Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants

Published: December 21, 2021 doi: 10.3791/63177
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

Die frühe Entwicklung hängt von mütterlich vererbten Produkten ab, und die Rolle vieler dieser Produkte ist derzeit unbekannt. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das CRISPR-Cas9 verwendet, um mütterliche Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.

Abstract

Die frühe Entwicklung hängt von einem Pool mütterlicher Faktoren ab, die während der Oogenese in die reife Eizelle eingebaut werden und alle für die Entwicklung notwendigen zellulären Funktionen bis zur Aktivierung des zygotischen Genoms erfüllen. Typischerweise erfordert das genetische Targeting dieser mütterlichen Faktoren eine zusätzliche Generation, um Phänotypen mit mütterlichem Effekt zu identifizieren, was die Fähigkeit behindert, die Rolle von maternal exprimierten Genen während der Entwicklung zu bestimmen. Die Entdeckung der biallelischen Editierfähigkeiten von CRISPR-Cas9 hat das Screening embryonaler Phänotypen in somatischen Geweben injizierter Embryonen oder "Crispants" ermöglicht und das Verständnis der Rolle zygotisch exprimierter Gene in Entwicklungsprogrammen erweitert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das eine Erweiterung der Crispant-Methode darstellt. Bei dieser Methode ermöglicht die biallelische Bearbeitung von Keimzellen die Isolierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation oder "mütterlichen Crispants". Multiplexing-Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel fördert die effiziente Produktion von mütterlichen Crispants, während die Sequenzanalyse von mütterlichen Crispant-Haploiden eine einfache Methode zur Bestätigung genetischer Läsionen bietet, die einen mütterlichen Phänotyp erzeugen. Die Verwendung von mütterlichen Crispants unterstützt die schnelle Identifizierung essentieller maternal exprimierter Gene und erleichtert so das Verständnis der frühen Entwicklung.

Introduction

Ein Pool von mütterlich abgelagerten Produkten (z. B. RNAs, Proteine und andere Biomoleküle) ist für alle frühen zellulären Prozesse notwendig, bis das zygotische Genom des Embryos aktiviert ist1. Die vorzeitige Erschöpfung dieser Produkte aus der Eizelle ist typischerweise embryonal tödlich. Trotz der Bedeutung dieser Gene für die Entwicklung ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene derzeit unbekannt. Fortschritte in der Gen-Editing-Technologie bei Zebrafischen, wie CRISPR-Cas9, ermöglichen das Targeting von maternal exprimierten Genen 2,3,4. Die Identifizierung eines mütterlichen Phänotyps erfordert jedoch eine zusätzliche Generation im Vergleich zu einem zygotischen Phänotyp und erfordert daher mehr Ressourcen. Vor kurzem wurde die biallelische Bearbeitungsfähigkeit von CRISPR-Cas9 genutzt, um nach embryonalen Phänotypen in somatischen Geweben injizierter (F0) Embryonen, bekannt als "Crispants"5,6,7,8,9,10, zu suchen. Die Crispant-Technik ermöglicht ein ressourceneffizientes Screening von Kandidatengenen in somatischen Zellen und erleichtert so das Verständnis spezifischer Aspekte in der Entwicklung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von mütterlichen Effekt-Phänotypen oder "maternalen Crispants" in einer einzigen Generation11. Dieses Schema ist erreichbar, indem Guide-RNAs auf ein einzelnes Gen gemultiplext und biallelische Editierereignisse in der Keimbahn gefördert werden. Diese mütterlichen Crispant-Embryonen können durch grobe morphologische Phänotypen identifiziert werden und einer primären Charakterisierung unterzogen werden, wie z. B. Markierung für Zellgrenzen und DNA-Musterung11. Die kombinierte Analyse des beobachtbaren Phänotyps und die grundlegende molekulare Charakterisierung der induzierten INDELs ermöglichen die Vorhersage der Rolle des Zielgens in der frühen Entwicklung.

Im Zebrafisch entwickelt sich während der ersten 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) eine kleine Gruppe von Zellen zu den primordialen Keimzellen, einem Vorläufer der Keimbahn12,13,14,15. In Gelege von F0-Weibchen hängt der Anteil der gewonnenen mütterlichen Crispant-Embryonen davon ab, wie viele Keimzellen ein biallelisches Editierungsereignis im Zielgen enthalten. Im Allgemeinen gilt: Je früher das Bearbeitungsereignis im Embryo auftritt, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass CRISPR-Cas9-Mutationen in der Keimbahn beobachtet werden. In den meisten Fällen stammen die Phänotypen mütterlicher Crispant-Embryonen aus dem Funktionsverlust der beiden mütterlichen Allele, die in der sich entwickelnden Eizelle vorhanden sind. Wenn die Eizelle die Meiose beendet, wird eines der mütterlichen Allele über den Polkörper aus dem Embryo extrudiert, während das andere Allel in den mütterlichen Vorkern eingebaut wird. Die Sequenzierung mehrerer mütterlicher Crispant-Haploide stellt eine Mischung der in der Keimbahn vorhandenen Mutationen (Insertionen und/oder Deletionen (INDELs)) dar, die zum Phänotyp11 beitragen.

Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Erzeugung von CRISPR-Cas9-Mutationen in maternalen Effektgenen und zur Identifizierung des entsprechenden Phänotyps mit einem mütterlichen Crispant-Ansatz (Abbildung 1). Abschnitt eins wird erklären, wie man Guide-RNAs effektiv entwirft und erstellt, während die Abschnitte zwei und drei kritische Schritte zur Herstellung mütterlicher Crispants durch Mikroinjektion enthalten. Nach der Injektion der CRISPR-Cas9-Mischung werden die injizierten Embryonen mittels PCR auf somatische Schnitte untersucht (Abschnitt vier). Sobald sich die injizierten F0-Embryonen entwickeln und die Geschlechtsreife erreichen, werden die F0-Weibchen mit Wildtyp-Männchen gekreuzt, und ihre Nachkommen werden auf mütterliche Phänotypen untersucht (Abschnitt fünf). Abschnitt sechs enthält Anweisungen zur Herstellung mütterlicher Crispant-Haploide, die mit der Sanger-Sequenzierung kombiniert werden können, um die CRISPR-Cas9-induzierten INDELs zu identifizieren. Darüber hinaus enthält die Diskussion Änderungen, die am Protokoll vorgenommen werden können, um die Empfindlichkeit und Leistungsfähigkeit dieser Methode zu erhöhen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

In Studien, die zur Entwicklung dieses Protokolls führten, wurden alle Zebrafischhaltungen und Experimente vom University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2) genehmigt.

