Summary
Tidig utveckling är beroende av moderligt ärvda produkter, och rollen för många av dessa produkter är för närvarande okänd. Häri beskrev vi ett protokoll som använder CRISPR-Cas9 för att identifiera fenotyper för modereffekt i en enda generation.
Abstract
Tidig utveckling beror på en pool av moderfaktorer som ingår i den mogna äggcellen under oogenes som utför alla cellulära funktioner som är nödvändiga för utveckling tills zygotisk genomaktivering. Vanligtvis kräver genetisk inriktning av dessa moderfaktorer en ytterligare generation för att identifiera fenotyper för modereffekt, vilket hindrar förmågan att bestämma rollen för moderligt uttryckta gener under utvecklingen. Upptäckten av de bialleliska redigeringsfunktionerna hos CRISPR-Cas9 har möjliggjort screening av embryonala fenotyper i somatiska vävnader hos injicerade embryon eller "crispants", vilket ökar förståelsen för den roll zygotiskt uttryckta gener spelar i utvecklingsprogram. I den här artikeln beskrivs ett protokoll som är en förlängning av crispant-metoden. I denna metod möjliggör den bialleliska redigeringen av bakterieceller isolering av en modereffektfenotyp i en enda generation, eller "moderchips". Multiplexering styr RNA till ett enda mål främjar effektiv produktion av moderns crispants, medan sekvensanalys av moderns crispant haploids ger en enkel metod för att bekräfta genetiska lesioner som producerar en fenotyp med modereffekt. Användningen av moderns crispants stöder snabb identifiering av viktiga moderligt uttryckta gener, vilket underlättar förståelsen för tidig utveckling.
Introduction
En pool av maternellt deponerade produkter (t.ex. RNA, proteiner och andra biomolekyler) är nödvändig för alla tidiga cellulära processer tills embryots zygotiska genom aktiveras1. Den för tidiga utarmningen av dessa produkter från äggcellen är vanligtvis embryonal dödlig. Trots betydelsen av dessa gener i utvecklingen är rollen för många moderligt uttryckta gener för närvarande okänd. Framsteg inom genredigeringsteknik hos zebrafiskar, såsom CRISPR-Cas9, möjliggör inriktning av moderligt uttryckta gener 2,3,4. Identifieringen av en fenotyp med modereffekt kräver emellertid en extra generation jämfört med en zygotisk fenotyp, vilket kräver mer resurser. Nyligen har den bialleliska redigeringsförmågan hos CRISPR-Cas9 använts för att screena för embryonala fenotyper i somatiska vävnader hos injicerade (F0) embryon, så kallade "crispants"5,6,7,8,9,10. Crispant-tekniken möjliggör resurseffektiv screening av kandidatgener i somatiska celler, vilket underlättar förståelsen för specifika aspekter i utvecklingen. Protokollet som beskrivs i detta dokument möjliggör identifiering av fenotyper för modereffekt, eller "moderchips", i en enda generation11. Detta schema kan uppnås genom att multiplexera guide-RNA till en enda gen och främja bialleliska redigeringshändelser i bakterielinjen. Dessa moderns krispiga embryon kan identifieras med grovmorfologiska fenotyper och genomgå primär karakterisering, såsom märkning för cellgränser och DNA-mönstring11. Kombinerad analys av den observerbara fenotypen och grundläggande molekylär karakterisering av de inducerade INDEL: erna möjliggör förutsägelse av den riktade genens roll i tidig utveckling.
I zebrafisk, under de första 24 h efterbefruktningen (hpf), utvecklas en liten grupp celler till de ursprungliga bakteriecellerna, en föregångare till bakterielinjen12,13,14,15. I kopplingar som läggs av F0-honor beror andelen återvunna moderns crispantembryon på hur många könsceller som innehåller en biallelisk redigeringshändelse i den riktade genen. I allmänhet, ju tidigare redigeringshändelsen inträffar i embryot, desto högre är sannolikheten för att CRISPR-Cas9-mutationer observeras i bakterielinjen. I de flesta fall kommer fenotyperna av moderns krispiga embryon från funktionsförlusten i de två moderallelerna som finns i den utvecklande äggcellen. När äggcellen avslutar meios strängsprutas en av moderns alleler från embryot via den polära kroppen, medan den andra allelen införlivas i moderns pronukleus. Sekvenseringen av flera moderns crispant haploider kommer att representera en blandning av mutationerna (infogningar och / eller deletioner (INDELs)) som finns i könslinjen som bidrar till fenotypen11.
Följande protokoll beskriver de nödvändiga stegen för att skapa CRISPR-Cas9-mutationer i moderseffektgener och identifiera motsvarande fenotyp med hjälp av en moderns crispant-metod (figur 1). Avsnitt ett kommer att förklara hur man effektivt utformar och skapar guide-RNA, medan avsnitt två och tre innehåller kritiska steg för att skapa moderns crispants genom mikroinjektion. Efter injektion av CRISPR-Cas9-blandningen screenas injicerade embryon för somatiska redigeringar via PCR (avsnitt fyra). När de injicerade F0-embryona utvecklas och når sexuell mognad korsas F0-honorna till vilda hanar och deras avkommor screenas för fenotyper med modereffekt (avsnitt fem). Avsnitt sex innehåller instruktioner om hur man gör moderns krispiga haploider som kan kombineras med Sanger-sekvensering för att identifiera de CRISPR-Cas9-inducerade INDELs. Dessutom innehåller diskussionen ändringar som kan göras i protokollet för att öka känsligheten och kraften i denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I studier som ledde till utvecklingen av detta protokoll godkändes alla zebrafiskhus och experiment av University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2).
