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Genetics

Déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels

Published: December 21, 2021 doi: 10.3791/63177
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

Le développement précoce dépend des produits hérités de la mère, et le rôle de bon nombre de ces produits est actuellement inconnu. Ici, nous avons décrit un protocole qui utilise CRISPR-Cas9 pour identifier les phénotypes d’effet maternel en une seule génération.

Abstract

Le développement précoce dépend d’un ensemble de facteurs maternels incorporés dans l’ovocyte mature au cours de l’oogenèse qui remplissent toutes les fonctions cellulaires nécessaires au développement jusqu’à l’activation du génome zygotique. En règle générale, le ciblage génétique de ces facteurs maternels nécessite une génération supplémentaire pour identifier les phénotypes d’effet maternel, ce qui entrave la capacité de déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère au cours du développement. La découverte des capacités d’édition biallélique de CRISPR-Cas9 a permis le criblage de phénotypes embryonnaires dans les tissus somatiques d’embryons injectés ou de « crispants », augmentant ainsi la compréhension du rôle que jouent les gènes exprimés zygotiquement dans les programmes de développement. Cet article décrit un protocole qui est une extension de la méthode crispant. Dans cette méthode, l’édition biallélique des cellules germinales permet d’isoler un phénotype d’effet maternel en une seule génération, ou « crispants maternels ». Le multiplexage des ARN guides vers une seule cible favorise la production efficace de crispants maternels, tandis que l’analyse de séquence des haploïdes maternels crispants fournit une méthode simple pour corroborer les lésions génétiques qui produisent un phénotype d’effet maternel. L’utilisation de crispants maternels favorise l’identification rapide des gènes essentiels exprimés par la mère, facilitant ainsi la compréhension du développement précoce.

Introduction

Un pool de produits déposés par la mère (par exemple, ARN, protéines et autres biomolécules) est nécessaire pour tous les processus cellulaires précoces jusqu’à ce que le génome zygotique de l’embryon soit activé1. L’épuisement prématuré de ces produits de l’ovocyte est généralement létal embryonnaire. Malgré l’importance de ces gènes dans le développement, le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère est actuellement inconnu. Les progrès de la technologie d’édition de gènes chez le poisson zèbre, tels que CRISPR-Cas9, permettent de cibler les gènes exprimés par la mère 2,3,4. Cependant, l’identification d’un phénotype d’effet maternel nécessite une génération supplémentaire par rapport à un phénotype zygotique, nécessitant ainsi plus de ressources. Récemment, la capacité d’édition biallélique de CRISPR-Cas9 a été utilisée pour dépister les phénotypes embryonnaires dans les tissus somatiques d’embryons injectés (F0), connus sous le nom de « crispants »5,6,7,8,9,10. La technique de crispant permet un criblage efficace des gènes candidats dans les cellules somatiques, facilitant ainsi la compréhension des aspects spécifiques du développement. Le protocole décrit dans cet article permet d’identifier les phénotypes de l’effet maternel, ou « crispants maternels », en une seule génération11. Ce schéma est réalisable en multiplexant les ARN guides vers un seul gène et en favorisant les événements d’édition bialléliques dans la lignée germinale. Ces embryons maternels crispants peuvent être identifiés par des phénotypes morphologiques macroscopiques et faire l’objet d’une caractérisation primaire, telle que l’étiquetage des limites cellulaires et la structuration de l’ADN11. L’analyse combinée du phénotype observable et la caractérisation moléculaire de base des INDEL induites permettent de prédire le rôle du gène ciblé dans le développement précoce.

Chez le poisson zèbre, au cours des premières 24 heures post-fécondation (HPF), un petit groupe de cellules se développe dans les cellules germinales primordiales, un précurseur de la lignée germinale12,13,14,15. Dans les couvées pondues par les femelles F0, la proportion d’embryons maternels crispants récupérés dépend du nombre de cellules germinales contenant un événement d’édition biallélique dans le gène ciblé. En général, plus l’événement d’édition se produit tôt dans l’embryon, plus la probabilité que des mutations CRISPR-Cas9 soient observées dans la lignée germinale est élevée. Dans la plupart des cas, les phénotypes des embryons maternels crispants proviennent de la perte de fonction des deux allèles maternels présents dans l’ovocyte en développement. Lorsque l’ovocyte termine la méiose, l’un des allèles maternels est extrudé de l’embryon via le corps polaire, tandis que l’autre allèle est incorporé dans le pronucleus maternel. Le séquençage de multiples haploïdes maternels crispants représentera un mélange des mutations (insertions et/ou délétions (INDEL)) présentes dans la lignée germinale qui contribuent au phénotype11.

Le protocole suivant décrit les étapes nécessaires pour créer des mutations CRISPR-Cas9 dans les gènes de l’effet maternel et identifier le phénotype correspondant à l’aide d’une approche de crispant maternel (Figure 1). La première section expliquera comment concevoir et créer efficacement des ARN guides, tandis que les sections deux et trois contiennent des étapes critiques pour la création de crispants maternels par micro-injection. Après l’injection du mélange CRISPR-Cas9, les embryons injectés sont examinés pour les modifications somatiques par PCR (section quatre). Une fois que les embryons F0 injectés se développent et atteignent la maturité sexuelle, les femelles F0 sont croisées avec des mâles de type sauvage, et leur progéniture est examinée pour les phénotypes d’effet maternel (section cinq). La section six comprend des instructions sur la fabrication d’haploïdes maternels crispants qui peuvent être combinés avec le séquençage de Sanger pour identifier les INDEL induites par CRISPR-Cas9. En outre, la discussion contient des modifications qui peuvent être apportées au protocole pour augmenter la sensibilité et la puissance de cette méthode.

