Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Подготовка липидных бислоев, поддерживаемых бисером, для изучения выхода твердых частиц иммунных синапсов Т-клеток

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

Здесь мы представляем протокол поэтапного восстановления синтетических антигенпрезентирующих клеток с использованием липидных бислоев, поддерживаемых бисером, и их использование для опроса синаптического выхода из активированных Т-клеток.

Abstract

Антигенпрезентирующие клетки (АПК) представляют три активирующих сигнала для Т-клеток, участвующих в физическом контакте: 1) антиген, 2) костимуляция / корепрессия и 3) растворимые цитокины. Т-клетки высвобождают два вида эффекторных частиц в ответ на активацию: транссинаптические везикулы (tSV) и частицы супрамолекулярной атаки, которые переносят межклеточные мессенджеры и опосредуют цитотоксичность соответственно. Эти сущности быстро усваиваются БТП, участвующими в физическом контакте с Т-клетками, что делает их характеристику сложной. В этой статье представлен протокол для изготовления и использования липидных бислоев с поддержкой бисера (BSLB) в качестве антигенпрезентирующих клеточных (APC) миметиков для захвата и анализа этих транссинаптических частиц. Также описаны протоколы абсолютных измерений плотности белка на клеточных поверхностях, восстановления BSLB с такими физиологическими уровнями и процедуры проточной цитометрии для отслеживания высвобождения синаптических частиц Т-клетками. Этот протокол может быть адаптирован для изучения влияния отдельных белков, сложных смесей лигандов, детерминант вирулентности патогенов и лекарств на эффекторный выход Т-клеток, включая хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, регуляторные Т-клетки и химерные антиген-рецептор-экспрессирующие Т-клетки (CART).

Introduction

Иммунологический синапс (ИС) представляет собой ключевую молекулярную структуру, образованную на границе раздела клеток, участвующих в физическом контакте, которая облегчает регулируемый обмен юкстракриновой информацией. Различные ИС были описаны в литературе, и растущее количество доказательств предполагает, что эти молекулярные центры являются сохраненной особенностью клеточных сетей. Различные иммунные клетки, включая В-клетки, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, макрофаги и Т-клетки, обмениваются информацией посредством сборки короткоживущих контактов1. Мультиомные исследования продвигают понимание новых подмножеств лейкоцитов и стромальных клеток, управляющих патогенными клеточными сетями и экспрессирующих поверхностные белки с неизвестными функциями. Как синтетические ПТР, BSLB позволяют непосредственно исследовать функциональную роль отдельных белков в интеграции активирующих сигналов, а именно антигенов и костимуляции/корепрессии, Т-клетками и результирующего высвобождения эффекторных частиц, называемых сигнальной четверкой.

В этом документе описываются протоколы и критические технические моменты, которые следует учитывать при использовании BSLB для имитации состава поверхности модельных БТР. Протоколы количественного измерения иммунных рецепторов и других поверхностных белков на АПК представлены вместе с протоколом восстановления синтетических АТР, содержащих эти измеренные количества. Затем этапы, необходимые для кокультурирования Т-клеток и BSLB, представлены вместе с протоколом количественного измерения транссинаптического переноса частиц с помощью проточной цитометрии. Наиболее примечательно, что BSLB облегчают изучение популяции tSV, полученных из плазматической мембраны, называемых синаптическими эктосомами (SE). Т-клеточные антигенные рецепторы (TCR+) SE выделяются в ответ на триггер TCR2 и эффективно захватываются BSLBs3, представляя собой отличное считывание для оценки агонистических свойств антигенов и смоделированного состава мембраны. CD63+ экзосомы и частицы супрамолекулярной атаки (SMAP) также высвобождаются стимулированными Т-клетками и захватываются BSLB. Они могут быть использованы в качестве дополнительных показаний активации и результирующей экзоцитарной и литической секреции гранул Т-клетками. Мобилизация экзоцитарных везикул к взаимодействующему полюсу Т-клетки также облегчает направленное высвобождение цитокинов, таких как IL-2, IFN-γ и IL-10 в ответ на активацию4,5,6,7,8. Хотя Т-клеточные высвобождаемые цитокины также могут быть обнаружены на BSLB, в настоящее время разрабатывается более специализированное исследование для подтверждения количественного анализа высвобождения цитокинов в иммунологическом синапсе.

Чтобы выяснить, как специфические мембранные композиции влияют на синаптический выход Т-клеток, необходимо определить физиологическую плотность компонента мембраны-мишени. Количественные оценки белков клеточной поверхности на основе проточной цитометрии являются важным шагом в этом протоколе и требуют: 1) использования антител с известным количеством фторхромов на антитело (F / P) и 2) эталонных шариков, обеспечивающих стандартную ссылку для интерполяции молекул фторхрома из измеренных средних интенсивностей флуоресценции (MFI).

Эти эталонные стандарты состоят из пяти популяций шариков, каждая из которых содержит все большее число эквивалентных растворимых флуорохромов (MESF), которые охватывают динамический диапазон произвольного обнаружения флуоресценции. Эти стандартные популяции дают дискретные пики флуоресценции, облегчая преобразование произвольных флуоресцентных единиц в MESF путем простой линейной регрессии. Полученные MESF затем используются вместе со значениями F/P антител для расчета среднего числа связанных молекул на клетку (или BSLB на более поздних этапах). Применение оценочных площадей поверхности клеток к среднему числу обнаруженных молекул позволяет рассчитать физиологические плотности в виде молекул/мкм2. Этот протокол количественной оценки также может быть адаптирован для измерения плотности белка на Т-клетках и биохимического восстановления мембранных композиций, опосредующих образование гомотипических синапсов Т-клеток (т.е. Т-Т-синапсов9). При необходимости валентность связывания антител может быть дополнительно оценена с помощью рекомбинантных мишеней, меченных известным количеством фторхромов на молекулу. Затем валентность, связывающая антитела, может быть рассчитана для одной и той же популяции BSLB путем одновременного сравнения количества связанных флуоресцентных белков и количественных антител (с использованием двух различных стандартов количественной оценки фторхромов и MESF).

Восстановление мембран APC требует сборки поддерживаемых липидных бислоев (SLB) на бисерах кремнезема1. Запасы липосом, содержащие различные виды фосфолипидов, могут быть использованы для формирования универсальной липидно-двухслойной матрицы, позволяющей закреплять рекомбинантные белки с различной химией связывания (получение липосом подробно описано в 10). Как только физиологическая плотность (или плотности) соответствующего лиганда «на клетках» определена, тот же протокол проточной цитометрии адаптируется для оценки концентрации рекомбинантного белка, необходимой для покрытия BSLB целевой физиологической плотностью. Две различные анкерные системы могут использоваться как в комбинации, так и по отдельности.

Во-первых, SLB, содержащий конечные 12,5 моль% Ni2+-содержащих фосфолипидов, достаточен для обеспечения примерно 10 000 сайтов связывания His-tag на квадратный микрон10 и хорошо работает для украшения BSLB большинством коммерчески доступных белков, физиологическая плотность которых не превышает эту максимальную нагрузочную способность. Вторая система загрузки использует биотинсодержащие фосфолипиды (в виде моля%) для загрузки биотинилированных анти-CD3e Fab (или мономеров HLA / MHC) через мосты стрептавидина. Комбинация этих двух методов декорирования BSLB позволяет гибко адаптировать BSLB как синтетические БТР. Для очень сложных поверхностных композиций APC моль% фосфолипидов и белков может быть увеличен для загрузки столько белков, сколько требуется для рассматриваемого вопроса. После определения рабочих концентраций белков и моль% биотинилированных фосфолипидов BSLB могут быть собраны для опроса синаптического выхода Т-клеток с помощью многопараметрической проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Измерение плотности белков поверхности клеток с помощью количественной проточной цитометрии