1. Syntes av guide-RNA
OBS: Zygotiska crispants har skapats med hjälp av ett enda guide-RNA eller multiplexering av flera styr-RNA till ett enda mål 5,6,7,8,9,10. Multiplexeringen av guide-RNA ökar andelen embryon som visar en zygotisk krispig fenotyp10. På grund av denna ökade frekvens av embryon som uppvisar en fenotyp skapas moderns crispants genom att multiplexera fyra guide-RNA till en enda gen. Ett mer detaljerat protokoll om användning av CHOPCHOP för att designa guide-RNA och en glödgningsmetod för att syntetisera guide-RNA för zebrafisk finns någon annanstans 16,17,18,19,20.
- För att identifiera en maternellt uttryckt gen att rikta in sig på, fastställa mRNA-transkriptnivåerna under utveckling via en RNA-sekvensdatabas som ger transkriptominformation från zygot till 5 dagar21. I allmänhet uttrycks moderspecifika gener starkt i det tidiga embryot och bryts ned efter att det zygotiska genomet har aktiverats22.
- När en moderligt uttryckt målgen har identifierats, bestäm den första förutsagda proteindomänen med hjälp av avsnittet "domäner och funktioner" som finns tillgängligt i Ensembl-genomwebbläsaren23. Använd den här domänen som målregion för de fyra guide-RNA:erna.
- Använd guide-RNA-urvalsprogrammet CHOPCHOP för att identifiera fyra guide-RNA-målplatser i den första aktiva domänen. Utforma genspecifika oligonukleotider, som visas nedan för varje målplats. I den genspecifika oligonukleotiden motsvarar N20-sektionen målsekvensen minus PAM-platsen (NGG) från CHOPCHOP. Beställ dessa genspecifika oligonukleotider och den konstanta oligonukleotiden med hjälp av standardavsaltning (se materialförteckning).
Genspecifik oligonukleotid:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - För att skapa en guide-RNA-mall för varje genspecifik oligonukleotid, glödg den till den konstanta oligonukleotiden och fyll i överhängen med T4-DNA-polymeras som tidigare beskrivits16. Efter att de fyra guide-RNA-mallarna har monterats, rena och koncentrera dem tillsammans med hjälp av en DNA-rengöring och koncentratorsats enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
- Syntetisera sgRNA-blandningen från den poolade guide-RNA-mallen med hjälp av ett in vitro T7-transkriptionssats (se materialförteckning). Utför in vitro-transkriptionen enligt tillverkarens instruktioner. Att använda halvreaktioner av T7-transkriptionssatsen kan minska kostnaden per reaktion.
- Efter RNA-syntes, rena den resulterande poolen av sgRNA med hjälp av ett etanol/ammoniumacetatprotokoll som tidigare beskrivits 16,20,24. Efter att RNA har isolerats, återsuspendera det i 20 μl nukleasfritt vatten. Om halvreaktioner av T7-transkriptionssatsen användes för att transkribera poolen av sgRNA, återsuspendera det renade RNA till 10-15 μL nukleasfritt vatten.
- Kvantifiera mängden poolade sgRNA som skapades med hjälp av en spektrofotometer. Späd poolen av sgRNA i nukleasfritt vatten till en utspädning av 1500 ng/μl ± 500 ng/μl. Vanligtvis varierar den slutliga volymen av arbetsutspädningen från 30–50 μl.
- Efter bestämning av koncentrationen av poolen av sgRNA, verifiera integriteten hos sgRNA på en 1% agarosgel.
- Gjut en 1% agaros/0,5 μg/ml etidiumbromid/TBE-gel. När gelén har stelnat placerar du den i TBE-löpbuffert.
- Blanda 1 μl av sgRNA-blandningen och 1 μl RNA-gelbelastningsbuffert (se materialförteckning). Ladda detta prov i gelén och kör gelén vid 100 V i 5 min.
- Visualisera banden med ultraviolett (UV) ljus. Poolen av sgRNA ska visas som ett enda band. Om ett smet observeras har RNA-nedbrytning sannolikt inträffat.
- Förvara poolen med sgRNA i alikvoter för engångsbruk på 1 μl i nukleasfria PCR-bandrör i frysen för -80 °C. För stora volymer sgRNA-blandning (30 μl eller mer) alikvoterar du hälften av volymen i de nukleasfria PCR-bandrören och lagrar den andra halvan som en större volym i ett nukleasfritt mikrocentrifugrör. Tina upp och alikvotera vid behov.
- För att förhindra RNA-nedbrytning, se till att proverna i mikrocentrifugröret inte genomgår mer än två frys-tina cykler.
2. Beredning av reagenser och material för mikroinjektion
OBS: I zebrafisk kan injektionen av Cas9 mRNA skapa zygotiska crispants. Studier har dock visat att Cas9-protein är effektivare för att skapa INDEL i injicerade embryon16,25. Detta protokoll använder Cas9-protein för att generera moderns crispants eftersom detta protein inte upplever samma fördröjning i aktivitet som injicerat Cas9 mRNA. I teorin bör detta öka sannolikheten för en biallelisk mutation tidigt i utvecklingen vilket resulterar i en ökad chans att en mer omfattande del av könslinjen påverkas. Andra protokoll och resurser som beskriver hur man förbereder sig för mikroinjektioner finns någon annanstans24,26.