1. Synthese von Guide-RNAs

HINWEIS: Zygotische Crispants wurden unter Verwendung einer einzigen Guide-RNA oder des Multiplexens mehrerer Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel 5,6,7,8,9,10 hergestellt. Das Multiplexing von Guide-RNAs erhöht den Prozentsatz der Embryonen mit einem zygotischen crispant-Phänotyp10. Aufgrund dieser erhöhten Häufigkeit von Embryonen, die einen Phänotyp aufweisen, werden mütterliche Crispants erzeugt, indem vier Guide-RNAs zu einem einzigen Gen gemultiplext werden. Ein detaillierteres Protokoll über die Verwendung von CHOPCHOP zum Design von Guide-RNAs und eine Annealing-Methode zur Synthese von Guide-RNAs für Zebrafische finden Sie an anderer Stelle 16,17,18,19,20.

  1. Um ein mütterlich exprimiertes Gen zu identifizieren, das anvisiert werden soll, bestimmen Sie die mRNA-Transkriptspiegel während der Entwicklung über eine RNA-Sequenzdatenbank, die Transkriptominformationen von Zygote bis 5 Tage21 liefert. Im Allgemeinen werden maternspezifische Gene im frühen Embryo stark exprimiert und nach Aktivierung des zygotischen Genoms abgebaut22.
  2. Sobald ein mütterlich exprimiertes Zielgen identifiziert wurde, bestimmen Sie die erste vorhergesagte Proteindomäne mithilfe des Abschnitts "Domänen und Merkmale", der im Ensembl-Genombrowser23 verfügbar ist. Verwenden Sie diese Domäne als Zielregion für die vier Guide-RNAs.
  3. Verwenden Sie das Guide-RNA-Auswahlprogramm CHOPCHOP, um vier Guide-RNA-Zielstellen in der ersten aktiven Domäne zu identifizieren. Entwerfen Sie genspezifische Oligonukleotide, wie unten für jede Zielstelle gezeigt. Im genspezifischen Oligonukleotid entspricht derN20-Abschnitt der Zielsequenz abzüglich der PAM-Stelle (NGG) von CHOPCHOP. Ordnen Sie diese genspezifischen Oligonukleotide und das konstante Oligonukleotid mittels Standard-Entsalzungsreinigung (siehe Materialtabelle).
    Genspezifisches Oligonukleotid:
    5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
  4. Um eine Leit-RNA-Vorlage für jedes genspezifische Oligonukleotid zu erstellen, glühen Sie es auf das konstante Oligonukleotid und füllen Sie die Überhänge mit T4-DNA-Polymerase, wie zuvor beschrieben16. Nachdem die vier Guide-RNA-Templates zusammengesetzt sind, reinigen und konzentrieren Sie sie zusammen mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  5. Synthetisieren Sie die sgRNA-Mischung aus der gepoolten Guide-RNA-Vorlage unter Verwendung eines In-vitro-T7-Transkriptionskits (siehe Materialtabelle). Führen Sie die In-vitro-Transkription gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Die Verwendung von Halbreaktionen des T7-Transkriptionskits kann die Kosten pro Reaktion senken.
  6. Nach der RNA-Synthese wird der resultierende Pool von sgRNAs unter Verwendung eines Ethanol/Ammoniumacetat-Protokolls gereinigt, wie zuvor beschrieben 16,20,24. Nachdem die RNA isoliert wurde, resuspendieren Sie sie in 20 μL nukleasefreiem Wasser. Wenn Halbreaktionen des T7-Transkriptionskits verwendet wurden, um den Pool von sgRNAs zu transkribieren, resuspendieren Sie die gereinigte RNA in 10-15 μL nukleasefreies Wasser.
  7. Quantifizieren Sie die Menge der gepoolten sgRNAs, die mit einem Spektralphotometer erzeugt wurden. Verdünnen Sie den Pool von sgRNAs in nukleasefreiem Wasser auf eine Verdünnung von 1500 ng / μL ± 500 ng / μL. Typischerweise liegt das Endvolumen der Arbeitsverdünnung zwischen 30 und 50 μL.
  8. Nachdem Sie die Konzentration des Pools von sgRNAs bestimmt haben, überprüfen Sie die Integrität der sgRNAs auf einem 1% igen Agarosegel.
    1. Gießen Sie ein 1% Agarose/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/FSME-Gel. Sobald das Gel erstarrt ist, legen Sie es in den FSME-Laufpuffer.
    2. Mischen Sie 1 μL der sgRNA-Mischung und 1 μL RNA-Gel-Ladepuffer (siehe Materialtabelle). Laden Sie diese Probe in das Gel und lassen Sie das Gel bei 100 V für 5 min laufen.
  9. Visualisieren Sie die Bänder mit ultraviolettem (UV) Licht. Der Pool der sgRNAs sollte als eine einzige Bande erscheinen. Wenn ein Abstrich beobachtet wird, ist wahrscheinlich ein RNA-Abbau aufgetreten.
  10. Lagern Sie den Pool der sgRNAs in 1 μL Aliquots zur einmaligen Verwendung in nukleasefreien PCR-Streifenröhrchen im -80 °C Gefrierschrank. Bei großen Mengen an sgRNAs-Gemischen (30 μL oder mehr) aliquot die Hälfte des Volumens in die nukleasefreien PCR-Streifenröhrchen und speichern Sie die andere Hälfte als größeres Volumen in einem nukleasefreien Mikrozentrifugenröhrchen. Auftauen und bei Bedarf aliquot.
  11. Um einen RNA-Abbau zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Proben im Mikrozentrifugenröhrchen nicht mehr als zwei Gefrier-Tau-Zyklen durchlaufen.

2. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für die Mikroinjektion

HINWEIS: Im Zebrafisch kann die Injektion von Cas9 mRNA zygotische Crispants erzeugen. Studien haben jedoch gezeigt, dass Cas9-Protein effizienter bei der Erzeugung von INDELs in injizierten Embryonenist 16,25. Dieses Protokoll verwendet Cas9-Protein, um mütterliche Crispants zu erzeugen, da dieses Protein nicht die gleiche Verzögerung in der Aktivität erfährt wie injizierte Cas9-mRNA. Theoretisch sollte dies die Wahrscheinlichkeit einer biallelischen Mutation früh in der Entwicklung erhöhen, was zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit führt, dass ein ausgedehnterer Abschnitt der Keimbahn betroffen ist. Andere Protokolle und Ressourcen, die detailliert beschreiben, wie man sich auf Mikroinjektionen vorbereitet, finden Sie an anderer Stelle24,26.

  1. Cas9-Protein kaufen oder erzeugen (siehe Materialtabelle). Resuspendieren Sie das Cas9-Protein in nukleasefreiem Wasser, um eine 2 mg/ml-Lösung herzustellen, und aliquot 1 μL in RNase-freie Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie diese als Einwegröhrchen bei -80 °C.
  2. Verwenden Sie am Nachmittag vor der Injektion einen Mikropipettenzieher, um eine Glaskapillare zu ziehen und eine Injektionsnadel herzustellen. Bewahren Sie die ungebrochene Nadel bis zum Morgen der Mikroinjektionen in einem geschlossenen Nadelhalter auf.
  3. Um eine Injektionsplatte herzustellen, gießen Sie 20 ml 1,5% Agarose/sterilesH2O, um die Hälfte einer 100 mm x 15 mm großen Petrischale zu füllen, und warten Sie, bis sie sich verfestigt hat. Sobald die Agaroselösung fest ist, geben Sie 20 ml 1,5% Agarose/sterilesH2Oin die Petrischale und legen Sie die Kunststoffform (siehe Materialtabelle) in die flüssige Agarose und lassen Sie sie aushärten.
  4. Nachdem die Agarose ausgehärtet ist, entfernen Sie die Kunststoffform und lagern Sie die Spritzplatte kopfüber in einem Kühlschrank bis zum Morgen der Injektionen. Eine einzelne Platte kann für mehrere Injektionen verwendet werden, solange die Vertiefungen ihre Integrität beibehalten.

3. Mikroinjektion des CRISPR-Cas9-Cocktails in einen einzelligen Zebrafischembryo zur Erzeugung mütterlicher Crispants

HINWEIS: Weitere Ressourcen für die Mikroinjektion in Zebrafischembryonen finden Sie an anderer Stelle24,26,27. Die Injektion der CRISPR-Cas9-Mischung in die sich entwickelnde Blastodisc von einzelligen Embryonen kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, mütterliche Crispants zu erzeugen. Die Mischung kann auch bis zum 2-Zell-Stadium in den Dottersack injiziert werden. Mischungen, die in das Eigelb injiziert werden, hängen jedoch von oplasmatischem Strömen ab, um die Blastoscheibe zu erreichen, so dass CRISPR-Cas9, das in das Eigelb injiziert wird, die Schneideffizienz des CRISPR-Cas928 verringern könnte.

  1. Stellen Sie am Nachmittag vor den Mikroinjektionen Wildtyp-Kreuzungen in Zebrafisch-Paarungsboxen auf. Halten Sie sowohl den männlichen als auch den weiblichen Fisch im selben Tank, aber trennen Sie sie mit einem Paarungskastenteiler oder legen Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz.
  2. Nehmen Sie am Morgen des Experiments ein 2 mg/ml Aliquot Cas9-Protein und ein Aliquot aus dem Pool der sgRNAs heraus. In der RNase-freien Polypropylen-Mikrozentrifugenröhre, die das Cas9-Protein enthält, wird eine 5-μL-Injektionsmischung zusammengestellt, die den Pool von sgRNAs, 1 μL 0,5% ige Phenolrotlösung und nukleasefreies Wasser enthält. Ziel ist eine Endkonzentration von 400 ng/μL Cas9-Protein und 200 ng/μL der gepoolten sgRNAs in RNase-freiem Wasser oder ein 2:1-Verhältnis von Cas9-Protein zu sgRNAs im injizierten Embryo. Diese Injektionsmischung kann für den Morgen der Injektion auf Eis gelagert werden.
  3. Nehmen Sie eine Injektionsplatte aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie mindestens 20 Minuten auf Raumtemperatur (RT) erwärmen.
  4. Nachdem der Injektionscocktail zusammengesetzt ist, lassen Sie das Männchen und das Weibchen paaren, z. B. indem Sie den Trennwand der Steckbox entfernen oder das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen.
  5. Nachdem die Fische gelegt haben, aber bevor die Embryonen gesammelt wurden, schneiden Sie die Spitze einer ungebrochenen Nadel mit einer neuen Rasierklinge oder einer feinen Pinzette ab, um eine Nadel zu schaffen, deren Bohrung klein genug ist, um Embryoschäden zu vermeiden, aber breit genug ist, damit sie nicht mit Injektionsmischung verstopft wird. Nachdem die Nadel geschnitten wurde, beladen Sie die Nadel mit der Injektionsmischung unter Verwendung einer Mikroladerpipettenspitze, die in das hintere Ende der Kapillare eingeführt wird (siehe Materialtabellen).
  6. Nachdem die Nadel gefüllt ist, inkubieren Sie die Nadel für 5 min bei RT, um Cas9-sgRNA-Komplexe zusammenzusetzen.
  7. Schalten Sie den Mikroinjektor ein und führen Sie die Nadel in den Mikromanipulator ein. Legen Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerobjektträger und kalibrieren Sie die Nadel durch Einstellen des Einspritzdrucks, bis die Nadel einen 1 nL Bolus in das Mineralöl ausstößt.
    HINWEIS: Bei der Injektion in das Mineralöl hat ein 1-nL-Bolus einen Durchmesser von ca. 0,125 mm (oder einen Radius von 0,062 mm), gemessen mit dem Mikrometerobjektträger.
  8. Um die Embryonen zu synchronisieren, sammeln Sie sie nach 10 min mit einem Kunststoffsieb und spülen Sie sie mit 1x E3-Medien (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4) in eine Petrischale und spülen Sie sie mit 1 l 1x E3 in eine Petrischale ein. Entfernen Sie 10-15 Embryonen und legen Sie sie in eine separate Petrischale, um sie als nicht injizierte Kontrollen zu behalten.
  9. Übertragen Sie den Rest der sich entwickelnden Embryonen in die Vertiefungen der Injektionsplatte.
  10. Injizieren Sie 1 nL Lösung (insgesamt 400 pg Cas9-Protein und 200 pg sgRNAs) in die sich entwickelnde Blastodisc eines einzelligen Embryos. Wenn die Spitze der Nadel verstopft, verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze zurückzubrechen und die Nadel neu zu kalibrieren, um einen 1-nL-Bolus auszustoßen. Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen während der ersten 40 Minuten der Entwicklung nach der Befruchtung injiziert werden.
  11. Nach Abschluss der Injektion geben Sie die injizierten Embryonen in eine markierte Petrischale zurück, die 1x E3-Medien enthält, und lassen Sie sie den ganzen Tag über entwickeln. Entfernen Sie alle Embryonen, die unbefruchtet sind oder sich nicht normal gemäß der Zebrafisch-Staging-Serie29 entwickeln.

4. Screening auf somatische INDELs in injizierten F0-Embryonen

HINWEIS: Andere Methoden zur Identifizierung von INDELs, wie der T7-Endonuklease-I-Test oder die hochauflösende Schmelzanalyse, können verwendet werden, um festzustellen, ob die Embryonen somatische INDELs 30 enthalten.

  1. Am nächsten Tag nach den Injektionen entfernen Sie defekte und lysierte Embryonen aus der Petrischale und ersetzen Sie die 1x E3-Medien, um die Gesundheit des Embryos zu erhalten.
  2. Nachdem Sie die Schale gereinigt haben, sammeln Sie sechs gesunde injizierte Embryonen und zwei Kontrollembryonen von der nicht injizierten Platte. Legen Sie jeden Embryo einzeln in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens und beschriften Sie die Oberseite der Röhrchen.
  3. Um die genomische DNA einzelner Embryonen zu extrahieren, entfernen Sie die überschüssigen E3-Medien aus den Vertiefungen des Streifenrohrs und fügen Sie 100 μL 50 mM NaOH pro Vertiefung hinzu.
  4. Inkubieren Sie die Embryonen bei 95 °C für 20 min. Dann kühlen Sie die Proben auf 4 °C ab, fügen Sie 10 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) hinzu und wirbeln Sie sie für 5 bis 10 s. Diese extrahierte DNA kann bei -20 °C für mindestens 6 Monate ohne signifikanten DNA-Abbau gelagert werden.
  5. Entwerfen Sie einzigartige Screening-Primer für jede Guide-Site, um ein 100-110 bp DNA-Fragment zu amplifizieren, das die CRISPR-Cas9-Zielstelle enthält. Wenn möglich, platzieren Sie die Zielstelle in der Mitte des amplifizierten Fragments, um die Identifizierung größerer Deletionen zu ermöglichen.
  6. Richten Sie für jede der vier Leitzielstellen acht 25-μL-PCR-Reaktionen unter Verwendung von 5 μL der vorbereiteten genomischen DNA eines einzelnen Embryos, eines PCR-Mixes und der leitfadenspezifischen Screening-Primer ein, um somatische Mutationen in der Zielstelle zu identifizieren (Tabelle 1).
  7. Gießen Sie ein 2,5% Agarose/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/FSME-Gel mit Kämmen, die etwa 0,625 cm breite Vertiefungen erzeugen. Dieser breite Kamm ermöglicht eine bessere Auflösung bei der Erkennung von Größenänderungen der genomischen Sequenz. Nachdem das Gel erstarrt ist, legen Sie es in eine Elektrophoresekammer, die FSME-Laufpuffer enthält.
  8. Fügen Sie 5 μL 6x Ladenfarbstoff zum PCR-Produkt hinzu und laden Sie 25 μL dieser Mischung in das Gel. Stellen Sie sicher, dass die injizierten und die Kontrollproben in derselben Reihe des Gels ausgeführt werden. Nachdem alle Proben geladen sind, fügen Sie 5 μL Ethidiumbromid pro 1 L FSME-Laufpuffer zum positiven Ende der Gelbox hinzu.
  9. Lassen Sie das Gel bei 120 V laufen, bis sich die DNA-Banden auflösen oder die DNA sich dem Ende der Spur genähert hat. Wenn das Cas9 INDELs an der Zielstelle erzeugt, wird typischerweise ein Abstrich in injizierten Proben beobachtet, nicht jedoch in den Kontrollen.
  10. Wenn Abstriche an mindestens drei der vier Führungsstellen bei Embryonen beobachtet werden, denen vier Leit-RNAs injiziert wurden, wachsen die injizierten Geschwisterembryonen auf.
  11. Wenn die injizierten Proben keine Abstriche in der erforderlichen Anzahl von Führungsstellen enthalten, entwerfen Sie neue Guide-RNAs, um diejenigen zu ersetzen, die nicht funktioniert haben, und erstellen Sie einen neuen Pool von Guide-RNAs, der die funktionierten und die neu entworfenen enthält. Injizieren und testen Sie den neuen Pool für somatische INDELs wie oben beschrieben.

5. Identifizierung maternaler Effekt-Phänotypen in maternalen Crispant-Embryonen

HINWEIS: Sobald die injizierten F0-Weibchen die Geschlechtsreife erreicht haben, haben ihre Keimbahnzellen das Potenzial, eine Mischung aus mütterlichen Crispant- und Wildtyp-Embryonen zu erzeugen. Obwohl diese Mischung interne Kontrollen für die Befruchtung und das Entwicklungstiming ermöglicht, ist es dennoch vorteilhaft, eine Wildtyp-Kreuzung als externe Kontrolle einzurichten, falls ein Gelege von F0-Weibchen nur mütterliche knusprige Embryonen enthält.

  1. Am Nachmittag vor dem Experiment stellten die F0-injizierten Weibchen gegen Wildtyp-Männchen auf und kontrollierten Wildtyp-Kreuzungen in Standard-Zebrafisch-Paarungsboxen. Setzen Sie sowohl den männlichen als auch den weiblichen Fisch in dasselbe Becken, trennen Sie sie jedoch mit einem Paarungskastenteiler oder legen Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz.
  2. Lassen Sie das Männchen und das Weibchen am Morgen des Experiments mit der Paarung beginnen, z. B. indem Sie den Trennkasten entfernen oder das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen.
  3. Sammeln Sie die Embryonen alle 10 Minuten, indem Sie den Eiablageeinsatz in einen neuen Boden des Paarungsbeckens bewegen, der frisches Systemwasser enthält, und den Tank mit einem Etikett versehen, das das einzelne F0-Weibchen identifiziert. Nehmen Sie das alte Paarungsbecken und gießen Sie das Wasser durch ein Teesieb, um die Embryonen aus einem einzelnen 10-minütigen Gelege zu sammeln.
  4. Nachdem die Embryonen eines einzigen 10-minütigen Geleges im Sieb gesammelt wurden, werden sie in eine Petrischale mit 1x E3-Medien überführt. Beschriften Sie die Petrischale mit dem Zeitpunkt der Entnahme und den Fischinformationen.
  5. Beobachten Sie unter einem Seziermikroskop mit einer Durchlichtquelle die Entwicklung der Embryonen jede Stunde für die ersten 6-8 h und täglich für die nächsten 5 Tage.
  6. Identifizierung potenzieller mütterlicher Crispant-Embryonen durch grobe morphologische Veränderungen in ihrer Entwicklung im Vergleich zu zeitangepassten Wildtyp-Kontrollen29.
  7. Bringen Sie die potenziellen mütterlichen Crispant-Embryonen in eine Petrischale, die 1x E3-Medien und Assay für den morphologischen Phänotyp bei 24 hpf und die Lebensfähigkeit (z. B. Schwimmblaseninflation) 5 Tage nach der Befruchtung enthält.

6. Sequenzierung von Allelen in mütterlichen Crispant-Haploiden

HINWEIS: Maternale Crispant-Haploide enthalten ein einzelnes Allel im Ziellocus, was die Identifizierung von INDELs im Zielgen mittels Sanger-Sequenzierung ermöglicht. Mütterliche Crispant-Haploide-Embryonen können auch mit Next-Generation-Sequenzierungsassays analysiert werden. Es wird erwartet, dass Embryonen, die einen mütterlichen Crispant-Phänotyp aufweisen, eine Läsion an mindestens einer der vier Zielstellen tragen (siehe Diskussion).

  1. Am Nachmittag vor dem Experiment wurden Paarungspaare von F0-Weibchen aufgestellt, von denen bekannt ist, dass sie mütterliche Crispant-Embryonen produzieren, die mit Wildtyp-Männchen gekreuzt wurden. Halten Sie die Wildtyp-Männchen physisch von den Weibchen mit einem Paarungskastenteiler getrennt oder legen Sie das Weibchen in den Eiablageeinsatz.
  2. Entfernen Sie am Morgen des Experiments die physische Trennwand oder legen Sie sowohl die Männchen als auch die Weibchen in den Eiablageeinsatz, um die Paarung einzuleiten. Bei den ersten Anzeichen einer Eiablage unterbrechen Sie die Brut, indem Sie das Männchen und das F0-Weibchen trennen. Bewahren Sie jedes getrennte F0-Weibchen in einzelnen Steckboxen auf.
  3. Bereiten Sie UV-behandelte Spermienlösung unter Verwendung von Hoden eines Wildtyp-Männchens für jeweils 100 μL Hank-Lösung vor (Tabelle 2), die ausreicht, um extrudierte Eier von einem Weibchen zu befruchten, wie zuvor beschrieben31.
  4. Extrudieren Sie manuell reife Eier von den vorausgewählten F0-Weibchen und führen Sie eine In-vitro-Fertilisation (IVF) mit den UV-behandelten Spermiendurch 31.
  5. Lassen Sie nach der In-vitro-Fertilisation die haploiden Embryonen sich entwickeln, bis der mütterliche Crispant-Phänotyp beobachtet ist, und legen Sie diese Embryonen in eine andere Petrischale.
  6. Sobald die mütterlichen haploiden Crispant-Embryonen identifiziert wurden, lassen Sie sie mindestens 6 Stunden nach der Befruchtung entwickeln.
  7. Um die genomische DNA aus mindestens zehn mütterlichen haploiden Crispant-Embryonen zu extrahieren, legen Sie einen einzelnen haploiden Embryo in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens, entfernen Sie überschüssige E3-Medien aus der Vertiefung und fügen Sie 50 μL 50 mM NaOH hinzu.
  8. Inkubieren Sie die Embryonen bei 95 °C für 20 min. Dann kühlen Sie die Proben auf 4 °C ab, fügen Sie 5 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) hinzu und wirbeln Sie für 5-10 s. Die extrahierte DNA kann bei -20 °C bis zu 6 Monate gelagert werden.
  9. Um zu identifizieren, welche Leitstellen INDELs enthalten, entwerfen Sie Sequenzierungsprimer, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das alle vier CRISPR-Cas9-Zielstellen enthält. Diese Sequenzierungsprimer ermöglichen die Identifizierung von INDELs, die sich über mehrere Führungsstellen erstrecken.
  10. Richten Sie zwei 25-μL-PCR-Reaktionen pro Embryo unter Verwendung von 5 μL der vorbereiteten genomischen DNA und der Sequenzierungsprimer ein.
  11. Nachdem die PCR abgeschlossen ist, reinigen und konzentrieren Sie die beiden Proben mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit (siehe Materialtabelle). Dann reichen Sie das DNA-Fragment an die Sanger-Sequenzierung mit den Vorwärts- und Rückwärtssequenzierungsprimern ein.
  12. Nachdem das haploide mütterliche Crispant-Fragment sequenziert wurde, richten Sie es an die Wildtyp-Sequenz aus und identifizieren Sie INDELs an den Zielstellen mit einem Sequenz-Alignment-Programm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der in diesem Protokoll beschriebene experimentelle Ansatz ermöglicht die schnelle und ressourcenschonende Identifizierung mütterlicher Effektphänotypen (Abbildung 1).

Erzeugung von mütterlichen Knuspern:
Bei der Entwicklung der vier Guide-RNAs für ein einzelnes Kandidaten-Gen mit mütterlichem Effekt sollte besonders berücksichtigt werden, wo die Guide-RNAs an DNA binden. Im Allgemeinen sollten sie alle zusammen mit minimalen bis keinen überlappenden Regionen zwischen Guide-RNAs zu Beginn der ersten vorhergesagten Proteindomäne gruppiert sein (Abbildung 2A). Das Targeting der Guide-RNAs auf diese Domäne erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass sowohl In-Frame- als auch Out-of-Frame-INDELs die Funktion des Proteins beeinflussen. Andere Variablen, die beim Design von Guide-RNAs berücksichtigt werden sollten, sind die Schnitteffizienz und die Anzahl der Off-Target-Stellen im Genom.

Nach Injektion der CRISPR-Cas9-Lösung kann die somatische Aktivität von Cas9 bestimmt werden, indem ein kleines PCR-Fragment von etwa 100 bp auf ein Agarosegel aufgetragen wird. Wenn INDELs im injizierten Embryo erzeugt wurden, sollte ein Abstrich in den injizierten Proben beobachtet werden, nicht jedoch in der nicht injizierten Kontrolle (Abbildung 2B). Jede Leitstelle sollte unabhängig voneinander auf Cas9-Aktivität in somatischen Zellen getestet werden. Wenn Abstriche an mindestens drei Leitstellen beobachtet werden, sollten die injizierten Geschwisterembryonen aufgewachsen und auf mütterliche Crispant-Phänotypen untersucht werden.

Identifizierung von mütterlichen Crispants:
Um festzustellen, ob mütterliche Crispants in natürlichen Kreuzungen erzeugt werden, können die Embryonen eines weiblichen F0-Fisches mit zeitlich abgestimmten Wildtypkontrollen verglichen werden, um Veränderungen in der frühen Entwicklung zu beobachten. F0-Kupplungen sollten auch bei 24 hpf und 5 Tagen nach der Befruchtung bewertet werden, um die Entwicklung des grundlegenden Körperplans bzw. der Lebensfähigkeit zu untersuchen, um mütterliche Faktoren zu identifizieren, die spätere Stadien der Embryonalentwicklung regulieren könnten. Die Identifizierung eines gemeinsamen Phänotyps in Gelegen verschiedener F0-Weibchen erleichtert die Unterscheidung von Effekten, die durch den Funktionsverlust eines Zielgens verursacht werden, von Off-Target- oder unspezifischen Effekten.

Darüber hinaus sind Gelege, die mütterliche Crispants enthalten, typischerweise mosaikartig (dh sie umfassen sowohl phänotypische Wildtyp- als auch mütterliche Crispant-Embryonen), so dass Wildtyp-Embryonen als interne Kontrolle für Variablen wie Befruchtungszeitpunkt und Entwicklungsrate fungieren können. Im Durchschnitt enthalten Gelege von F0-Weibchen etwa 69% mütterliche Crispant-Embryonen, wobei Gelege bis zu 100% mütterliche Crispant-Embryonen enthalten11.

Nach der Identifizierung mütterlicher Crispant-Embryonen können sie zur primären molekularen Charakterisierung verwendet werden, d.h. zur Immunmarkierung für Zellgrenzen oder zur Färbung von DNA mit DAPI, was einen Einblick in die zelluläre Natur des betroffenen Entwicklungsprozesses geben kann11. Die maternale Crispant-Methode kann auch verwendet werden, um bekannte maternale Effektmutationen wie Motley, TMI und Aura zu phänokopieren (Abbildung 3)11.

Sequenzierung mütterlicher Crispant-Haploide:
Um die genetische Läsion(en) zu identifizieren, die zum mütterlichen Crispant-Phänotyp beitragen, werden UV-behandelte Spermien und IVF kombiniert, um mütterliche Crispant-Haploide zu erzeugen (Abbildung 4). UV-behandelte Spermien liefern eine Zentriole, tragen aber keine väterliche DNA bei, so dass die Zellteilung nur mit mütterlichem genomischem Material stattfinden kann. Die Erstellung eines haploiden Prozesses ermöglicht die Sanger-Sequenzierung des mütterlichen Allels und die Identifizierung mütterlicher Crispant-INDELs (Abbildung 4). Im Durchschnitt wurden zwei Allele pro Gelege mütterlichen Crispant haploid beobachtet. Die mittels Sanger-Sequenzierung identifizierten INDELs umfassen Bearbeitungen sowohl an einzelnen Führungsstellen als auch an Löschungen, die sich über mehrere Führungsstellen erstrecken (Abbildung 4C, Tabelle 3). Eine Untersuchung mütterlicher Crispant-haploider INDELs von verschiedenen F0-Weibchen zeigt, dass die gleichen Leitstellen in mehreren Embryonen bearbeitet werden und die meisten der wiederhergestellten Mutationen vorzeitige Stop-Codons sind (Tabelle 3)11.

Figure 1
Abbildung 1: Mütterlicher Crispant-Workflow. Um ein mütterliches Crispant zu erzeugen, entwerfen Sie zunächst vier gRNAs, die auf die erste aktive Domäne des Gens abzielen. 1) Dann synthetisieren Sie die vier gRNAs in einer einzigen Reaktion. 2) Nach der Synthese und Reinigung der gRNAs einen CRISPR-Cas9-Cocktail erzeugen und in die Blastodisc eines einzelligen Embryos injizieren. 3) Als nächstes screenen Sie die injizierten Embryonen auf somatische Mutationen mittels PCR und Gelelektrophorese. Wenn INDELs in injizierten Proben erzeugt würden, würde ein Abstrich in den injizierten Embryonen erscheinen, im Gegensatz zu dem engen Band der Wildtyp-Kontrolle. 4) Lassen Sie die Geschwister der injizierten Embryonen 3-6 Monate wachsen, um die Geschlechtsreife zu erreichen. Nachdem die Geschlechtsreife erreicht ist, kreuzen Sie ein F0-injiziertes Weibchen gegen ein Wildtyp-Männchen. Die resultierenden Nachkommen können eine Mischung aus Wildtyp- und mütterlichen Crispant-Embryonen sein. Identifizieren Sie eine F0-injizierte Frau, deren Embryonen den mütterlichen Phänotyp aufweisen. 5) Um die Läsionen zu identifizieren, die zum Phänotyp beitragen, wird die IVF mit UV-behandelten Spermien durchgeführt, um mütterliche Crispant-Haploiden für die Sanger-Sequenzierung zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Erzeugung von INDELs in Zielgenen. (A) Genstrukturdiagramm, das hypothetische Proteindomänen (hell- und dunkelviolette Blöcke), die Position von gRNAs (rote Linien) und PAM-Stellen (rote Sterne) zeigt. Die gRNAs sind auf die erste aktive Domäne ausgerichtet. Exons werden als Blöcke und Introns als Linien dargestellt. (B) Abstriche in einem 2,5%igen Agarosegel weisen auf INDELs in somatischen Zellen injizierter Embryonen hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Maternale Crispants rekapitulieren den Phänotyp bekannter maternaler Effektmutationen. Repräsentativer Vergleich von lebenden, zeitlich abgestimmten Wildtyp-Embryonen (linke Spalte), bekannten mütterlichen Mutanten (mittlere Spalte) und mütterlichen Crispant-Embryonen (rechte Spalte). (A) bunt zusammengewürfelt/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura/mid1ipIl-Mutanten/mütterliche Crispants zeigen Defekte in der Zytokinese in frühen embryonalen Teilungen, was zu vollständig synzytialen Blastula (A, B) oder teilweise azellulären Embryonen (C, White Box) führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Verwendung mütterlicher Crispant-Haploide zur Sequenzierung von CRISPR-Cas9-induzierten Mutationen . (A) Ein F0-injiziertes Weibchen, das gegen ein Wildtyp-Männchen gekreuzt wird, führt zu einem diploiden Embryo mit einem mütterlichen Effektphänotyp. (B) IVF wird mit UV-behandelten Spermien durchgeführt, um mütterliche Crispant-Haploide zu erzeugen, was die Sequenzierung und Analyse von induzierten INDELs im mütterlichen Allel ermöglicht. (C) Repräsentative Sequenzierung von birc5b maternal crispant haploid mit einer großen Deletion zwischen den Leitstellen 3 und 4 (verpackt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

PCR-Mix
Hinzufügen
sterilH2O 171,12 ml
MgCl2 (1 M) 0,393 ml
Tris-HCl (1 M, pH 8,4) 2.618 mL
KCl (1 M) 13.092 mL
Autoklav für 20 min, dann kühlen Sie die Lösung auf Eis. Weiter hinzufügen
BSA (100 mg / ml) 3.468 ml
dATP (100 mM) 0,262 ml
dCTP (100 mM) 0,262 ml
dGTP (100 mM) 0,262 ml
dTTP (100 mM) 0,262 ml
Aliquot in sterile Mikrozentrifugenröhrchen
PCR Rezept pro Probe
PCR-Mix 17,9 μL
F + R Primer (10 μM) 0,2 μL
ROH2O 1,8 μL
Taq-DNA-Polymerase 0,1 μL
DNS 5 μL

Tabelle 1: PCR-Mix.

Hanks Lösung
Hanks Premix Kombinieren Sie die folgenden in der angegebenen Reihenfolge: (1) 10,0 ml HS # 1, (2) 1,0 ml HS # 2, (3) 1,0 ml HS # 4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS # 5. Alle HS-Lösungen bei 4 °C lagern
Hank's Stock Solution #1 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl in 100 mLddH2O
Hank's Stock Solution #2 0,358 g Na2HPO4 wasserfrei; 0,60 gK2H2PO4 in 100 mLddH2O
Hank's Stock Solution #4 0,72 g CaCl2 in 50 mLddH2O
Hank's Stock Solution #5 1,23 g MgSO4·7H2O in 50 mLddH20
Hank's Stock Solution #6 0,35 g NaHCO3 in 10,0 mlddH20; am Tag des Gebrauchs frisch machen
Hanks endgültige Arbeitslösung Kombinieren Sie 9,9 ml Hank's Premix mit 0,1 ml HS Stock #6

Tabelle 2: Hanks Lösung.

birc5b #1 birc5b #2 birc5b #3 PRC1L #1 PRC1L #2
Gesamtzahl der sequenzierten Embryonen 3 9 12 8 10
Gesamtzahl der Embryonen mit INDELs 3 9 12 8 10
Mutation an einer Stelle 0 0 0 0 0
Mutationen an mehreren Stellen 3 9 12 8 10
Standort von INDELs
Reiseführer Seite 1 0 0 0 0 0
Guide Seite 2 0 0 0 8 10
Guide Seite 3 3 9 12 8 10
Reiseführer Seite 4 3 9 12 0 10
Arten von INDELs
In-Frame-Mutation 1 2 2 7 10
Frame-Shift-Mutation 4 7 10 9 10

Tabelle 3: Die Position und Art der INDELs, die in zwei verschiedenen Gruppen von mütterlichen Crispant-Haploiden gefunden wurden: birc5b und prc1l.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das in diesem Manuskript vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und primäre molekulare Charakterisierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation anstelle der mehreren Generationen, die für vorwärts- und rückwärtsgenetische Techniken erforderlich sind. Derzeit ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene unbekannt. Dieser Mangel an Wissen ist zum Teil auf die zusätzliche Generation zurückzuführen, die erforderlich ist, um einen Phänotyp bei der Identifizierung von Genen mit mütterlicher Wirkung sichtbar zu machen. In der Vergangenheit konnte die schnelle Identifizierung von Genen mit maternaler Wirkung im Zebrafisch durch Injektion translationsblockierender Morpholino-Oligonukleotide in kultivierte Eizellen erreichtwerden 32. Diese Methode hat sich als erfolgreich erwiesen, indem mehrere bekannte mütterliche Effektgene phänokopiert wurden, aber die Manipulation einer unreifen Eizelle kann ein heikles, zeitaufwendiges Experiment sein. Mütterliche RNAs können auch mit CRISPR-RfxCas13d-Komplexen gezielt abgebaut werden, aber die Injektion dieser Komplexe in den einzelligen Embryo kann nicht auf das mütterlich bereitgestellte Protein33 abzielen. In jüngerer Zeit wurde entdeckt, dass CRISPR-Cas9 biallelische Mutationen in der Keimbahn induzieren kann, was die schnelle Identifizierung neuer Gene mit mütterlicher Wirkung in einer einzigen Generationermöglicht 11.

Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte, die zur Wiederherstellung mütterlicher Crispant-Embryonen beitragen. Da Keimzellen in der frühen Embryonalentwicklung spezifiziert werden, ist theoretisch die Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle, die Mutationen enthält, Teil der Keimbahn wird, umso höher, je früher eine DNA-Läsion in einem Zielgen erzeugt wird. Diese Methode verwendet Cas9-Protein, das in die sich entwickelnde Blastodisc eines einzelligen Embryos injiziert wird, um die Wahrscheinlichkeit von Veränderungen in der Keimbahn zu erhöhen. Ein weiterer kritischer Faktor, der den Prozentsatz der wiedergewonnenen mütterlichen Crispant-Embryonen beeinflusst, ist die Effizienz der Guide-RNAs bei der Erstellung genetischer Schnitte an Zielstellen. Dieses Verfahren enthält einen Abschnitt über die Bestimmung der Fähigkeit von Guide-RNAs, somatische INDELs bei 24 hpf mittels PCR zu erzeugen. Wenn eine Guide-RNA keine somatischen Bearbeitungen vornimmt, ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass sie in der Keimbahn mit einer ausreichend hohen Rate Änderungen erzeugt, um ein mütterliches Crispant zu erzeugen. Dieses Protokoll weist den Benutzer an, somatische Bearbeitungen zu testen, die in drei oder mehr Anleitungen sichtbar sein sollten.

Nach Beobachtung des Phänotyps mütterlicher Crispant-Embryonen können die genetischen Läsionen, die zum Phänotyp beitragen, auf Sequenzebene mittels IVF mit UV-behandelten Spermien analysiert werden. Um genügend Ausgangsmaterial für die PCR zu erhalten, sollten sich mütterliche haploide Crispant-Embryonen für mindestens sechs bis acht Stunden entwickeln, so dass mehrere Zyklen der DNA-Replikation stattfinden können. Die genomische DNA sollte auch in 50 μL 50mM NaOH extrahiert werden, um die DNA zu konzentrieren. Wenn die mütterlichen haploiden Crispant-Embryonen 6-8 h nicht überleben können, sammeln Sie die Embryonen zu einem früheren Zeitpunkt. Um zu erklären, dass der Embryo weniger DNA-Replikationszyklen durchläuft, extrahieren Sie die DNA in einem kleineren Volumen von 50 mM NaOH unter Beibehaltung des gleichen Anteils an NaOH und Tris-HCL. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die extrahierte DNA mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit zu konzentrieren. Nach der DNA-Extraktion sollte das für die Sequenzierung verwendete PCR-Fragment möglichst alle vier Zielstellen umfassen. Dieses Fragment ermöglicht die Identifizierung großer Deletionen, die sich über mehrere Führungsstellen in mütterlichen Crispant-Embryonen erstrecken.

Wenn Sie mütterliche Crispant-Haploide für die Sanger-Sequenzierung sammeln, sammeln Sie alle Haploide, die den Phänotyp zeigen, und senden Sie mindestens 10 einzigartige haploide Embryonenproben zur Sanger-Sequenzierung. Die Sequenzierung mehrerer haploider Embryonen pro Gelege ermöglicht die Identifizierung mehrerer INDELs in der Keimbahn. Frühere Sequenzierungsdaten von mütterlichen Crispant-Haploiden haben gezeigt, dass mehrere Allele in einer Reihe von mütterlichen Crispant-Haploiden identifiziert werden können11. Diese Allele werden jedoch nicht im erwartetenVerhältnis 1 zu 11 wiederhergestellt. Die Sequenzierung mehrerer Embryonen wird auch dazu beitragen, die Idee zu unterstützen, dass der Phänotyp durch ein CRISPR-Cas9 INDEL im Zielgen verursacht wird. Jede Wildtyp-Sequenz, die in sequenzierten haploiden Embryonen beobachtet wird, die einen spezifischen Phänotyp aufweisen, deutet darauf hin, dass der Phänotyp nicht mit dem Zielgen assoziiert ist. Alle neuen mütterlichen Phänotypen, die durch das Targeting zuvor nicht charakterisierter Gene identifiziert wurden, sollten ebenfalls durch die Etablierung einer stabilen Linie unter Verwendung der Geschwister F0-Männchenbestätigt werden 11.

In einigen Fällen kann es schwierig sein, INDELs durch haploide Analyse zu identifizieren, wenn der identifizierte mütterliche Crispant-Phänotyp ein bestimmtes phänotypisches Merkmal aufweist. Zum Beispiel können mütterliche knusprige haploide Embryonen, die unbefruchtet zu sein scheinen, oder Lyse während der Spaltungsphase unmöglich ausgewählt werden. Mütterliche Crispant-Embryonen mit Achsverlängerungsdefekten, die denen ähneln, die dem haploiden Syndrom entsprechen, sind für die Analyse bei der Erzeugung maternaler Haploiden möglicherweise ebenfalls nicht unterscheidbar34. In solchen Fällen wird dem Forscher empfohlen, die Analyse direkt mit stabilen Linien zur Gen-Phänotyp-Bestätigung durchzuführen.

Eine Einschränkung des derzeitigen mütterlichen Crispant-Protokolls besteht darin, dass es nur mütterliche Effektgene durch grobe morphologische Defekte identifiziert. Um die Empfindlichkeit der Methode zu erhöhen und sie für bestimmte Aspekte der frühen Entwicklung spezifischer zu machen, könnten transgene Reporter verwendet werden, um bestimmte Strukturen oder Zelltypen hervorzuheben, wie dies für andere Screens 9,10,35 geschehen ist. Zum Beispiel könnte die CRISPR-Cas9-Mischung in die transgene Buc-GFP-Linie injiziert werden, um nicht-letale Gene zu identifizieren, die die Bildung und Entwicklung von primordialen Keimzellenregulieren 36. Eine weitere Einschränkung des mütterlichen Crispant-Protokolls besteht darin, dass es, obwohl es für Gene nützlich ist, die ausschließlich während der frühen Entwicklung exprimiert werden, möglicherweise nicht für Gene mit mütterlicher und zygotischer Funktion wirksam ist, da das CRISPR-Cas9-Targeting des Gens für den sich entwickelnden Embryo tödlich sein könnte. Um die mütterliche Funktion von Genen zu untersuchen, die während der gesamten Entwicklung exprimiert werden, könnte die Cas9-Aktivität auf die Keimbahn37 ausgerichtet werden, wodurch die somatische Funktion des Gens unberührt bleibt und das Überleben der F0-Weibchen bis ins Erwachsenenalter ermöglicht wird.

Maternale Crispants sind ein wirksames Werkzeug, um neue Gene mit mütterlichem Effekt zu identifizieren, die für die frühe Entwicklung notwendig sind. Die Kombination von Multiplexing-Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel und der biallelischen Editierfähigkeit von Cas9 ermöglicht es, den mütterlichen Effekt-Phänotyp in einer einzigen Generation zu beobachten, wodurch Mehrgenerationen-Züchtungsschemata vermieden werden, die typischerweise bei der Durchführung gezielter Geneditierung erforderlich sind. Die Umgehung mehrerer Generationen verringert den Platz und die Ressourcen, die zur Identifizierung von Genen mit mütterlichem Effekt erforderlich sind.

Zusätzlich zur Identifizierung neuer Gene mit mütterlichem Effekt ermöglicht dieses Protokoll jedem Zebrafischlabor, jede bekannte Mutante mit mütterlichem Effekt zu phänokopieren und zu untersuchen, ohne stabile Linien zu etablieren und aufrechtzuerhalten, was eine detaillierte Analyse der genetischen Wege erleichtert. Prinzipiell kann dieser maternale Crispant-Ansatz auch die Funktion mütterlicher Produkte in nicht-genetischen Modellarten bestimmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Wir danken ehemaligen und aktuellen Mitarbeitern der Tierhaltung des Pelegri Labors für ihre Pflege der Wasseranlage. Wir sind auch dankbar für die Kommentare und Einblicke in das Manuskript von Ryan Trevena und Diane Hanson. Die Finanzierung erfolgte durch NIH-Zuschuss an F.P. (GM065303)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
  3. Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
  4. He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
  5. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
  6. Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  7. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  8. Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
  9. Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
  10. Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
  11. Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
  12. Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
  13. Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
  14. Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
  15. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
  16. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
  17. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  18. Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  19. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  20. Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
  21. White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
  22. Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
  23. Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  24. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
  25. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
  26. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
  27. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
  28. Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
  31. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
  32. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
  33. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  34. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
  35. Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
  36. Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
  37. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

Tags

Genetics early development CRISPR-Cas9 maternal-effect zebrafish genome editing reverse genetics
Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moravec, C. E., Voit, G. C.,… More

Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter