL da mistura mestre de anticorpos de quantificação ou da mistura mestre de anticorpos isótipo.
  14. Incubar as células por pelo menos 30 min a 4 °C e 400 rpm usando um agitador de placas. Proteja as placas da luz (cubra com papel alumínio).
  15. Lave as células três vezes usando hFCB e centrífuga a 300 × g por 5 min a 4 °C.
  16. Resuspenncie a pelota celular utilizando 200 μL de PBS (ou seja, para uma concentração final de 5 × 106 células/mL).
  17. Para aquisição:
    1. Se usar um carregador BD FACS padrão, transfira as amostras para tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL (consulte a tabela de materiais).
    2. Se o uso de Samplers de alto rendimento (HTS, também chamado de leitores de placas), proceda imediatamente para a etapa 1.19.
  18. Antes de prosseguir com a aquisição de dados para as normas MESF, verifique os limites máximos e mínimos de intensidade de fluorescência para os canais de quantificação.
  19. Antes da compensação, adquira dados para as normas mesf, garantindo que as populações mais fracas e mais brilhantes caiam na faixa linear de medição.
  20. Adquira as amostras de compensação. Mantenha os valores de tensão do tubo fotomultiplier (PMT) para os canais de quantificação inalterados para preservar o alcance dinâmico da detecção. Realizar pequenos ajustes na tensão pmt de outros canais antes de calcular as matrizes de compensação.
  21. Calcular e aplicar compensação.
  22. Adquira e economize um mínimo de 2 × 104 contas MESF totais para cada um dos canais de quantificação.
  23. Selecione a população de células únicas com base em suas áreas de dispersão de luz lateral e dianteira (SSC-A e FSC-A, respectivamente, como mostrado na Figura 1A (i)), seguida pela seleção de eventos dentro do contínuo temporal (Figura 1A (ii)) e baixa para o tempo de voo (W) tanto no FSC quanto no SSC em comparação com suas alturas (ou seja, FSC-W/FSC-H, seguido por SSC-W/SSC-H gating como mostrado na Figura 1A (iii) e (iv), respectivamente. Defina um portão de um único evento final contendo eventos com distribuição proporcional FSC-A versus FSC-H (Figura 1A (v)).
  24. Adquirir amostras de controle (controles isótipos e FMO).
  25. Adquira amostras e registo até que um mínimo de 10.000 células-alvo tenham sido adquiridas.
    NOTA: a determinação robusta das densidades moleculares médias requer a análise de vários doadores em experimentos independentes. Isso é crucial ao analisar os subconjuntos celulares encontrados em frequências reduzidas ou derivados de material biológico escasso (por exemplo, de biópsias de tecido humano).
  26. Lave o cítmetro funcionando por 5 minutos com uma solução de limpeza FACS seguida de 5 min de água ultrapura antes de desligar o instrumento. Se estiver usando o HTS, siga as opções embaixo da guia HTS e do programa Clean Plate.
    NOTA: Para reduzir a transferência amostral para amostra, ative as opções de lavagem do sampler sit (sampler) ou de alta throughput sampler , que lavará automaticamente o citômetro entre tubos ou poços. Antes de iniciar a aquisição, execute a água ultrauso por 10 minutos a uma alta taxa de fluxo para remover quaisquer contaminantes biológicos não lavados da linha de amostragem do citômetro.
  27. Exporte os arquivos Padrão de Citometria de Fluxo (FCS).

2. Análises de regressão da intensidade de fluorescência média (ou mediana) da MESF (MFI)

  1. Abra o software de análise de citometria de fluxo e carregue os arquivos FCS do experimento. Selecione a população de contas com base em suas áreas de dispersão de luz lateral e dianteira (SSC-A versus FSC-A), como mostrado na Figura 1A (i).
  2. Controle a qualidade dos dados verificando a distribuição de eventos únicos ao longo do tempo, conforme indicado na etapa 1.24.
    NOTA: Bolhas criam lacunas na distribuição de eventos ao longo do tempo; isso normalmente aparece no início da aquisição usando o HTS. Evite selecionar eventos que flanqueam lacunas no tempo de aquisição, pois estes adicionam erros de medição devido a aberrações ópticas.
  3. Concentre-se nos eventos únicos.
    1. Células
      1. Identifique células únicas primeiro com base em sua distribuição SSC-A e FSC-A (Figura 1A (i)), seguida por eventos baixos para W nos portões sequenciais FSC-W/FSC-H (singlets-1, Painel Figura 1A (iii)) e SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figura 1A painel (iv)). Defina um portão singlets-3 adicional selecionando eventos com FSC-A proporcional e FSC-H (Figura 1A, painel (v)). Finalmente, identifique as células vivas como aquelas negativas para o corante de viabilidade fixável.
    2. Contas MESF
      1. Siga os mesmos singlets-1 para singlets-3 discriminação como na etapa 2.3.1.1 (Figura 1B, painéis (i) a (v)). Identificar cada uma das populações do MESF (em branco, 1, 2, 3 e 4) com base em seus níveis de intensidade de fluorescência (ver Figura 1B, painel (vi)).
  4. Extrair o MFI das frações MESF em branco e 1 a 4.
  5. Gerar valores de MFI (cMFI) corrigidos para frações mesf 1 a 4 subtraindo os MFIs da população de contas em branco de cada fração.
  6. Calcule a linha de melhor ajuste para a relação entre cMFIs e os valores MESF fornecidos pelo fornecedor (variável independente, sendo fração em branco igual a zero).
  7. Extrair a inclinação (b na equação abaixo) da regressão linear de MESF sobre cMFI (Painel Figura 1B (viii) mostra uma regressão na qual y = a + bx; com a = 0).
  8. Extrair a mediana (para distribuições de fluorescência bimodal) ou média (para distribuições normais ou log-normal de fluorescência) intensidades de fluorescência das populações de interesse (células TFH e B no painel Figura 1A (vii)).
  9. Como nas etapas 2.5-2.7, extrair os valores de IM das células de controle rotuladas por isótipo.
  10. Se o F/P de controles isótipos for o mesmo que os anticorpos de quantificação, corrija os MFIs das células manchadas subtraindo os MFIs de células rotuladas por Isótipo.
  11. Se o F/P dos isótipos difere dos anticorpos de quantificação, extraia o MESF dos isótipos dividindo os MFIs das células rotuladas pelo isótipo com a inclinação calculada na etapa 2.7. Subtrair isótipo MESF da quantificação MESF antes de estimar anticorpos de quantificação vinculados.
  12. Divida o MESF pelo F/P dos anticorpos de quantificação para estimar o número de moléculas ligadas por célula (Molec. célula como mostrado no diagrama de fluxo da Figura 1C).
  13. Divida o número de moléculas ligadas com a área estimada da superfície celular (CSA (μm2)) para extrair a densidade de proteínas como molec./μm2 (Figura 1C). Consulte a seção de resultados representativos para obter mais detalhes.