- Köp eller generera Cas9-protein (se Materialförteckning). Återsuspendera Cas9-proteinet i nukleasfritt vatten för att göra en 2 mg / ml lösning och alikvot 1 μL i RNas-fria polypropenmikrocentrifugrör. Förvara dessa som engångsrör vid -80 °C.
- Eftermiddagen före injektionen, använd en mikropipettdragare för att dra en glaskapillär och skapa en injektionsnål. Förvara den obrutna nålen i en sluten nålhållare tills mikroinjektionsmorgonen är på morgonen.
- För att skapa en injektionsplatta, häll 20 ml 1,5% agaros / steril H2O för att fylla hälften av en 100 mm X 15 mm petriskål och vänta tills den stelnar. När agaroslösningen är inställd, tillsätt 20 ml 1,5% agaros / steril H2O till petriskålen och placera plastformen (se materialtabell) i flytande agaros och låt den härda.
- När agarosen har härdat, ta bort plastformen och förvara injektionsplattan upp och ner i kylskåp tills injektionsmorgonen. En enda platta kan användas för flera injektioner så länge brunnarna bibehåller sin integritet.
3. Mikroinjektion av CRISPR-Cas9-cocktail i ett encelligt zebrafiskembryo för att generera moderns crispants
OBS: Fler resurser för mikroinjektion i zebrafiskembryon finns någon annanstans24,26,27. Att injicera CRISPR-Cas9-blandningen i den utvecklande blastodiscen hos encellsembryon kan öka sannolikheten för att skapa moderliga crispants. Blandningen kan också injiceras i äggula sac upp till 2-cellssteget. Blandningar som injiceras i äggulan är dock beroende av ooplasmatisk strömning för att nå blastodiscen, så CRISPR-Cas9 som injiceras i äggulan kan minska skäreffektiviteten hos CRISPR-Cas928.
- Eftermiddagen före mikroinjektioner, sätt upp kors av vild typ i zebrafiskparningslådor. Förvara både han- och honfisken i samma tank men separera dem med en parningsboxavdelare eller placera honan i en äggläggningsinsats.
- På morgonen för experimentet, ta ut en 2 mg / ml alikvot av Cas9-protein och en alikvot av poolen av sgRNA. I det RNas-fria polypropenmikrocentrifugröret som innehåller Cas9-proteinet, montera en 5 μL injektionsblandning som inkluderar poolen av sgRNA, 1 μL 0,5% fenolröd lösning och nukleasfritt vatten. Sikta på en slutlig koncentration av 400 ng/μL Cas9-protein och 200 ng/μL av de poolade sgRNA i RNasfritt vatten eller ett förhållande 2:1 mellan Cas9-protein och sgRNA i det injicerade embryot. Denna injektionsblandning kan förvaras på is för injektionens morgon.
- Ta ut en injektionsplatta ur kylskåpet och låt den värmas upp till rumstemperatur (RT) i minst 20 minuter.
- Efter att injektionscocktailen har monterats, låt hanen och honan para sig, t.ex. genom att ta bort parningsboxens avdelare eller genom att placera hanen i samma äggläggningsinsats som honan, beroende på vad som är lämpligt.
- Efter att fisken har lagt sig men innan embryona har samlats in, skär spetsen på en obruten nål med ett nytt rakblad eller fina pincett för att skapa en nål som har en borrning som är tillräckligt liten för att undvika embryoskador men är tillräckligt bred så att den inte blir igensatt med injektionsblandning. När nålen har skurits, ladda nålen med injektionsblandningen med hjälp av en mikrolastarpipettspets som sätts in i kapillärens baksida (se Materialtabeller).
- När nålen är fylld, inkubera nålen i 5 minuter vid RT för att montera Cas9-sgRNA-komplex.
- Sätt på mikroinjektorn och sätt in nålen i mikromanipulatorn. Placera en droppe mineralolja på en mikrometerglas och kalibrera nålen genom att justera injektionstrycket tills nålen matar ut en 1 nL bolus i mineraloljan.
OBS: Vid injektion i mineraloljan kommer en 1 nL bolus att ha en diameter på cirka 0,125 mm (eller radie på 0,062 mm) mätt med mikrometerglaset. - För att synkronisera embryona, samla dem efter 10 minuter med en plastsil och skölj dem i en petriskål med 1x E3-media (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 och tillsätt 20 μL0,03 M metylenblått per 1 liter 1x E3). Ta bort 10-15 embryon och placera dem i en separat petriskål som ska förvaras som oinjicerade kontroller.
- Överför resten av de utvecklande embryona till injektionsplattans brunnar.
- Injicera 1 nL lösning (totalt 400 pg Cas9-protein och 200 pg sgRNA) i den utvecklande blastodiscen hos ett encelligt embryo. Om nålspetsen blir igensatt, använd pincett för att bryta tillbaka spetsen och kalibrera om nålen för att mata ut en 1 nL bolus. Se till att injicera alla embryon under de första 40 minuterna av utvecklingen efter befruktning.
- När injektionen är klar, returnera de injicerade embryona i en märkt petriskål som innehåller 1x E3-media och låt dem utvecklas under dagen. Ta bort alla embryon som är obefruktade eller inte utvecklas normalt enligt zebrafiskens iscensättningsserie29.
