Summary
이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.
Abstract
염증성 카스파제는 카스파제-1, -4, -5, -11, 및 -12를 포함하고, 개시제 카스파제의 하위군에 속한다. Caspase-1은 염증 신호전달의 정확한 조절을 보장하기 위해 요구되며, 염증에 대한 모집 후 근접-유도된 이량체화에 의해 활성화된다. Caspase-1은 단핵구 세포 계보에 풍부하고, 전염증성 사이토카인인 인터루킨(IL)-1β 및 IL-18의 성숙을 활성 분비 분자로 유도한다. 다른 염증성 카스파제, 카스파제-4 및 -5 (및 이들의 뮤린 상동체 카스파제-11)는 피로옵토시스를 유도함으로써 IL-1β 방출을 촉진한다. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)은 카스파제 활성화의 판독으로서 염증성 카스파제 유도 근접성을 측정하는데 사용되는 도구이다. 인플라마좀에 결합하는 영역을 포함하는 카스파제-1, -4, 또는 -5 프로도메인은 카스파아제가 유도된 근접성을 겪을 때 형광성 복합체를 개혁하기 위해 연관되는 황색 형광 단백질 금성(Venus-N[VN] 또는 Venus-C[VC])의 비형광 단편에 융합된다. 이 프로토콜은 핵을 사용하여 이러한 리포터를 일차 인간 단핵구 유래 대식세포 (MDM)에 도입하고, 세포를 치료하여 염증성 카스파제 활성화를 유도하고, 형광 및 공초점 현미경을 사용하여 카스파제 활성화를 측정하는 방법을 설명합니다. 이러한 접근법의 장점은 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화 복합체의 성분, 요건 및 국소화를 확인하는데 사용될 수 있다는 것이다. 그러나 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않도록 신중한 통제를 고려해야합니다. 이 기술은 인플라마솜 수준에서 동적 카스파제 상호작용을 분석하고 살아있는 MDM 및 인간 혈액 샘플로부터 유래된 단핵구에서 염증성 신호전달 캐스케이드의 심문을 위한 강력한 도구입니다.
Introduction
카스파제는 개시제 카스파제 및 집행자 카스파제로 그룹화될 수 있는 시스테인 아스파르테이트 프로테아제의 패밀리이다. 사형 집행자 카스파제는 카스파제-3, -6 및 -7을 포함한다. 그들은 이량체로서 세포에서 자연적으로 발견되며 아폽토시스1을 실행하기 위해 개시제 카스파제에 의해 절단됩니다. 개시제 카스파제는 인간 카스파제-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 및 -12를 포함한다. 이들은 근접-유도된 이량체화에 의해 활성화되고 자가-단백질 분해 절단 2,3에 의해 안정화되는 비활성 효소원(pro-caspases)으로서 발견된다. 염증성 카스파제는 개시제 카스파제2의 서브세트이고, 인간에서 카스파제-1, -4, -5, 및 -12를 포괄하고, 마우스4,5에서 카스파제-1, -11, 및 -12를 포괄한다. 아폽토시스 역할보다는 염증에서 중심적인 역할을합니다. 이들은 프로인터루킨(IL)-1β 및 프로-IL-18 6,7의 단백질 분해 처리 및 분비를 매개하며, 이는 병원성 침입자 8,9에 반응하여 방출되는 최초의 사이토카인이다. Caspase-1은 활성화 플랫폼으로의 모집시 활성화됩니다. 큰 분자량의 단백질 복합체를 인플람마솜(도 1A)10이라고 불렀다. 카스파제-4, -5 및 -11의 이량체화는 비정준 인플라마솜 경로(11,12)를 통해 이들 플랫폼과 독립적으로 발생한다.
정준 인플라마좀은 인플람마솜 센서 단백질, 어댑터 단백질 ASC(CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 얼룩-유사 단백질), 및 이펙터 단백질 카스파제-110으로 구성된 시토졸 다량체 단백질 복합체이다. 가장 잘 연구된 정준 인플라마좀은 피린 도메인 (NLRP), NLRP1 및 NLRP3을 함유하는 NOD 유사 수용체 패밀리, CARD (NLRC), NLRC4, 및 흑색종 2 (AIM2)에 결석한 NLR 패밀리를 함유한다. 그들은 각각 피린 도메인, 카드 또는 두 도메인을 모두 포함합니다. CARD 도메인은 CARD 함유 카스파제와 그들의 업스트림 활성화제 사이의 상호작용을 매개한다. 따라서, N 말단 피린 도메인 (PYD) 및 C 말단 CARD 모티프 13,14로 구성되는 스캐폴드 분자 ASC는 NLRP1 10, NLRP315 및 AIM216 inflammasomes에 대한 카스파제-1의 모집에 필요하다.
각 인플람마솜은 뚜렷한 전염증성 자극을 인식하는 고유한 센서 단백질의 이름을 따서 명명되었습니다(그림 1B). 이 경로의 활성화자는 정식 자극이라고합니다. 인플람마좀은 미생물 성분 및 조직 스트레스에 대한 센서로서 작용하고, 염증 카스파제(17)의 활성화를 통해 강력한 염증 반응을 촉발시키기 위해 조립된다. 인플라마솜 어셈블리는 카스파제-1 활성화를 개시하여 그의 주요 기질인 pro-IL-1β 및 pro-IL-18의 성숙 및 분비를 매개한다. 이 프로세스는 두 단계 메커니즘을 통해 발생합니다. 첫째, 프라이밍 자극은 NF-κB 경로의 활성화를 통해 특정 염증성 단백질 및 pro-IL-1β의 발현을 상향조절한다. 둘째, 세포내(정경적) 자극은 프로파스파제-1 6,7의 인플라마솜 조립 및 모집을 유도한다.
Caspase-4 및 caspase-5는 뮤린 카스파제-11 11의 인간 오르토로그이다. 이들은 그람 음성 박테리아 18,19,20의 외막에서 발견되는 분자인 세포내 리포폴리사카라이드(LPS)와 적혈구 용혈(21)의 산물인 세포외 헴에 의해 인플라마솜-비의존성 방식으로 활성화된다. LPS가 이들 단백질의 CARD 모티프에 직접 결합하고 이들의 올리고머화(20)를 유도한다는 것이 제안되었다. 카스파제-4 또는 카스파제-5의 활성화는 기공 형성 단백질 가스더미민 D(GSDMD)18,19의 절단을 통해 피롭토시스라고 불리는 염증성 형태의 세포 사멸을 유도함으로써 IL-1β 방출을 촉진한다. 또한, 카스파제-4 및 GSDMD 매개 열록토시스 사멸로부터 야기되는 칼륨 이온의 유출은 NLRP3 인플라마좀의 활성화 및 카스파제-122,23의 후속 활성화를 유도한다. 따라서, 카스파제-4, -5, 및 -11은특정 자극(11,24)에 반응하여 피옵토시스 및 카스파제-1 활성화를 유도할 수 있는 LPS용 세포내 센서로 간주된다.
그림 1: 염증성 카스파제 및 카스파제-이분자 형광 보체 (BiFC) 분석. (A) 카스파제-BiFC 시스템을 나타낸 도면으로, 금성의 각 비형광 단편(Venus-C 또는 Venus-N)에 연결된 두 개의 카스파제-1 프로도메인(C1-pro)이 NLRP3 활성화 플랫폼으로 모집되어 금성이 재굴 및 형광을 갖도록 강제한다. 이 복합체는 현미경 하에서 녹색 반점으로 나타나며 개시제 카스파제 활성화의 첫 번째 단계 인 염증성 카스파제 유도 근접성에 대한 판독 역할을합니다. (b) 염증성 카스파아제 및 염증성 카스파제의 도메인 조직을 보여주는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
특정 개시제 카스파제 활성화를 측정하는 것은 어렵고, 이미징 접근법에 의해 그렇게 할 수 있는 방법은 많지 않다. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)은 살아있는 세포에서 직접 염증성 카스파제 활성화를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다 (그림 1A)25. 이 기술은 최근 인간 단핵구 유래 대식세포 (MDM)21에서 사용하기 위해 적응되었다. 카스파제 BiFC는 염증성 카스파제 활성화의 첫 번째 단계를 측정하고, 이량체화를 촉진하기 위해 근접성을 유도한다. 광화성 황색 형광 단백질 금성 (Venus-C[VC]) 및 Venus-N[VN])의 비형광 단편에 융합된 CARD 함유 카스파제 프로도메인을 코딩하는 플라스미드의 발현이 사용된다. 두 카스파제 프로도메인이 그들의 활성화 플랫폼으로 모집되거나 유도된 근접성을 겪을 때, 금성의 두 반쪽은 근접하게 가져와 굴착 및 형광을 강요받는다(도 1A,B 참조). 이는 특정 염증성 카스파제 활성화의 실시간 판독을 제공한다.
인간 MDM은 위험 신호 및 병원체 생성물을 식별하는 인플라마솜 유전자와 패턴 인식 수용체를 풍부하게 발현한다. 이것은 염증성 카스파제 경로의 심문을 위한 이상적인 세포 유형을 제공한다. 또한, 이들은 말초 혈액 및 심지어 환자 샘플로부터 유래되어 특정 질병 상태에서의 염증성 카스파제 활성화를 평가할 수 있다. 이 프로토콜은 뉴클레오펙션을 사용하여 BiFC 카스파제 리포터를 MDM에 도입하는 방법, 전기천공 기반 트랜스펙션 방법, 염증성 카스파제 활성화를 유도하기 위해 세포를 치료하는 방법, 현미경 접근 방식을 사용하여 활성 카스파제 복합체를 시각화하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 이 방법론은 이들 복합체의 분자 조성, 아세포 국재화, 동역학, 및 이들 고도로 정렬된 구조의 크기(25,26,27)를 결정하도록 적응될 수 있다.
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Protocol
이 프로토콜은 인간 샘플의 조작에 대한 Baylor College of Medicine의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 혈액 샘플은 인간 샘플에 대한 제도적 안전 지침에 따라 처리됩니다. 혈액 샘플은 지역 혈액 은행에서 얻어지며, 구연산 인산염 덱스트로스 (CPD) 용액으로 수집됩니다. 그러나, 나트륨 헤파린, 리튬 헤파린 또는 EDTA와 같은 다른 항응고제로 수집된 혈액은 또한 이 프로토콜28,29에 사용될 수 있다.
1. 인간 단핵구의 분리 및 대식세포로의 분화
- 지역 혈액 은행에서 식별되지 않은 건강한 개인으로부터 항응고 된 혈액을 얻고 아래에 표시된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하십시오.
참고: 조직 배양 층류 후드의 모든 단계를 수행하십시오. 멸균 튜브 만 사용하고 장갑을 착용하십시오. 처분 할 때 모든 혈액 관련 제품에 10 % 표백제를 첨가하십시오. 멸균 PBS (1x) 또는 DPBS (Ca 제외)2+ 및 밀리그램2+)를 서로 바꿔서 사용할 수 있습니다.- 희석 완충액을 준비하십시오: 1x 멸균 PBS를 2% FBS 및 0.5 mM EDTA로 보충하십시오.
- 배양액 준비: RPMI-1640 배지에 FBS(10% (v/v)), 글루타맥스(2 mM) 및 페니실린/스트렙토마이신(50 I.U./50 μg/mL)을 보충합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 실행 버퍼(재료 표)를 미리 냉각합니다.
- 두 부피의 희석 완충액으로 전혈을 희석하십시오. 혈청학적 피펫을 사용하여, 15 mL의 항응고된 혈액을 희석 완충액 30 mL가 들어있는 50 mL 튜브로 옮긴다. 반전으로 부드럽게 섞으십시오.
- 전혈 10mL 또는 희석된 혈액 30mL마다 밀도 구배 배지 15mL를 50mL의 빈 튜브에 첨가한다.
- 단계 1.1.5로부터의 밀도 구배 배지를 25 mL의 혈청학적 피펫을 사용하여 천천히 그리고 꾸준히 희석된 혈액으로 층화한다. 튜브의 벽에 피펫의 끝을 기울어진 각도로 유지하십시오.
- 튜브를 스윙 버킷 원심 분리기로 조심스럽게 옮깁니다. 두 단계를 방해하지 마십시오. 튜브를 실온(RT)에서 400 x g 에서 25분 동안 원심분리하고 가속 및 감속을 최소값으로 설정한다.
- 10mL 피펫을 사용하여 상단(투명한) 플라즈마층을 조심스럽게 제거하고 표백제(10%)가 있는 용기에 폐기합니다.
- 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs, 그림 2)의 간상 (흰색) 층을 10 mL 피펫으로 수집하고 신선한 50 mL 튜브로 옮긴다. 동일한 도너에 있는 다른 튜브의 흰색 층을 최대 30mL의 50mL 튜브에 결합합니다.
- 각 튜브를 단계 1.1.1로부터의 희석 완충액과 함께 50 mL의 총 부피로 가져오고, 300 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 10 mL 피펫으로 상층액을 제거하고 표백제 (10 %)가있는 용기에 폐기하십시오.
- 각 세포 펠릿을 p1000 마이크로피펫을 사용하여 단계 1.1.3으로부터 미리 냉각된 실행 완충액 중 1 mL에 재현탁시킨다. 동일한 공여체로부터의 세포 현탁액을 새로운 15 mL 튜브에 결합한다. 미리 냉각된 실행 버퍼를 사용하여 각 튜브의 부피를 15mL로 가져오고 반전으로 잘 혼합하십시오.
- 단계 1.1.11로부터 세포 현탁액의 20 μL 분취량을 취하고, 1x 멸균 PBS를 사용하여 1:100 희석액을 제조하였다. 혈구세포계를 사용하여 세포 번호를 결정하십시오.
- 단계 1.1.11로부터 세포 현탁액을 300 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하고, 10 mL 피펫으로 상층액을 제거하였다. 필요한 경우 p200 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거하십시오.
- 분리된 PBMC를 각 1 x 107 세포에 대해 80 μL의 사전 냉각된 MACS 실행 완충액에 재현탁하여 최대 800 μL의 완충액을 첨가한다.