3. Espécies fosfolipídicas funcionais para usar na calibração de proteínas que cobrem BSLBs

  1. Use 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholina) como o principal componente da matriz lipídica formando a bicamada lipídica suportada. Diluir todas as outras espécies de lipídios nesta solução DOPC.
  2. Use entre 0,2 e 1 mol% de 0,4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamina) conjugado a corantes, incluindo ATTO 390, 488 ou 565 (ver a Tabela de Materiais), para gerar BSLBs com fluência intrínseca.
    NOTA: A fluorescência intrínseca dos BSLBs facilita a identificação de BSLBs únicos e células únicas em experimentos de transferência sináptica.
  3. Use 12,5 mol% de 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl]) para ancorar proteínas sua marcadas. Mantenha o mol% de DGS-NTA(Ni) constante e realize titulações 2 vezes das proteínas marcadas com sua marca a partir de 100 nM como a maior concentração. Deixe uma condição sem proteína como controle negativo para quantificações absolutas.
    NOTA: Sinais acessórias e moléculas de adesão, como o ICAM-1, são projetados com uma tag 12-Sua para aumentar a afinidade da proteína para DGS-NTA(Ni).
  4. Use Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-gliceo-3-fosfoethanolamina-N-(cap biotinyl)) para ancorar proteínas biotiniladas através de pontes biotina-streptavidina-biotina. Use uma titulação serial de 5 vezes de 0,4 mM Biotinyl Cap PE cobrindo entre 10 mol% e 0 mol% (como controle negativo). Mantenha a concentração de proteínas streptavidinas e biotiniladas constantes (200 nM) tanto em experimentos de calibração quanto na reconstituição de APCs sintéticos para experimentos de transferência sináptica.
    NOTA: As análises de regressão das densidades empíricas de proteínas biotiniladas sobre o percentual final de Mol% da Lasca Biotinílica NA matriz lipídica (também contendo DGS-NTA(Ni) para ancorar proteínas marcadas com sua marca) definirão o mol% a ser usado para reconstituir densidades alvo de antígeno.

4. Preparação de soro suplementado HEPES contendo 1% de albumina de soro

NOTA: O soro fisiológico tamponado hepes com suplemento contendo 1% de albumina de soro humano (HBS/HSA) ou 1% de albumina de soro bovino (HBS/BSA) é necessária nas etapas de lavagem e carga de proteínas de BSLBs (Tabela 1). Prepare uma solução de estoque HBS 10x e o buffer de trabalho o mais fresco possível; manter refrigerado e usar dentro de um mês. Embora o BSA seja uma alternativa mais barata ao HSA, ele fornece um bloqueio eficiente de lipídios ni-chelating13 e é recomendado para experimentos de alto rendimento.

  1. Prepare uma solução tampão de estoque de 10x de HBS suplementado contendo 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM de glicose, 10 mM CaCl2 e 20 mM MgCl2.
    NOTA: Dissolver MgCl2 é altamente exotérmico e um risco de queimadura. Adicione este sal lentamente e em um grande volume de solvente. Evite preparar soluções concentradas (ou seja, 1 M) desses sais, pois tendem a precipitar com o tempo, dificultando sua adição precisa ao tampão de trabalho.
  2. Filtre a solução de 10x usando uma unidade de filtro de 0,22 μm e mantenha-a estéril a 4 °C.
  3. Para 500 mL de HBS/tem, pegue 50 mL da solução HBS de 10x suplementada, ajuste o pH para 7,4 se necessário e compõe o volume para 483,4 mL com água ultrapura.
  4. Adicione 16,6 mL de solução HSA de 30% aos 483,4 mL de HBS, pH 7.4.
  5. Para 500 mL de HBS/BSA, dissolva 5 g de BSA no HBS e incubar a 37 °C por 30 min. Em seguida, misture suavemente no RT invertendo a garrafa periodicamente até que não haja cristais de proteína visível ou aglomerados.
  6. Filtre a solução resultante da etapa 4.5 usando uma unidade de filtro de 0,22 μm (veja a tabela de materiais) e armazene-a a 4 °C.

5. Calibrações de densidade de proteínas em BSLBs

  1. Antes de tomar as contas de sílica não funcionalizadas de 5,00 ±,05 μm de diâmetro, misture bem a solução de estoque e resuspenque qualquer grande aglomerado de contas sedimentadas na parte inferior dos frascos.
    NOTA: As contas de sílica tendem a sedimentar rapidamente, o que pode levar à contagem de erros. Misture vigorosamente por pipetar para cima e para baixo metade do volume máximo de uma micropipette P1000.
  2. Diluir 1 μL de solução de contas em 1.000 μL de PBS, contar as contas usando uma câmara hemócica e calcular sua concentração por mL.
    NOTA: A coloração azul trypan não é necessária para visualizar contas de sílica.
  3. Calcule o volume de contas de sílica necessárias para 5 × 105 BSLBs finais por ponto da titulação.
  4. Transfira o volume necessário de contas de sílica para um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL estéril.
  5. Lave as contas de sílica três vezes com 1 mL de PBS estéril, centrifugar as contas por 15 s em uma microcentrifuagem de bancada em RT (em rpm fixo).
    NOTA: Ao remover a solução de lavagem, evite perturbar a pelota de contas. Uma pequena coluna tampão não afetará a disseminação dos lipossomos que compõem a mistura de mestre liposomino, pois estes também estão na PBS.
  6. Prepare três volumes da mistura principal lipossosome para montar o BSLB nas contas de sílica lavadas (por exemplo, se o volume total inicial de contas de sílica for de 20 μL, prepare um mínimo de 60 μL da mistura master lipossosome).
  7. Para titulações de mol% de Biotinyl Cap PE
    1. Prepare as misturas de mestre lipídicos contendo diluições de 5 vezes da Tampa Biotinílica PE.
      1. Diluir a 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% em uma matriz 100% DOPC.
      2. Misture cada ponto de titulação de mol% biotinyl Cap PE em uma proporção de 1:1 (vol:vol) com uma solução de 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) de tal forma que um 12,5% final de lipídios contendo Ni esteja presente em todas as titulações.
        NOTA: Os 12,5 mol% (vol:vol%) dos lipídios contendo Ni representam a composição lipídica mista de BSLBs nas quais as proteínas sua marcadas também podem ser testadas em calibrações paralelas. Por exemplo, uma vez que todos os estoques de lipossomo são preparados na mesma concentração molar, para alcançar a mistura de mol% alvo em 200 μL de mix lipossomo final, basta misturar 100 μL de 25 mol% de DGS-NTA contendo Ni com 100 μL de 100% DOPC.
    2. Transfira 5 × 105 contas de sílica lavadas para tubos de microcentrífugo de 1,5 mL, de tal forma que um ponto de titulação de mol% de Biotinyl Cap PE seja montado por tubo.
    3. Adicione as misturas mestres de titulação de mol% biotinyl Cap PE às contas de sílica lavadas e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo metade do volume total. Evite formar bolhas, que em excesso destroem a bicamadas lipídicas.
    4. Adicione gás de argônio (ou nitrogênio) no tubo contendo os BSLBs agora formadores para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.
    5. Adicione Argon aos estoques lipídides de 0,4 mM antes de armazenar e manipule usando uma técnica estéril.
      NOTA: Conecte uma pequena tubulação ao cilindro de gás Argon/Nitrogênio. Antes de adicionar gás aos tubos, ajuste o regulador do cilindro de gás para que a pressão não seja superior a 2 psi. Conecte uma ponta de pipeta estéril à tubulação de saída para direcionar o fluxo de gás para dentro do caldo lipossomo por 5 s e feche rapidamente a tampa. No caso de estoques lipídicos, sele a tampa do tubo com filme de parafina antes de armazená-lo a 4 °C.
    6. Mova os BSLBs para uma batedeira de laboratório vertical de ângulo variável (ver a Tabela de Materiais) e misture por 30 minutos no RT usando uma mistura orbital de 10 rpm.
      NOTA: Esta etapa evitará a sedimentação de contas durante a formação da bicamada lipídica suportada.
    7. Gire as contas por centrifugação para 15 s em RT em uma minicentrifutura de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de HBS/HSA (BSA) para remover o excesso de lipossomos.
    8. Bloqueie os BSLBs formados adicionando 1 mL de 5% de caseína ou 5% de BSA contendo 100 μM de NiSO4 para saturar os locais NTA e 200 nM streptavidin para cobrir todos os locais de ancoragem de biotinas nos BSLBs uniformemente. Misture suavemente por pipetar para cima e para baixo metade do volume total e incubar na batedeira vertical por não mais do que 20 min no RT e 10 rpm.
    9. Gire os BSLBs por centrifugação para 15 s em RT em uma minicentrifutura de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de tampão HBS/HSA (BSA).
      NOTA: Mantenha as contas lavadas verticalmente com um pequeno volume de tampão de lavagem cobrindo os BSLBs. Evite a desidratação dos BSLBs, pois o ar destruirá a bicamadas lipídica.
  8. Para a titulação de proteínas sua marcadas em 12,5 mol% de BSLBs contendo NTA DGS-(Ni
    1. Prepare três volumes de mix de mestre lipossomo contendo um final de 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni).
    2. Use a mistura de mestre lipososome para resuspensar as contas de sílica lavadas e misturar suavemente por pipetar para cima e para baixo metade do volume total. Evite formar bolhas, que em excesso danificam a bicamadas lipídicas.
    3. Adicione gás de argônio (ou nitrogênio) no tubo contendo os BSLBs agora formadores para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.
    4. Adicione Argon aos estoques lipídides de 0,4 mM antes de armazenar e manipule usando uma técnica estéril.
    5. Mova os BSLBs para a batedeira vertical e misture por 30 minutos no RT usando mistura orbital a 10 rpm.
    6. Gire as contas por centrifugação para 15 s em RT em uma minicentrifutura de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de HBS/HSA (BSA) para remover o excesso de lipossomos.
    7. Bloqueie os BSLBs formados adicionando 1 mL de caseína de 5% (ou 5% BSA) contendo 100 μM de NiSO4 para saturar os locais NTA nos BSLBs. Misture suavemente e incubar na batedeira vertical por não mais do que 20 min em RT e 10 rpm.
    8. Lave três vezes usando HBS/HSA (BSA) para remover a solução de bloqueio em excesso.
    9. Em uma nova placa U-bottom 96-well prepare diluições em série de 2 vezes das proteínas.
      1. Prepare uma concentração inicial de 100 nM para a proteína de interesse em um volume total de 200 μL de tampão HBS/HSA (BSA), distribua 100 μL desta solução na primeira coluna e os 100 μL restantes em cima da coluna n2 contendo 100 μL de hbs/hsa (BSA) tampão.
      2. Continue transferindo em série 100 μL da coluna #2 para a coluna #3 e repita conforme necessário para cobrir todos os pontos de titulação. Deixe a última coluna da série sem proteína, pois esta será usada como referência em branco para quantificação.
    10. Resuspenda os BSLBs preparados em um volume de tal forma que 5 × 105 BSLB estão contidos em 100 μL de tampão HBS/HSA (BSA).
    11. Transfira 100 μL da suspensão BSLB para poços de uma segunda placa de 96 poços, de modo que cada poço receba 5 × 105 BSLBs.
    12. Gire a segunda placa contendo BSLBs por 2 min a 300 × g e RT e descarte o supernasce.
    13. Transfira os volumes de 100 μL da placa de titulação proteica para a placa contendo os BSLBs sedimentados. Misture suavemente, evite o excesso de geração de bolhas durante a pipetação e incubar por 30 minutos na RT e 1.000 rpm usando um agitador de placas. Proteja-se da luz com papel alumínio.
    14. Lave a placa três vezes com tampão HBS/HSA (BSA) utilizando etapas de sedimentação de 300 × g por 2 min em RT.
    15. Se a proteína recombinante utilizada na calibração for diretamente conjugada a fluorochromes e tiver valores conhecidos de F/P, proceda à etapa 5.8.20.
    16. Se a proteína recombinante usada na calibração não for rotulada ou conjugada a fluorochromes ou nenhum padrão de contas MESF estiver disponível, use anticorpos Alexa Fluor 488 ou 647 conjugados com valores conhecidos de F/P para manchar o BSLB revestido de proteína.
    17. Mancha com concentrações saturadas de anticorpos de quantificação.
      NOTA: Dependendo do nível de expressão do alvo, estes variam entre 5 e 10 μg/mL.
    18. Mancha por 30 min no RT e 1.000 rpm usando um agitador de placas. Proteger contra a luz usando papel alumínio.
    19. Lave duas vezes com tampão HBS/HSA (BSA) e uma vez com PBS usando etapas de sedimentação de 300 × g por 2 min na RT.
      NOTA: Use PBS, pH 7.4 para resususpensar os BSLBs lavados antes da aquisição. Não utilize tampões contendo proteína, pois isso leva à formação de bolhas durante a mistura automática de amostras com amostradores de alto rendimento.
    20. Adquira os padrões MESF, certificando-se de que os picos mais brilhantes permaneçam na faixa de detecção linear para o detector de quantificação (canal), como mostrado na Figura 1B (vii).
    21. Adquira as amostras manualmente ou usando HTS. Se usar este último, resuspenque BSLBs em 100 μL de PBS e adquira 80 μL usando uma taxa de fluxo entre 2,5 e 3,0 μL/s, um volume de mistura de 100 μL (ou 50% do volume total se o volume de ressuspensão for menor), uma velocidade de mistura de 150 μL/s e cinco misturas para garantir que os BSLBs sejam monodispersados.
    22. Exporte os arquivos FCS.
    23. Concentre-se em eventos únicos para as análises (Figura 2A), pois doublets ou trigêmeos introduzirão erro na determinação. Use a identificação aninhada de eventos únicos conforme indicado na etapa 1.2.3 do protocolo.
    24. Meça o MFI de cada fração MESF (1-4) e subtraia o MFI de contas em branco para extrair MFIs corrigidos (cMFI).
    25. Realize uma análise de regressão linear para extrair a inclinação (b) do MESF sobre o cMFI calculado para as normas MESF, que será utilizada na etapa 5.33.
    26. Extrair o IMfi de cada ponto de titulação e subtrair o MFI de contas sem proteína para obter cMFIs.
    27. Divida os cMFIs com a inclinação calculada na etapa 5.31 para extrair o MESF vinculado aos BSLBs para cada ponto de titulação.
    28. Divida o MESF vinculado aos BSLBs pelo valor F/P do anticorpo de quantificação para extrair o número médio de moléculas ligadas por BSLB.
    29. Utilizando o diâmetro das BSLBs (5,00 ± 0,05 μm), extraia a área da superfície das contas (SA = 4pr2) para calcular as densidades finais de proteína (molec./μm2) por ponto de titulação (concentração proteica).
    30. Realize uma nova análise de regressão da concentração proteica sobre a densidade proteica para calcular a inclinação (b) da linha de melhor ajuste.
      NOTA: A concentração de 12,5% de DGS-NTA(Ni) confere uma capacidade máxima de ancoragem de aproximadamente 10.000 molec./μm210 sem induzir a ativação inespecífica das células T ou afetar a mobilidade lateral dos SLBs.

6. Realizando experimentos de transferência sináptica entre células T e BSLBs

  1. Antes de executar o experimento de transferência sináptica
    1. Adquira BSLBs não fluorescentes, BSLBs com lipídios fluorescentes, células não manchadas (ou contas de compensação; consulte a Tabela de Materiais) e células manchadas de cor única (ou contas de compensação) para identificar as interações de espectro de fluorescência do instrumento. Concentre-se nesses detectores com alta disseminação de respingos para redesenhar o painel policromático, aumentar a sensibilidade e reduzir o erro de medição em detectores críticos (ver 14).
    2. Titular os anticorpos de detecção para encontrar a concentração ideal, permitindo a detecção de eventos positivos sem comprometer a detecção de negativos.
      NOTA: Repita esta etapa sempre que houver uma alteração do lote de anticorpos, pois os valores f/P e o brilho variam de lote para lote.
    3. Opcional: Otimize as tensões pmt adquirindo a amostra em diferentes faixas de tensão (ou seja, uma voltagem caminha) para encontrar os PMTs levando a sinal ideal sobre ruído (ou seja, separação de negativos e positivos, garantindo que o sinal da população mais brilhante permaneça na faixa linear).
  2. Medição da transferência de saída de célula T para BSLBs
    1. Prepare rpmi suplementado 1640 (aqui em meio R10) contendo 10% de soro bovino fetal inativado térmico (FBS), 100 μM aminoácidos não essenciais, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Use r10 médio para cultura e expanda células T.
    2. No primeiro dia, isole as células T das câmaras periféricas do sistema de sangue ou leucoreducção (LRS). Use kits de isolamento e separação de células de imunodensidade (ver a Tabela de Materiais) para enriquecimento das células CD4+ e CD8+ T humanas.
    3. Semear as células em uma concentração final variando entre 1,5 e 2,0 × 106 células/mL, utilizando placas de 6 poços com não mais de 5 mL no total por poço.
    4. Ative as células T usando uma proporção de 1:1 de células T humanas (anti-CD3/anti-CD28) contas magnéticas (veja a Tabela de Materiais) e adicione 100 UI de IL-2 humano recombinante para suportar a proliferação e sobrevivência celular.
    5. No dia 3, remova as contas magnéticas ativantes usando colunas magnéticas (veja a Tabela de Materiais). Certifique-se de que as contas magnéticas permaneçam presas às laterais do tubo antes de recuperar as células para etapas adicionais de lavagem.
    6. Lave as contas magnéticas mais uma vez com 5 mL de meio R10 fresco, misture bem e coloque-as de volta no ímã . Recupere este volume e misture com as células recuperadas na etapa 6.2.5.
    7. Resuspengem as células para 1,5-2 × 106 células/mL em R10 fresco contendo 100 U/mL de IL-2. Reabastecer o meio após 48 h, certificando-se de que a última adição de IL-2 seja de 48 h antes do dia da experimentação (dias 7 a 14 de cultura).
    8. No dia do experimento de transferência sináptica, prepare o meio de ensaio de transferência sináptica (ver Tabela 1) suplementando o meio RPMI 1640 sem fenol com 10% de FBS, 100 μM aminoácidos não essenciais, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Não inclua il-2 humano recombinante.
    9. Conte as células usando manchas azuis de tripano ou exclusão de corrente elétrica e resuspensá-las a uma concentração final de 2,5 × 106 células/mL em média. Se for observada morte celular excessiva (>10%), remova células mortas/moribundas usando uma mistura de polissacarídeo e diatrizoato de sódio (veja a Tabela de Materiais) da seguinte forma:
      1. Camada 15 mL de cultura celular em cima de 13 mL da solução de diatrizoato polissacarídeo-sódio.
      2. Centrifugar por 1.250 × g por 20 min em RT com aceleração mínima e desaceleração. Colete a camada celular (nuvem) na interface entre o meio e a solução de diatrizoato polissacarídeo-sódio.
      3. Lave as células pelo menos duas vezes com o meio de ensaio de transferência sináptica pré-armado (preparado na etapa 6.2.7).
      4. Conte e resuspenge as células para uma concentração final de 2,5 × 106/mL usando o meio de ensaio de transferência sináptica. Cocultura 100 μL desta suspensão celular com BSLBs (ver passo 6.2.15).
    10. Calcular o número de BSLBs necessários para o experimento; considere todas as diferentes misturas mestres de proteínas e titrtações de antígeno a serem testadas (monômeros de HLA/MHC biotinilatos ou anti-CD3ε Fab monogratinilados).
    11. Monte os BSLBs seguindo os mesmos passos da seção 5 do protocolo, mas desta vez, combine todas as titulações de proteínas e lipídios necessários para reconstituir uma membrana APC complexa (Figura 3A). Mantenha o mesmo vol: as relações vol entre o volume inicial de contas de sílica e o volume de mistura de proteínas utilizada durante as calibrações, bem como os tempos e temperaturas utilizados no carregamento de BSLBs. Por exemplo, se 0,5 μL de contas de sílica/bem e 100 μL/bem de mistura de proteína foram usados para a calibração inicial, mantenha as relações de 5:1.000 vol:vol para preparar os BSLBs a serem coculturados com células T.
    12. Uma vez que os BSLBs tenham sido carregados com o mix de proteínas de interesse, lave os BSLBs duas vezes com HBS/HSA (BSA) para remover o excesso de proteínas não ligadas. Use velocidades de sedimentação de 300 × g por 2 min em RT em cada etapa de lavagem e descarte os sobrenantes.
    13. Resuspend os 5 × 105 BSLBs por poço em 200 μL.
    14. Transfira 100 μL por poço para uma nova placa U-bottom de 96 poços para fazer uma duplicata, de tal forma que a quantidade final de BSLB por poço seja de 2,5 × 105.
    15. Gire os BSLBs a 300 × g por 2 min e RT e descarte o supernasce.
    16. Resuspend os BSLBs usando 100 μL de suspensão celular T; misture suavemente para evitar a formação de bolhas.
    17. Incubar as coculturas por 90 min a 37 °C.
      NOTA: Alternativamente, as células e as contas podem ser resuspended no buffer HBS/HSA (BSA) em vez de RPMI livre de Fenol-Vermelho para a cocultura. Neste caso, a incubação deve ser realizada em uma incubadora não-CO2 , pois este gás irá acidificar rapidamente o tampão na ausência de bicarbonato.
    18. Esfrie as coculturas de células BSLB-T incubando as células em RT por um mínimo de 15 minutos. Proteja-os da luz.
    19. Centrifugar as células por 5 min a 500 × g e RT; descartar o supernatante.
    20. Resuspende as células em RT 2% BSA-PBS (Ca2+ e Mg2+-free) para bloqueio. Coloque as células no gelo por 45 minutos. Proteja-se contra a luz.
    21. Ao incubar as células, prepare a mistura mestre de anticorpos usando 0,22 μm filtrado 2% BSA no PBS como um tampão de coloração, que fornecerá um bloqueio extra.
      NOTA: Alguns lotes de anticorpos conjugados a corantes violeta brilhantes tendem a se ligar a BSLBs de forma inpecífica. O bloqueio com 5% de BSA-PBS ajuda a reduzir esse ruído. De agora em diante, certifique-se de manter a corrente fria ininterrupta.
    22. Gire as coculturas a 500 × g para 5 min e 4 °C. Antes de descartar os supernantes, certifique-se brevemente de que a pelota está presente inspecionando a parte inferior da placa de 96 poços usando uma luz de fundo.
    23. Usando uma pipeta multicanal, resuspende as células na mistura mestre de coloração contendo concentrações otimizadas de anticorpos.
      NOTA: Use pontas de pipeta sem filtro para evitar a geração de bolhas e erros na distribuição de volumes de coloração.
    24. Inclua células com rótulo de isótipo e BSLBs, BSLBs fluorescentes e não fluorescentes, e células e BSLBs manchadas sozinhas. Respeite o número total de eventos por poço para todos os controles (ou seja, apenas BSLBs contendo 5 × 105 BSLB/well, e apenas controles celulares contendo 5 × 105 células/poço para evitar um aumento relativo de anticorpos por evento manchado).
    25. Misture suavemente por tubos para cima e para baixo metade do volume e incubar por 30 minutos no gelo. Proteja-se contra a luz.
    26. Lave as células e os BSLBs duas vezes usando 2% de BSA-PBS gelado, pH 7,4 e etapas de sedimentação de 500 × g por 5 min a 4 °C. Resuspentures lavadas em 100 μL de PBS e adquira imediatamente.
    27. Se for necessária a fixação, fixe usando 0,5% c/v de PFA no PBS por 10 minutos, lave uma vez e mantenha em PBS até a aquisição. Proteja-se contra a luz.
    28. Antes da compensação, adquira padrões mesf, garantindo que as populações mais fracas e mais brilhantes caiam na faixa linear de medição.
    29. Adquira amostras de compensação, calcule a compensação e aplique a matriz de compensação (link) ao experimento.
    30. Adquira e economize um mínimo de 2 × 104 padrões totais de MESF para cada um dos canais de quantificação.
    31. Para aquisição usando amostradores de alto rendimento, definir a aquisição do instrumento para o padrão, definir a aquisição de amostra para 80 μL (ou 80% do volume total), taxa de fluxo amostral entre 2,0 e 3,0 μL/s, volume de mistura amostral de 50 μL (ou 50% do volume total para evitar a formação de bolhas durante a mistura), mistura de amostras de 150 μL/s, e mistura por poço entre 3 e 5.
    32. Adquira um mínimo de 1 × 104 BSLBs únicos por amostra (consulte os painéis figura 3B (i)-(vi) para a estratégia de gating de referência).
    33. Lave o cítmetro funcionando por 5 min de uma solução de limpeza seguida de 5 min de água ultrapura antes de desligar o instrumento. Se estiver usando o HTS, siga as opções embaixo da guia HTS e da opção Limpar .
    34. Exportar arquivos FCS.

7. Medindo a transferência sináptica de partículas para BSLB

  1. Abra os arquivos FCS de experimento. Selecione a população de células e BSLBs com base em suas áreas de dispersão de luz lateral e dianteira (SSC-A versus FSC-A), como mostrado na Figura 3B (i).
  2. Selecione os eventos dentro da janela de aquisição contínua (Figura 3B (ii)).
  3. Foco nos eventos únicos de ambas as células e BSLB; identificar células únicas primeiro com base no baixo W nos portões sequenciais FSC-W/FSC-H (singlets-1, painel Figura 3B (iii)) e SSC-W/SSC-H (singlets-2; Painel figura 3B (iv)). Defina um portão singlets-3 adicional selecionando eventos com FSC-A proporcional e FSC-H (Figura 3B, painel (v)).
  4. Extrair o MFI de frações MESF em branco e 1 a 4 e de células únicas e MESF para cada amostra de experimento.
  5. Gerar valores de MFI (cMFI) corrigidos para frações mesf 1 a 4 subtraindo o MFI da população de contas em branco de cada fração.
  6. Gerar cMFIs para BSLBs e células únicas (consulte o painel Figura 3C (i)).
  7. Use o sinal da BSLB manchado com anticorpos de controle de isótipo para corrigir o MFI de BSLB manchado com anticorpos contra os marcadores de células T relevantes. Use cMFI para calcular a porcentagem de transferência sináptica normalizada (NST%) utilizando a equação mostrada no painel Figura 3C (ii).
  8. Se interessados, em vez disso, nas partículas especificamente transferidas em resposta ao acionamento do TCR, subtraia o sinal de BSLBs nulos do MFI de BSLBs agonizantes. Use este cMFI para calcular o NST% orientado pelo TCR usando a equação mostrada no painel Figura 3C (ii).
  9. Se estiver interessado em determinar o número total de moléculas transferidas como carga de partículas através da interface T cell-BSLB, adquira contas de referência MESF usando as mesmas configurações de instrumentos e sessão de aquisição para coculturas T cell-BSLB.
  10. Analisar as populações de contas do MESF e extrair seus CMFIs conforme indicado nas etapas do protocolo 5.8.15 a 5.8.17. Calcule a inclinação da linha de melhor ajuste para a análise de regressão do MESF sobre cMFI.
  11. Use a inclinação calculada para extrair o número de MESF depositado em BSLBs. Use cMFIs calculados usando controles de isótipo ou BSLB nulo como espaços em branco para extrair o número de MESF transferido especificamente para BSLBs estimulantes.
  12. Calcule o número de moléculas de marcadores transferidos para BSLBs dividindo os MESFs calculados (médios) por BSLB pelo valor F/P do anticorpo de quantificação.

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Representative Results

FCM para quantificação absoluta de proteína na superfície celular
A reconstituição de BSLBs apresentando densidades fisiológicas de ligantes requer a estimativa de densidades proteicas totais no subconjunto celular modelado. Para reconstituir os BSLBs, inclua qualquer ligante relevante esperado para desempenhar um papel no eixo de sinalização de interesse ao lado de proteínas que suportem a adesão e interação funcional entre bslb e células, como ICAM-1 e moléculas costimulatórias, por exemplo, receptores CD40, CD58 e B7 (CD80 e CD86). Proteínas adicionais podem ser adicionadas dependendo da questão em questão, incluindo moléculas costimulatórias como ICOSL3, PD-L1 e PD-L215. Para qualquer outra molécula, reconstituir BSLBs usando densidades moleculares determinadas pela análise direta de células com citometria de fluxo quantitativo. Para anticorpos diretamente conjugados, o BioLegend fornece valores F/P para cada número de lote de anticorpos. Os anticorpos também podem ser rotulados internamente e as relações F/P determinadas pela espectrofotometria, proporcionando uma alternativa quando não há anticorpos comerciais conjugados ao fluorocromo desejado. Uma vez que usamos os mesmos anticorpos para calibrar o número de proteínas recombinantes na superfície das células e BSLBs, não há necessidade de corrigir a valência de ligação de anticorpos, pois isso permanece constante. Se for necessária a valência de ligação de anticorpos, use proteínas recombinantes e anticorpos com F/P conhecidos para decorar BSLBs e comparar moléculas de proteínas recombinantes carregadas com o número de anticorpos ligados após a coloração sob condições de saturação.

As moléculas de anticorpos ligados por célula podem ser estimadas usando uma medição citométrica de fluxo monocromático dedicada ou um painel policromático de anticorpos destinados a estimar densidades proteicas absolutas em um subconjunto relativamente pouco frequente de células dentro de um tecido de interesse, como amígdalas palatinas. A Figura 1 mostra como exemplo as medições representativas das densidades do ICAM-1 em células B CXCR5+ e células T foliculares (TFH). Os mesmos princípios de análise de flactologia e citometria de fluxo mostrados na Figura 1A podem ser usados para medir densidades proteicas em células epiteliais, células estrômicas, monócitos, células dendríticas derivadas de monócitos (moDCs), ou em linfócitos B e T em outros tecidos humanos e camundongos. Para tecidos diferentes de sangue e amígdalas, deve-se ter cuidado ao isolar as células que usam coquetéis protease, pois a exposição prolongada das células às enzimas digestíveis reduz os níveis de expressão da superfície celular.

Concentre a aquisição e as análises em células individuais e vivas dentro da janela de aquisição contínua (Figura 1A ii), como eventos fora do tempo contínuo dispersar a luz, comprometendo a quantificação. Para aumentar a precisão das determinações, reduza a coloração inespecífica dos APCs por meio de um bloqueio eficiente de FcγRs. O soro humano e o EDTA presentes no hFCB permitem um bloqueio fcγR eficiente enquanto sequeta ca2+ livre para reduzir a agregação espontânea de células durante sua manipulação e coloração (setas pretas na Figura 1A (iii) e (iv) mostram dobras remanescentes em suspensões de células anúngicos).

Acompanhar o desempenho do instrumento usando as contas de configuração e rastreamento e o software (ou similar; ver a Tabela de Materiais) é fundamental para a reprodutibilidade das quantificações ao longo do tempo, especialmente em etapas posteriores quando a transferência sináptica de partículas para BSLB é medida usando apenas MFIs (ou seja, para fluorochromes para os quais não há padrões MESF). Da mesma forma, verifique a faixa linear (ou seja, linearidade mínima e linearidade máxima) das unidades de fluorescência arbitrária para que o detector de quantificação seja usado junto aos padrões do MESF de tal forma que cada ponto de calibração mantenha a relação linear entre fluorescência e o número de fluorocromes.

A preparação de amostras "em branco" para fluorescência, ou amostras que fornecem uma ideia do ruído de coloração de fundo, são essenciais para subtrair o sinal fluorescente inespecífico. Controles isótipos e/ou amostras biologicamente nulas (por exemplo, nocautes) são essenciais para corrigir o sinal de fundo das células e extrair o verdadeiro sinal derivado dos anticorpos de quantificação (painel Figura 1A (viii)). Da mesma forma, as contas mesf padrão usam uma população em branco dedicada para subtrair o sinal de fundo de cada população de contas verdadeiramente positiva (painéis Figura 1B (vii) e (viii)). Uma vez realizadas as análises de regressão e a inclinação que define a relação entre MESF e OSS corrigidos, a conversão para densidades moleculares absolutas segue operações matemáticas simples (Figura 1C).

Para estimar CSA na Figura 1C, a exclusão da corrente elétrica (CASY-TT) foi utilizada para extrair medidas do volume celular e diâmetro de milhares de células. O CSA resultante estimado a partir do cálculo da área de superfície para esferas (4pr2) varia com o estado de ativação das células, com valores observados de 170,37 ± 4,91 μm2 para células B não ativadas e 234,52 ± 1,53 μm2 e 318 ± 24,45 μm2 para células T não ativadas e ativadas, respectivamente. Estes CSAs são comparáveis aos estimados por técnicas de imagem, como tomografia de índice refrativo tridimensional de linfócitos não ativados16.

Uma vez definida a gama de densidades fisiológicas (por exemplo, comparando densidades superficiais em células submetidas a diferentes programas de ativação), os BSLBs podem ser usados para modelar essas superfícies. Uma titulação de monômeros antigênicos biotinílicos HLA-peptídeos fornecidos pela instalação de tetramer NIH (ou monobiotinilado anti-CD3ε-Fab) pode ser usada ao lado do ICAM-1 12-His para reconstituir uma membrana APC canônica. Proteínas comerciais marcadas com 6, 9, 12 e 14 Sua pode ser usada para decorar a superfície do BSLB (ver Figura 2A para exemplos com ICAM-1 12-His). As titulações proteicas juntamente com as análises quantitativas da FCM fornecem uma metodologia robusta para reconstituir superfícies apc fisiológicas e testar seu efeito na saída sináptica de diferentes subconjuntos de células T.

Para estudar a saída de sinapses de células T, use uma relação celular BSLB-to-T de 1:1 para garantir que, em média, uma célula interaja com um BSLB durante o período estudado. Observamos que a transferência de material é proporcional ao tempo de incubação, fornecendo uma plataforma versátil para detectar moléculas transferidas em baixas quantidades através da interface celular:BSLB. Um design adequado do painel é, portanto, fundamental para aumentar a sensibilidade e a confiabilidade da detecção de material transsintártico, como no caso das televisores, a saída varia entre 25 e 36 vesículas/célula/20 min2,3. Teste primeiro o derramamento espectral de cada anticorpo fluorocromo e lipídio. Quando observada alta repercussão, recomendamos a titulação de anticorpos de coloração e a porcentagem de lipídios fluorescentes que compõem o BSLB, bem como caminhadas de tensão pmt para reduzir o erro de disseminação em amostras compensadas e melhorar o sinal sobre a razão de ruído, respectivamente (consulte para 12,14,17 para uma introdução dedicada ao sujeito).

O uso de controles de quantificação, incluindo BSLBs nulos (sem antígeno ou anti-CD3 Fab) e células eliminatórias ou amostras com rótulo de isótipo18, é essencial para medir com precisão a transferência de tSV efeitoor, como as ESS, bem como partículas de ataque supramolecular liberadas dentro da fenda sinapática. Use proteínas altamente abundantes da superfície celular, como CD4, CD2 ou CD45 ao lado de lipídios fluorescentes sintéticos (conjugados DOPE Atto) para identificar a população de células únicas e BSLB após dissociação de conjugados à base de frio. Concentre as análises na média geométrica ou mediana das intensidades de fluorescência em células únicas de BSLB e (CD4 é usado na Figura 3B). As SEs são um tipo especializado de tSV derivado da membrana plasmática (PM), e sua transferência para BSLB é evidenciada pelo ganho de sinal marcador em BSLBs com a perda consistente de sinal na superfície das células interativas (consulte TCR em BSLBs como mostrado na Figura 2B, setas violetas). BSLBs nulos sem antígeno ou anti-CD3 são uma excelente referência para acompanhar o ganho específico de TCR (e outros marcadores de células T) no BSLB resultantes do estímulo de células interativas através de seu complexo TCR.

Figure 1
Figura 1: Quantificação absoluta de proteínas na superfície dos APCs. (A) Exemplo de medidas quantitativas de citometria de fluxo de ICAM-1 na superfície das células B tonsilár (Foll. Bc) e células T auxiliares (TFH). (i-vii) Estratégia de gating para análise de CXCR5+ Bc e TFH isolados de amígdalas palatinas humanas. Mostrado é a estratégia de gating sequencial para identificar eventos individuais e ao vivo contidos dentro da janela contínua de aquisição. (iii-iv) setas pretas indicam dobras. (viii) histogramas sobrepostos mostrando a expressão da superfície celular de ICAM-1 (histogramas teais) em comparação com os controles FMO (histogramas cinzentos) e controles FMO rotulados com isótipos relevantes (histogramas negros, que se sobrepõem aos histogramas cinzentos) das populações mostradas em (vii). As setas indicam a direção da estratégia de gating aninhada usada para identificar células B CXCR5+ (Bc; CD19+) e TFH (CD4+). (B) A extração de moléculas absolutas na superfície das células tonsilares de MFI requer análises de regressão das contas de referência mesf adquiridas usando o mesmo ajuste de instrumentos que as células mostradas em A. (i-v) Mostrado é a estratégia de gating sequencial para identificar eventos individuais e ao vivo contidos dentro da janela contínua de aquisição. (vi) Gating e medição de MFIs de diferentes populações padrão de MESF. (vii) são histogramas sobrepostos das populações do MESF identificadas em (vi). Os valores apresentados no canto superior direito representam os MFIs para cada uma das 5 populações do MESF (em branco, 1, 2, 3 e 4). (viii) Regressão linear do MESF sobre a CMFI para as populações do MESF mostradas em (vii). Mostrado é a inclinação (b) para extrair MESF vinculado a células a partir de dados em A. (C) Na extração do número de moléculas, siga operações matemáticas simples a partir da aplicação da inclinação calculada em (viii) a partir de mesf cMFI (cMFIM) medido e valores mesf de referência (MESFR). Para extrair o MESF vinculado às células (MESFcells), divida o MFI corrigido de células (cMFIcells) pela inclinação calculada. Em seguida, para calcular o número de moléculas ligadas às células (Molec. células), divida MESFcells pelo F/P do anticorpo de detecção (quantificação). Finalmente, para calcular a densidade molecular na superfície das células (Dcells), divida o Molec. células pela área estimada da superfície celular (CSAE). Abreviaturas: X = variável independente; Y = variável dependente (fluorescência medida), cMFIM = MFIm medido corrigido; MESFR = referência valores MESF; MESFcells = MESF estimado por célula; cMFIcells = células MFI corrigidas; O Molec. células = moléculas estimadas por célula. Dcells = densidade estimada nas células; CSAE = Área estimada da superfície celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Reconstituição de BSLB com ICAM-1 recombinante e a medição da transferência de partículas para BSLBs. (A, i-vi) Análise de citometria de fluxo de BSLBs reconstituídas com densidades aumentadas de ICAM monomérica recombinante ICAM-1 12-His (rICAM-1). (i-v) Como na Figura 1, concentre a estratégia de gating em BSLBs únicos dentro da janela contínua de aquisição. Observe a lacuna imediatamente antes do portão contínuo do tempo, que foi excluído para evitar erros de medição. (vi) A boa qualidade da proteína muitas vezes resulta no revestimento homogêneo de BSLB em altas concentrações, com a observação de distribuições estreitas de fluorescência (baixo Coeficiente de Variação, ver histogramas em vi). (B) Análises de regressão da concentração de referência ICAM-1 (RC) sobre a densidade medida (DM). Use a inclinação para calcular as concentrações-alvo de proteína (CT) para alcançar a densidade de células (Dcells) medida nos experimentos da Figura 1. Abreviaturas: 12-His = 12-histidines tag; DM = densidades moleculares medidas; CR = concentrações de referência do rICAM-1; CT = concentração de alvo (a ser interpolada); Dcells = densidades medidas em células (ver também Fig. 1C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Medição de partículas sinápticas de células T transferidas para BSLBs. (A; i-v) Diagrama de fluxo mostrando os passos críticos para a co-cultivo de células T com BSLBs reconstituindo membranas modelo e a medição subsequente da transferência de partículas com citometria de fluxo. (iv) Os diagramas amarelos azuis e escuros mostram a distribuição relativa e a localização das células e BSLBs em parcelas de citometria de fluxo biparamétrico. v Histogramas de distribuição de fluorescência exibindo o ganho relativo de fluorescência de BSLBs agonísticos (amarelo escuro) em comparação com BSLBs nulos (cinza). (B) Experimento de transferência sináptica exemplar. (i-vi) Mostrado é a estratégia de gating para identificar BSLBs e células únicas dentro da janela de aquisição contínua. Setas violetas indicam a direção da análise, que continua em C. (C) (i) Concentre as análises no MFI de células únicas (azul) e BSLBs únicas (amarelo). (ii) Equações para calcular a transferência sináptica normalizada (NST%, superior) e Tmax% (inferior) do cMFI calculado para BSLB e células. (iii-vi) Histogramas sobrepostos mostrando a mudança das distribuições de intensidade de fluorescência para células (tons azuis) e BSLBs (tons amarelos) em diferentes densidades da célula T ativando anti-CD3ε-Fab, incluindo não ativação (cinza) e ativação com 250 (valor de cor suave) ou 1.000 (alto valor de cor) molec./μm2. Números em diferentes valores de cor representam o NST% medido para os histogramas BSLB mostrados em amarelo. Os histogramas sobrepostos mostram a hierarquia geral na transferência sináptica de vesículas de células T positivas para diferentes marcadores. Para esta composição de BSLBs (200 molec./μm2 de ICAM-1 e densidades crescentes de anti-CD3ε-Fab), as tSVs são transferidas para BSLB com TCR+(iii) > CD81+(iv) > CD4+(v) > CD28+(vi). Como demonstrado em artigos anteriores, TCR e CD81 são componentes das ES e são transferidos com eficiências comparativamente maiores para CD4, apesar deste último ter sido expresso em níveis de superfície relativamente mais altos. O derramamento de SE resulta na perda da superfície celular CD81 e TCR e no ganho desses sinais em BSLBs (setas roxas abertas para 250 molec./μm2, e setas roxas fechadas para 1.000 molec./μm2 em histogramas amarelos). (D) O resfriamento inadequado dos conjugados leva a células que arrancam o SLB de contas de sílica, como visto da comparação de contas de entrada (parcela biparamétrica esquerda) e conjugados submetidos a resfriamento rápido até 4 °C de 37 °C (parcela biparmétrica direita). Compare também com o painel Figura 3B (vi). Abreviaturas: PRF1 = perforin 1; NST% = transferência sináptica normalizada; Tmax% = percentual de transferência máxima observada (em condição de controle ou referência); tSVs: vesículas transsintásticas; SEs: ectosósias sinapáticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tampões utilizados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

Os BSLBs são ferramentas versáteis para estudar a saída de partículas de células T estimuladas com membranas modelo APC. A flexibilidade do método permite a reconstituição de composições complexas e reducionistas da membrana para estudar os efeitos dos ligantes e seus sinais sobre a secreção de tSVs e partículas de ataque supramolecular e seus componentes. Testamos esta tecnologia em várias células T, incluindo TH pré-ativado, CTL, Tregs e CART15. Este protocolo também funciona para a medição da liberação de partículas sinápticas de células T recém-isoladas e quiescentes. Uma limitação do uso de células T recém-isoladas é que essas populações quiescentes produzem um perfil diferente de partículas trans-sinápticas, que se correlaciona com sua composição da superfície celular (ver 15 para mais detalhes).

Como um simples painel de citometria de fluxo, recomendamos o uso de clone anti-TCR IP26, clone anti-CD81 5A6, clone anti-perforina (PRF1) clone B-D48 ou clone anti-CD40L 24-31, e ATTO 390 ou ATTO 565-containing lipídios (para confer BSLBs uma fluorecência intrínseca). Para ajudar a discriminar células únicas de BSLBs e conjugados únicos, recomendamos o uso de clone anti-CD4 OKT4 e/ou anti-CD45 clone HI30, que são transferidos para BSLBs em níveis limitados, apesar de serem expressos em níveis muito altos na superfície celular (ver Tabela de Materiais para obter mais detalhes sobre fluorochromes e outros anticorpos validados). Painéis com maior número de fluorochromes podem ser projetados, mas requerem uma avaliação sistemática do espectro de fluorescência de cada fluorocromo analisado. Para aumentar a sensibilidade, experimente diferentes titulações de anticorpos de quantificação que variam de 0,5 μg a 20 μg/mL final, e repita sempre que novos estoques de anticorpos forem usados. Para garantir a reprodutibilidade das medidas absolutas e relativas da transferência de partículas, titular e calcular a capacidade de ligação de cada novo lote de fosfolipídios biotiningados e ni-contendo, pois podem diferir significativamente de lote a lote. O resfriamento gradual dos conjugados T cell-BSLB é fundamental para aumentar a sensibilidade da detecção de partículas com baixa abundância. O rápido resfriamento das coculturas leva à destruição de BSLBs, como evidenciado pela perda significativa da fluorescência lipídica (Figura 3D).

Diferentes métricas podem ser usadas para medir a saída de partículas de sinapses imunes de células T, dependendo da questão experimental em questão. Por exemplo, quando pequenas diferenças são esperadas nos níveis de expressão da linha de base das proteínas superficiais classificadas em SEs brotantes, uma métrica de transferência sináptica normalizada (NST%) pode ser usada (Figura 3C painel (ii) equação superior). Este último quantifica o sinal percentual de MFI em BSLBs em função do MFI total combinado de células e contas. Uma ressalva dessa abordagem é a análise de marcadores transferidos não expressos na PM, como componentes de partículas de ataque supramolecular19. Como esses elementos chegam aos BSLBs por vias independentes do trânsito da PM, como a exocite da loja intracelular, o cálculo de NST% não é recomendado, pois o resultado será inflado porque o numerador será dividido por um denominador relativamente pequeno (nível de expressão da superfície celular). Em vez disso, use MFIs corrigidos para comparar a deposição de perforina e granzymes entre BSLBs nulos e BSLBs apresentando densidades crescentes de antígeno ou anti-CD3 Fab. Alternativamente, para rastrear elementos intracelulares transferidos para BSLBs, use para comparação as moléculas absolutas estimadas transferidas ou a porcentagem de sinal em relação ao sinal máximo transferido para BSLBs (Tmax%) (Figura 3C painel (ii) equação inferior). Para tmax%, use cMFI ou moléculas medidas na amostra (ou condição) BSLB apresentando a maior densidade de antígeno como a referência Tmax. Ao analisar diferentes doadores, use Tmax específico para comparações. Ao estudar o material transferido em resposta ao acionamento específico do TCR, os MFIs também podem ser corrigidos ao nível de transferência de fundo observado em BSLBs antigênio negativos (nulos).

Estimar o número absoluto de moléculas transferidas para BSLBs é um método mais robusto, pois envolve calibração mesf com a medição de moléculas como ponto final e uma melhor comparação de experimentos independentes. Tmax% oferece uma normalização semelhante entre experimentos independentes e é particularmente útil ao usar FCM policromática para marcadores intracelulares, como perfuração e granzymes, ou para marcadores para os quais não há padrão MESF. Tmax% é simplesmente a porcentagem de sinal em qualquer condição dada à condição com a maior transferência na condição de controle (por exemplo, controles de veículo/não tratados para estudos de drogas, guia de controle RNAs para bibliotecas CRISPR/Cas9). Além disso, o Tmax% pode ser usado tanto para cMFIs quanto para um número absoluto de moléculas e tem sido particularmente útil para as comparações lado a lado dos efeitos das exclusões genéticas na saída sináptica das células T. Este último é evidente quando a edição de genes leva à alta variabilidade no alcance dinâmico da expressão do receptor imunológico entre doadores e experimentos independentes, o que pode impactar medidas absolutas e NST%.

Os BSLBs facilitaram a captura e caracterização da saída sináptica de diferentes tipos de células T, que de outra forma são difíceis de isolar devido à sua rápida internalização por APCs2. A estabilidade física das BSLBs também fornece uma plataforma para a triagem celular ativada pela fluorescência de BSLBs que foram pesquisadas por células T, permitindo assim a caracterização bioquímica de preparações de partículas altamente puras por tecnologias de espectrometria de massa e sequenciamento de ácido nucleico. Este último facilita a caracterização detalhada de mensageiros intercelulares derramados por células T sob uma ampla gama de condições experimentais. Diferentes questões podem ser abordadas, incluindo como esses mensageiros de partículas mudam entre diferentes tipos de células T e estados de ativação, como receptores de antígeno canônicos e não triônicos (ou seja, receptores de antígeno quimérico) e como sinais de membrana agonizante e antagônica influenciam a composição de partículas. Estamos atualmente desenvolvendo essa tecnologia para a caracterização quantitativa de citocinas secretadas na sinapse imune de células T estimuladas. Este último requer o estudo cuidadoso de combinações de receptores e anticorpos de citocinas recombinantes, fornecendo captura eficiente de interleucinas, interferons e quimiocinas depositadas em BSLBs após a ativação celular T. Os BSLBs podem ser adaptados para modelar a composição superficial de outros APCs suspeitos de desencadear a liberação de tSV por células T, como células imunes estrominas e inatas. As BSLBs também podem ser adaptadas para tela de novos compostos farmacológicos que buscam a modulação positiva e negativa do maquinário de secreção exocítico e tSV para o tratamento de câncer e outras patologias. Finalmente, os BSLBs também podem ser usados para descobrir determinantes de virulência modulando a função celular T em doenças infecciosas20.

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Disclosures

Os autores não têm conflito de interesses para declarar.

Acknowledgments

Somos gratos aos nossos membros do laboratório e à comunidade do Instituto Kennedy de Reumatologia por discussões científicas construtivas, especialmente ao nosso gerente de instalações de citometria de fluxo, Jonathan Webber. Este trabalho foi financiado pela Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, o ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) e o Kennedy Trust for Reumatology Research (KTRR) (todos os três para MLD). O PFCD foi apoiado pela EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, em conjunto com a Comissão Europeia (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) e Marie Sklodowska-Curie Actions) e uma Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

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References

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Imunologia e Infecção Problema 182
Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T
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Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

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