4. Screening för somatiska INDEL hos F0-injicerade embryon
OBS: Andra metoder för att identifiera INDELs, såsom T7-endonukleas I-analys eller högupplöst smältanalys, kan användas för att bestämma om embryona innehåller somatiska INDELs 30.
- Nästa dag efter injektioner, ta bort defekta och lyserade embryon från petriskålen och byt ut 1x E3-mediet för att upprätthålla embryohälsan.
- Efter rengöring av skålen, samla sex friska injicerade embryon och två kontrollembryon från den oinjicerade plattan. Placera varje embryo individuellt i en enda brunn i ett PCR-remsrör och märk toppen av rören.
- För att extrahera det genomiska DNA:t hos enskilda embryon, ta bort överskottet av E3-media från brunnarna i bandröret och tillsätt 100 μl 50 mM NaOH per brunn.
- Inkubera embryona vid 95 °C i 20 minuter. Kyl sedan ned proverna till 4 °C, tillsätt 10 μl 1 M Tris HCL (pH 7,5) och virvla dem i 5 till 10 s. Detta extraherade DNA kan lagras vid -20 °C i minst 6 månader utan signifikant DNA-nedbrytning.
- Designa unika screeningprimrar för varje guideplats för att förstärka ett 100-110 bp DNA-fragment som inkluderar CRISPR-Cas9-målplatsen. Om möjligt, placera målplatsen i mitten av det förstärkta fragmentet, vilket möjliggör identifiering av större raderingar.
- För var och en av de fyra vägledande målställena ställer du in åtta 25 μL PCR-reaktioner med användning av 5 μL av det beredda genomiska DNA:t med ett embryo, PCR-blandningen och de guidespecifika screeningprimrarna för att identifiera somatiska mutationer på målstället (tabell 1).
- Gjut en 2,5% agaros/0,5 μg/ml etidiumbromid/TBE-gel med hjälp av kammar som skapar cirka 0,625 cm breda brunnar. Denna breda kam möjliggör bättre upplösning när man upptäcker storleksförändringar i den genomiska sekvensen. När gelén har stelnat, placera den i en elektroforeskammare som innehåller TBE-löpande buffert.
- Tillsätt 5 μL 6x laddningsfärg till PCR-produkten och ladda 25 μL av denna blandning i gelén. Se till att de injicerade proverna och kontrollproverna körs på samma rad i gelén. När alla prover har laddats, tillsätt 5 μl etidiumbromid per 1 liter TBE-löpbuffert till gelboxens positiva ände.
- Kör gelén vid 120 V tills DNA-banden löser sig eller DNA har närmat sig slutet av körfältet. Om Cas9 skapade INDELs på målplatsen observeras vanligtvis ett utstryk i injicerade prover men inte kontrollerna.
- Om utstryk observeras på minst tre av de fyra styrplatserna i embryon injicerade med fyra guide-RNA, växa upp de syskoninjicerade embryona.
- När de injicerade proverna inte innehåller utstryk i det önskade antalet guideplatser, utforma nya guide-RNA för att ersätta de som inte fungerade och skapa en ny pool av guide-RNA som inkluderar de som fungerade och de nydesignade. Injicera och testa den nya poolen för somatiska INDELs enligt beskrivningen ovan.
5. Identifiering av moderskapsfenotyper i moderns crispantembryon
OBS: När de injicerade F0-honorna har nått sexuell mognad har deras könsceller potential att generera en blandning av moderns krispiga och vilda embryon. Även om denna blandning möjliggör interna kontroller för befruktning och utvecklingstidpunkt, är det fortfarande fördelaktigt att ställa in en vildtypsincross som en extern kontroll om en koppling från F0-hona endast innehåller moderns krispiga embryon.
- Eftermiddagen före experimentet satte du upp de F0-injicerade honorna mot vilda hanar och kontrollerade vildtypskors i vanliga zebrafiskparningslådor. Placera både han- och honfisken i samma tank men separera dem med en parningsboxdelare eller placera honan i en äggläggningsinsats.
- På morgonen för experimentet, låt hanen och honan börja para sig, t.ex. genom att ta bort parningsboxens avdelare eller placera hanen i samma äggläggningsinsats som honan.
- Samla embryona var 10: e minut genom att flytta äggläggningsinsatsen till en ny parningstankbotten som innehåller färskt systemvatten och märk tanken med en tagg som identifierar den enskilda F0-honan. Ta den gamla parningstanken och häll vattnet genom en tesil för att samla embryon från en individuell 10-minuters koppling.
- När embryona från en enda 10-minuters koppling har samlats i silen, överför dem till en petriskål som innehåller 1x E3-media. Märk petriskålen med tidpunkten för insamling och fiskinformationen.
- Under ett dissekerande mikroskop med en överförd ljuskälla, observera embryon som genomgår utveckling varje timme under de första 6-8 timmarna och dagligen under de närmaste 5 dagarna.
- Identifiera potentiella moderkrispliga embryon genom grova morfologiska förändringar i deras utveckling jämfört med tidsmatchade vildtypskontroller29.
- Flytta de potentiella moderns krispiga embryon till en petriskål som innehåller 1x E3-media och analys för morfologisk fenotyp vid 24 hpf och livskraft (t.ex. simblåseinflation) vid 5 dagar efter befruktning.