- 각 1 x 10 7 세포 당 20 μL의 항인간 CD14 마이크로비드를 첨가하거나 혈액 샘플 당 최대 100 μL (희석되지 않은 혈액 100 mL)를 첨가한다. 역전으로 잘 혼합하고 4°C에서 연속 혼합하면서 20분 동안 튜브 회전기 위에 놓는다.
- 튜브 회전기로부터 샘플을 제거하고, 10 mL의 예비냉각된 러닝 버퍼를 각 튜브에 첨가하고, 300 x g (가속 = 5, 감속 = 5) 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
- 10 mL 피펫으로 상청액을 제거하고 미리 냉각된 실행 완충액 500 μL(2 x 10 8/mL)에 최대 1 x 108 세포를 재현탁시켰다.
- 제조업체의 지침에 따라 수동 또는 자동화 시스템(재료 표)을 사용하여 자기 세포 분류를 통해 CD14 양성 세포의 분리를 수행합니다.
- CD14 양성 선택 후 단계 1.1.18로부터 세포 현탁액의 20 μL 분취량을 취하고, 1x 멸균 PBS를 사용하여 1:100 희석액을 제조하였다. 혈구측정기에서 세포를 계수하여 세포 수를 결정하십시오.
- CD14 양성 세포를 300 x g 및 RT에서 10분 동안 원심분리한다. 10 mL 피펫 또는 진공 시스템을 사용하여 상청액을 제거한다.
- 단계 1.1.20의 세포 펠릿을 단계 1.1.2의 예열 배양 배지에 재현탁시켜 1 x 107 cells/mL의 최종 세포 밀도로 재현탁시킨다.
- 단리된 CD14 양성 단핵구를 5 x 106 세포의 세포 밀도로 시드한다.
- 10cm 조직 배양 접시에 50ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)가 보충된 1.1.2단계의 배지 10mL를 첨가한다.
- 단계 1.1.21로부터의 세포 현탁액 0.5 mL를 배양액에 적가하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이친다. 세포를 가습된 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 다음날, 진공 시스템을 이용하여 배지를 흡인하여 하룻밤 사이에 부착하지 않은 세포를 제거한다. GM-CSF(50 ng/mL)가 보충된 신선한 배지 10 mL를 첨가하고, 가습 조직 배양 배양기(37°C, 5%CO2)에서 세포를 7일 동안 배양하여 완전한 분화를 허용한다(GM-CSF에서 분화의 다양한 단계에서 CD14+ 단핵구의 출현에 대해서는 도 3A 참조). 2-3 일마다 배양액을 교환하고 매번 신선한 GM-CSF (50 ng / mL)로 보충하십시오.
그림 2: 실험 워크플로의 개략적인 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 전기천공 성분의 제조
참고: 이 프로토콜은 10μL-네온 팁(재료 표)을 위해 설계되었습니다. 각 형질감염에 대해 1-2 x 105 세포를 사용하십시오. 형질감염된 세포를 48-웰 플레이트 또는 8-웰 챔버 디쉬(웰 당 10 μL-형질감염된 세포)에 시드하는 것이 좋습니다. PBS 대신에 1x 멸균 DPBS (Ca2+ 및Mg2+ 제외)를 사용할 수 있습니다.
- 7일째에 RPMI-1640 배지에 FBS(10%(v/v))와 글루타맥스(2mM)를 보충하여 항생제가 없는 배지를 준비합니다.
- 무혈청 RPMI-1640 배지, 트립신-EDTA (0.25%) 용액, 1x 멸균 PBS (Ca2+ 및Mg2+ 없이), 및 단계 1.1.2로부터의 완전한 배양 배지를 37°C 수조에 놓는다.
- 유리 바닥 접시 (공초점 현미경 검사용)를 사용하는 경우 폴리 D- 라이신 하이드로 브로마이드로 접시를 코팅하십시오.
- 8개의 웰 챔버 디쉬를 200μL의 폴리-D-라이신 하이드로브로마이드(1x 멸균 PBS 중 0.1mg/mL)와 코팅하고 RT에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 폴리-D-라이신 용액을 흡인하고 유리를 1x 멸균 PBS로 1회 세척한다. PBS를 흡인하고 단계 2.4로 진행한다.
- 48 웰 플레이트 또는 8 웰 챔버 디쉬의 웰 당 200 μL의 항생제 프리 배지를 첨가하고, 형질감염된 세포를 플레이트할 준비가 될 때까지 가습된 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 예비인큐베이션한다.
3. 전기천공용 전지의 제조
주: 7-일 분화 기간의 끝에서 10 cm 디쉬로부터의 MDM의 수율은 대략 1.5 x 106 세포이다. PBS 대신에 1x 멸균 DPBS (Ca2+ 및Mg2+ 제외)를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 대부분의 대식세포가 세포 생존력 및 완전성의 유지와 함께 플레이트로부터 분리되도록 최적화되었다. MDM은 세포 배양 플레이트로부터 분리하기가 어렵다. 따라서, 세포를 해리시키기 위해 단계 3.2 및 3.3을 두 번 수행할 필요가 있을 수 있다. 트립신-EDTA (0.25 %)를 사용한 각 인큐베이션 시간이 5 분을 초과하지 않는지 확인하십시오.
- 완전히 분화된 대식세포로부터 배지를 10cm 접시에 흡인하고 따뜻한 무혈청 RPMI-1640 배지로 세포 단층을 세척한다. 매체를 완전히 제거해야 합니다.
- 10 cm 디쉬 당 2 mL의 가온 트립신-EDTA (0.25%) 용액을 첨가하여 세포를 수확하고, 가습 조직 배양 인큐베이터 (37°C, 5%CO2)에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 트립신-EDTA(0.25%) 용액을 p1000 마이크로피펫을 사용하여 접시 전체 영역에 걸쳐 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 분리를 완료한다. 세포 현탁액을 단계 1.1.2로부터 가온 완전 배양 배지 5 mL를 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다.
- 접시를 밝은 현장 현미경으로 가져 가서 다양한 시야에서 세포 분리를 확인하십시오. 아직 상당한 양의 세포가 연결되어 있으면 3.2-3.3단계를 반복합니다.
- 세포 현탁액을 RT에서 5분 동안 250 x g 에서 원심분리한다.
- 배지를 흡인하고 세포를 10 mL의 1x 멸균 PBS에 재현탁시키고 37°C로 미리 가온하였다. 20 μL 분취량을 취하여 혈구측정기를 사용하여 세포 수를 결정한다.
- 의도한 형질감염 당 1-2 x 105 세포를 취하여 15 mL 튜브에 넣는다. 미리 예열된 1x 멸균 PBS로 15 mL의 최종 부피로 가져온다. RT에서 5분 동안 250 x g 에서 원심분리한다.
- PBS를 흡인하고 250 x g에서 1분 동안 1회 더 원심분리한다. p200 마이크로피펫을 사용하여 세포 펠릿으로부터 임의의 잔류 PBS를 제거하였다.
4. 인간 단핵구 유래 대식세포로의 카스파제 BiFC 성분의 핵형성
참고: 프로토콜의 이 섹션은 네온 트랜스펙션 시스템(Table of Materials)을 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜은 10 μL 네온 팁을 사용하여 1-2 x 105 세포를 형질감염시키는 단계를 간략하게 설명합니다 (표 물질). 100 μL 네온 팁을 사용하는 경우 그에 따라 스케일업하십시오. 세포를 15분 이상 재현탁 완충액 R에 노출시키지 마십시오, 이것은 세포 생존력 및 형질감염 효율을 감소시킬 수 있기 때문입니다.
- 리포터 플라스미드(즉, 100ng/μL에서 mCherry 또는 dsRedmito)를 뉴클레아제가 없는 물 또는 0.5x TE 완충액에 희석하여 형질감염된 세포를 시각화한다.
- 카스파제 BiFC 플라스미드를 뉴클레아제가 없는 물 또는 0.5x TE 완충액에 적절한 농도로 희석하여 플라스미드의 총 부피가 10μL의 총 형질감염 부피의 30%를 초과하지 않도록 한다(즉, C1 Pro-VC의 300 ng/μL 및 C1 Pro-VN의 300 ng/μL).
- 의도된 형질감염 당 1.5 mL 멸균 마이크로튜브를 제조하고, 적절한 양의 리포터 플라스미드 (즉, 50 ng 또는 0.5 μL) 및 카스파제 BiFC 플라스미드 (즉, 300 ng 또는 1 μL의 C1 Pro-VC 및 300 ng 또는 1 μL의 C1 Pro-VN 단편)를 첨가한다. 마이크로 튜브를 항상 후드에 보관하십시오.
- 피펫 스테이션, 장치, 팁, 전기 천공 튜브 및 피펫을 멸균 층류 후드에 놓습니다.
참고: 피펫 스테이션, 장치, 팁, 전기 천공 튜브 및 피펫은 네온 트랜스펙션 시스템에 포함되어 있습니다. - 파이펫 스테이션의 고전압 및 센서 커넥터를 제조업체의 지침에 따라 장치의 후면 포트에 연결합니다. 파이펫 스테이션을 장치 가까이에 두십시오.
- 전원 코드를 후면 AC 입구에 연결하고 장치를 전기 콘센트에 연결하십시오. 전원 스위치를 눌러 장치를 켭니다.
- 장치가 켜져 있고 적절하게 연결될 때 표시되는 시작 화면에 트랜스펙션 매개 변수를 입력합니다. 전압을 누르고 1000을 입력한 다음 Done을 눌러 전압을 1000V로 설정합니다. 너비를 누르고 40을 입력한 다음 Done을 눌러 펄스 지속 시간을 40ms로 설정합니다. 마지막으로 # 펄스를 누르고 2를 입력 한 다음 완료를 눌러 전기 펄스 수를 2로 설정하십시오.
- 전기천공 튜브(키트에 제공됨) 중 하나를 가져와 RT에서 3mL의 전해 버퍼 E(10μL 팁과 키트에 제공됨)로 채웁니다. 전기천공 튜브를 피펫 스테이션의 피펫 홀더에 삽입합니다. 튜브 측면의 전극이 안쪽을 향하고 있고 튜브를 삽입할 때 딸깍 소리가 들리는지 확인하십시오.
- 단계 3.8로부터 세포 펠릿을 취하고, 각 1-2 x 105 세포에 대해 10 μL의 예비가온 재현탁 R 완충액 (키트에 제공됨)을 첨가한다. p20 마이크로피펫과 부드럽게 섞는다. 10 μL의 세포 현탁액을 단계 4.3에서 설정된 각 튜브에 첨가하고, p20 마이크로피펫으로 부드럽게 혼합한다.
- 피펫을 가져 와서 푸시 버튼을 눌러 팁을 삽입하여 두 번째 정지로 이동하십시오. 클램프가 팁에 있는 피스톤의 장착 스템을 완전히 집어 들고 피펫의 상단 헤드에 틈이 보이지 않는지 확인하십시오.
- 샘플을 흡인하려면 피펫의 푸시 버튼을 눌러 첫 번째 정지로 누르고 세포 / 플라스미드 DNA 혼합물이 들어있는 첫 번째 튜브에 담그십시오. 혼합물을 피펫 팁으로 천천히 흡인하십시오.
참고: 기포는 전기 천공 중에 아크를 일으킬 수 있으므로 피하고, 장치에서 감지되면 전기 펄스의 전달을 방지할 수 있습니다. 기포가 관찰되면 내용물을 튜브에 넣고 다시 흡인하십시오. - 샘플이있는 피펫을 피펫 홀더에 매우 조심스럽게 삽입하십시오. 파이펫이 딸깍 소리가 나고 제대로 배치되었는지 확인하십시오.
- 터치 스크린에서 시작 을 누르고 전기 펄스가 전달될 때까지 기다립니다. 화면의 메시지가 완료를 나타냅니다.
- 역에서 피펫을 천천히 제거하고, 첫 번째 정지까지 누름 버튼을 천천히 누름으로써 단계 2.4에서 미리 가온된 항생제가 없는 배지로 상응하는 웰 내로 형질감염된 세포 현탁액을 즉시 첨가한다.
참고: 이 팁은 동일한 플라스미드에 대해 최대 세 번 재사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 푸시 버튼을 눌러 두 번째 정지로 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리십시오. - 세포/플라스미드 DNA 혼합물이 포함된 각 튜브에 대해 4.10-4.14단계를 반복합니다.
- 플레이트를 형질감염된 세포로 부드럽게 가습하고, 가습된 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 1-3시간 동안 인큐베이션한다.
- 단계 1.1.2로부터 200 μL의 미리 가온된 배양 배지(complete medium)를 각 웰에 첨가한다. 접시를 가습 조직 배양 배양기(37°C, 5%CO2)에 다시 넣는다. 유전자 발현을 위해 적어도 24 시간을 허용하십시오.
- 다음날, 에피형광 현미경을 이용하여 세포 생존율 및 형질감염 효율을 검사한다.
- 제조업체의 지시에 따라 epifluorescence 현미경과 형광 광원 상자를 켜고 배양 접시를 현미경 단계에 놓습니다.
- 10x 또는 20x 목표와 568nm(RFP) 필터를 선택합니다.
- 셀 생존율을 추정하려면 투과광 LED(TL) 버튼을 눌러 선택한 필드의 모든 셀을 시각화합니다. 현미경 접안 렌즈를 들여다 보면서 세포가 관찰 될 때까지 초점 노브를 돌리고 선택한 필드에서 세포 부착을 확인하십시오.
참고: 완전히 부착된 세포는 생존 가능한 세포를 나타내는 반면, 부유하는 세포는 생존할 수 없는 세포를 나타낸다. 웰의 컨플루언스가 높다면, 부착되지 않은 세포의 존재는 낮은 생존력의 결과가 아니라 세포 수의 과대 평가의 결과 일 수 있습니다. 그러나, 부유하는 세포의 높은 함량을 수반하는 낮은 컨플루언시는 전기천공 동안 아크, 플라스미드 독성 또는 재현탁 R 완충제에 대한 과다 노출로 인해 발생할 수 있는 낮은 생존력을 의미한다. 후자의 행동을 표시하는 우물을 사용하지 마십시오. - 형질감염 효율을 추정하기 위해, 전술한 바와 같이 투과된 광 하에서 선택된 분야에 있는 세포에 초점을 맞춘다. 선택한 필드의 총 셀 수를 계산합니다. 전송광 LED(TL )가 꺼진 상태에서 반사광 LED 버튼(RL) 을 눌러 전원을 켭니다.
- 형광 리포터 유전자(적혈구)에 미세하게 초점을 맞추고 적색 형광 세포의 총 수를 세어본다. 웰당 적어도 두 개 이상의 필드에 대해 이 단계(4.18.4-4.18.5)를 반복합니다.
5. 형질감염된 MDM 및 카스파아제 BiFC 데이터 수집의 치료
참고: 부형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미지화할 계획인 경우, 선택된 자극으로 1시간 전에 qVD-OPh(20 μM)로 처리하여 카스파제 의존성 세포 사멸(주로 아폽토시스)을 예방하는 것이 좋습니다. 이것은 아폽토시스로 인해 세포가 들어 올리는 것을 방지하기 위해 이미징에 사용되며, 초점면에서 움직일 때 이미지를 이미지화하기가 매우 어렵습니다. 활성화 플랫폼 및 연관된 카스파제 BiFC로의 카스파제 모집은 카스파제의 촉매 활성에 의존하지 않으며, 결과적으로, 카스파제 억제는 이 단계에 영향을 미치지 않을 것이라는 점에 유의한다.
- 형질 감염 후 약 24 시간 동안 선택한 자극으로 치료하고 각 약물에 필요한만큼 오랫동안 배양하십시오.
- 단계 1.1.2의 배양액을 Hepes (20 mM, pH 7.2-7.5) 및 2-메르캅토에탄올 (55 μM)로 보충하여 이미징 배지를 제조하였다.
- 미리 예열된 이미징 매질에 원하는 농도의 자극을 넣고 부드럽게 혼합하십시오.
- p1000 마이크로피펫으로 세포로부터 배지를 조심스럽게 제거하고 5.1.2단계에서 자극 용액 500 μL를 웰의 측면 아래로 첨가한다.
- 처리되지 않은 제어 웰을 실행하려면 자극 없이 이미징 배지를 추가합니다.
- 세포를 각 처리에 대해 지시된 한, 가습된 조직 배양 배양기(37°C, 5%CO2)에서 인큐베이션한다.
- 후피형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포를 시각화합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 현미경과 형광 광원을 켭니다.
- 10x 또는 20x 목표를 선택하고 배양 접시를 현미경 단계에 놓습니다.
- 현미경 접안 렌즈를 사용하여 568nm 필터 아래에서 세포를 찾고 dsRedmito/mCherry 리포터(적혈구)를 발현하는 세포에 초점을 맞춥니다.
- 시각적 필드의 모든 빨간색 셀을 계산하고 숫자를 기록합니다.
- 동일한 시야에 있는 동안, 488 또는 512 필터(GFP 또는 YFP)로 변경하고, 녹색(금성 양성 또는 BiFC 양성)인 적색 세포의 수를 카운트하고 그 수를 기록한다.
- 최소 세 개의 개별 시야에서 최소 100개의 dsRedmito/mCherry 양성 세포를 계산합니다.
- 시야당 금성 양성 형질감염된 세포의 백분율을 계산하고, 표준 편차를 얻기 위해 각 치료(웰)에 대한 결과 백분율을 평균한다.
- 후피형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 이미지
참고: 20x 대물 또는 더 큰 배율을 사용하여 공초점 이미지를 획득하려면 현미경에 장거리 통과 목표가 장착되어 있지 않은 한 세포를 유리 접시에 도금해야 합니다.- 5.2.1-5.2.3단계를 수행합니다. 40x, 60x 또는 63x 오일 목표와 공초점 현미경을 사용하는 경우 목표에 오일 한 방울을 놓습니다.
- 카메라에 의해 획득된 대로 컴퓨터 화면에 있는 셀의 라이브 이미지를 시각화합니다. 형광 이미지에 에피형광 광원을 사용하거나 공초점 이미지를 위해 광원을 레이저로 전환합니다.
- 조이스틱 컨트롤과 포커스 휠을 사용하여 셀의 초점과 위치를 미세 조정합니다.
- 이미지의 신호가 양호하게 보이고 채도에 도달하지 않도록 512nm 또는 488nm(YFP 또는 GFP) 및 568nm(RFP) 레이저의 레이저 출력 및 노출 시간 백분율을 설정합니다.
- 라이브 캡처를 켜고 결과 이미지를 검사합니다. 두 채널 모두에 대한 디스플레이 히스토그램의 각 형광에 대해 뚜렷한 피크가 표시되는지 확인하십시오.
- 필요에 따라 레이저 파워와 노출 시간을 조정하십시오. 형광 신호(RFP 및 GFP/YFP)를 모두 감지할 수 있는 동시에 이 값을 가능한 한 낮게 유지하십시오.
- 세포의 라이브 이미지를 시각화하는 동안 플레이트의 각 웰에 대해 mCherry/dsRedmito 리포터를 발현하는 하나 이상의 셀이 포함된 필드의 여러 대표 이미지를 촬영하고 데이터를 저장합니다.
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Representative Results
도 2에 도시된 반응식은 인간 MDM을 수득, 형질감염 및 이미지화하는 방법에 대한 개요를 제공한다. 선택된 CD14+ 단핵구를 GM-CSF로 7일 동안 인큐베이션한 후, 분화 기간에 걸쳐 세포 형태가 변화하고(도 3A), 구형 현탁액 세포로부터 스핀드하고 완전히 부착되는 과정(제3일 및 제4일), 마지막으로 완전히 분화되었을 때 세포를 더 많이 퍼뜨린다(제7일째). 완전히 분화된 세포는 이어서 플레이트로부터 분리되고 카스파제 BiFC 쌍 (VC 및 VN)과 함께 리포터 플라스미드 (예를 들어, dsRedmito, 미토콘드리아를 표적화하는 적색 형광 단백질을 코딩하는 플라스미드)로 형질감염되고, 이는 형질감염된 세포를 표지하는데 사용되고(도 3B), 24시간 후에 형질감염의 효율을 평가하기 위해 사용된다. 도 3B-D 니게리신 (5 μM)으로 20 h 동안 처리된 카스파제-1 프로BiFC 형질감염된 세포를 사용한 BiFC 결과의 예를 보여주며, NLRP3의 조립을 촉발시키는 공지된 전염증성 자극인30,31을 인플라마좀이다. 처리되지 않은 세포는 금성 형광을 나타내지 않으며(도 3B), 니게리신 처리된 세포에서, 카스파제-1 BiFC는 ASC 스펙크 32,33,25의 전형적인 형상을 갖는 단일 누점으로 나타난다(도 3C). 도 3D는 금성 양성 MDM의 정량의 예를 도시한다. 카스파제-1 BiFC의 가장 높은 백분율은 LPS+니게리신 처리군에서 나타난다(도 3D). 이 결과는 카파제-1의 활성화를 위해 프라이밍 신호(LPS)와 세포내 신호(니게리신)가 모두 필요한 정식 인플라마좀의 활성화와 일치한다.
도 3: CD14-단핵구의 분화 및 인간 MDM의 형질감염. (A) 분화의 1, 3, 4, 및 7일에 GM-CSF에 노출된 말초 혈액으로부터의 CD14+ 단핵구의 대표적인 밝은 필드 이미지(스케일 바, 100 μm). (B-C) 인간 MDM을 카스파제-1 프로BiFC 쌍 및 형질감염 리포터 dsRedmito (50 ng, 적색)로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 LPS(100 ng/mL)와 함께 또는 LPS 없이 3시간 동안 프라이밍하고, 20시간 동안 이미징 배지에서 니게리신(5 μM)으로 처리하였다. 미처리 및 니게리신 처리된 세포의 대표적인 공초점 이미지가 도시되어 있다 (스케일 바, 10 μm). BiFC는 녹색으로 표시됩니다. (d) (C)로부터의 세포를 20 h에서 금성 양성 (녹색, 카스파제-1 BiFC 복합체)이었던 dsRedmito 양성 세포 (적색, 형질감염된 세포)의 백분율에 대해 평가하였다. 오류 막대는 웰당 적어도 두 개의 독립적인 카운트의 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
플라스미드 적정의 예가 도 4에 도시되어 있으며, 여기서 각 BiFC 플라스미드의 증가량이 형질감염된다. 이것은 플라스미드의 최적 투여량의 선택을 허용하여, 특정 신호와 최소한의 배경을 초래한다. 도 4A는 적혈구 파괴로부터 기인하는 고도로 전염증성 분자인 헴으로 처리된 카스파제-1, -4, 및 -5 프로BiFC 쌍 (VC 및 VN)의 농도가 증가함에 따라 형질감염된 인간 MDM의 결과를 보여준다34. 카스파제-1, -4 및 -5 프로BiFC 쌍에 대한 금성 양성 세포의 가장 높은 비율은 각각 400 ng, 500 ng 및 1000 ng의 형질감염된 플라스미드로부터 유래한다. 그러나, 가장 많은 양의 플라스미드를 사용하는 것은 또한 비특이적 배경을 증가시킬 위험이 있다(도 4B). 예를 들어, 카스파제-5 프로 BiFC 쌍의 1000 ng의 형질감염은 거의 40%의 비특이적 배경을 초래한다. 따라서, 더 낮은 700 ng 양을 사용하는 것은 이러한 플라스미드 쌍에 대해 최적으로 고려된다(도 4B). 도 4C에서, 형질감염 후 24시간 세포의 필드의 20x 목적을 갖는 수득된 대표적인 공초점 이미지가 도시된다. 이 이미지에서, 처리되지 않은 형질감염된 세포는 미토콘드리아의 출현 (죽은 세포의 미토콘드리아는 고도로 단편화되어 있음)과 세포의 형태 (아폽토시스 세포가 축소 됨)에 기초하여 생존 가능하다는 것을 알 수 있다. 헴으로 처리한 후, 카스파제-1 복합체는 도 3C에서 니게리신에 의해 유도된 것과 유사한 단일 녹색 누점으로 나타나고, 그 외관은 세포 수축을 수반하였다.
도 4: 상이한 양의 염증성 카스파제 프로BiFC 쌍으로 형질감염된 인간 MDM. (A) 프로카스파제-1의 적정; 카스파제-4 프로; 또는 카스파제-5 프로 BiFC 쌍. 인간 MDM을 트랜스펙션 리포터(50 ng)로서 dsRedmito와 함께 지시된 양의 카스파제 프로BiFC 쌍으로 형질감염시키고, 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 배양 배지를 모든 웰로부터 제거하고, 세포를 0.1% FBS 배지에서 헴 (50 μM)으로 또는 헴 없이 처리하였다. 1시간 후, 동일한 양의 완전한 배지를 모든 웰에 첨가하여 FBS 농도를 5%로 재구성하고 헴이 세포를 사멸시키는 것을 방지하였다. 20 h의 총 처리 후, 세포를 금성 양성이었던 dsRedmito 양성 형질감염된 세포의 백분율에 대해 평가하였고, 웰 당 최소 300개의 세포로부터 결정하였다. 오류 막대는 웰당 적어도 세 개의 독립적인 카운트의 SD를 나타냅니다. (b) 인간 MDM을 선택된 양의 카스파제-1프로로 형질감염시키고; 카스파제-4 프로; 또는 카스파제-5 프로 BiFC 쌍, dsRedmito (50 ng)와 함께 트랜스펙션을 위한 리포터로서. 형질감염 후 24시간에, 세포를 0.1% FBS로 헴(50 μM)과 함께 또는 없이 처리하였다. 1시간 후, FBS를 5%로 재구성하여 세포외 헴을 억제하였다. 세포를 웰 당 최소 300개의 세포로부터 결정된 20 h에서 금성 양성 (녹색, 카스파제 BiFC 복합체)이었던 dsRedmito 양성 세포 (적색, 형질감염된 세포)의 백분율에 대해 평가하였다. 결과는 금성 양성 세포 백분율로 표시된다. 오류 막대는 웰당 적어도 세 개의 독립적인 카운트의 SD를 나타냅니다. (c) (B)에 기재된 바와 같이 헴으로 또는 헴 없이 처리된 후 24시간 후 세포 필드의 20x 목적으로 수득된 대표적인 공초점 이미지. 레드: dsRedmito-양성 세포; 녹색: 금성 양성 세포; 스케일 바, 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 분리된 단핵구로부터 대식세포를 수득하는 워크플로우 및 세포 생존력 및 거동을 손상시키지 않으면서 염증성 카스파제 BiFC 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 방법을 기술한다.
이 프로토콜은 BiFC 기술(35 )을 활용하여 카스파제 모집 도메인(CARD)에서 염증성 카스파제를 비형광 단백질 금성의 비형광 단편으로 태그한다. 염증성 카스파제는 큰 (p20) 및 작은 (p10) 서브유닛으로 구성된 촉매 도메인을 코딩하고, 보존된 단백질-단백질 상호작용 모티프는 그들의 N 말단 또는 프로도메인36 에서 CARD로 명명된다 (도 1B). 그들의 활성화 플랫폼에 염증성 카스파제의 모집은 손상되지 않은 카드에 달려 있습니다. 이러한 접근법을 위해, 두 개의 카스파제 프로도메인 작제물(CARD 모티프를 코딩함)이 생성되고, 각각은 형광 트랜스펙션 리포터와 함께 광가능한 황색 단백질 금성(Venus-C[VC]) 및 Venus-N[VN])의 비형광 단편에 연결되어 카스파제 BiFC 리포터의 활성화 이전 또는 부재 하에 세포의 시각화를 허용한다. 형광은 상호작용하는 단백질이 이량체화 및 활성화를 허용하기에 충분히 근접하게 될 때만 관찰된다( 도 1A 참조). 이 공정의 효율은 표준 에피형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 정량할 수 있습니다. 단일 셀 이미징과 결합하여, 이 프로토콜은 벌크 집단에서 구별할 수 없는 비동기 이벤트의 시각화를 허용하며, 이미지의 해상도에 따라, 각 카스파제와 연관된 BiFC 복합체의 크기 및 국부화를 결정하는 데 사용될 수 있다.
이 프로토콜은 올리고머화에 의해 활성화되는 단백질의 범위에 적응될 수 있고, 그의 적용가능성은 현미경 방법론에 제한되지 않는다. 이 접근법은 또한 염증성 카스파제 어셈블리에 대한 차별적 요구 사항의 조사를 허용합니다. 예를 들어, siRNA는 특정 염증성 카스파제 활성화를 위한 업스트림 성분/요건을 확인하는데 사용될 수 있다. 카스파제-BiFC 프로브와 siRNA 올리고(표적 단백질을 침묵시키는 데 사용됨)는 MDM으로 동시에 형질감염될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 단백질 파트너 또는 각 활성화 플랫폼의 필수 성분을 식별할 수 있습니다. 예를 들어, NLRP1, NLRP3 및 AIM2 인플람마좀의 조립에 필요한 ASC 어댑터 분자를 표적으로 하는 siRNA 올리고가 카스파제-1의 헴-유도된 활성화가 이들 정준 인플라마좀을 필요로 하는 반면, 카스파제-4 및 -5는21이 아니었다는 것을 보여주기 위해 사용되었다. 이 방법론은 또한 타임랩스 현미경에 적응될 수 있으므로, 염증성 카스파제 활성화의 동역학은 단일 세포에서 결정될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 세포 용해의 지표로서 트랜스펙션 리포터(mCherry)의 형광 손실을 모니터링함으로써 세포가 사멸을 겪는 시간에 대하여 BiFC 발병의 출현 타이밍을 정확하게 검출함으로써 카스파제 이량체화가 언제 발생하는지를 평가할 수 있다. 카스파아제 BiFC 데이터를 획득하고 분석하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 선택은 대답 할 질문과 사용 가능한 현미경 및 소프트웨어의 종류에 달려 있습니다. 예를 들어, 타임랩스 분석뿐만 아니라 활성화의 효율을 결정하는 데 사용되는 단일 시점 데이터는 일부 현미경 소프트웨어에 의해 제공되는 자동 획득 기능을 사용할 수 있는 경우 특히 효과적일 수 있습니다. 이것은 소정의 위치 어레이가 다중 웰 플레이트의 각 웰로부터 획득되기 때문에 객관적인 이미징을 허용한다. 시각적 검사와 CellProfiler, ImageJ 또는 MATLAB과 같은 자동화된 이미징 소프트웨어를 사용하여 정확도와 객관성을 높여 이미지를 정량화할 수 있습니다.
일차 세포에서 카스파제 경로를 조사하는 것은 이러한 단백질의 생리적 역할을 완전히 이해하는 데 필수적입니다. 또한, 마우스에서 caspase-4 및 caspase-5가 단일 caspase-11로 대체되기 때문에, 인간 세포를 평가할 수 있는 것이 필수적이다. 그러나, 일차 세포에서 많은 전달 시스템과 관련된 낮은 형질감염 효율 및 독성으로 인해, 이용가능한 플라스미드 기반 리포터의 사용을 최대화하는 것이 어려울 수 있다. 염증성 카스파제 BiFC 프로토콜은 환자 또는 건강한 피험자의 말초 혈액으로부터 MDM을 형질감염시켜 형질감염당 필요한 세포의 수를 감소시키는 간단한 방법을 기술한다. 이를 통해 연구자들은 세포 생존력과 세포 특성을 손상시키지 않고 대식세포와 같은 귀중한 세포에 대해보다 복잡한 실험을 수행 할 수 있습니다. 환자 샘플을 사용하는 능력은 특정 질병 상태에서 염증성 카스파제 활성화를 평가할 수 있다는 주요 이점을 제공한다. 실제로, 약간의 최적화를 통해,이 프로토콜은 다른 뮤린 또는 인간 일차 세포에 쉽게 적응 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 MDM을 형질감염시키기 위해 전기천공 기반 접근법을 사용한다. 네온 시스템은 세포(37)의 특이적 면역 반응을 교란시킬 수 있는 MDM에서 IFN γ 반응을 유도하지 않기 때문에 특히 유리하다. 이것은 외인성 DNA를 많은 수의 세포로 효율적으로 전달할 수 있도록 높은 세포 밀도를 갖는 10 μL 형질감염 부피를 사용하는 소규모 전기천공 시스템이다. 그것은 세포막에 일시적인 기공을 만들어 플라스미드가 신속하게 통과 할 수 있도록하여 화학적 형질 감염 중에 발생하고 플라스미드 분해를 유발할 수있는 후기 엔도 세포증을 피할 수 있습니다. 이 프로토콜은 염화물 이온(38)을 갖는 다른 완충제와 비교할 때 최소한의 세포 독성을 도입하는 유기산계 완충액 제형(완충액 R)을 사용한다. 작은 부피 및 피펫 팁 챔버의 설계는 높은 생존율을 초래하는 생리학적 조건을 유지하기 위해 균일한 전기장을 생성하는 것을 돕는다. 형질감염 효율 및 세포 생존은 완충제의 화학적 조성, 세포 밀도, 펄스의 강도, 및 플라스미드 농도(39)에 크게 의존한다. 따라서, 도입된 플라스미드 및 각 세포 유형에 대해 이러한 조건을 최적화하는 것이 필수적이다. MDM에서는 펄스 지속 시간이 길수록 낮은 전압이 플라스미드를 더 효율적으로 전달하면서 세포를 실행 가능하고 건강하게 유지했습니다. 결과적으로, 이 프로토콜에 사용된 설정은 1000V 및 40ms의 2펄스였으며, 트랜스펙션 후 플레이트에 재부착하는 세포의 능력에 따라 세포 생존율이 90%보다 높은 40-60% 사이의 형질감염 효율을 가져왔다. 이 프로토콜은 인간 MDM에 최적화되어 있지만 전압 설정을 500V에서 1700V로 변경하고 펄스 수를 1에서 3으로 늘리고 10ms ~ 40ms 범위의 펄스 길이를 테스트하면 추가 셀 유형 및 실험 설정에서 트랜스펙션 효율과 세포 생존력의 균형을 맞출 수 있습니다.
BiFC 기술을 최적으로 사용하기 위한 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 1) 사용자가 도입할 각 카스파제 플라스미드의 최적 양을 결정하는 것이 중요한데, 이는 단백질 및 세포 유형에 따라 다를 수 있기 때문입니다. 이는 분석의 최대 민감도와 특이성을 보장하기 위해 필요합니다. 도 4A-B에 도시된 바와 같이 200 ng 내지 1000 ng 사이에서 카스파제 BiFC 플라스미드 (VC 및 VN 단편)의 파일럿 적정을 실행하는 것이 좋다. 도입된 플라스미드의 최적 범위는 각각의 개별 카스파제에 대해 상이하며, 따라서 이들은 개별적으로 평가되어야 한다. 최소한의 배경으로 가장 높은 특정 신호를 제공하는 플라스미드 양을 선택하십시오. 이상적으로 배경 레벨은 10% 미만이어야 하지만 특정 신호가 높으면 최대 20%까지 사용할 수 있습니다. 또한 분화, 형질감염 및 치료 중에 가혹한 조건과 이러한 세포의 과도한 조작을 피하는 것이 중요합니다. 이것은 또한 자발적인 활성화를 초래할 수 있고, 단핵구 또는 대식세포와 같은 면역 세포의 활성화가 전염증 기능(40)을 획득할 수 있는 자연적인 과정이기 때문에 특정 결과를 흐릴 수 있는 카스파제 활성화의 높은 배경 수준을 초래할 수 있다. 환자 세포를 사용하는 경우, 자극 및 국소 미세 환경의 변화에 민감하게 또는 탈감작시킬 수 있는 염증성 활성화 및 유전적 배경의 일부 내재적 변이를 조절하는 것이 어려울 수 있다. 예를 들어, 대식세포 기능은 면역이 손상된 개인이나 감염과 싸우는 개인에서 영향을받을 수 있는데, 이러한 유형의 세포는 중요한 항상성 기능을 수행하고 다른 기능 중에서도 염증의 조절에 관여하기 때문입니다. 이러한 유전 적 및 환경 적 요인은 높은 배경이 비 특이적인지 생물학적 효과가 있는지 결정할 때 고려해야합니다. 밀접하게 매칭된 건강한 대조군(예를 들어, 성별 및 연령에 대해 매칭됨)을 사용하는 것은 카스파제 BiFC의 높은 배경 수준의 생물학적 유의성을 평가하는 것을 도울 수 있다. 2) 하나의 금성 단편의 불평등 한 발현이 더 높은 주파수에서 플랫폼에 모집되고 전체 형광 신호를 마스킹하여 거짓 음성 결과를 생성 할 수 있기 때문에 VC 및 VN 단편이 동일한 양으로 도입되는 것이 중요합니다. 따라서, 각각의 개별 플라스미드의 완전성 및 농도는 상이한 양의 VC 및 VN 단편의 도입을 피하기 위해 모든 형질감염 전에 검증되어야 한다. 3) 이 접근법은 카스파제 리포터의 외인성 발현에 기초하기 때문에, 특이성에 대한 추가적인 조절이 포함되어야 한다. 카스파아제와 그의 활성화 플랫폼 사이의 결합을 교란하는 단일 점 돌연변이를 함유하는 Caspase-BiFC 구축물 또는 siRNA를 이용한 활성화 플랫폼의 성분 중 하나의 침묵은 형광 신호가 인플라마좀에 대한 카스파제의 특이적 결합에 기인한다는 것을 확인하는데 사용될 수 있다. 이 대조군 실험은 금성 양성 세포의 감소 수준을 초래한다. 4) 카스파제 BiFC 구축물의 발현은 세포 사멸과 같은 하류 사건을 유발하거나 영향을 미칠 수 있다. 이를 피하기 위해, 카스파제의 비효소 버전은 촉매 시스테인 잔기가 돌연변이되고 불활성화되는 카스파제 프로도메인 또는 전장 카스파제와 같은 BiFC 리포터에게 권장된다. 이를 추가로 제어하기 위해, 대조군 비형질감염된 처리된 웰 및 처리되지 않은 웰이 실험에 포함되어야 하고, 형질감염된 웰의 것과 유사한 거동을 보여야 한다. 5) 내인성 카스파제 활성은 BiFC 판독에 영향을 미칠 수 있다. 이를 제어하기 위해, BiFC 효율이 동일할 것이라는 기대와 함께 연구 중인 카스파아제에 대해 결핍된 세포에서 카스파제 리포터를 발현할 수 있다.
이 접근법의 주요 단점 중 하나는 카스파제 활성화 자체를 측정하지 않지만 , 활성화가 일어나기 위해 요구되는 유도된 근접 단계를 측정하지 않는다는 것이다. 이것은 미묘하지만 중요한 구별입니다. 설계에 의해, 프로도메인은 실제로 이량체화되는 카스파제의 촉매 도메인을 포함하지 않는다. 따라서, 금성 단편의 재접힘 및 형광은 카스파아제 이량체화에 대한 프록시로서 작용하는데, 이는 카스파아제가 이량체화하기에 충분히 근접한 경우에만 재검역할 수 있기 때문이다. 따라서, BiFC는 구체적으로 유도된 근접성을 측정한다. 촉매 도메인에서의 번역 후 변형은 BiFC 신호에 영향을 미치지 않으면서 이량체화를 방해할 수 있다. 예를 들어, 카스파제-2는 그의 촉매 도메인 상에서 인산화되고, 이것은 그의 활성화 플랫폼(41)으로의 카스파제-2의 모집을 방해하지 않으면서 이량체화를 방해한다. 따라서, BiFC 접근법을 이용한 관찰은 관찰된 형광이 카스파제 활성화를 대표한다는 것을 확인하기 위한 기능적 연구로 보완되어야 한다. 이러한 단점에도 불구하고, 여기서 논의된 대조군이 포함된다면, 카스파제 BiFC에 의한 유도된 근접성의 측정은 특정 카스파제 활성화의 정확한 표현을 제공할 수 있다.
결론적으로, 카스파제 BiFC는 인플라마솜 수준에서 동적 카스파제 상호작용의 분석을 위한 강력한 도구이다. 이 프로토콜은 살아있는 면역 세포에서 염증성 카스파제 신호전달 캐스케이드의 심문을 허용한다. 이러한 접근법은 카스파제 활성화의 첫 번째 단계를 구체적이고 정확하게 측정하는 기술을 제공할 뿐만 아니라, 일차 면역 세포에 적용됨으로써, 종래의 방법으로는 확인될 수 없었던 염증성 카스파제의 특성을 드러낼 수 있는 잠재력을 갖는다.
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Disclosures
저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는이 기술의 발전에 기여한 LBH의 과거와 현재의 실험실 구성원들에게 감사드립니다. 이 실험실은 NIH / NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH / NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH / NIGMS R01GM121389 (LBH)가 지원합니다. 도 2는 바이오렌더 소프트웨어를 사용하여 도출하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 well tissue culture2:34 plates | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 cm Tissue Culture Dishes | VWR | 25382-166 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS columns | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Rinsing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMacs running buffer | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
| Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit | Zeiss | Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
| AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope | Zeiss | Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
| DPBS without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | Available by request from LBH lab | ||
| LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS Columns | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| MACS 15 mL Tube Rack | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| mCherry plasmid | Yungpeng Wang Lab | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes |
| Nigericin sodium salt, ready made solution | Sigma | SML1779-1ML | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software | Zeiss | Any software used to operate the confocal microscope of choice |
References
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Boice, A., Bouchier-Hayes, L.
- Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
- Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
- Lamkanfi, M., Vishva, M. D.
- Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
- Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
- van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
- Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
- Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
- Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A.
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
- Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
- Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
- Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
- Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
- Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
- Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
- Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
- Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
- Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
- Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
- Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
- Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
- Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
- Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).