  1. Получают 0,22 мкм-фильтрованный буфер проточной цитометрии человека (hFCB), добавляя ЭДТА (к конечной концентрации 2 мМ) и сыворотку AB человека (до последних 10%) к стерильному фосфат-буферному физиологическому раствору (PBS), pH 7,4 (см. Таблицу 1). Отфильтруйте раствор с помощью порового фильтра 0,22 мкм для удаления сывороточных примесей и храните при температуре 4 °C.
  2. Восстанавливают клетки и откладывают их центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
  3. Дважды промыть ячейки PBS. На каждой стадии промывки повторно суспендируйте ячейки в PBS до исходного объема (до центрифугирования) и открутите вниз при 300 × g в течение 5 мин при RT.
  4. Подсчитайте суспензии клеток трипана, окрашенных синим цветом, в гемоцитометре11. В качестве альтернативы можно подсчитывать ячейки, используя исключение электрического тока. Для последнего следуйте инструкциям производителя CASY-TT (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Счетчик клеток CASY-TT позволяет определить процент жизнеспособных клеток, размер клеток и объем клеток.
  5. Рассчитайте объем PBS, содержащий разбавление 1:1000 красителя для фиксации жизнеспособности eFluor 780 или аналогичного (см. Таблицу материалов), необходимого для повторного суспендирования клеток до концентрации окрашивания 107 клеток/мл.
  6. Повторно суспендируют клетки с помощью раствора жизнеспособности красителя PBS и инкубируют на льду в течение 30 мин.
  7. Удалите краситель жизнеспособности, добавив один объем ледяного hFCB. Открутите при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне держите холодовую цепь непрерывной.
  8. Промыть клетки hFCB, содержащим 1:50 разбавлением раствора для блокировки fc-рецепторов (см. Таблицу материалов). Доведите объем до конечной концентрации 107 клеток/мл и инкубируйте в течение дополнительных 15 минут для достижения эффективной блокировки FcgR.
  9. Распределите 100 мкл клеточной суспензии (т.е. 106 ячеек) на лунку U-нижней или V-нижней 96-луночной пластины. Держите ячейки на льду и защищенными от света (накройте алюминиевой фольгой).
  10. Приготовьте смесь антител в hFCB, определив оптимальные концентрации антител для каждого фторхром-конъюгированного антитела и, самое главное, для тех антител, которые используются для определения плотности поверхностного белка. Например, для количественной оценки экспрессии ICAM-1 на популяциях тонзиллярных клеток, как показано на фиг.1, готовят смесь, содержащую 1:200 разведений анти-CD4, анти-CD19 и анти-CXCR5 вместе с насыщенными концентрациями анти-ICAM-1 известными фторхромами AF647 на антитело (т.е. 10 мкг/мл, что было определено независимыми экспериментами по титрованию антител).
  11. В качестве дополнительного контроля готовят мастер-смесь антител, содержащую соответствующие контрольные изотипы антител (в тех же эффективных концентрациях, что и их аналоги, конъюгированные с теми же фторхромами для фонового вычитания), т.е. используют 10 мкг/мл соответствующего контроля изотипа AF647.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном выше примере такой элемент управления изотипом используется для вычитания фоновой флуоресценции из истинного сигнала ICAM-1 на ячейках.
  12. При количественной оценке плотности белка на подмножествах клеток, присутствующих на низких частотах в тканях, подготовьте флуоресцентные минус один (FMO) контрольные элементы, содержащие все окрашивающие антитела, за исключением маркеров, представляющих интерес (см. дополнительные сведения в 12).
  13. Раскрутите 96-луночную пластину, содержащую клетки, при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 50 мкл либо мастер-смеси антител количественной оценки, либо смеси мастер-смеси антител изотипа.
  14. Инкубируйте клетки в течение не менее 30 мин при 4 °C и 400 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите пластины от света (накройте алюминиевой фольгой).
  15. Промыть ячейки три раза с помощью hFCB и центрифуги при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  16. Повторно суспендировать клеточную гранулу с использованием 200 мкл PBS (т.е. до конечной концентрации 5 × 106 клеток/мл).
  17. Для приобретения:
    1. При использовании стандартного погрузчика BD FACS перенесите образцы на полистирольные трубки круглого дна объемом 5 мл (см. Таблицу материалов).
    2. При использовании высокопроизводительных пробоотборников (HTS, также называемых считывателями пластин), немедленно перейдите к шагу 1.19.
  18. Прежде чем приступить к сбору данных для стандартов MESF, проверьте максимальную линейность интенсивности флуоресценции и минимальные пределы для каналов количественной оценки.
  19. Перед компенсацией получите данные для стандартов MESF, гарантируя, что как самые тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон измерений.
  20. Приобретите компенсационные образцы. Сохраняйте значения напряжения фотоумножителя (PMT) для каналов количественной оценки неизменными, чтобы сохранить динамический диапазон обнаружения. Выполните небольшие корректировки напряжения PMT других каналов перед расчетом компенсационных матриц.
  21. Рассчитайте и примените компенсацию.
  22. Приобретите и сохраните не менее 2 × 104 бусин MESF для каждого из каналов количественной оценки.
  23. Выберите популяцию одиночных ячеек на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A и FSC-A, соответственно, как показано на рисунке 1A (i)), с последующим выбором событий внутри временного континуума (рисунок 1A (ii)) и низких для времени полета (W) как в FSC, так и в SSC по сравнению с их высотой (т.е. FSC-W/FSC-H, за которым следует SSC-W/SSC-H, как показано на рисунке 1A (iii) и (iv), соответственно). Определите конечный шлюз с одним событием, содержащий события с пропорциональным распределением FSC-A и FSC-H (рисунок 1A (v)).
  24. Получение контрольных образцов (isotype-labeled и FMO controls).
  25. Извлекайте образцы и записывайте до тех пор, пока не будет получено не менее 10 000 клеток-мишеней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: надежное определение средней молекулярной плотности требует анализа нескольких доноров в независимых экспериментах. Это имеет решающее значение при анализе подмножеств клеток, обнаруженных на пониженных частотах или полученных из дефицитного биологического материала (например, из биопсии тканей человека).
  26. Промыть работающий цитометр в течение 5 минут чистящим раствором FACS, а затем 5 минут сверхчистой водой перед выключением прибора. Если вы используете HTS, следуйте параметрам на вкладке HTS и программа Clean Plate.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить перенос пробы в образец, активируйте опции промывки сидячего (пробоотборника) или высокопроизводительного пробоотборника , которые будут автоматически промывать цитометр между трубками или скважинами. Перед началом сбора пропустите сверхчистую воду в течение 10 минут с высокой скоростью потока, чтобы удалить любые немытые биологические загрязнения из линии отбора проб цитометра.
  27. Экспортируйте файлы стандарта проточной цитометрии (FCS).

2. Регрессионный анализ средней (или медианной) интенсивности флуоресценции (MFI) MESF

  1. Откройте программное обеспечение для анализа проточной цитометрии и загрузите файлы FCS эксперимента. Выберите популяцию бусин на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A против FSC-A), как показано на рисунке 1A (i).
  2. Контролируйте качество данных путем проверки распределения единичных событий по времени, как указано в шаге 1.24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки создают пробелы в распределении событий по времени; обычно это проявляется в начале приобретения с использованием HTS. Избегайте выбора событий, обрамляющих пробелы во времени сбора, поскольку они добавляют погрешности измерения из-за оптических аберраций.
  3. Сосредоточьтесь на отдельных событиях.
    1. Клетки
      1. сначала определите одиночные ячейки на основе их распределения SSC-A и FSC-A (рисунок 1A (i)), а затем события низкого уровня для W в последовательных затворах FSC-W/FSC-H (синглеты-1, рисунок 1A панель (iii)) и SSC-W/SSC-H (синглеты-2; Рисунок 1А панель (iv)). Определите дополнительный затвор singlets-3, выбрав события с пропорциональными FSC-A и FSC-H (рисунок 1A, панель (v)). Наконец, идентифицируйте живые клетки как отрицательные для поправимого красителя жизнеспособности.
    2. Бусины MESF
      1. Следуйте той же дискриминации синглетов-1 к синглетам-3, что и на этапе 2.3.1.1 (рисунок 1В, панели i)-v)). Определите каждую из популяций MESF (пустые, 1, 2, 3 и 4) на основе их уровней интенсивности флуоресценции (см. Рисунок 1B, панель (vi)).
  4. Извлеките из МФО фракции MESF заготовки и от 1 до 4.
  5. Генерация скорректированных значений MFI (cMFI) для фракций MESF от 1 до 4 путем вычитания MFI пустой популяции бусин из каждой дроби.
  6. Рассчитайте строку, наиболее подходящую для связи между cMFI и значениями MESF, предоставленными поставщиком (независимая переменная, пустая дробь равна нулю).
  7. Извлеките наклон (b в уравнении ниже) линейной регрессии MESF над cMFI (на панели (viii) на рисунке 1B показана регрессия, в которой y = a + bx; с a = 0).
  8. Извлеките среднюю (для бимодальных флуоресцентных распределений) или среднюю (для нормальных или логарифмических флуоресцентных распределений) интенсивность флуоресценции из интересующих популяций (TFH и B-элементы на рисунке 1A панели (vii)).
  9. Как и на этапах 2.5-2.7, извлеките значения MFI из контрольных ячеек, меченных изотипом.
  10. Если F/P контроля изотипа совпадает с антителами количественной оценки, исправьте МФО окрашенных клеток, вычитая МФО из клеток, меченных изотипом.
  11. Если F/P изотипов отличается от F/P антител количественной оценки, извлеките MESF из изотипов путем деления МФУ меченых изотипами клеток с наклоном, рассчитанным на этапе 2.7. Вычтите изотип MESF из количественной оценки MESF перед оценкой связанных количественных антител.
  12. Разделите MESF на F/P антител количественной оценки, чтобы оценить количество связанных молекул на клетку (Molec. ячейки , как показано на блок-схеме рисунка 1С).
  13. Разделите число связанных молекул с расчетной площадью поверхности клетки (CSA (мкм2)), чтобы извлечь плотность белков в виде молекулы/мкм2 (рисунок 1C). Для получения более подробной информации обратитесь к разделу репрезентативных результатов.