6. Sekvensering av alleler i moderns krispiga haploider
OBS: Moderns crispant haploids innehåller en enda allel i det riktade locuset, vilket möjliggör identifiering av INDELs i målgenen via Sanger-sekvensering. Moderns krispiga haploiderembryon kan också analyseras med hjälp av nästa generations sekvenseringsanalyser. Embryon som visar en moderns krispiga fenotyp förväntas bära en lesion på minst en av de fyra målplatserna (se diskussion).
- Eftermiddagen före experimentet satte man upp parningspar av F0-honor som är kända för att producera moderns krispiga embryon korsade till vilda hanar. Håll hanarna av vild typ fysiskt åtskilda från honorna med hjälp av en parningsboxdelare eller placera honan i äggläggningsinsatsen.
- På morgonen av experimentet, ta bort den fysiska partitionen eller placera både män och kvinnor i äggläggningsinsatsen för att initiera parning. Vid det första tecknet på äggläggning, avbryt avel genom att separera hanen och F0-kvinnorna. Förvara varje separerad F0-hona i enskilda parningslådor.
- Bered UV-behandlad spermielösning med testiklar från en vild hane för varje 100 μl Hanks lösning (tabell 2), tillräckligt för att befrukta extruderade ägg från en hona, som tidigare beskrivits31.
- Extrudera mogna ägg manuellt från de förvalda F0-honorna och utför provrörsbefruktning (IVF) med hjälp av UV-behandlade spermier31.
- Efter provrörsbefruktning , låt de haploida embryona utvecklas tills moderns crispant fenotyp observeras och placera dessa embryon i en annan petriskål.
- När moderns krispiga haploida embryon har identifierats, låt dem utvecklas i minst 6 timmar efter befruktning.
- För att extrahera det genomiska DNA:t från minst tio moderns crispant haploida embryon, placera ett enda haploidt embryo i en enskild brunn i ett PCR-remsrör, ta bort överskott av E3-media från brunnen och tillsätt 50 μL 50 mM NaOH.
- Inkubera embryona vid 95 °C i 20 minuter. Kyl sedan ned proverna till 4 °C, tillsätt 5 μl 1 M Tris HCL (pH 7,5) och virvel i 5–10 s. Det extraherade DNA:t kan lagras vid -20 °C i upp till 6 månader.
- För att identifiera vilka guideplatser som innehåller INDELs, designa sekvenseringsprimrar för att förstärka ett DNA-fragment som inkluderar alla fyra CRISPR-Cas9-målplatserna. Dessa sekvenseringsprimrar möjliggör identifiering av INDELs som sträcker sig över flera styrplatser.
- Ställ in två 25 μL PCR-reaktioner per embryo med användning av 5 μL av det beredda genomiska DNA:t och sekvenseringsprimrarna.
- När PCR är klar, rena och koncentrera de två proverna med hjälp av en DNA-sanerings- och koncentratorsats (se materialförteckning). Skicka sedan DNA-fragmentet till Sanger-sekvensering med både framåt- och bakåtsekvenseringsprimrarna.
- Efter att det haploida moderns crispantfragment har sekvenserats, justera det till vildtypssekvensen och identifiera INDELs på målplatserna med hjälp av ett sekvensjusteringsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det experimentella tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll möjliggör identifiering av fenotyper från moderns effekt på ett snabbt och resurseffektivt sätt (figur 1).
Generera moderns crispants:
Vid utformningen av de fyra guide-RNA för att rikta in sig på en enda kandidats modereffektgen, bör särskild hänsyn tas till var guide-RNA kommer att binda till DNA. I allmänhet bör de alla grupperas tillsammans med minimala eller inga överlappande regioner mellan vägledande RNA i början av den första förutsagda proteindomänen (figur 2A). Att rikta in guide-RNA till denna domän ökar chansen att både in-frame och out-of-frame INDELs kommer att påverka proteinets funktion. Andra variabler som bör beaktas vid utformningen av guide-RNA är skäreffektivitet och antalet off-target-platser i genomet.
Efter injektion av CRISPR-Cas9-lösningen kan den somatiska aktiviteten hos Cas9 bestämmas genom att köra ett litet PCR-fragment, cirka 100 bp, på en agarosgel. Om INDEL skapades i det injicerade embryot ska ett utstryk observeras i de injicerade proverna men inte i den oinjicerade kontrollen (figur 2B). Varje guideställe bör testas oberoende av varandra för Cas9-aktivitet i somatiska celler. Om utstryk ses på minst tre ställen ska de syskoninjicerade embryona odlas upp och screenas för moderns krispiga fenotyper.
Identifiering av moderns crispants:
För att avgöra om moderns crispants skapas i naturliga kors kan embryona från en F0-honfisk jämföras med tidsmatchade vildtypskontroller för att observera eventuella förändringar i tidig utveckling. F0-kopplingar bör också poängsättas vid 24 hkf och 5 dagar efter befruktning för att undersöka utvecklingen av den grundläggande kroppsplanen respektive livskraften för att identifiera moderfaktorer som kan reglera senare stadier av embryonal utveckling. Att identifiera en delad fenotyp i kopplingar från olika F0-honor underlättar att skilja effekter orsakade av förlust av funktion hos en målgen från off-target eller icke-specifika effekter.
Dessutom är kopplingar som innehåller moderns crispants vanligtvis mosaik (dvs. de inkluderar både fenotypiska vilda och moderns krispiga embryon), vilket gör att embryon av vild typ kan fungera som en intern kontroll för variabler som befruktningstid och utvecklingshastighet. I genomsnitt kommer kopplingar från F0-honor att innehålla cirka 69% moderns krispiga embryon, med kopplingar som innehåller upp till 100% moderns krispiga embryon observerade11.
Efter att ha identifierat moderns krispiga embryon kan de användas för primär molekylär karakterisering, dvs immunmärkning för cellgränser eller färgning av DNA med DAPI, vilket kan ge insikt i den cellulära naturen hos den drabbade utvecklingsprocessen11. Moderns crispant-metod kan också användas för att fenoskopi kända modereffektmutationer, såsom motley, tmi och aura (figur 3)11.
Sekvensering av moderns krispiga haploider:
För att identifiera de genetiska lesioner som bidrar till moderns krispiga fenotyp kombineras UV-behandlade spermier och IVF för att skapa moderns krispiga haploider (figur 4). UV-behandlade spermier ger en centriole men bidrar inte med faderligt DNA, vilket gör att celldelning kan ske med endast moderns genomiska material. Skapandet av en haploid möjliggör Sanger-sekvensering av moderns allel och identifiering av moderns crispant INDELs (Figur 4). I genomsnitt observerades två alleler per koppling av moderns krispiga haploida. INDEL:erna som identifieras via Sanger-sekvensering inkluderar redigeringar både på enskilda guidewebbplatser och borttagningar som sträcker sig över flera guideplatser (figur 4C, tabell 3). En undersökning av moderns krispiga haploida INDELs från olika F0-honor visar att samma guideställen redigeras i flera embryon, och de flesta av de återvunna mutationerna är för tidiga stoppkodoner (tabell 3)11.
Bild 1: Arbetsflöde för moderns krispiga medel. För att skapa ett moderkrispämne, börja med att designa fyra gRNA som riktar sig mot genens första aktiva domän. 1) Syntetisera sedan de fyra gRNA i en enda reaktion. 2) Efter att ha syntetiserat och renat gRNA, skapa en CRISPR-Cas9-cocktail och injicera den i blastodisc av ett encelligt embryo. 3) Screena sedan de injicerade embryona för somatiska mutationer med hjälp av PCR och gelelektrofores. Om INDEL skapades i injicerade prover skulle ett smet uppträda i de injicerade embryona, i motsats till det snäva bandet i vildtypskontrollen. 4) Låt syskonen till de injicerade embryona växa i 3-6 månader för att nå sexuell mognad. När sexuell mognad har uppnåtts, korsa en F0-injicerad kvinna mot en vild hane. Den resulterande avkomman kan vara en blandning av vilda och moderns skarpa embryon. Identifiera en F0-injicerad kvinna vars embryon visar fenotypen för modereffekt. 5) För att identifiera de lesioner som bidrar till fenotypen utförs IVF med UV-behandlade spermier för att skapa moderns krispiga haploider för Sanger-sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Generering av INDEL i riktade gener. (A) Genstrukturdiagram som visar hypotetiska proteindomäner (ljusa och mörklila block), placering av gRNA (röda linjer) och PAM-platser (röda stjärnor). GRNA är riktade mot den första aktiva domänen. Exoner visas som block och introner visas som linjer. (B) Utstryk i en 2,5% agarosgel är en indikation på INDEL i somatiska celler i injicerade embryon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Moderns crispants rekapitulerar fenotypen av kända modereffektmutationer. Representativ jämförelse av levande, tidsmatchad vildtyp (vänster kolumn), kända modermutanter (mellersta kolumnen) och moderns krispiga embryon (höger kolumn). (A) motley/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura/mid1ipIl mutanter/moderns crispants uppvisar defekter i cytokinese i tidiga embryonala uppdelningar, vilket leder till helt syncytial blastula (A, B) eller delvis acellulära embryon (C, vit låda). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Användning av moderns krispiga haploider för att sekvensera CRISPR-Cas9-inducerade mutationer . (A) En F0-injicerad hona korsad mot en vild hane resulterar i ett diploid embryo med en fenotyp som har moderseffekt. (B) IVF utförs med UV-behandlade spermier för att skapa moderns krispiga haploider, vilket möjliggör sekvensering och analys av inducerade INDEL i moderns allel. (C) Representativ sekvensering av birc5b moderns crispant haploid som visar en stor deletion mellan styrplatserna 3 och 4 (boxade). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PCR-blandning | ||
| Addera | ||
| sterilH2O | 171,12 ml | |
| MgCl2 (1 M) | 0,393 ml | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8,4) | 2.618 ml | |
| KCl (1 M) | 13.092 ml | |
| Autoklav i 20 min, kyl sedan lösningen på is. Nästa tillägg | ||
| BSA (100 mg/ml) | 3.468 ml | |
| dATP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dCTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dGTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dTTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| Alikvot i sterila mikrocentrifugrör | ||
| PCR Recept | per prov | |
| PCR-blandning | 17,9 μl | |
| F + R Primer (10 μM) | 0,2 μL | |
| ROH2O | 1,8 μL | |
| Taq DNA-polymeras | 0,1 μL | |
| DNA | 5 μl | |
Tabell 1: PCR-blandning.
| Hanks lösning | |||
| Hanks premix | Kombinera följande i ordning: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Förvara alla HS-lösningar vid 4 °C | ||
| Hanks lagerlösning #1 | 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl i 100 ml ddH2O. | ||
| Hanks lagerlösning #2 | 0,358 g Na2HPO4 vattenfri; 0,60 g K2H2PO4i 100 ml ddH2O | ||
| Hanks lagerlösning #4 | 0,72 g CaCl2i 50 ml ddH2O | ||
| Hanks lagerlösning #5 | 1,23 gMgSO4·7H2Oi 50 ml ddH20 | ||
| Hanks lagerlösning #6 | 0,35 gNaHCO3 i 10,0 ml ddH20; Gör färskt på användningsdagen | ||
| Hanks slutliga arbetslösning | Kombinera 9,9 ml Hank's Premix med 0,1 ml HS Stock #6 | ||
Tabell 2: Hanks lösning.
| BIRC5B #1 | BIRC5B #2 | BIRC5B #3 | PRC1L #1 | PRC1L #2 | ||
| Totalt antal sekvenserade embryon | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Totalt antal embryon med INDEL | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Mutation på ett ställe | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Mutationer på flera platser | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Placering av INDELs | ||||||
| Guide webbplats 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Guide webbplats 2 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | |
| Guide webbplats 3 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Guide webbplats 4 | 3 | 9 | 12 | 0 | 10 | |
| Typer av INDELs | ||||||
| Mutation i bildrutan | 1 | 2 | 2 | 7 | 10 | |
| Mutation av ramförskjutning | 4 | 7 | 10 | 9 | 10 | |
Tabell 3: Platsen och typen av INDEL som finns i två olika uppsättningar av moderns krispiga haploider: birc5b och prc1l.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras i detta manuskript möjliggör identifiering och primär molekylär karakterisering av en modereffektfenotyp i en enda generation istället för de flera generationer som krävs för både framåt- och bakåtgenetiska tekniker. För närvarande är rollen för många moderligt uttryckta gener okänd. Denna brist på kunskap beror delvis på den extra generation som krävs för att visualisera en fenotyp när man identifierar moderseffektgener. Tidigare kunde den snabba identifieringen av moderseffektgener hos zebrafiskar uppnås genom att injicera translationsblockerande morfolinooligonukleotider i odlade oocyter32. Denna metod visade sig vara framgångsrik genom fenokopiering av flera kända moderseffektgener, men att manipulera en omogen oocyt kan vara ett känsligt, tidskrävande experiment. Moderns RNA kan också riktas mot nedbrytning med hjälp av CRISPR-RfxCas13d-komplex, men injektionen av dessa komplex i encellsembryot kan inte rikta in sig på moderligt tillhandahållet protein33. På senare tid har det upptäckts att CRISPR-Cas9 kan inducera bialleliska mutationer i könslinjen, vilket möjliggör snabb identifiering av nya modereffektgener i en enda generation11.
Detta protokoll innehåller flera kritiska steg som bidrar till återhämtningen av moderns skarpa embryon. I teorin, eftersom bakterieceller specificeras i tidig embryonal utveckling, ju tidigare en DNA-lesion skapas i en målgen, desto högre är sannolikheten för att en cell som innehåller mutationer blir en del av bakterielinjen. Denna metod använder Cas9-protein injicerat i den utvecklande blastodiscen hos ett encellsembryo för att öka sannolikheten för redigeringar i bakterielinjen. En annan kritisk faktor som påverkar andelen återvunna moderns crispantembryon är effektiviteten hos guide-RNA när det gäller att skapa genetiska redigeringar på målplatser. Denna procedur innehåller ett avsnitt om att bestämma förmågan hos guide-RNA att skapa somatiska INDELs vid 24 hpf med PCR. Om ett guide-RNA misslyckas med att göra somatiska redigeringar har det en låg sannolikhet att producera redigeringar i bakterielinjen i tillräckligt hög takt för att generera ett moderns crispant. Detta protokoll uppmanar användaren att testa somatiska redigeringar, som ska vara synliga på tre eller flera guidewebbplatser.
Efter att ha observerat fenotypen hos moderns krispiga embryon kan de genetiska lesioner som bidrar till fenotypen analyseras på sekvensnivå via IVF med UV-behandlade spermier. För att få tillräckligt med utgångsmaterial för PCR bör moderns crispant haploida embryon utvecklas i minst sex till åtta timmar, vilket möjliggör flera cykler av DNA-replikation. Det genomiska DNA:t bör också extraheras i 50 μl 50 mM NaOH för att koncentrera DNA:t. Om moderns krispiga haploida embryon inte kan överleva i 6-8 timmar, samla embryona vid en tidigare tidpunkt. För att ta hänsyn till embryot som genomgår färre cykler av DNA-replikation, extrahera DNA i en mindre volym på 50 mM NaOH samtidigt som samma andel av NaOH och Tris-HCL bibehålls. Ett annat alternativ är att koncentrera det extraherade DNA:t med hjälp av ett DNA-sanerings- och koncentratorkit. Efter att DNA har extraherats bör PCR-fragmentet som används för sekvensering inkludera alla fyra målplatserna, om möjligt. Detta fragment kommer att möjliggöra identifiering av stora deletioner som sträcker sig över flera styrplatser i moderns krispiga embryon.
När du samlar moderns krispiga haploider för Sanger-sekvensering, samla alla haploider som visar fenotypen och skicka minst 10 unika haploida embryoprover till Sanger-sekvensering. Sekvenseringen av flera haploida embryon per koppling möjliggör identifiering av flera INDELs som finns i bakterielinjen. Tidigare sekvenseringsdata för moderns crispant haploider har visat att flera alleler kan identifieras i en uppsättning moderns krispiga haploider11. Dessa alleler återvinns emellertid inte i det förväntade förhållandet1 till 11. Sekvenseringen av flera embryon kommer också att bidra till att stödja tanken att fenotypen orsakas av en CRISPR-Cas9 INDEL i målgenen. Varje vildtypsekvens som observeras i sekvenserade haploida embryon som visar en specifik fenotyp kommer att föreslå att fenotypen inte är associerad med den riktade genen. Alla nya fenotyper med moderseffekt som identifieras genom inriktning på tidigare okarakteriserade gener bör också bekräftas genom att etablera en stabil linje med hjälp av syskonet F0-hanar11.
I vissa fall kan det vara utmanande att identifiera INDEL via haploid analys där den identifierade moderns crispant fenotyp har en viss fenotypisk egenskap. Till exempel kan moderns krispiga haploida embryon som verkar vara obefruktade eller lys under klyvningsstadiet vara omöjliga att välja. Moderns krispiga embryon med axelförlängningsdefekter som liknar dem som motsvarar det haploida syndromet kan inte heller särskiljas för analys när de genererar moderns haploider34. I sådana fall rekommenderas forskaren att genomföra analysen direkt med hjälp av stabila linjer för genfenotypbekräftelse.
En begränsning med det nuvarande moderkrispantprotokollet är att det endast identifierar moderseffektgener genom grova morfologiska defekter. För att öka metodens känslighet och göra den mer specifik för vissa aspekter av tidig utveckling kan transgena reportrar användas för att markera specifika strukturer eller celltyper, vilket har gjorts för andra skärmar 9,10,35. Till exempel kan CRISPR-Cas9-blandningen injiceras i Buc-GFP-transgena linjen för att identifiera icke-dödliga gener som reglerar bildandet och utvecklingen av primordiala könsceller36. En annan begränsning av moderns crispant-protokoll är att även om det är användbart för gener som enbart uttrycks under tidig utveckling, kanske det inte är effektivt för gener med både moderns och zygotisk funktion eftersom CRISPR-Cas9-inriktningen av genen kan vara dödlig för det utvecklande embryot. För att studera moderns funktion hos gener uttryckta under hela utvecklingen kan Cas9-aktivitet riktas mot bakterielinjen37, vilket lämnar genens somatiska funktion opåverkad och möjliggör överlevnad av F0-honorna till vuxen ålder.
Moderns crispants är ett effektivt verktyg för att identifiera nya moderseffektgener som är nödvändiga för tidig utveckling. Kombinationen av multiplexeringsguide RNA till ett enda mål och den bialleliska redigeringsförmågan hos Cas9 gör att modereffektfenotypen kan observeras i en enda generation, vilket undviker avelsscheman för flera generationer som vanligtvis behövs vid riktad genredigering. Förbikopplingen av flera generationer minskar mängden utrymme och resurser som krävs för att identifiera moderseffektgener.
Förutom att identifiera nya modereffektgener, tillåter detta protokoll alla zebrafisklaboratorier att fenoskopi och studera alla kända modereffektmutanter utan att upprätta och upprätthålla stabila linjer, vilket underlättar detaljerad analys av genetiska vägar. I princip kan detta moderns krispiga tillvägagångssätt också bestämma funktionen hos moderprodukter i icke-genetiska modellarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar tidigare och nuvarande Pelegri lab djurhållningspersonal för deras vård av vattenanläggningen. Vi är också tacksamma för kommentarerna och insikten om manuskriptet av Ryan Trevena och Diane Hanson. Finansiering tillhandahölls av NIH-bidrag till F.P. (GM065303)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
| 100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
| 70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
| Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
| Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
| Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
| Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
| Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
| Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
| General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Gloves | Any Maker | ||
| Ice Bucket | Any Maker | ||
| Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Female zebrafish | |||
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
| Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
| MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
| Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
| Micropipeters | Any Maker | ||
| Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
| Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
| Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
| Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
| nuclease-free water | Any Maker | ||
| Paper Towel | Any Maker | ||
| Pastro Pipettes | Any Maker | ||
| PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
| Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
| Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
| Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
| Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatula | Any Maker | ||
| Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
| Tape | Any Maker | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
| Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
| UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
| Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
| 1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse free ethanol | any maker | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
| Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agarose | any maker | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | any maker | ||
| Dissecting Forcepts | any maker | ||
| Dissecting Microscope | any maker | ||
| Dissecting Scissors | any maker | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
| Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fish Net | any maker | fine mesh | |
| Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
| Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
| Gel Electropheresis System | any maker | ||
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
| Glass Dishes | any maker | ||
| Gloves | any maker | ||
| Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ice Bucket | any maker | ||
| Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
| In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Male and Female zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Microinjector | |||
| Microneedle Slide | |||
| Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
| Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
| Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
| Microplastic slide | |||
| Microwave | any maker | ||
| MiliQ Water | any maker | ||
| mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Narrow Spatula | any maker | ||
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Paper Towel | any maker | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
| PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
| Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
| Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software for sanger sequencing Analysis | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterlie H2O | any brand | ||
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Tape | any brand | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
| UV lamp | UVP | ||
| UV safety glasses | any maker | ||
| Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
| Zebrafish mating boxes | any maker | ||
| PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |
References
- Pelegri, F.
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
- He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
- Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
- Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
- Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
- Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
- Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
- Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
- Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
- Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
- White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
- Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
- Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
- Xu, Q.
- Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
- Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