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Protocol

Dans les études qui ont conduit à l’élaboration de ce protocole, tous les logements et expériences de poisson zèbre ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).

1. Synthèse des ARN guides

REMARQUE: Les crispants zygotiques ont été créés en utilisant un seul ARN guide ou en multiplexant plusieurs ARN guides vers une seule cible 5,6,7,8,9,10. Le multiplexage des ARN guides augmente le pourcentage d’embryons présentant un phénotype zygotique crispant10. En raison de cette fréquence accrue d’embryons présentant un phénotype, les crispants maternels sont créés en multiplexant quatre ARN guides vers un seul gène. Un protocole plus détaillé sur l’utilisation de CHOPCHOP pour concevoir des ARN guides et une méthode de recuit pour synthétiser les ARN guides pour le poisson zèbre peuvent être trouvés ailleurs 16,17,18,19,20.

  1. Pour identifier un gène exprimé par la mère à cibler, déterminer les niveaux de transcrit d’ARNm pendant le développement via une base de données de séquences d’ARN qui fournit des informations sur le transcriptome du zygote à 5 jours21. En général, les gènes spécifiques à la mère sont fortement exprimés dans l’embryon précoce et sont dégradés après l’activation du génome zygotique22.
  2. Une fois qu’un gène cible exprimé par la mère a été identifié, déterminer le premier domaine protéique prédit à l’aide de la section « domaines et caractéristiques » disponible sur le navigateur génomique Ensembl23. Utilisez ce domaine comme région cible pour les quatre ARN guides.
  3. Utilisez le programme de sélection de l’ARN guide CHOPCHOP pour identifier quatre sites cibles d’ARN guides dans le premier domaine actif. Concevoir des oligonucléotides spécifiques aux gènes, comme indiqué ci-dessous pour chaque site cible. Dans l’oligonucléotide spécifique du gène, la section N20 correspond à la séquence cible moins le site PAM (NGG) de CHOPCHOP. Commandez ces oligonucléotides spécifiques au gène et l’oligonucléotide constant en utilisant la purification standard du dessel (voir le tableau des matériaux).
    Oligonucléotide spécifique du gène :
    5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
  4. Pour créer un modèle d’ARN guide pour chaque oligonucléotide spécifique au gène, recuit à l’oligonucléotide constant et remplir les surplombs avec de l’ADN polymérase T4 comme décrit précédemment16. Une fois les quatre modèles d’ARN guides assemblés, purifiez-les et concentrez-les ensemble à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  5. Synthétiser le mélange d’ARNg à partir du modèle d’ARN guide mis en commun à l’aide d’un kit de transcription T7 in vitro (voir le tableau des matériaux). Effectuer la transcription in vitro selon les instructions du fabricant. L’utilisation de demi-réactions du kit de transcription T7 peut réduire le coût par réaction.
  6. Après synthèse d’ARN, purifier le pool résultant d’ARNg à l’aide d’un protocole éthanol/acétate d’ammonium tel que décrit précédemment 16,20,24. Une fois l’ARN isolé, remettez-le en suspension dans 20 μL d’eau exempte de nucléase. Si des demi-réactions du kit de transcription T7 ont été utilisées pour transcrire le pool d’ARNg, remettre en suspension l’ARN purifié dans 10-15 μL d’eau sans nucléase.
  7. Quantifier la quantité d’ARNg regroupés qui ont été créés à l’aide d’un spectrophotomètre. Diluer le pool d’ARNg dans de l’eau exempte de nucléases jusqu’à une dilution de 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. En règle générale, le volume final de la dilution de travail varie de 30 à 50 μL.
  8. Après avoir déterminé la concentration du pool d’ARNg, vérifier l’intégrité des ARNg sur un gel d’agarose à 1%.
    1. Lancer un gel d’agarose à 1 % / 0,5 μg / mL de bromure d’éthidium / TBI. Une fois que le gel s’est solidifié, placez-le dans un tampon courant de TBE.
    2. Mélanger 1 μL du mélange d’ARNg et 1 μL de tampon de charge de gel d’ARN (voir le tableau des matériaux). Chargez cet échantillon dans le gel et faites fonctionner le gel à 100 V pendant 5 min.
  9. Visualisez les bandes à l’aide de la lumière ultraviolette (UV). Le pool de sgRNAs doit apparaître comme une seule bande. Si un frottis est observé, une dégradation de l’ARN s’est probablement produite.
  10. Entreposer le pool d’ARNg dans des aliquotes à usage unique de 1 μL dans des tubes en bandelettes PCR sans nucléase dans le congélateur à -80 °C. Pour de grands volumes de mélange d’ARNg (30 μL ou plus), aliquote la moitié du volume dans les tubes de bandelette de PCR sans nucléase et stocker l’autre moitié comme un plus grand volume dans un tube de microcentrifugeuse sans nucléase. Décongeler et aliquote au besoin.
  11. Pour prévenir la dégradation de l’ARN, s’assurer que les échantillons dans le tube de microcentrifugation ne subissent pas plus de deux cycles de congélation-dégel.

2. Préparation des réactifs et des matériaux pour la microinjection

REMARQUE: Chez le poisson zèbre, l’injection d’ARNm Cas9 peut créer des croustillants zygotiques. Cependant, des études ont montré que la protéine Cas9 est plus efficace dans la création d’INDELs dans les embryons injectés16,25. Ce protocole utilise la protéine Cas9 pour générer des crispants maternels car cette protéine ne connaît pas le même décalage d’activité que l’ARNm Cas9 injecté. En théorie, cela devrait augmenter la probabilité d’une mutation biallélique au début du développement, ce qui augmenterait le risque qu’une section plus étendue de la lignée germinale soit affectée. D’autres protocoles et ressources détaillant comment se préparer aux micro-injections peuvent être trouvés ailleurs24,26.

  1. Achetez ou générez de la protéine Cas9 (voir le tableau des matières). Remettez en suspension la protéine Cas9 dans de l’eau exempte de nucléases pour obtenir une solution de 2 mg/mL et aliquote 1 μL dans des tubes microcentrifuges en polypropylène sans RNase. Conservez-les sous forme de tubes à usage unique à -80 °C.
  2. L’après-midi précédant l’injection, utilisez un extracteur de micropipette pour tirer un capillaire en verre et créer une aiguille d’injection. Conservez l’aiguille intacte dans un porte-aiguille fermé jusqu’au matin des micro-injections.
  3. Pour créer une plaque d’injection, versez 20 ml d’agarose à 1,5 % / H2O stérile pour remplir la moitié d’une boîte de Petri de 100 mm X 15 mm et attendez qu’elle se solidifie. Une fois la solution d’agarose prise, ajouter 20 mL d’agarose à 1,5 % / H2O stérile à la boîte de Petri et placer le moule en plastique (voir le tableau des matériaux) dans l’agarose liquide et laisser durcir.
  4. Une fois que l’agarose a durci, retirez le moule en plastique et conservez la plaque d’injection à l’envers dans un réfrigérateur jusqu’au matin des injections. Une seule plaque peut être utilisée pour des injections multiples tant que les puits conservent leur intégrité.

3. Microinjection de cocktail CRISPR-Cas9 dans un embryon de poisson-zèbre unicellulaire pour générer des crispants maternels

NOTE: Plus de ressources pour la micro-injection dans les embryons de poisson zèbre peuvent être trouvées ailleurs24,26,27. L’injection du mélange CRISPR-Cas9 dans le blastodisque en développement d’embryons unicellulaires peut augmenter la probabilité de créer des crispants maternels. Le mélange peut également être injecté dans le sac vitellin jusqu’au stade 2 cellules. Cependant, les mélanges injectés dans le jaune dépendent du flux ooplasmique pour atteindre le blastodisque, de sorte que CRISPR-Cas9 injecté dans le jaune pourrait diminuer l’efficacité de coupe du CRISPR-Cas928.

  1. L’après-midi précédant les micro-injections, installez des croisements de type sauvage dans des boîtes d’accouplement de poisson zèbre. Gardez les poissons mâles et femelles dans le même aquarium, mais séparez-les avec un séparateur de boîte d’accouplement ou placez la femelle à l’intérieur d’un insert de ponte.
  2. Le matin de l’expérience, sortez une partie aliquote de 2 mg/mL de protéine Cas9 et une partie aliquote du pool d’ARNg. Dans le tube microcentrifuge en polypropylène sans RNase qui contient la protéine Cas9, assemblez un mélange d’injection de 5 μL qui comprend le pool d’ARNg, 1 μL de solution de rouge phénolique à 0,5 % et de l’eau sans nucléase. Visez une concentration finale de 400 ng/μL de protéine Cas9 et 200 ng/μL des ARNg mélangés dans de l’eau exempte de RNase ou un rapport de 2:1 de la protéine Cas9 aux ARNg dans l’embryon injecté. Ce mélange d’injection peut être conservé sur de la glace pour le matin de l’injection.
  3. Retirez une plaque d’injection du réfrigérateur et laissez-la chauffer à température ambiante (RT) pendant au moins 20 minutes.
  4. Une fois le cocktail d’injection assemblé, laisser le mâle et la femelle s’accoupler, par exemple en retirant le séparateur de boîte d’accouplement ou en plaçant le mâle dans le même insert de ponte que la femelle, selon le cas.
  5. Après la ponte du poisson, mais avant que les embryons aient été recueillis, coupez la pointe d’une aiguille intacte à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir ou d’une pince fine pour créer une aiguille dont l’alésage est assez petit pour éviter les dommages aux embryons, mais suffisamment large pour ne pas être obstruée par le mélange d’injection. Une fois l’aiguille coupée, chargez-la avec le mélange d’injection à l’aide d’une pointe de pipette de microchargeur insérée dans l’extrémité arrière du capillaire (voir Tableaux des matériaux).
  6. Une fois l’aiguille remplie, incuber l’aiguille pendant 5 min à RT pour assembler les complexes Cas9-sgRNA.
  7. Allumez le micro-injecteur et insérez l’aiguille dans le micromanipulateur. Placez une goutte d’huile minérale sur une lame micrométrique et calibrez l’aiguille en ajustant la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille éjecte un bolus de 1 nL dans l’huile minérale.
    REMARQUE: Lors de l’injection dans l’huile minérale, un bolus de 1 nL aura un diamètre d’environ 0,125 mm (ou un rayon de 0,062 mm) tel que mesuré avec la lame micrométrique.
  8. Pour synchroniser les embryons, prélevez-les après 10 min à l’aide d’une passoire en plastique et rincez-les dans une boîte de Petri à l’aide de 1x milieu E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, et ajoutez 20 μL de0,03 M de Bleu de méthylène pour 1 L de 1x E3). Prélever 10 à 15 embryons et les placer dans une boîte de Petri séparée pour les conserver comme témoins non injectés.
  9. Transférer le reste des embryons en développement dans les puits de la plaque d’injection.
  10. Injecter 1 nL de solution (un total de 400 pg de protéine Cas9 et 200 pg d’ARNg) dans le blastodisque en développement d’un embryon unicellulaire. Si l’extrémité de l’aiguille se bouche, utilisez une pince pour casser l’extrémité vers l’arrière et recalibrez l’aiguille pour éjecter un bolus de 1 nL. Assurez-vous d’injecter tous les embryons pendant les 40 premières minutes de développement après la fécondation.
  11. Une fois l’injection terminée, remettez les embryons injectés dans une boîte de Petri étiquetée contenant 1x milieu E3 et laissez-les se développer tout au long de la journée. Enlever tous les embryons qui ne sont pas fécondés ou qui ne se développent pas normalement selon la série de stadification du poisson zèbre29.

4. Dépistage des INDEL somatiques dans les embryons injectés F0

REMARQUE : D’autres méthodes d’identification des INDEL, telles que le dosage de l’endonucléase T7 I ou l’analyse de fusion à haute résolution, peuvent être utilisées pour déterminer si les embryons contiennent des INDEL somatiques 30.

  1. Le lendemain après les injections, retirez les embryons défectueux et lysés de la boîte de Petri et remplacez le support E3 1x pour maintenir la santé de l’embryon.
  2. Après avoir nettoyé le plat, prélevez six embryons injectés sains et deux embryons témoins de la plaque non injectée. Placez chaque embryon individuellement dans un seul puits d’un tube en bande PCR et étiquetez le dessus des tubes.
  3. Pour extraire l’ADN génomique d’embryons individuels, retirez l’excès de milieu E3 des puits du tube en bande et ajoutez 100 μL de NaOH 50 mM par puits.
  4. Incuber les embryons à 95 °C pendant 20 min. Refroidir ensuite les échantillons à 4 °C, ajouter 10 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) et les vorter pendant 5 à 10 s. Cet ADN extrait peut être conservé à -20 °C pendant au moins 6 mois sans dégradation significative de l’ADN.
  5. Concevoir des amorces de criblage uniques pour chaque site guide afin d’amplifier un fragment d’ADN de 100 à 110 pb qui comprend le site cible de CRISPR-Cas9. Si possible, placez le site cible au milieu du fragment amplifié, ce qui permet d’identifier des suppressions plus importantes.
  6. Pour chacun des quatre sites cibles guides, mettre en place huit réactions PCR de 25 μL en utilisant 5 μL d’ADN génomique mono-embryon préparé, le mélange de PCR et les amorces de criblage spécifiques au guide pour identifier les mutations somatiques dans le site cible (tableau 1).
  7. Couler une agarose à 2,5 %/0,5 μg/mL de bromure d’éthidium/gel d’encéphalite à l’aide de peignes qui créent des puits d’environ 0,625 cm de large. Ce peigne large permet une meilleure résolution lors de la détection des changements de taille de la séquence génomique. Une fois que le gel s’est solidifié, placez-le dans une chambre d’électrophorèse contenant un tampon courant de TBE.
  8. Ajouter 5 μL de colorant de chargement 6x au produit PCR et charger 25 μL de ce mélange dans le gel. Assurez-vous que les échantillons injectés et témoins sont exécutés sur la même rangée du gel. Une fois tous les échantillons chargés, ajouter 5 μL de bromure d’éthidium par 1 L de tampon courant de TBE à l’extrémité positive de la boîte de gel.
  9. Exécutez le gel à 120 V jusqu’à ce que les bandes d’ADN se résolvent ou que l’ADN se soit approché de la fin de la voie. Si le Cas9 a créé des INDEL dans le site cible, un frottis est généralement observé dans les échantillons injectés, mais pas dans les témoins.
  10. Si des frottis sont observés dans au moins trois des quatre sites guides dans les embryons injectés avec quatre ARN guides, grandir les embryons injectés frères et sœurs.
  11. Chaque fois que les échantillons injectés ne contiennent pas de frottis dans le nombre requis de sites guides, concevoir de nouveaux ARN guides pour remplacer ceux qui n’ont pas fonctionné et créer un nouveau pool d’ARN guides qui comprend ceux qui ont fonctionné et ceux nouvellement conçus. Injectez et testez le nouveau pool pour les INDEL somatiques comme décrit ci-dessus.

5. Identification des phénotypes de l’effet maternel chez les embryons maternels crispants

NOTE: Une fois que les femelles F0 injectées ont atteint la maturité sexuelle, leurs cellules germinales ont le potentiel de générer un mélange d’embryons maternels crispants et sauvages. Même si ce mélange permet des contrôles internes pour la fécondation et le calendrier de développement, il est toujours avantageux de mettre en place un croisement de type sauvage comme contrôle externe dans le cas où une couvée de femelle F0 ne contient que des embryons maternels crispants.

  1. L’après-midi précédant l’expérience, installez les femelles injectées F0 contre des mâles de type sauvage et contrôlez les croisements de type sauvage dans des boîtes d’accouplement standard de poisson zèbre. Placez les poissons mâles et femelles dans le même aquarium, mais séparez-les à l’aide d’un séparateur de boîte d’accouplement ou placez la femelle à l’intérieur d’un insert de ponte.
  2. Le matin de l’expérience, laissez le mâle et la femelle commencer à s’accoupler, par exemple en retirant le séparateur de boîte d’accouplement ou en plaçant le mâle dans le même insert de ponte que la femelle.
  3. Prélevez les embryons toutes les 10 minutes en déplaçant l’insert de ponte dans un nouveau fond de réservoir d’accouplement contenant de l’eau fraîche du système et étiquetez le réservoir avec une étiquette identifiant la femelle F0 individuelle. Prenez l’ancien réservoir d’accouplement et versez l’eau dans une passoire à thé pour recueillir les embryons d’une couvée individuelle de 10 minutes.
  4. Une fois que les embryons d’une seule couvée de 10 minutes ont été collectés dans la passoire, transférez-les dans une boîte de Petri contenant 1x milieu E3. Étiquetez la boîte de Petri avec l’heure de collecte et les informations sur le poisson.
  5. Sous un microscope à dissection avec une source de lumière transmise, observez les embryons en cours de développement toutes les heures pendant les 6-8 premières heures et quotidiennement pendant les 5 jours suivants.
  6. Identifier les embryons maternels crispants potentiels par des changements morphologiques bruts dans leur développement par rapport aux témoins de type sauvage appariés dans le temps29.
  7. Déplacer les embryons potentiellement crispants maternels dans une boîte de Petri contenant 1x milieu E3 et un test de phénotype morphologique à 24 hpf et de viabilité (par exemple, gonflement de la vessie natatoire) 5 jours après la fécondation.

6. Séquençage des allèles chez les haploïdes croustillants maternels

REMARQUE: Les haploïdes maternels crispants contiennent un seul allèle dans le locus ciblé, ce qui permet l’identification des INDEL dans le gène cible via le séquençage de Sanger. Les embryons haploïdes crispants maternels peuvent également être analysés à l’aide de tests de séquençage de nouvelle génération. On s’attend à ce que les embryons qui présentent un phénotype de crispant maternel soient porteurs d’une lésion dans au moins un des quatre sites cibles (voir la discussion).

  1. L’après-midi précédant l’expérience, mise en place de paires d’accouplement de femelles F0 connues pour produire des embryons maternels crispants croisés avec des mâles de type sauvage. Gardez les mâles de type sauvage physiquement séparés des femelles à l’aide d’un séparateur de boîte d’accouplement ou placez la femelle dans l’insert de ponte.
  2. Le matin de l’expérience, retirez la cloison physique ou placez les mâles et les femelles dans l’insert de ponte pour initier l’accouplement. Au premier signe de ponte, interrompre la reproduction en séparant le mâle et les femelles F0. Gardez chaque femelle F0 séparée dans des boîtes d’accouplement individuelles.
  3. Préparer une solution de sperme traitée aux UV à l’aide de testicules provenant d’un mâle de type sauvage pour chaque tranche de 100 μL de solution de Hank (tableau 2), suffisante pour féconder les œufs extrudés d’une femelle, comme décrit précédemment31.
  4. Extrudez manuellement les ovules matures des femelles F0 présélectionnées et effectuez la fécondation in vitro (FIV) à l’aide du sperme traité aux UV31.
  5. Après la fécondation in vitro , laissez les embryons haploïdes se développer jusqu’à ce que le phénotype de crispant maternel soit observé et placez ces embryons dans une boîte de Petri différente.
  6. Une fois que les embryons haploïdes maternels crispants ont été identifiés, laissez-les se développer pendant au moins 6 heures après la fécondation.
  7. Pour extraire l’ADN génomique d’au moins dix embryons haploïdes maternels crispants, placez un seul embryon haploïde dans un puits individuel d’un tube en bandelette de PCR, retirez l’excès de milieu E3 du puits et ajoutez 50 μL de NaOH 50 mM.
  8. Incuber les embryons à 95 °C pendant 20 min. Ensuite, refroidir les échantillons à 4 °C, ajouter 5 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) et vortex pendant 5-10 s. L’ADN extrait peut être conservé à -20 °C jusqu’à 6 mois.
  9. Pour identifier les sites guides contenant des INDEL, concevez des amorces de séquençage pour amplifier un fragment d’ADN qui comprend les quatre sites cibles CRISPR-Cas9. Ces amorces de séquençage permettent d’identifier les INDEL qui couvrent plusieurs sites guides.
  10. Mettre en place deux réactions PCR de 25 μL par embryon en utilisant 5 μL de l’ADN génomique préparé et les amorces de séquençage.
  11. Une fois la PCR terminée, purifier et concentrer les deux échantillons à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN (voir le tableau des matériaux). Ensuite, soumettez le fragment d’ADN au séquençage de Sanger en utilisant à la fois les amorces de séquençage avant et arrière.
  12. Une fois que le fragment de crispant maternel haploïde a été séquencé, alignez-le sur la séquence de type sauvage et identifiez les INDEL dans les sites cibles à l’aide d’un programme d’alignement de séquence.

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Representative Results

L’approche expérimentale décrite dans ce protocole permet d’identifier les phénotypes d’effet maternel de manière rapide et économe en ressources (Figure 1).

Générer des crispants maternels :
Lors de la conception des quatre ARN guides pour cibler un seul gène candidat de l’effet maternel, une attention particulière doit être accordée à l’endroit où les ARN guides se lieront à l’ADN. En général, ils devraient tous être regroupés avec peu ou pas de chevauchement de régions entre les ARN guides au début du premier domaine protéique prédit (Figure 2A). Le ciblage des ARN guides dans ce domaine augmente les chances que les INDEL dans le cadre et hors cadre affectent la fonction de la protéine. D’autres variables qui devraient être prises en compte lors de la conception des ARN guides sont l’efficacité de réduction et le nombre de sites hors cible dans le génome.

Après injection de la solution CRISPR-Cas9, l’activité somatique de Cas9 peut être déterminée en exécutant un petit fragment de PCR, environ 100 pb, sur un gel d’agarose. Si des INDELs ont été créés dans l’embryon injecté, un frottis doit être observé dans les échantillons injectés, mais pas dans le témoin non injecté (Figure 2B). Chaque site guide doit être testé indépendamment pour l’activité Cas9 dans les cellules somatiques. Si des frottis sont observés dans au moins trois sites guides, les embryons injectés par les frères et sœurs doivent être adultes et soumis à un dépistage des phénotypes maternels crispants.

Identification des crispants maternels :
Pour déterminer si les crispants maternels sont créés dans des croisements naturels, les embryons d’un poisson femelle F0 peuvent être comparés à des témoins de type sauvage appariés au moment pour observer tout changement dans le développement précoce. Les couvées F0 doivent également être notées à 24 hpf et 5 jours après la fécondation pour examiner le développement du plan corporel de base et la viabilité, respectivement, afin d’identifier les facteurs maternels qui pourraient réguler les stades ultérieurs du développement embryonnaire. L’identification d’un phénotype partagé dans des couvées de différentes femelles F0 facilite la distinction entre les effets causés par la perte de fonction d’un gène cible et les effets hors cible ou non spécifiques.

De plus, les couvées contenant des crispants maternels sont généralement mosaïques (c’est-à-dire qu’elles comprennent à la fois des embryons phénotypiques de type sauvage et des embryons de crispants maternels), ce qui permet aux embryons de type sauvage d’agir comme un contrôle interne pour des variables telles que le moment de la fécondation et le taux de développement. En moyenne, les couvées des femelles F0 contiennent environ 69 % d’embryons maternels crispants, et les couvées contenant jusqu’à 100 % d’embryons de crispants maternelsont été observées11.

Après avoir identifié les embryons maternels crispants, ils peuvent être utilisés pour la caractérisation moléculaire primaire, c’est-à-dire l’immunomarquage des limites cellulaires ou la coloration de l’ADN avec DAPI, ce qui peut donner un aperçu de la nature cellulaire du processus de développement affecté11. La méthode du crispant maternel peut également être utilisée pour phénocopier les mutations connues de l’effet maternel, telles que les effets hétéroclites, les TMI et l’aura (Figure 3)11.

Séquençage des haploïdes croustillants maternels :
Pour identifier la ou les lésions génétiques qui contribuent au phénotype de crispant maternel, les spermatozoïdes traités aux UV et la FIV sont combinés pour créer des haploïdes maternels crispants (Figure 4). Les spermatozoïdes traités aux UV fournissent un centriole mais ne contribuent pas à l’ADN paternel, permettant ainsi la division cellulaire de se produire uniquement avec du matériel génomique maternel. La création d’un haploïde permet le séquençage de Sanger de l’allèle maternel et l’identification des INDEL croustillantes maternelles (Figure 4). En moyenne, deux allèles par couvée d’haploïde croustillant maternel ont été observés. Les INDEL identifiées par séquençage de Sanger comprennent des modifications à la fois dans des sites de guides uniques et des suppressions couvrant plusieurs sites de guides (Figure 4C, Tableau 3). Une étude des INDEL haploïdes croustillantes maternelles de différentes femelles F0 montre que les mêmes sites guides sont édités dans plusieurs embryons, et que la plupart des mutations récupérées sont des codons stop prématurés (tableau 3)11.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail des croustillants maternels. Pour créer un crispant maternel, commencez par concevoir quatre ARNg qui ciblent le premier domaine actif du gène. 1) Synthétisez ensuite les quatre ARNg en une seule réaction. 2) Après avoir synthétisé et purifié les ARNg, créez un cocktail CRISPR-Cas9 et injectez-le dans le blastodisque d’un embryon unicellulaire. 3) Ensuite, dépister les embryons injectés pour les mutations somatiques en utilisant la PCR et l’électrophorèse sur gel. Si les INDELs étaient créés dans des échantillons injectés, un frottis apparaîtrait dans les embryons injectés, contrairement à la bande serrée du témoin de type sauvage. 4) Permettre aux frères et sœurs des embryons injectés de grandir pendant 3 à 6 mois pour atteindre la maturité sexuelle. Une fois la maturité sexuelle atteinte, croiser une femelle injectée F0 contre un mâle de type sauvage. La descendance résultante peut être un mélange d’embryons de type sauvage et maternel crispant. Identifier une femelle injectée F0 dont les embryons présentent le phénotype de l’effet maternel. 5) Pour identifier les lésions qui contribuent au phénotype, la FIV est réalisée à l’aide de spermatozoïdes traités aux UV pour créer des haploïdes croustillants maternels pour le séquençage de Sanger. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Génération d’INDELs dans les gènes ciblés. (A) Diagramme de structure génique montrant des domaines protéiques hypothétiques (blocs violets clairs et foncés), l’emplacement des ARNg (lignes rouges) et des sites PAM (étoiles rouges). Les ARNg sont ciblés sur le premier domaine actif. Les exons sont représentés sous forme de blocs et les introns sous forme de lignes. (B) Les frottis dans un gel d’agarose à 2,5% indiquent des INDELs dans les cellules somatiques des embryons injectés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les crispants maternels récapitulent le phénotype des mutations connues de l’effet maternel. Comparaison représentative d’embryons vivants de type sauvage appariés dans le temps (colonne de gauche), de mutants maternels connus (colonne du milieu) et d’embryons maternels crispants (colonne de droite). (A) hétéroclites/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura/mid1ipIl mutants/crispants maternels présentent des défauts de cytocinèse dans les divisions embryonnaires précoces, conduisant à une blastule entièrement syncytiale (A, B), ou à des embryons partiellement acellulaires (C, boîte blanche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Utilisation d’haploïdes maternels crispants pour séquencer les mutations induites par CRISPR-Cas9. (A) Une femelle injectée F0 croisée contre un mâle de type sauvage donne un embryon diploïde avec un phénotype d’effet maternel. (B) La FIV est réalisée en utilisant des spermatozoïdes traités aux UV pour créer des haploïdes maternels crispants, permettant le séquençage et l’analyse des INDEL induites dans l’allèle maternel. (C) Séquençage représentatif de l’haploïde maternel crispant birc5b montrant une délétion importante entre les sites guides 3 et 4 (encadré). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Mélange PCR
Ajouter
H2O stérile 171,12 ml
MgCl2 (1 M) 0,393 mL
Tris-HCl (1 M, pH 8,4) 2,618 mL
KCl (1 M) 13,092 mL
Autoclaver pendant 20 min, puis refroidir la solution sur de la glace. Suivant ajouter
BSA (100 mg/mL) 3,468 mL
dATP (100 mM) 0,262 mL
dCTP (100 mM) 0,262 mL
dGTP (100 mM) 0,262 mL
dTTP (100 mM) 0,262 mL
Aliquote dans des tubes microcentrifugés stériles
Recette PCR par échantillon
Mélange PCR 17,9 μL
F + R Primer (10 μM) 0,2 μL
ROH2O 1,8 μL
Taq ADN polymérase 0,1 μL
ADN 5 μL

Tableau 1 : Mélange de PCR.

La solution de Hank
Prémix de Hank Combinez ce qui suit dans l’ordre : (1) 10,0 mL de HS #1, (2) 1,0 mL de HS#2, (3) 1,0 mL de HS#4, (4) 86 mL de ddH2O, (5) 1,0 mL de HS#5. Conservez toutes les solutions HS à 4 °C
La solution de stock de Hank #1 8,0 g de NaCl, 0,4 g de KCl dans 100 mL deddH2O
La solution de stock de Hank #2 0,358 g deNa2HPO4 anhydre ; 0,60 g de K2H2PO4 dans 100 mL de ddH2O
Hank’s Stock Solution #4 0,72 g de CaCl2dans 50 mL de ddH2O
Hank’s Stock Solution #5 1,23 g de MgSO4·7H2O dans 50 mL deddH20
La solution de stock de Hank #6 0,35 g de NaHCO3 dans 10,0 mL de ddH20; faire frais le jour de l’utilisation
La solution de travail finale de Hank Combiner 9,9 mL de Hank’s Premix avec 0,1 mL de HS Stock #6

Tableau 2 : Solution de Hank.

BIRC5B #1 BIRC5B #2 BIRC5B #3 PRC1L #1 PRC1L #2
Nombre total d’embryons séquencés 3 9 12 8 10
Nombre total d’embryons avec INDELs 3 9 12 8 10
Mutation dans un site 0 0 0 0 0
Mutations dans plusieurs sites 3 9 12 8 10
Localisation des INDEL
Guide site 1 0 0 0 0 0
Guide site 2 0 0 0 8 10
Guide site 3 3 9 12 8 10
Site guide 4 3 9 12 0 10
Types d’INDEL
Mutation dans le cadre 1 2 2 7 10
Mutation de décalage de trame 4 7 10 9 10

Tableau 3 : Localisation et type d’INDELs trouvées dans deux ensembles différents d’haploïdes maternels crispants : birc5b et prc1l.

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Discussion

Le protocole présenté dans ce manuscrit permet l’identification et la caractérisation moléculaire primaire d’un phénotype d’effet maternel en une seule génération au lieu des générations multiples requises pour les techniques génétiques directes et inverses. Actuellement, le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère est inconnu. Ce manque de connaissances est en partie dû à la génération supplémentaire nécessaire pour visualiser un phénotype lors de l’identification des gènes de l’effet maternel. Dans le passé, l’identification rapide des gènes de l’effet maternel chez le poisson zèbre pouvait être réalisée en injectant des oligonucléotides morpholino bloquant la traduction dans des ovocytes en culture32. Cette méthode s’est avérée efficace en phénocopiant plusieurs gènes connus de l’effet maternel, mais la manipulation d’un ovocyte immature peut être une expérience délicate et longue. Les ARN maternels peuvent également être ciblés pour la dégradation en utilisant les complexes CRISPR-RfxCas13d, mais l’injection de ces complexes dans l’embryon unicellulaire ne peut pas cibler la protéine33 fournie par la mère. Plus récemment, il a été découvert que CRISPR-Cas9 peut induire des mutations bialléliques dans la lignée germinale, permettant l’identification rapide de nouveaux gènes de l’effet maternel dans une seule génération11.

Ce protocole comprend plusieurs étapes critiques qui contribuent à la récupération des embryons maternels crispants. En théorie, parce que les cellules germinales sont spécifiées dans le développement embryonnaire précoce, plus tôt une lésion d’ADN est créée dans un gène cible, plus la probabilité qu’une cellule contenant des mutations fasse partie de la lignée germinale est élevée. Cette méthode utilise la protéine Cas9 injectée dans le blastodisque en développement d’un embryon unicellulaire pour augmenter la probabilité de modifications dans la lignée germinale. Un autre facteur critique qui affecte le pourcentage d’embryons de crispant maternels récupérés est l’efficacité des ARN guides dans la création de modifications génétiques dans les sites cibles. Cette procédure comprend une section sur la détermination de la capacité des ARN guides à créer des INDEL somatiques à 24 hpf par PCR. Si un ARN guide ne parvient pas à faire des modifications somatiques, il a une faible probabilité de produire des modifications dans la lignée germinale à un taux suffisamment élevé pour générer un crispant maternel. Ce protocole demande à l’utilisateur de tester les modifications somatiques, qui doivent être visibles dans trois sites guides ou plus.

Après avoir observé le phénotype des embryons maternels crispants, la ou les lésions génétiques contribuant au phénotype peuvent être analysées au niveau de la séquence par FIV avec des spermatozoïdes traités aux UV. Pour acquérir suffisamment de matériel de départ pour la PCR, les embryons haploïdes maternels crispants doivent se développer pendant au moins six à huit heures, permettant à plusieurs cycles de réplication de l’ADN de se produire. L’ADN génomique doit également être extrait dans 50 μL de 50mM de NaOH pour concentrer l’ADN. Si les embryons haploïdes maternels crispants ne peuvent pas survivre pendant 6 à 8 heures, prélevez les embryons à un moment antérieur. Pour tenir compte du fait que l’embryon subit moins de cycles de réplication de l’ADN, extraire l’ADN dans un plus petit volume de 50 mM de NaOH tout en maintenant la même proportion de NaOH et de Tris-HCL. Une autre option consiste à concentrer l’ADN extrait en utilisant un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN. Une fois l’ADN extrait, le fragment de PCR utilisé pour le séquençage devrait inclure les quatre sites cibles, si possible. Ce fragment permettra d’identifier de grandes délétions qui couvrent plusieurs sites guides dans les embryons maternels crispants.

Lors de la collecte d’haploïdes maternels crispants pour le séquençage de Sanger, collectez tous les haploïdes qui montrent le phénotype et envoyez un minimum de 10 échantillons uniques d’embryons haploïdes au séquençage de Sanger. Le séquençage de plusieurs embryons haploïdes par couvée permettra d’identifier plusieurs INDEL trouvés dans la lignée germinale. Les données de séquençage antérieures des haploïdes maternels crispants ont montré que plusieurs allèles peuvent être identifiés dans un ensemble d’haploïdes crispants maternels11. Cependant, ces allèles ne sont pas récupérés dans le rapport attendu1 pour 11. Le séquençage de plusieurs embryons aidera également à soutenir l’idée que le phénotype est causé par un INDEL CRISPR-Cas9 dans le gène cible. Toute séquence de type sauvage observée dans des embryons haploïdes séquencés qui présentent un phénotype spécifique suggérera que le phénotype n’est pas associé au gène ciblé. Tout nouveau phénotype d’effet maternel identifié en ciblant des gènes non caractérisés auparavant devrait également être confirmé par l’établissement d’une lignée stable utilisant les mâles frères F011.

Dans certains cas, il peut être difficile d’identifier les INDEL par analyse haploïde lorsque le phénotype de crispant maternel identifié présente une certaine caractéristique phénotypique. Par exemple, les embryons haploïdes maternels crispants qui semblent non fécondés ou lysés pendant la phase de clivage peuvent être impossibles à sélectionner. Les embryons maternels crispants présentant des défauts d’extension d’axe similaires à ceux correspondant au syndrome haploïde peuvent également ne pas être distingués pour l’analyse lors de la génération d’haploïdes maternels34. Dans de tels cas, il est conseillé au chercheur d’effectuer l’analyse directement en utilisant des lignées stables pour la confirmation du génotype.

L’une des limites du protocole actuel de crispant maternel est qu’il n’identifie les gènes de l’effet maternel que par des défauts morphologiques grossiers. Pour augmenter la sensibilité de la méthode et la rendre plus spécifique pour certains aspects du développement précoce, les rapporteurs transgéniques pourraient être utilisés pour mettre en évidence des structures ou des types de cellules spécifiques, comme cela a été fait pour d’autres cribles 9,10,35. Par exemple, le mélange CRISPR-Cas9 pourrait être injecté dans la lignée transgénique Buc-GFP pour identifier des gènes non létaux qui régulent la formation et le développement des cellules germinales primordiales36. Une autre limite du protocole de crispant maternel est que, bien qu’utile pour les gènes uniquement exprimés au cours du développement précoce, il peut ne pas être efficace pour les gènes ayant à la fois une fonction maternelle et zygotique puisque le ciblage CRISPR-Cas9 du gène pourrait être mortel pour l’embryon en développement. Pour étudier la fonction maternelle des gènes exprimés tout au long du développement, l’activité Cas9 pourrait être ciblée sur la lignée germinale37, laissant ainsi la fonction somatique du gène intacte et permettant la survie des femelles F0 jusqu’à l’âge adulte.

Les crispants maternels sont un outil efficace pour identifier de nouveaux gènes de l’effet maternel nécessaires au développement précoce. La combinaison du multiplexage guide les ARN vers une seule cible et la capacité d’édition biallélique de Cas9 permet d’observer le phénotype de l’effet maternel en une seule génération, évitant ainsi les schémas de sélection multigénérationnels généralement nécessaires lors de l’édition de gènes ciblée. Le contournement de plusieurs générations diminue la quantité d’espace et de ressources nécessaires pour identifier les gènes de l’effet maternel.

En plus d’identifier de nouveaux gènes de l’effet maternel, ce protocole permet à tout laboratoire de poisson zèbre de phénocopier et d’étudier tout mutant connu de l’effet maternel sans établir et maintenir des lignées stables, facilitant ainsi l’analyse détaillée des voies génétiques. En principe, cette approche de crispant maternel peut également déterminer la fonction des produits maternels chez les espèces modèles non génétiques.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Nous remercions les membres passés et actuels du personnel d’élevage du laboratoire Pelegri pour les soins qu’ils ont prodigués à l’installation aquatique. Nous sommes également reconnaissants pour les commentaires et la perspicacité sur le manuscrit par Ryan Trevena et Diane Hanson. Le financement a été fourni par la subvention des NIH à F.P. (GM065303)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

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References

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  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
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Génétique numéro 178 développement précoce CRISPR-Cas9 effet maternel poisson zèbre édition du génome génétique inverse
Déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels
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Moravec, C. E., Voit, G. C.,… More

Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

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