3. Функциональные виды фосфолипидов для использования при калибровке белкового покрытия BSLBs

  1. Используйте 0,4 мМ DOPC (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин) в качестве основного компонента липидного матрикса, образующего поддерживаемый липидный бислой. Разбавьте все другие виды липидов в этом растворе DOPC.
  2. Используйте от 0,2 до 1 моль% 0,4 мМ DOPE (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-фосфоэтаноламина), конъюгированного с красителями, включая ATTO 390, 488 или 565 (см. Таблицу материалов), для получения BSLB с внутренней флуоресценцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя флуоресценция BSLB облегчает идентификацию отдельных BSLB и отдельных клеток в экспериментах по синаптикальному переносу.
  3. Используйте 12,5 моль% от 0,4 мМ DGS-NTA(Ni) (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусная кислота) сукцинил]) для закрепления помеченных His белков. Держите моль% DGS-NTA(Ni) постоянным и выполняйте 2-кратное титрование помеченных His белков, начиная со 100 нМ в качестве самой высокой концентрации. Оставьте одно состояние без белка в качестве отрицательного контроля для абсолютных количественных показателей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вспомогательные сигналы и молекулы адгезии, такие как ICAM-1, разработаны с меткой 12-His для увеличения сродства белка к DGS-NTA(Ni).
  4. Используйте Biotinyl Cap PE (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(cap biotinyl)) для закрепления биотинилированных белков через мосты биотин-стрептавидин-биотин. Используйте 5-кратное последовательное титрование 0,4 мМ Biotinyl Cap PE, покрывающее от 10 моль% до 0 моль% (в качестве отрицательного контроля). Поддерживайте концентрацию стрептавидина и биотинилированных белков постоянной (200 нМ) как в калибровочных экспериментах, так и при восстановлении синтетических АТР для экспериментов по синаптикальному переносу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регрессионный анализ эмпирических плотностей биотинилированных белков над конечным моль% биотинилового полиэтилена в липидной матрице (также содержащей DGS-NTA(Ni) для закрепления помеченных His белков) определит моль%, который будет использоваться для восстановления целевой плотности антигена.

4. Получение дополнительного буферного физиологического раствора HEPES, содержащего 1% сывороточного альбумина

ПРИМЕЧАНИЕ: Добавленный HEPES-буферный физиологический раствор, содержащий 1% сывороточного альбумина человека (HBS/HSA) или 1% бычьего сывороточного альбумина (HBS/BSA), необходим на этапах промывки и загрузки белка BSLB (таблица 1). Подготовьте 10-кратный раствор HBS и рабочий буфер как можно более свежими; хранить в холодильнике и использовать в течение одного месяца. Хотя BSA является более дешевой альтернативой HSA, он обеспечивает эффективную блокировку ni-хелатирующих липидов13 и рекомендуется для экспериментов с высокой пропускной способностью.

  1. Приготовьте 10-кратный запасной буферный раствор дополненного HBS, содержащий 200 мМ HEPES, 7 мМ Na2HPO4, 1400 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 60 мМ глюкозы, 10 мМ CaCl2 и 20 мМ MgCl2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворение MgCl2 является высокоэкзотермическим и опасным для ожога. Добавляйте эту соль медленно и на большой объем растворителя. Избегайте приготовления концентрированных растворов (т.е. 1 М) этих солей, поскольку они имеют тенденцию выпадать в осадок с течением времени, что затрудняет их точное добавление к рабочему буферу.
  2. Отфильтруйте 10-кратный раствор с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм и держите его стерильным при 4 °C.
  3. Для 500 мл HBS /has, возьмите 50 мл дополненного 10x раствора HBS, отрегулируйте рН до 7,4, если это необходимо, и увеличьте объем до 483,4 мл сверхчистой водой.
  4. Добавьте 16,6 мл 30% раствора HSA к 483,4 мл HBS, рН 7,4.
  5. Для 500 мл HBS/BSA растворить 5 г BSA в HBS и инкубировать при 37 °C в течение 30 мин. Затем осторожно перемешайте при RT, периодически переворачивая бутылку, пока не появятся видимые кристаллы белка или сгустки.
  6. Фильтруйте полученный раствор с этапа 4,5 с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) и храните его при 4 °C.

5. Калибровка плотности белка на BSLB

  1. Перед тем, как взять нефункционализированные кварцевые шарики диаметром 5,00 ±0,05 мкм, хорошо перемешайте запасной раствор и повторно суспендируйте любые большие скопления бусин, осажденных на дне колб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кварцевые шарики имеют тенденцию быстро оседать, что может привести к ошибкам подсчета. Энергично перемешивайте, пипетируя вверх и вниз половину максимального объема микропипетки P1000.
  2. Разбавьте 1 мкл бисерного раствора в 1000 мкл PBS, подсчитайте шарики с помощью камеры гемоцитометра и рассчитайте их концентрацию на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание трипанов в синий цвет не требуется для визуализации бисер кремнезема.
  3. Рассчитайте объем кварцевых шариков, необходимых для 5 × 105 конечных BSLB на точку титрования.
  4. Перенесите необходимый объем шариков кремнезема в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  5. Трижды вымойте шарики кремнезема 1 мл стерильного PBS, центрифугируйте шарики в течение 15 с на настольной микроцентрифуге на RT (при фиксированных оборотах).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении моющего раствора не нарушайте гранулу бусины. Небольшой буферный столбец не повлияет на распространение липосом, составляющих мастер-микс липосом, поскольку они также находятся в PBS.
  6. Подготовьте три тома липосомной смеси для сборки BSLB на промытых кварцевых шариках (например, если начальный общий объем бисер кремнезема составляет 20 мкл, приготовьте минимум 60 мкл мастер-смеси липосом).
  7. Для титрования биотиниловых колпачков PE моль%
    1. Приготовьте липидные мастер-смеси, содержащие 5-кратные разведения Биотинилкап ПЭ.
      1. Разбавляют 0,4 мМ биотиниловый колпачок ПЭ моль% в 100% DOPC матрице.
      2. Смешайте каждую точку титрования Biotinyl Cap PE mol% в соотношении 1:1 (об/об)с раствором 0,4 мМ 25% DGS-NTA(Ni) таким образом, чтобы во всех титровании присутствовали конечные 12,5 моль% Ni-содержащих липидов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 12,5 моль% (об.:об.%) Ni-содержащих липидов представляют собой смешанный липидный состав BSLB, на котором his-меченые белки также могут быть протестированы в параллельных калибровках. Например, поскольку все запасы липосом получают в одной и той же молярной концентрации, чтобы достичь целевой моль% смеси в 200 мкл окончательной смеси липосом, просто смешайте 100 мкл 25 моль% Ni-содержащего DGS-NTA со 100 мкл 100 моль% DOPC.
    2. Переложите 5 × 105 промытых шариков кремнезема в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл таким образом, чтобы на каждую трубку собиралась одна точка титрования Биотинильного колпачка ПЭ моль%.
    3. Добавьте мастер-смеси для титрования Biotinyl Cap PE mol% в промытые шарики кремнезема и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Избегайте образования пузырьков, которые в избытке разрушают липидный бислой.
    4. Добавьте газ аргон (или азот) в трубку, содержащую образующиеся BSLB, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
    5. Добавьте аргон в запасы липидов 0,4 мМ перед хранением и манипулируйте используя стерильную технику.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подключите небольшую трубку к газовому баллону с аргоном/азотом. Перед добавлением газа в трубки отрегулируйте регулятор газового баллона так, чтобы давление было установлено не выше 2 фунтов на квадратный дюйм. Подключите стерильный наконечник пипетки к выходной трубке, чтобы направить поток газа внутрь липосомного материала на 5 с и быстро закрыть крышку. В случае липидных запасов закройте крышку трубки парафиновой пленкой перед хранением при температуре 4 °C.
    6. Переместите BSLB в вертикальный лабораторный смеситель с переменным углом наклона (см. Таблицу материалов) и перемешивайте в течение 30 минут на RT, используя орбитальное смешивание 10 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап предотвратит осаждение шариков во время образования поддерживаемого липидного бислоя.
    7. Раскрутите шарики центрифугированием в течение 15 с в RT на настольной мини-центрифуге, а затем трижды промыть 1 мл HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние липосомы.
    8. Блокируют образующиеся BSLB путем добавления 1 мл 5% казеина или 5% BSA, содержащего 100 мкМ NiSO4 для насыщения участков NTA и 200 нМ стрептавидина для равномерного покрытия всех биотиновых анкеровочных участков на BSLB. Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину общего объема, и инкубируйте в вертикальном смесителе не более 20 мин при RT и 10 об/мин.
    9. Раскрутите BSLB путем центрифугирования в течение 15 с на RT на настольной миницентрифуге, а затем трижды промыть 1 мл буфера HBS/HSA (BSA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите промытые бусины вертикально с небольшим объемом промывочного буфера, покрывающего BSLB. Избегайте обезвоживания BSLB, так как воздух разрушит липидный бислой.
  8. Для титрования his-меченых белков на 12,5 моль% DGS-(Ni)NTA-содержащих BSLB
    1. Приготовьте три тома липосомной мастер-смеси, содержащей конечные 12,5 моль% DGS-NTA(Ni).
    2. Используйте липосомную смесь, чтобы повторно суспендировать промытые шарики кремнезема и аккуратно перемешать, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Избегайте образования пузырьков, которые в избытке повреждают липидный бислой.
    3. Добавьте газ аргон (или азот) в трубку, содержащую образующиеся BSLB, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
    4. Добавьте аргон в запасы липидов 0,4 мМ перед хранением и манипулируйте используя стерильную технику.
    5. Переместите BSLB в вертикальный смеситель и перемешивайте в течение 30 минут на RT, используя орбитальное смешивание при 10 оборотах в минуту.
    6. Раскрутите шарики центрифугированием в течение 15 с в RT на настольной мини-центрифуге, а затем трижды промыть 1 мл HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние липосомы.
    7. Блокируют образующиеся BSLB путем добавления 1 мл 5% казеина (или 5% BSA), содержащего 100 мкМ NiSO4 , для насыщения NTA-сайтов на BSLB. Осторожно перемешайте и инкубируйте в вертикальном смесителе не дольше 20 мин при RT и 10 об/мин.
    8. Промыть три раза, используя HBS/HSA (BSA), чтобы удалить лишний блокирующий раствор.
    9. В новой U-нижней 96-луночной пластине готовят 2-кратное серийное разведение белков.
      1. Подготовьте начальную концентрацию 100 нМ для интересующего белка в общем объеме 200 мкл буфера HBS/HSA (BSA), распределите 100 мкл этого раствора в первой колонке, а оставшиеся 100 мкл поверх колонки No2, содержащей 100 мкл буфера HBS/HSA (BSA).
      2. Продолжайте последовательно передавать 100 мкл из колонки No 2 в колонку No 3 и повторяйте по мере необходимости, чтобы охватить все точки титрования. Оставьте последний столбец серии без белка, так как он будет использоваться в качестве пустой ссылки для количественной оценки.
    10. Повторно суспендировать подготовленные BSLB в объеме таким образом, чтобы 5 × 105 BSLB содержались в 100 мкл буфера HBS/HSA (BSA).
    11. Перенесите 100 мкл суспензии BSLB в скважины второй U-нижней 96-луночной плиты таким образом, чтобы каждая скважина получала 5 × 105 BSLB.
    12. Открутите вторую пластину, содержащую BSLB, в течение 2 мин при 300 × г и RT и выбросьте супернатант.
    13. Перенесите объемы 100 мкл с пластины титрования белка на пластину, содержащую осажденные BSLB. Осторожно перемешайте, избегайте образования избыточных пузырьков во время пипетки и инкубируйте в течение 30 мин при RT и 1000 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите от света алюминиевой фольгой.
    14. Промыть пластину три раза буфером HBS/HSA (BSA), используя ступени осаждения 300 × г в течение 2 мин при RT.
    15. Если рекомбинантный белок, используемый при калибровке, непосредственно конъюгирован с фторхромами и имеет известные значения F/P, перейдите к шагу 5.8.20.
    16. Если рекомбинантный белок, используемый при калибровке, не маркирован или конъюгирован с фторхромами или нет стандарта MESF, используйте Alexa Fluor 488 или 647-конъюгированные антитела с известными значениями F / P для окрашивания BSLB с белковым покрытием.
    17. Окрашивание с насыщенными концентрациями количественных антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целевого уровня экспрессии они варьируются от 5 до 10 мкг/мл.
    18. Окрашивание в течение 30 мин при RT и 1000 об/мин с помощью пластинчатого шейкера. Защитите от света с помощью алюминиевой фольги.
    19. Дважды промывайте буфером HBS/HSA (BSA) и один раз PBS, используя ступени осаждения 300 × г в течение 2 мин при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PBS, pH 7.4 для повторного суспендирования промытых BSLB перед приобретением. Не следует использовать буферы, содержащие белок, так как это приводит к образованию пузырьков при автоматическом смешивании образцов с высокопроизводительными пробоотборниками.
    20. Приобретите стандарты MESF, убедившись, что самые яркие пики остаются в линейном диапазоне обнаружения для детектора количественной оценки (канала), как показано на рисунке 1B (vii).
    21. Приобретайте образцы вручную или с помощью HTS. При использовании последнего повторно суспендируют BSLB в 100 мкл PBS и приобретают 80 мкл, используя скорость потока от 2,5 до 3,0 мкл/с, объем смешивания 100 мкл (или 50% от общего объема, если объем повторного суспендирования меньше), скорость смешивания 150 мкл/с и пять смесей для обеспечения монодисперсирования BSLB.
    22. Экспортируйте файлы FCS.
    23. Сосредоточьтесь на единичных событиях для анализа (рисунок 2A), так как дублеты или триплеты внесут ошибку в определение. Используйте вложенную идентификацию отдельных событий, как указано на этапе 1.2.3 протокола.
    24. Измерьте МФО каждой фракции MESF (1-4) и вычтите MFI из пустых шариков для извлечения скорректированных MFI (cMFI).
    25. Выполнить линейный регрессионный анализ для извлечения уклона (b) MESF над cMFI, рассчитанным для стандартов MESF, который будет использоваться на этапе 5.33.
    26. Извлеките МФО из каждой точки титрования и вычтите МФО бусин без белка для получения цМФИ.
    27. Разделите cMFI на наклон, рассчитанный на шаге 5.31, чтобы извлечь MESF, привязанный к BSLB для каждой точки титрования.
    28. Разделите MESF, связанный с BSLB, на значение F/P количественного антитела для извлечения среднего числа молекул, связанных на BSLB.
    29. Используя диаметр BSLB (5,00 ± 0,05 мкм), извлеките площадь поверхности шарика (SA = 4pr2) для расчета конечной плотности белка (молек./мкм2) на точку титрования (концентрацию белка).
    30. Выполните новый регрессионный анализ концентрации белка над плотностью белка , чтобы рассчитать наклон (b) линии наилучшего соответствия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация 12,5 моль% DGS-NTA(Ni) обеспечивает максимальную анкерную способность приблизительно 10 000 молек/мкм210 без индуцирования неспецифической активации Т-клеток или влияния на боковую подвижность SLB.

6. Проведение экспериментов по синаптическому переносу между Т-клетками и BSLB

  1. Перед запуском эксперимента по синаптическому переносу
    1. Приобретайте нефлуоресцентные BSLB, BSLB с флуоресцентными липидами, неокрашенные клетки (или компенсационные шарики; см. Таблицу материалов) и одноцветные окрашенные ячейки (или компенсационные шарики) для идентификации взаимодействий флуоресцентного спектра прибора. Сосредоточьтесь на детекторах с высоким распространением побочных эффектов, чтобы перепроектировать полихроматическую панель, повысить чувствительность и уменьшить погрешность измерения на критических детекторах (см. 14).
    2. Титруйте антитела для обнаружения, чтобы найти оптимальную концентрацию, позволяющую обнаруживать положительные события без ущерба для обнаружения отрицательных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте этот шаг всякий раз, когда изменяется партия антител, поскольку значения F / P и яркость варьируются от партии к партии.
    3. Дополнительно: Оптимизируйте напряжения PMT путем получения образца в различных диапазонах напряжения (т. Е. Напряжение идет), чтобы найти PMT, ведущие к оптимальному сигналу над шумом (т. Е. Разделение отрицательных и положительных при обеспечении того, чтобы сигнал самой яркой популяции оставался в линейном диапазоне).
  2. Измерение передачи выхода Т-клеток на BSLB
    1. Готовят препарат RPMI 1640 (в настоящем описании среды R10), содержащий 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мкМ заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Используйте среду R10 для культивирования и расширения Т-клеток.
    2. На 1-й день выделяют Т-клетки из камер периферической крови или системы лейкоредукции (LRS). Используйте наборы для изоляции и разделения клеток иммуноденции (см. Таблицу материалов) для обогащения человеческих CD4+ и CD8+ Т-клеток.
    3. Посейте клетки в конечной концентрации в диапазоне от 1,5 до 2,0 × 106 клеток/мл, используя пластины из 6 лунок с общим количеством не более 5 мл на лунку.
    4. Активируйте Т-клетки, используя соотношение 1:1 активации Т-клеток человека (анти-CD3 / анти-CD28) магнитных шариков (см. Таблицу материалов) и добавьте 100 МЕ рекомбинантного человеческого IL-2 для поддержки пролиферации и выживания клеток.
    5. На 3-й день снимите активирующие магнитные шарики с помощью магнитных колонок (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что магнитные шарики прикреплены к боковым сторонам трубки, прежде чем восстанавливать ячейки для дополнительных этапов промывки.
    6. Вымойте магнитные шарики еще раз 5 мл свежей среды R10, хорошо перемешайте и положите их обратно в магнит. Восстановите этот объем и смешайте с клетками, восстановленными на шаге 6.2.5.
    7. Повторно суспендировать клетки до 1,5-2 × 106 клеток/мл в свежем R10, содержащем 100 Ед/мл IL-2. Пополняют среду через 48 ч, следя за тем, чтобы последнее добавление ИЛ-2 было за 48 ч до дня экспериментирования (дни с 7 по 14 посева).
    8. В день эксперимента по синаптическому переносу подготовьте среду Synaptic Transfer Assay (см. Таблицу 1), добавив среду RPMI 1640 без фенола 10% FBS, 100 мкМ заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Не включайте рекомбинантный человеческий IL-2.
    9. Подсчитайте клетки, используя либо окрашивание трипановым синим цветом, либо исключение электрического тока, и повторно суспендируйте их до конечной концентрации 2,5 × 106 клеток/мл в среде. Если наблюдается чрезмерная гибель клеток (>10%), удалите мертвые/умирающие клетки с помощью смеси полисахарида и диатризоата натрия (см. Таблицу материалов) следующим образом:
      1. Слой 15 мл клеточной культуры поверх 13 мл раствора полисахарид-натрия диатризоата.
      2. Центрифуга на 1 250 × g в течение 20 мин при РТ с минимальным ускорением и разгоном. Соберите клеточный слой (облако) в интерфейсе между средой и раствором полисахарид-натрия диатризоата.
      3. Промыть клетки не менее двух раз предварительно расплавленной средой для анализа синаптического переноса (подготовленной на этапе 6.2.7).
      4. Подсчитайте и повторно суспендируйте клетки до конечной концентрации 2,5 × 106 /мл с использованием среды Synaptic Transfer Assay. Кокультура 100 мкл этой клеточной суспензии с BSLB (см. этап 6.2.15).
    10. Рассчитайте количество BSLB, необходимое для эксперимента; рассмотрим все различные мастер-смеси белков и титрование антигенов, подлежащие тестированию (либо биотинилированные мономеры HLA/MHC-пептидов, либо монобиотинилированные анти-CD3ε Fab).
    11. Соберите BSLB, выполнив те же шаги, что и в разделе 5 протокола, но на этот раз объедините все титрования белков и липидов, необходимые для восстановления сложной мембраны APC (рисунок 3A). Сохраняйте одинаковые соотношения vol: vol между начальным объемом шариков кремнезема и объемом белковой смеси, используемой во время калибровки, а также временем и температурами, используемыми при загрузке BSLB. Например, если для первоначальной калибровки было использовано 0,5 мкл шариков кремнезема/лунка и 100 мкл/лунка белковой смеси, поддерживайте соотношение 5:1000 об/об, чтобы подготовить BSLB к кокультурированию с Т-клетками.
    12. После того, как BSLB были загружены интересующей белковой смесью, дважды промыть BSLB HBS / HSA (BSA), чтобы удалить лишние несвязанные белки. Используйте скорость осаждения 300 × г в течение 2 мин при РТ на каждом этапе промывки и выбрасывайте супернатанты.
    13. Повторное суспендирование 5 × 105 BSLB на скважину в 200 мкл.
    14. Перенесите 100 мкл на скважину на новую U-донную 96-луночную пластину, чтобы сделать дубликат, так что конечное количество BSLB на скважину составляет 2,5 × 105.
    15. Раскрутите BSLB при 300 × g в течение 2 мин и RT и выбросьте супернатант.
    16. Повторное суспендирование BSLB с использованием 100 мкл суспензии Т-клеток; аккуратно перемешать, чтобы предотвратить образование пузырьков.
    17. Инкубировать кокультуры в течение 90 мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, клетки и шарики могут быть повторно суспендированы в буфере HBS/HSA (BSA) вместо Phenol-Red free RPMI для кокультуры. В этом случае инкубация должна быть выполнена в инкубаторе без CO2 , так как этот газ будет быстро подкислять буфер в отсутствие бикарбоната.
    18. Охладите клеточные кокультуры BSLB-T, сначала инкубируя клетки в RT в течение как минимум 15 минут. Защитите их от света.
    19. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 500 × г и РТ; отбросьте супернатант.
    20. Повторное суспендирование клеток в RT 2% BSA-PBS (Ca2+ и Mg2+-free) для блокировки. Поместите ячейки на лед на 45 мин. Защита от света.
    21. Во время инкубации клеток приготовьте смесь антител с использованием ледяного 0,22 мкм-фильтрованного 2% BSA в PBS в качестве буфера окрашивания, который обеспечит дополнительную блокировку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые партии антител, конъюгированных с красителями Brilliant Violet, имеют тенденцию связываться с BSLB неспецифически. Блокировка с 5% BSA-PBS помогает уменьшить этот шум. Отныне убедитесь, что холодовая цепь не нарушена.
    22. Вращайте кокультуры при 500 × г в течение 5 мин и 4 °C. Прежде чем выбрасывать супернатанты, кратко убедитесь, что гранула присутствует, осмотрев дно 96-луночной пластины с помощью подсветки.
    23. Используя многоканальную пипетку, повторно суспендируйте клетки в мастер-смеси окрашивания, содержащей оптимизированные концентрации антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипеток без фильтра, чтобы предотвратить образование пузырьков и ошибок в распределении объемов окрашивания.
    24. Включают изотип-меченые клетки и BSLB, флуоресцентные и нефлуоресцентные BSLB, а также клетки и BSLB, окрашенные отдельно. Соблюдайте общее количество событий на скважину для всех контрольных групп (т.е. только BSLB, содержащих 5 × 105 BSLB/well, и только клеточные элементы управления, содержащие 5 × 105 клеток/скважину, чтобы избежать относительного увеличения антител на окрашенное событие).
    25. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз половину объема, и высиживайте в течение 30 минут на льду. Защита от света.
    26. Промывайте клетки и BSLB дважды, используя ледяной 2% BSA-PBS, pH 7,4 и стадии осаждения 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте промытые сокультуры в 100 мкл PBS и немедленно приобретайте.
    27. Если требуется фиксация, исправьте, используя 0,5% мас./v PFA в PBS в течение 10 минут, промыть один раз и сохранить в PBS до приобретения. Защита от света.
    28. Перед компенсацией приобретите стандарты MESF, гарантируя, что как самые тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон измерения.
    29. Получите компенсационные образцы, рассчитайте компенсацию и примените к эксперименту компенсационную матрицу (ссылку).
    30. Приобретите и сохраните не менее 2 × 104 общих стандарта MESF для каждого из каналов количественной оценки.
    31. Для сбора с использованием высокопроизводительных пробоотборников установите набор прибора на стандартный уровень, установите отбор проб на 80 мкл (или 80% от общего объема), расход пробы от 2,0 до 3,0 мкл/с, объем перемешивания проб 50 мкл (или 50% от общего объема, чтобы избежать образования пузырьков во время смешивания), смешивание проб 150 мкл/с и смешивание на скважину от 3 до 5.
    32. Приобретите минимум 1 × 104 одиночных BSLB на выборку (см. рисунок 3B панелей (i)-(vi) для стратегии эталонного сбора).
    33. Промыть работающий цитометр в течение 5 минут чистящим раствором, а затем 5 минут сверхчистой водой перед выключением инструмента. При использовании HTS следуйте параметрам на вкладке HTS и параметру Очистить .
    34. Экспорт файлов FCS.

7. Измерение синаптического переноса частиц в BSLB

  1. Откройте FCS-файлы эксперимента. Выберите популяцию клеток и BSLB на основе их боковых и передних областей рассеяния света (SSC-A против FSC-A), как показано на рисунке 3B (i).
  2. Выберите события в окне непрерывного сбора (рисунок 3B (ii)).
  3. Сосредоточьтесь на единичных событиях как ячеек, так и BSLB; идентифицировать одиночные ячейки сначала на основе низкого W в последовательных затворах FSC-W/FSC-H (синглеты-1, рисунок 3B панель (iii)) и SSC-W/SSC-H (синглеты-2; Рисунок 3В панель (iv)). Определите дополнительный затвор singlets-3, выбрав события с пропорциональными FSC-A и FSC-H (рисунок 3B, панель (v)).
  4. Извлеките МФО из фракций MESF заготовки и от 1 до 4 и из отдельных клеток и MESF для каждого экспериментального образца.
  5. Генерация скорректированных значений MFI (cMFI) для фракций MESF от 1 до 4 путем вычитания MFI пустой популяции бусин из каждой дроби.
  6. Генерация cMFI для отдельных BSLB и ячеек (см. рисунок 3C панели (i)).
  7. Используйте сигнал от BSLB, окрашенный контрольными антителами изотипа, для коррекции MFI BSLB, окрашенного антителами, против соответствующих маркеров Т-клеток. Используйте cMFI для расчета нормализованного процента синаптического переноса (NST%) с помощью уравнения, показанного на рисунке 3C панели (ii).
  8. Если вас интересуют частицы, специально передаваемые в ответ на срабатывание TCR, вычтите сигнал из нулевых BSLB из MFI агонистических BSLB. Используйте этот cMFI для расчета NST%, управляемого TCR , используя уравнение, показанное на рисунке 3C панели (ii).
  9. Если вы заинтересованы в определении общего количества молекул, передаваемых в качестве груза частиц через интерфейс Т-клетка-BSLB, приобретите эталонные шарики MESF, используя те же настройки прибора и сеанс сбора для кокультур Т-клеток-BSLB.
  10. Анализ популяций шариков MESF и извлечение их цМФИ, как указано на этапах протокола 5.8.15-5.8.17. Рассчитайте наклон линии, наиболее подходящей для регрессионного анализа MESF над cMFI.
  11. Используйте рассчитанный наклон для извлечения количества MESF, нанесенных на BSLB. Используйте cMFI, рассчитанные с использованием либо элементов управления изотипом, либо нулевого BSLB в качестве пробелов, чтобы извлечь количество MESF, переданных специально стимулирующим BSLB.
  12. Рассчитать количество молекул маркеров, перенесенных в BSLB, разделив рассчитанные (средние) MESF на BSLB на значение F/P количественного антитела.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FCM для абсолютной количественной оценки белка на поверхности клетки
Восстановление BSLB, представляющих физиологические плотности лигандов, требует оценки общей плотности белка на моделируемом подмножестве клеток. Для восстановления BSLB включите любой соответствующий лиганд, который, как ожидается, будет играть роль в интересующей сигнальной оси, наряду с белками, поддерживающими адгезию и функциональное взаимодействие между BSLB и клетками, такими как ICAM-1 и костимуляторные молекулы, например, рецепторы CD40, CD58 и B7 (CD80 и CD86). Дополнительные белки могут быть добавлены в зависимости от рассматриваемого вопроса, включая костимуляторные молекулы, такие как ICOSL3, PD-L1 и PD-L215. Для любых других молекул воссоздайте BSLB, используя молекулярные плотности, определяемые путем непосредственного анализа клеток с помощью количественной проточной цитометрии. Для непосредственно конъюгированных антител BioLegend предоставляет значения F/P для каждого номера партии антител. Антитела также могут быть помечены внутри компании, а соотношения F/P определяются спектрофотометрией, обеспечивая альтернативу, когда нет коммерческих антител, конъюгированных с желаемым фторхромом. Поскольку мы используем одни и те же антитела для калибровки количества рекомбинантных белков на поверхности клеток и BSLB, нет необходимости корректировать валентность, связывающую антитела, поскольку она остается постоянной. Если требуется валентность, связывающая антитела, используйте как рекомбинантные белки, так и антитела с известным F/P для украшения BSLB и сравнения молекул загруженных рекомбинантных белков с количеством связанных антител после окрашивания в условиях насыщения.

Связанные молекулы антител на клетку могут быть оценены с использованием специального монохроматического проточного цитометрического измерения или полихроматической панели антител, предназначенной для оценки абсолютной плотности белка на относительно редком подмножестве клеток в интересующей ткани, такой как небные миндалины. На рисунке 1 показаны репрезентативные измерения плотности ICAM-1 в В-клетках CXCR5+ и фолликулярных Т-клетках (TFH) в качестве примера. Тот же протокол окрашивания и принципы анализа проточной цитометрии, показанные на рисунке 1А , могут быть использованы для измерения плотности белка на эпителиальных клетках, стромальных клетках, моноцитах, дендритных клетках моноцитного происхождения (moDC) или на В- и Т-лимфоцитах в других тканях человека и мыши. Для тканей, отличных от крови и миндалин, следует соблюдать осторожность при выделении клеток с использованием протеазных коктейлей, так как длительное воздействие на клетки переваривающих ферментов снижает уровень экспрессии клеточной поверхности.

Сосредоточьте сбор и анализ на одиночных живых клетках в окне непрерывного сбора (рисунок 1A ii), поскольку события за пределами континуума времени аберрантно рассеивают свет, ставя под угрозу количественную оценку. Чтобы повысить точность определений, уменьшите неспецифическое окрашивание БТР путем эффективной блокировки FcγRs. Сыворотка человека и ЭДТА, присутствующие в hFCB, обеспечивают эффективную блокировку FcγR при хелатировании свободного Ca2+ для уменьшения спонтанной агрегации клеток во время их манипуляций и окрашивания (черные стрелки на рисунке 1A (iii) и (iv) показывают оставшиеся дублеты в суспензиях тонзиллярных клеток).

Отслеживание производительности прибора с помощью установочных и отслеживающих шариков и программного обеспечения (или аналогичного; см. Таблицу материалов) имеет решающее значение для воспроизводимости количественных показателей с течением времени, особенно на более поздних этапах, когда синаптический перенос частиц в BSLB измеряется с использованием только MFI (т. Е. Для фторхромов, для которых нет стандартов MESF). Аналогичным образом, проверьте линейный диапазон (т.е. минимум линейности и максимум линейности) произвольных флуоресцентных блоков для детектора количественной оценки, который будет использоваться вместе со стандартами MESF, чтобы каждая калибровочная точка сохраняла линейную зависимость между флуоресценцией и количеством флуорохромов.

Подготовка образцов «заготовок» для флуоресценции или образцов, дающих представление о фоновом окрашивающем шуме, имеет важное значение для вычитания неспецифического флуоресцентного сигнала. Контроль изотипов и/или биологически нулевые образцы (например, нокауты) необходимы для коррекции фонового сигнала клеток и извлечения истинного сигнала, полученного из количественных антител (рисунок 1A панель (viii)). Аналогичным образом, стандартные бусины MESF используют специальную пустую популяцию для вычитания фонового сигнала из каждой действительно положительной популяции бусин (диаграмма 1B панелей (vii) и (viii)). После того, как выполнен регрессионный анализ и извлечен наклон, определяющий связь между MESF и скорректированными MFI, преобразование в абсолютные молекулярные плотности следует простым математическим операциям (рисунок 1C).

Для оценки CSA на рисунке 1C исключение электрического тока (CASY-TT) использовалось для извлечения измерений объема и диаметра ячеек из тысяч ячеек. Полученный CSA, полученный из расчета площади поверхности для сфер (4pr2), изменяется в зависимости от состояния активации клеток, с наблюдаемыми значениями 170,37 ± 4,91 мкм2 для неактивированных В-клеток и 234,52 ± 1,53 мкм2 и 318 ± 24,45 мкм2 для неактивированных и активированных Т-клеток соответственно. Эти CSA сопоставимы с теми, которые оцениваются методами визуализации, такими как трехмерная томография рефракционного индекса неактивированных лимфоцитов16.

После определения диапазона физиологических плотностей (например, путем сравнения поверхностных плотностей на клетках, проходящих различные программы активации), BSLB могут быть использованы для моделирования этих поверхностей. Титрование биотинилированных антигенных HLA-пептидных мономеров, предоставляемых тетрамерной установкой NIH (или монобиотинилированным мономерным анти-CD3ε-Fab), может быть использовано вместе с ICAM-1 12-His для воссоздания канонической мембраны APC. Коммерческие белки, помеченные 6, 9, 12 и 14 His, могут быть использованы для украшения поверхности BSLB (см. Рисунок 2A для примеров с ICAM-1 12-His). Титрование белка вместе с количественным анализом FCM обеспечивает надежную методологию для восстановления физиологических поверхностей APC и проверки их влияния на синаптический выход различных подмножеств Т-клеток.

Для изучения выхода синапсов Т-клеток используйте соотношение BSLB-к-Т-клеткам 1:1, чтобы гарантировать, что в среднем одна клетка будет взаимодействовать с одной BSLB в течение исследуемого периода. Мы заметили, что перенос материала пропорционален времени инкубации, обеспечивая универсальную платформу для обнаружения молекул, передаваемых в небольших количествах через интерфейс cell:BSLB. Таким образом, соответствующая конструкция панели имеет решающее значение для повышения чувствительности и надежности обнаружения транссинаптического материала, поскольку в случае tSV выход варьируется от 25 до 36 везикул / ячейка / 20 мин2,3. Сначала проверьте спектральный побочный эффект каждого меченого фторхромом антитела и липида. При наблюдении высокого поперечного эффекта мы рекомендуем титрование окрашивающих антител и процента флуоресцентных липидов, составляющих BSLB, а также прогулки напряжения PMT для уменьшения погрешности распространения на компенсированных образцах и повышения отношения сигнала к шуму соответственно (см. 12,14,17 для специального введения в предмет).

Использование средств количественной оценки, включая нулевые BSLB (без антигена или анти-CD3 Fab) и либо нокаут-клетки, либо образцы, меченые изотипом18, имеет важное значение для точного измерения переноса эффекторного tSV, такого как SE, а также частиц супрамолекулярной атаки, высвобождаемых в синаптической щели. Используйте высокообильные белки клеточной поверхности, такие как CD4, CD2 или CD45, наряду с синтетическими флуоресцентными липидами (конъюгаты DOPE Atto) для идентификации популяции отдельных клеток и BSLB при диссоциации конъюгатов на холодной основе. Сосредоточьте анализ на геометрическом среднем или медиане интенсивности флуоресценции в отдельных BSLB и клетках (CD4 используется на рисунке 3B). SE представляют собой специализированный тип tSV, полученный из плазматической мембраны (PM), и их передача в BSLB подтверждается усилением маркерного сигнала на BSLB с последовательной потерей сигнала на поверхности взаимодействующих клеток (см. TCR на BSLB, как показано на рисунке 2B, фиолетовые стрелки). Нулевые BSLB, в которых отсутствует антиген или анти-CD3, являются отличным ориентиром для отслеживания специфического усиления TCR (и других маркеров Т-клеток) на BSLB в результате стимуляции взаимодействующих клеток через их комплекс TCR.

Figure 1
Рисунок 1: Абсолютная количественная оценка белков на поверхности АПК. (A) Пример количественных измерений проточной цитометрии ICAM-1 на поверхности тонзиллярных В-клеток (Foll. Bc) и хелперные Т-клетки (TFH). (i-vii) Стратегия анализа одиночных CXCR5+ Bc и TFH, выделенных из небных миндалин человека. Показана последовательная стратегия определения единичных живых событий, содержащихся в непрерывном окне приобретения. (iii-iv) черные стрелки обозначают дублеты. (viii) наложенные гистограммы, показывающие экспрессию ICAM-1 на клеточной поверхности (гистограммы чирков) по сравнению с контрольными группами FMO (серые гистограммы) и FMO-контролями, помеченными соответствующими изотипами (черными гистограммами, которые перекрываются серыми гистограммами) популяций, показанных в (vii). Стрелки указывают направление для стратегии вложенного гатинга, используемой для идентификации В-клеток CXCR5+ (Bc; CD19+) и TFH (CD4+). (B) Извлечение абсолютных молекул на поверхности тонзиллярных клеток из MFI требует регрессионного анализа эталонных шариков MESF, полученных с использованием той же настройки прибора, что и ячейки, показанные в A. (и-в) Показана последовательная стратегия определения единичных живых событий, содержащихся в непрерывном окне приобретения. vi) определение и измерение МФУ из различных стандартных популяций MESF. (vii) показаны наложенные гистограммы популяций MESF, идентифицированных в (vi). Значения, отображаемые в правом верхнем углу, представляют MFI для каждой из 5 популяций MESF (пустые, 1, 2, 3 и 4). viii) линейная регрессия MESF по cMFI для популяций MESF, показанная в пункте vii). Показан наклон (b) для извлечения MESF, привязанного к ячейкам, из данных в A. (C) При извлечении числа молекул следовать простым математическим операциям, начиная с применения наклона, рассчитанного в (viii) на основе измеренных значений MESF cMFI (cMFIM) и эталонных значений MESF (MESFR). Чтобы извлечь MESF, связанный с клетками (MESFcells), разделите скорректированную MFI клеток (cMFIcells) по расчетному наклону. Затем рассчитать количество молекул, связанных с клетками (Molec. клетки), делят MESF-клетки по F/P обнаружения (количественной оценки) антитела. Наконец, чтобы рассчитать молекулярную плотность на поверхности клеток (D-клеток), разделите Molec. ячейки по расчетной площади поверхности ячейки (CSAE). Сокращения: X = независимая переменная; Y = зависимая переменная (измеренная флуоресценция), cMFIM = измеренная скорректированная МФО; MESFR = эталонные значения MESF; MESFcells = расчетный MESF на ячейку; cMFIcells = скорректированные клетки MFI; Молец. клетки = расчетные молекулы на клетку. Dcells = расчетная плотность на клетках; CSAE = расчетная площадь поверхности ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Восстановление BSLB с рекомбинантным ICAM-1 и измерение переноса твердых частиц в BSLB. (A, i-vi) Анализ проточной цитометрии BSLB, восстановленных с повышенной плотностью рекомбинантного мономерного ICAM-1 12-His (rICAM-1). (и-в) Как и на рисунке 1, сосредоточьте стратегию захвата на отдельных BSLB в непрерывном окне приобретения. Обратите внимание на зазор непосредственно перед затвором временного континуума, который был исключен для предотвращения погрешностей измерения. (vi) Хорошее качество белка часто приводит к однородному покрытию BSLB при высоких концентрациях при наблюдении узких флуоресцентных распределений (низкий коэффициент вариации, см. гистограммы in vi). (B) Регрессионный анализ эталонной концентрации (CR) ICAM-1 сверх измеренной плотности (DM). Используйте наклон для расчета целевых концентраций белка (CT) для достижения плотности клеток (D-клеток), измеренной в экспериментах на рисунке 1. Аббревиатуры: тег 12-His = 12-гистидинов; DM = измеренные молекулярные плотности; CR = эталонные концентрации rICAM-1; CT = целевая концентрация (интерполируется); Dcells = плотности, измеренные в клетках (см. также рис. 1С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Измерение синаптических частиц Т-клеток, переносимых в BSLB. (А; i-v) Блок-схема, показывающая критические этапы совместного культивирования Т-клеток с BSLB, воссоздающими модельные мембраны, и последующее измерение переноса частиц с помощью проточной цитометрии. iv) синие и темно-желтые диаграммы показывают относительное распределение и расположение клеток и BSLB на бипараметрических участках проточной цитометрии. v) гистограммы распределения флуоресценции, показывающие относительное усиление флуоресценции агонистических BSLB (темно-желтый) по сравнению с нулевыми BSLB (серый). (B) Образцовый эксперимент по синаптикальному переносу. (i-vi) Показана стратегия захвата для идентификации отдельных BSLB и ячеек в окне непрерывного сбора. Фиолетовые стрелки указывают направление анализа, которое продолжается в C. (C) (i) Фокусировка анализов на MFI отдельных клеток (синий) и одиночных BSLB (желтый). ii) Уравнения для расчета нормализованного синаптического переноса (NST%, вверху) и Tmax% (снизу) из cMFI, рассчитанного для BSLB и клеток. (iii-vi) Наложенные гистограммы, показывающие изменение распределения интенсивности флуоресценции для клеток (синие оттенки) и BSLB (желтые оттенки) по различным плотностям Т-клеток, активирующих анти-CD3ε-Fab, включая неактивирующие (серый) и активирующиеся либо 250 (мягкое значение цвета), либо 1000 (высокое значение цвета) molec./μm2. Числа в разных значениях цвета представляют NST%, измеренный для гистограмм BSLB, показанных желтым цветом. Наложенные гистограммы показывают всеобъемлющую иерархию в синаптическом переносе везикул Т-клеток, положительную для различных маркеров. Для этого состава BSLB (200 мол./мкм2 ICAM-1 и возрастающей плотности анти-CD3ε-Fab) tSV переносят в BSLB с TCR+(iii) > CD81+(iv) > CD4+(v) > CD28+(vi). Как было показано в предыдущих статьях, TCR и CD81 являются компонентами SE и переносятся со сравнительно более высокой эффективностью на CD4, несмотря на то, что последний выражается на сравнительно более высоких поверхностных уровнях. Выделение SE приводит к потере CD81 и TCR клеточной поверхности и усилению этих сигналов на BSLB (открывают фиолетовые стрелки для 250 молек/мкм2 и закрытые фиолетовые стрелки для 1000 молек./мкм2 в желтых гистограммах). (D) Неправильное охлаждение сопряжений приводит к тому, что ячейки отрывают SLB от кварцевых шариков, как видно из сравнения входных шариков (левый бипараметрический график) и сопряжений, подвергающихся быстрому охлаждению, до 4 °C с 37 °C (правый бипараметрический график). Сравните также с рисунком 3B панели (vi). Сокращения: PRF1 = перфорин 1; NST% = нормализованный синаптический перенос; Tmax% = процент от максимального наблюдаемого переноса (в контрольном или эталонном состоянии); tSV: транссинаптические везикулы; SE: синаптические эктосомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Буферы, используемые в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BSLB являются универсальными инструментами для изучения выхода твердых частиц Т-клеток, стимулируемых модельными мембранами APC. Гибкость метода позволяет воссоздать сложные и редукционистские мембранные композиции для изучения влияния лигандов и их сигналов на секрецию tSV и частиц супрамолекулярной атаки и их компонентов. Мы протестировали эту технологию на различных Т-клетках, включая предварительно активированные TH, CTL, Tregs и CART15. Этот протокол также работает для измерения высвобождения синаптических частиц свежеизолированными и покоящимися Т-клетками. Одним из ограничений использования свежеизолированных Т-клеток является то, что эти покоящиеся популяции производят другой профиль транссинаптических частиц, который коррелирует с их составом клеточной поверхности (см. 15 для получения более подробной информации).

В качестве простой панели проточной цитометрии мы рекомендуем использовать анти-TCR клон IP26, анти-CD81 клон 5A6, антиперфориновый (PRF1) клон B-D48 или анти-CD40L клон 24-31 и ATTO 390 или ATTO 565-содержащие липиды (для придания BSLB внутренней флуоресценции). Чтобы помочь отличить одиночные клетки от одиночных BSLB и конъюгатов, мы рекомендуем использовать анти-CD4 клон OKT4 и / или анти-CD45 клон HI30, которые переносятся в BSLB на ограниченных уровнях, несмотря на то, что они экспрессируются на очень высоких уровнях на поверхности клетки (см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации о фторхромах и других проверенных антителах). Панели с большим количеством флуорохромов могут быть спроектированы, но требуют систематической оценки вторичных эффектов флуоресцентного спектра каждого анализируемого флуорохрома. Чтобы повысить чувствительность, попробуйте различные титрования количественных антител в диапазоне от 0,5 мкг до 20 мкг / мл и повторяйте всякий раз, когда используются новые запасы антител. Для обеспечения воспроизводимости абсолютных и относительных измерений переноса частиц титруйте и рассчитывайте связующую способность каждой новой партии биотинилированных и ni-содержащих фосфолипидов, поскольку они могут существенно отличаться от партии к партии. Постепенное охлаждение сопряжений Т-клеток-BSLB имеет решающее значение для повышения чувствительности обнаружения частиц с низкой плотностью. Быстрое охлаждение кокультур приводит к разрушению BSLB, о чем свидетельствует значительная потеря флуоресценции липидов (рисунок 3D).

Различные метрики могут быть использованы для измерения выхода твердых частиц иммунных синапсов Т-клеток в зависимости от рассматриваемого экспериментального вопроса. Например, когда ожидаются незначительные различия в базовых уровнях экспрессии поверхностных белков, отсортированных в почковые SE, можно использовать нормализованную метрику синаптического переноса (NST%) (верхнее уравнение панели 3C (ii)). Последний количественно определяет процент сигнала MFI на BSLB как функцию от общей, комбинированной MFI клеток и шариков. Одним из предостережений от этого подхода является анализ переносимых маркеров, не выраженных на ТЧ, таких как компоненты частиц супрамолекулярной атаки19. Поскольку эти элементы достигают BSLB путями, независимыми от транзита ТЧ, такими как экзоцитоз внутриклеточного хранилища, расчет NST% не рекомендуется, поскольку результат будет завышен, поскольку числитель будет разделен на сравнительно небольшой знаменатель (уровень экспрессии поверхности клеток). Вместо этого используйте скорректированные МФУ для сравнения осаждения перфорина и гранзимов между нулевыми BSLB и BSLB, представляющими растущую плотность антигена или анти-CD3 Fab. Альтернативно, для отслеживания внутриклеточных элементов, передаваемых в BSLB, используют для сравнения либо оцененные абсолютные переданные молекулы, либо процент сигнала по отношению к максимальному сигналу, передаваемому на BSLB (Tmax%) (рисунок 3C панели (ii) нижнего уравнения). Для Tmax% используйте либо cMFI, либо молекулы, измеренные на образце BSLB (или условии), представляющем самую высокую плотность антигена в качестве эталонного Tmax. При анализе различных доноров используйте для сравнения Tmax , специфичный для донора. При изучении материала, передаваемого в ответ на специфический триггер TCR, МФО также могут быть скорректированы до уровня фонового переноса, наблюдаемого на антиген-отрицательных (нулевых) BSLB.

Оценка абсолютного числа молекул, переданных в BSLB, является более надежным методом, поскольку это включает калибровку MESF с измерением молекул в качестве конечной точки и лучшее сравнение независимых экспериментов. Tmax% обеспечивает аналогичную нормализацию в независимых экспериментах и особенно полезен при использовании полихроматического FCM для внутриклеточных маркеров, таких как перфорин и гранзимы, или для маркеров, для которых нет стандарта MESF. Tmax% - это просто процент сигнала в любом данном состоянии к состоянию с наибольшим переносом в контрольном состоянии (например, контроль транспортного средства / необработанного контроля для исследований лекарств, контрольные направляющие РНК для библиотек CRISPR / Cas9). Кроме того, Tmax% может быть использован как для цМФИ, так и для абсолютного числа молекул и был особенно полезен для параллельных сравнений влияния делеций генов на синаптический выход Т-клеток. Последнее очевидно, когда редактирование генов приводит к высокой вариабельности в динамическом диапазоне экспрессии иммунных рецепторов среди независимых доноров и экспериментов, что может повлиять на абсолютные и NST% измерения.

BSLB облегчают захват и характеристику синаптического выхода различных типов Т-клеток, которые в противном случае трудно изолировать из-за их быстрой интернализации APC2. Физическая стабильность BSLB также обеспечивает платформу для флуоресцентно-активированной сортировки клеток BSLB, которые были исследованы Т-клетками, что позволяет биохимическую характеристику высокочистых препаратов частиц с помощью масс-спектрометрии и технологий секвенирования нуклеиновых кислот. Последнее облегчает детальную характеристику межклеточных мессенджеров, выделяемых Т-клетками в широком диапазоне экспериментальных условий. Можно ответить на различные вопросы, в том числе о том, как эти мессенджеры твердых частиц изменяются между различными типами Т-клеток и состояниями активации, как канонические и неканонические рецепторы антигенов (то есть химерные антигенные рецепторы) и как агонистические и антагонистические мембранные сигналы влияют на состав частиц. В настоящее время мы разрабатываем эту технологию для количественной характеристики цитокинов, секретируемых в иммунном синапсе стимулированных Т-клеток. Последнее требует тщательного изучения комбинаций рекомбинантных цитокиновых рецепторов и антител, обеспечивающих эффективный захват интерлейкинов, интерферонов и хемокинов, депонированных на BSLB после активации Т-клеток. BSLB могут быть адаптированы для моделирования состава поверхности других APC, подозреваемых в высвобождении tSV Т-клетками, таких как стромальные и врожденные иммунные клетки. BSLB также могут быть адаптированы для скрининга новых фармакологических соединений, стремящихся к положительной и отрицательной модуляции экзоцитарного и tSV-секреционного механизма для лечения рака и других патологий. Наконец, BSLB также могут быть использованы для обнаружения детерминант вирулентности, модулирующих функцию Т-клеток при инфекционных заболеваниях20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Acknowledgments

Мы благодарны членам нашей лаборатории и сообществу Института ревматологии Кеннеди за конструктивные научные дискуссии, особенно нашему менеджеру центра проточной цитометрии Джонатану Уэбберу. Эта работа финансировалась Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) и Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (все три для MLD). PFCD был поддержан долгосрочной стипендией EMBO (ALTF 1420-2015, совместно с Европейской комиссией (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) и Marie Sklodowska-Curie Actions) и стипендией Оксфорд-Бристоль Майерс Сквибб.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 182
Подготовка липидных бислоев, поддерживаемых бисером, для изучения выхода твердых частиц иммунных синапсов Т-клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Céspedes, P. F., Dustin, M. L.… More

Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter