Summary
초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.
Abstract
초기 발달은 접합체 게놈 활성화까지 발달에 필요한 모든 세포 기능을 수행하는 난자 형성 동안 성숙한 난모세포에 통합된 모체 인자 풀에 의존합니다. 일반적으로 이러한 모성 인자의 유전 적 표적화는 모성 효과 표현형을 식별하기 위해 추가 세대를 필요로하며, 발달 중에 모성 발현 유전자의 역할을 결정하는 능력을 방해합니다. CRISPR-Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력의 발견은 주입 된 배아 또는 "크리스펫"의 체세포 조직에서 배아 표현형을 스크리닝 할 수있게하여 발달 프로그램에서 접합 발현 유전자가하는 역할에 대한 이해를 높였습니다. 이 문서에서는 크리스펀트 방법의 확장인 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에서, 생식 세포의 이중 대립 유전자 편집은 단일 세대 또는 "모체 크리스펫"에서 모성 효과 표현형의 분리를 허용합니다. 단일 표적에 대한 가이드 RNA를 멀티플렉싱하면 모체 크리스펀트의 효율적인 생산을 촉진하는 반면, 모체 크리스펀트 반수체의 서열 분석은 모체 효과 표현형을 생성하는 유전적 병변을 확증하는 간단한 방법을 제공합니다. 모체 크리스펀트의 사용은 필수 모계 발현 유전자의 신속한 식별을 지원하여 조기 발달에 대한 이해를 용이하게합니다.
Introduction
모계로 축적된 산물(예: RNA, 단백질 및 기타 생체 분자) 풀은 배아의 접합체 게놈이 활성화될 때까지 모든 초기 세포 과정에 필요합니다1. 난 모세포에서 이러한 생성물의 조기 고갈은 일반적으로 배아 치명적입니다. 발달에서 이러한 유전자의 중요성에도 불구하고, 많은 모계 발현 유전자의 역할은 현재 알려지지 않았습니다. CRISPR-Cas9와 같은 제브라피쉬의 유전자 편집 기술의 발전은 모계에서 발현된 유전자 2,3,4의 표적화를 가능하게 합니다. 그러나 모성 효과 표현형의 식별은 접합 표현형과 비교할 때 추가 세대가 필요하므로 더 많은 자원이 필요합니다. 최근 CRISPR-Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력은 "크리스프 판트"5,6,7,8,9,10으로 알려진 주입 된 (F0) 배아의 체세포 조직에서 배아 표현형을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 크리스펀트 기술은 체세포에서 후보 유전자의 자원 효율적인 스크리닝을 허용하여 발달의 특정 측면에 대한 이해를 용이하게 합니다. 이 논문에 설명된 프로토콜은 단일 세대에서 모성 효과 표현형 또는 "모성 크리스펫"의 식별을 허용합니다11. 이 계획은 가이드 RNA를 단일 유전자로 멀티플렉싱하고 생식계열에서 이대립유전자 편집 이벤트를 촉진함으로써 달성할 수 있습니다. 이들 모체 크리스펀트 배아는 총 형태학적 표현형에 의해 확인될 수 있고, 세포 경계 및 DNA 패터닝(11)에 대한 표지와 같은 1차 특성화를 거친다. 관찰 가능한 표현형과 유도된 INDEL의 기본 분자 특성화의 결합 분석을 통해 초기 발달에서 표적 유전자의 역할을 예측할 수 있습니다.
제브라 피쉬에서는 수정 후 처음 24 시간 (hpf) 동안 작은 세포 그룹이 생식선12,13,14,15의 전구체 인 원시 생식 세포로 발전합니다. F0 암컷이 놓은 클러치에서 회수된 모체 크리스펀트 배아의 비율은 표적 유전자에 이대립유전자 편집 이벤트가 포함된 생식 세포의 수에 따라 달라집니다. 일반적으로 배아에서 편집 사건이 일찍 발생할수록 생식계열에서 CRISPR-Cas9 돌연변이가 관찰될 확률이 높아집니다. 대부분의 경우, 모체 크리스펀트 배아의 표현형은 발달중인 난 모세포에 존재하는 두 개의 모체 대립 유전자의 기능 상실에서 비롯됩니다. 난 모세포가 감수 분열을 마치면 모체 대립 유전자 중 하나가 극체를 통해 배아에서 돌출되고 다른 대립 유전자는 모체 전핵에 통합됩니다. 다수의 모체 크리스펀트 반수체의 시퀀싱은 표현형11에 기여하는 생식계열에 존재하는 돌연변이(삽입 및/또는 결실(INDEL))의 혼합물을 나타낼 것이다.
다음 프로토콜은 모성 효과 유전자에서 CRISPR-Cas9 돌연변이를 생성하고 모체 크리스펀트 접근법을 사용하여 해당 표현형을 식별하는 데 필요한 단계를 설명합니다(그림 1). 섹션 1은 가이드 RNA를 효과적으로 설계하고 생성하는 방법을 설명하고 섹션 2와 3에는 미세 주입으로 산모의 크리스펀트를 만드는 중요한 단계가 포함되어 있습니다. CRISPR-Cas9 혼합물을 주입한 후, 주입된 배아는 PCR을 통해 체세포 편집을 위해 스크리닝됩니다(섹션 4). 주입된 F0 배아가 발달하여 성적으로 성숙되면 F0 암컷을 야생형 수컷으로 교배하고 자손을 대상으로 모성 효과 표현형을 선별합니다(섹션 5). 섹션 6에는 CRISPR-Cas9 유도 INDEL을 식별하기 위해 Sanger 시퀀싱과 결합할 수 있는 모체 크리스펀트 반수체를 만드는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. 또한 토론에는 이 방법의 민감도와 성능을 높이기 위해 프로토콜에 적용할 수 있는 수정 사항이 포함되어 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜의 개발로 이어지는 연구에서 모든 제브라 피쉬 하우징 및 실험은 위스콘신 대학교 매디슨 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC-M005268-R2)의 승인을 받았습니다.
1. 가이드 RNA의 합성
참고: 접합체 크리스펀트는 단일 가이드 RNA를 사용하거나 여러 가이드 RNA를 단일 표적 5,6,7,8,9,10으로 멀티플렉싱하여 생성되었습니다. 가이드 RNA의 다중화는 접합체 크리스펀트 표현형10을 나타내는 배아의 백분율을 증가시킵니다. 표현형을 나타내는 배아의 빈도가 증가하기 때문에 4 개의 가이드 RNA를 단일 유전자로 멀티플렉싱하여 모체 크리스펀트가 생성됩니다. CHOPCHOP을 사용하여 가이드 RNA를 설계하고 어닐링 방법을 사용하여 제브라피쉬에 대한 가이드 RNA를 합성하는 방법에 대한 보다 자세한 프로토콜은16,17,18,19,20의 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.
- 모계에서 발현된 유전자를 표적으로 삼기 위해, 접합체로부터 5일째까지 전사체 정보를 제공하는 RNA 서열 데이터베이스를 통해 발달 중 mRNA 전사체 수준을 확인한다21. 일반적으로, 모계-특이적 유전자는 초기 배아에서 고도로 발현되고, 접합체 게놈이 활성화된 후에 분해된다22.
- 일단 모계-발현된 표적 유전자가 확인되면, Ensembl 게놈 브라우저(23) 상에서 이용가능한 "도메인 및 특징" 섹션을 사용하여 제1 예측된 단백질 도메인을 결정한다. 이 도메인을 4개의 가이드 RNA의 표적 영역으로 사용합니다.
- 가이드 RNA 선택 프로그램 CHOPCHOP을 사용하여 첫 번째 활성 도메인에서 4개의 가이드 RNA 표적 부위를 식별합니다. 각 표적 부위에 대해 아래와 같이 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드에서,N20 섹션은 CHOPCHOP으로부터의 PAM 부위(NGG)를 뺀 표적 서열에 상응한다. 이러한 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드와 불변 올리고뉴클레오티드는 표준 탈염 정제를 사용하여 정렬합니다( 재료 표 참조).
유전자 특이적 올리고뉴클레오티드:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - 각 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드에 대한 가이드 RNA 주형을 생성하려면, 이를 상수 올리고뉴클레오티드로 어닐링하고앞서 설명한 바와 같이 T4-DNA 중합효소로 오버행을 채운다. 4개의 가이드 RNA 주형을 조립한 후 제조업체의 지침에 따라 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 함께 정제하고 농축합니다( 재료 표 참조).
- 시험 관내 T7 전사 키트를 사용하여 풀링된 가이드 RNA 주형으로부터 sgRNA 혼합물을 합성한다( 재료 표 참조). 제조업체의 지침에 따라 체외 전사를 수행하십시오. T7 전사 키트의 반쪽 반응을 사용하면 반응당 비용을 줄일 수 있습니다.
- RNA 합성 후, 앞서 설명한바와 같이 에탄올/암모늄 아세테이트 프로토콜을 사용하여 생성된 sgRNA 풀을 정제합니다 16,20,24. RNA가 분리된 후 뉴클레아제가 없는 물 20μL에 재현탁합니다. T7 전사 키트의 반쪽 반응을 사용하여 sgRNA 풀을 전사한 경우 정제된 RNA를 뉴클레아제가 없는 물 10-15μL에 재현탁합니다.
- 분광 광도계를 사용하여 생성된 풀링된 sgRNA의 양을 정량화합니다. 뉴클레아제가 없는 물에 있는 sgRNA 풀을 1500ng/μL ± 500ng/μL의 희석으로 희석합니다. 전형적으로, 작업 희석의 최종 부피는 30-50 μL 범위이다.
- sgRNA 풀의 농도를 결정한 후 1% 아가로스 겔에서 sgRNA의 무결성을 확인합니다.
- 1% 아가로스/0.5μg/mL 에티듐 브로마이드/TBE 겔을 캐스팅합니다. 젤이 고형화되면 TBE 실행 버퍼에 넣습니다.
- 1μL의 sgRNA 혼합물과 1μL의 RNA 겔 로딩 버퍼를 혼합합니다( 재료 표 참조). 이 샘플을 젤에 넣고 100V에서 5분 동안 젤을 실행합니다.
- 자외선(UV)을 사용하여 밴드를 시각화합니다. sgRNA 풀은 단일 밴드로 나타나야 합니다. 얼룩이 관찰되면 RNA 분해가 발생했을 가능성이 있습니다.
- sgRNA 풀을 일회용 1μL 분취액으로 -80°C 냉동고의 뉴클레아제가 없는 PCR 스트립 튜브에 보관합니다. 대량의 sgRNA 혼합물(30μL 이상)의 경우 부피의 절반을 뉴클레아제가 없는 PCR 스트립 튜브에 분취하고 나머지 절반은 뉴클레아제가 없는 미세원심분리 튜브에 더 큰 부피로 저장합니다. 해동하고 필요할 때 분취하십시오.
- RNA 분해를 방지하려면 미세 원심분리 튜브의 샘플이 두 번 이상의 동결-해동 주기를 거치지 않도록 하십시오.
2. 미세 주입을위한 시약 및 재료 준비
참고: 제브라피쉬에서 Cas9 mRNA를 주입하면 접합체 크리스펀트를 생성할 수 있습니다. 그러나 연구에 따르면 Cas9 단백질은 주입 된 배아에서 INDEL을 생성하는 데 더 효율적입니다16,25. 이 프로토콜은 Cas9 단백질을 사용하여 모체 크리스펫을 생성하는데, 이는 이 단백질이 주입된 Cas9 mRNA와 동일한 활성 지연을 경험하지 않기 때문입니다. 이론적으로 이것은 발달 초기에 이중 대립 유전자 돌연변이의 가능성을 증가시켜 생식선의 더 광범위한 부분이 영향을 받을 가능성을 높여야 합니다. 미세 주사를 준비하는 방법을 자세히 설명하는 다른 프로토콜 및 리소스는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다24,26.
- Cas9 단백질을 구매하거나 생성합니다 ( 재료 표 참조). Cas9 단백질을 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시켜 2mg/mL 용액을 만들고 1μL를 RNase가 없는 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 분취합니다. -80 ° C에서 일회용 튜브로 보관하십시오.
- 주사 전날 오후에 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 당기고 주사 바늘을 만듭니다. 부러지지 않은 바늘은 미세 주사 아침까지 밀폐 된 바늘 홀더에 보관하십시오.
- 주입 플레이트를 만들려면 1.5% 아가로스/멸균H2O20mL를 부어 100mm X 15mm 페트리 접시의 절반을 채우고 응고될 때까지 기다립니다. 아가 로스 용액이 설정되면 20mL의 1.5 % 아가 로스 / 멸균 H2O를 페트리 접시에 넣고 플라스틱 몰드 ( 재료 표 참조)를 액체 아가 로스에 넣고 경화시킵니다.
- 아가 로스가 경화 된 후 플라스틱 몰드를 제거하고 주입 아침까지 주입 판을 냉장고에 거꾸로 보관하십시오. 단일 플레이트는 웰이 무결성을 유지하는 한 여러 번 주입에 사용할 수 있습니다.
3. CRISPR-Cas9 칵테일을 단세포 제브라피쉬 배아에 미세 주입하여 모체 크리스펀트 생성
참고: 제브라피쉬 배아에 미세 주입을 위한 더 많은 자료는24,26,27의 다른 곳에서 찾을 수 있습니다. CRISPR-Cas9 혼합물을 단세포 배아의 발달 중인 배반판에 주입하면 모체 크리스펀트가 생성될 확률이 높아질 수 있습니다. 혼합물은 또한 2 세포 단계까지 난황낭에 주입 될 수 있습니다. 그러나 노른자에 주입된 혼합물은 배반원에 도달하기 위해 난자질 스트리밍에 의존하므로 노른자에 주입된 CRISPR-Cas9는 CRISPR-Cas928의 절단 효율을 감소시킬 수 있습니다.
- 미세 주사 전날 오후, 제브라 피쉬 짝짓기 상자에 야생형 십자가를 설치하십시오. 수컷과 암컷 물고기를 같은 탱크에 보관하되 짝짓기 상자 칸막이로 분리하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물 안에 넣으십시오.
- 실험 아침에 Cas9 단백질 2mg/mL 분취량 1개와 sgRNA 풀 분취량 1개를 꺼냅니다. Cas9 단백질이 포함된 RNase가 없는 폴리프로필렌 미세 원심분리 튜브에서 sgRNA 풀, 0.5% 페놀 레드 용액 1μL 및 뉴클레아제가 없는 물을 포함하는 5μL 주입 혼합물을 조립합니다. RNase가 없는 물에 400ng/μL Cas9 단백질과 200ng/μL의 풀링된 sgRNA의 최종 농도 또는 주입된 배아에서 sgRNA에 대한 Cas9 단백질의 2:1 비율을 목표로 합니다. 이 주입 혼합물은 주사 아침에 얼음에 보관할 수 있습니다.
- 냉장고에서 주입판을 꺼내 최소 20분 동안 실온(RT)으로 예열합니다.
- 주입 칵테일을 조립한 후, 예를 들어 짝짓기 상자 칸막이를 제거하거나 수컷을 암컷과 동일한 알을 낳는 삽입물에 적절하게 배치하여 수컷과 암컷이 짝짓기를 하도록 합니다.
- 물고기를 낳은 후 배아를 채취하기 전에 새 면도날이나 가는 집게를 사용하여 끊어지지 않은 바늘 끝을 잘라 배아 손상을 피할 수 있을 만큼 구멍이 작지만 주사 혼합물로 막히지 않을 만큼 충분히 넓은 바늘을 만듭니다. 바늘을 자른 후 모세관의 뒤쪽 끝에 삽입된 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 주입 혼합물로 바늘을 로드합니다( 재료 표 참조).
- 바늘이 채워진 후 RT에서 5 분 동안 바늘을 배양하여 Cas9-sgRNA 복합체를 조립합니다.
- 마이크로 인젝터를 켜고 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 삽입합니다. 마이크로미터 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 놓고 바늘이 1nL 볼루스를 미네랄 오일로 배출할 때까지 주입 압력을 조정하여 바늘을 보정합니다.
알림: 미네랄 오일에 주입할 때 1nL 볼루스는 마이크로미터 슬라이드로 측정한 직경이 약 0.125mm(또는 반경 0.062mm)입니다. - 배아를 동기화하려면 플라스틱 스트레이너를 사용하여 10분 후에 배아를 수집하고 1x E3 배지(5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mMCaCl2, 0.33mM MgSO4, 1x E3 1L당 0.03M 메틸렌 블루 20μL를 추가)를 사용하여 페트리 접시에 헹굽니다. 10-15 개의 배아를 제거하고 별도의 페트리 접시에 넣어 주입되지 않은 대조군으로 보관합니다.
- 발달중인 배아의 나머지 부분을 주입 판의 우물로 옮깁니다.
- 1 세포 배아의 발달중인 배반원에 1 nL의 용액 (총 400 pg의 Cas9 단백질과 200 pg의 sgRNA)을 주입합니다. 바늘 끝이 막히면 집게를 사용하여 끝을 뒤로 부러뜨리고 바늘을 다시 보정하여 1nL 볼루스를 배출합니다. 수정 후 발달 첫 40 분 동안 모든 배아를 주입하십시오.
- 주입이 완료된 후 주입된 배아를 1x E3 배지가 들어 있는 라벨이 부착된 페트리 접시에 넣고 하루 종일 발달하도록 합니다. 수정되지 않았거나 제브라 피쉬 스테이징 시리즈29에 따라 정상적으로 발달하지 않는 배아를 제거하십시오.
4. F0 주입 배아에서 체세포 INDEL에 대한 스크리닝
참고: T7 엔도뉴클레아제 I 분석 또는 고해상도 용융 분석과 같은 INDEL을 확인하기 위한 다른 방법은 배아가 체세포 INDELs 30을 포함하는지 여부를 결정할 때 사용할 수 있습니다.
- 주사 후 다음날 페트리 접시에서 결함이 있고 용해된 배아를 제거하고 1x E3 배지를 교체하여 배아 건강을 유지합니다.
- 접시를 청소 한 후 주입되지 않은 플레이트에서 6 개의 건강한 주입 배아와 2 개의 대조 배아를 수집합니다. 각 배아를 PCR 스트립 튜브의 단일 웰에 개별적으로 놓고 튜브 상단에 레이블을 지정합니다.
- 개별 배아의 게놈 DNA를 추출하려면 스트립 튜브의 웰에서 과도한 E3 배지를 제거하고 웰당 100μL의 50mM NaOH를 추가합니다.
- 배아를 95°C에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 4 °C로 냉각하고 10 μL의 1 M Tris HCL (pH 7.5)을 첨가하고 5-10 초 동안 와동시킵니다. 이렇게 추출된 DNA는 DNA 분해 없이 최소 6개월 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- CRISPR-Cas9 표적 부위를 포함하는 100-110bp DNA 단편을 증폭하기 위해 각 가이드 부위에 고유한 스크리닝 프라이머를 설계합니다. 가능하면 증폭된 단편의 중간에 대상 부위를 배치하여 더 큰 결실을 식별할 수 있습니다.
- 4개의 가이드 표적 부위 각각에 대해 준비된 단일 배아 게놈 DNA 5μL, PCR 믹스 및 가이드 특이적 스크리닝 프라이머를 사용하여 8개의 25μL PCR 반응을 설정하여 표적 부위의 체세포 돌연변이를 확인했습니다(표 1).
- 약 0.625cm 너비의 웰을 만드는 빗을 사용하여 2.5% 아가로스/0.5μg/mL 에티듐 브로마이드/TBE 겔을 주조합니다. 이 넓은 빗은 게놈 서열의 크기 변화를 감지할 때 더 나은 해상도를 허용합니다. 겔이 응고 된 후 TBE 실행 버퍼가 포함 된 전기 영동 챔버에 넣습니다.
- PCR 생성물에 5μL의 6x 로딩 염료를 첨가하고 25μL의 이 혼합물을 겔에 로딩합니다. 주입 된 샘플과 대조군 샘플이 젤의 동일한 행에서 실행되는지 확인하십시오. 모든 샘플이 로딩된 후 TBE 실행 버퍼 1L당 5μL의 브롬화 에티듐을 겔 상자의 양극 끝에 추가합니다.
- DNA 밴드가 해결되거나 DNA가 레인 끝에 접근할 때까지 120V에서 젤을 실행합니다. Cas9가 표적 부위에 INDEL을 생성하면 일반적으로 주입된 샘플에서 얼룩이 관찰되지만 대조군에서는 관찰되지 않습니다.
- 4개의 가이드 RNA가 주입된 배아의 4개의 가이드 부위 중 최소 3개에서 도말이 관찰되면, 형제 주입된 배아를 성장시킨다.
- 주입된 샘플에 필요한 수의 가이드 부위에 도말이 포함되지 않을 때마다 작동하지 않는 가이드 RNA를 대체할 새로운 가이드 RNA를 설계하고 작동한 것과 새로 설계된 것을 포함하는 새로운 가이드 RNA 풀을 만듭니다. 위에서 설명한 대로 체세포 INDEL에 대한 새 풀을 주입하고 테스트합니다.
5. 모체 크리스펀트 배아에서 모성 효과 표현형의 동정
참고: 주입된 F0 암컷이 성적으로 성숙되면 생식세포 세포가 모체 크리스펀트와 야생형 배아의 혼합물을 생성할 가능성이 있습니다. 이 혼합물은 수정 및 발달시기에 대한 내부 제어를 허용하지만, F0 암컷의 클러치에 모체 크리스펀트 배아 만 포함 된 경우 야생형 인크로스를 외부 대조군으로 설정하는 것이 여전히 유익합니다.
- 실험 전날 오후, F0 주입 암컷을 야생형 수컷에 대해 설정하고 표준 제브라 피쉬 짝짓기 상자에서 야생형 교배를 통제했습니다. 수컷과 암컷 물고기를 같은 탱크에 놓고 짝짓기 상자 칸막이로 분리하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물 안에 넣으십시오.
- 실험 아침에 수컷과 암컷이 짝짓기 상자 칸막이를 제거하거나 암컷과 동일한 알을 낳는 삽입물에 수컷을 놓아 짝짓기를 시작하도록합니다.
- 알을 낳는 삽입물을 신선한 시스템 물이 들어있는 새로운 짝짓기 탱크 바닥으로 옮겨 10 분마다 배아를 수집하고 개별 F0 암컷을 식별하는 태그로 탱크에 라벨을 붙입니다. 오래된 짝짓기 탱크를 가지고 차 여과기를 통해 물을 부어 한 10 분 클러치에서 배아를 수집합니다.
- 단일 10분 클러치의 배아가 여과기에 수집되면 1x E3 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 페트리 접시에 수집 시간과 생선 정보를 표시하십시오.
- 투과 광원으로 해부 현미경으로 처음 6-8 시간 동안 매시간 발달중인 배아를 관찰하고 다음 5 일 동안 매일 관찰하십시오.
- 시간이 일치하는 야생형 대조군과 비교하여 발달의 총체적인 형태학적 변화에 의해 잠재적인 모체 크리스펀트 배아를 식별합니다29.
- 잠재적인 모체 크리스펀트 배아를 1x E3 배지가 포함된 페트리 접시로 옮기고 수정 후 5일에 24hpf에서 형태학적 표현형과 생존력(예: 수영 방광 팽창)에 대한 분석을 수행합니다.
6. 모체 파삭 파삭 반수체의 시퀀싱 대립 유전자
참고: 모체 크리스펀트 반수체는 표적 유전자좌에 단일 대립 유전자를 포함하므로 Sanger 시퀀싱을 통해 표적 유전자에서 INDEL을 식별할 수 있습니다. 모체 크리스펀트 반수체 배아는 차세대 시퀀싱 분석을 사용하여 분석할 수도 있습니다. 모체 크리스펀트 표현형을 보이는 배아는 4개의 표적 부위 중 적어도 하나에 병변을 가지고 있을 것으로 예상됩니다(토론 참조).
- 실험 전날 오후, 야생형 수컷과 교배된 모체 크리스펀트 배아를 생산하는 것으로 알려진 F0 암컷의 짝짓기 쌍을 설정했습니다. 짝짓기 상자 칸막이를 사용하여 야생형 수컷을 암컷과 물리적으로 분리하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물에 놓습니다.
- 실험 아침에 물리적 칸막이를 제거하거나 알을 낳는 삽입물 안에 수컷과 암컷을 모두 넣어 짝짓기를 시작합니다. 알을 낳는 첫 징후가 나타나면 수컷과 F0 암컷을 분리하여 번식을 중단하십시오. 분리 된 각 F0 암은 개별 짝짓기 상자에 보관하십시오.
- 앞서 설명한 바와 같이 행크 용액 100μL당 야생형 수컷 1명의 고환을 사용하여 UV 처리된 정자 용액을 준비하고(표 2), 암컷 1명의 압출 난자를 수정하기에 충분합니다(표31).
- 미리 선택된 F0 암컷으로부터 성숙한 난자를 수동으로 압출하고 UV 처리된 정자31을 사용하여 체외 수정(IVF)을 수행한다.
- 체외 수정 후, 모체의 바삭한 표현형이 관찰 될 때까지 반수체 배아가 발달하도록하고 그 배아를 다른 페트리 접시에 넣습니다.
- 모체 크리스펀트 반수체 배아가 확인되면 수정 후 최소 6시간 동안 발달하도록 합니다.
- 최소 10개의 모체 크리스펀트 반수체 배아에서 게놈 DNA를 추출하려면 단일 반수체 배아를 PCR 스트립 튜브의 개별 웰에 넣고 웰에서 과도한 E3 배지를 제거하고 50mM NaOH 50μL를 추가합니다.
- 배아를 95°C에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 4 ° C로 냉각하고 5 μL의 1 M Tris HCL (pH 7.5)을 추가하고 5-10 초 동안 와동시킵니다. 추출된 DNA는 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
- INDEL이 포함된 가이드 부위를 식별하려면 시퀀싱 프라이머를 설계하여 4개의 CRISPR-Cas9 표적 부위를 모두 포함하는 DNA 단편을 증폭합니다. 이러한 시퀀싱 프라이머를 사용하면 여러 가이드 사이트에 걸쳐 있는 INDEL을 식별할 수 있습니다.
- 준비된 게놈 DNA 5μL와 염기서열분석 프라이머를 사용하여 배아당 2개의 25μL PCR 반응을 설정합니다.
- PCR이 완료된 후 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 두 샘플을 정제하고 농축합니다( 재료 표 참조). 그런 다음 정방향 및 역방향 시퀀싱 프라이머를 모두 사용하여 DNA 단편을 Sanger 시퀀싱에 제출합니다.
- 반수체 모체 크리스펀트 단편이 시퀀싱된 후, 이를 야생형 서열에 정렬하고 서열 정렬 프로그램을 사용하여 표적 부위에서 INDEL을 식별합니다.
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Representative Results
이 프로토콜에 설명된 실험적 접근 방식을 사용하면 모성 효과 표현형을 빠르고 자원 효율적인 방식으로 식별할 수 있습니다(그림 1).
모성 크리스펀트 생성:
단일 후보 모성 효과 유전자를 표적으로 하는 4개의 가이드 RNA를 설계할 때 가이드 RNA가 DNA에 결합하는 위치를 특별히 고려해야 합니다. 일반적으로, 이들은 모두 첫 번째 예측된 단백질 도메인의 시작 부분에서 가이드 RNA 사이에 최소 또는 전혀 겹치지 않는 영역으로 함께 클러스터링되어야 합니다(그림 2A). 이 도메인에 대한 가이드 RNA를 표적으로 삼으면 프레임 내 및 프레임 외 INDEL이 단백질의 기능에 영향을 미칠 가능성이 높아집니다. 가이드 RNA를 설계할 때 고려해야 할 다른 변수는 절단 효율성과 게놈의 표적 외 부위 수입니다.
CRISPR-Cas9 용액을 주입 한 후, Cas9의 체세포 활성은 아가 로스 겔에서 약 100 bp의 작은 PCR 단편을 실행하여 결정할 수 있습니다. 주입된 배아에서 INDEL이 생성된 경우 주입된 샘플에서 도말이 관찰되어야 하지만 주입되지 않은 대조군에서는 관찰되지 않아야 합니다(그림 2B). 각 가이드 부위는 체세포에서 Cas9 활성에 대해 독립적으로 테스트해야합니다. 적어도 3 개의 가이드 부위에서 도말이 보이면 형제 주입 배아를 자라서 모체 크리스펀트 표현형을 검사해야합니다.
모성 크리스펀트의 식별 :
모체 크리스펫이 자연 교배에서 생성되는지 확인하기 위해 F0 암컷 물고기의 배아를 시간 일치 야생형 대조군과 비교하여 초기 발달의 변화를 관찰할 수 있습니다. F0 클러치는 또한 배아 발달의 후기 단계를 조절할 수 있는 모성 요인을 식별하기 위해 기본 신체 계획과 생존 능력의 발달을 각각 조사하기 위해 수정 후 24hpf 및 5일에 점수를 매겨야 합니다. 상이한 F0 암컷으로부터의 클러치에서 공유된 표현형을 확인하는 것은 표적 유전자의 기능 상실로 인한 효과를 비표적 또는 비특이적 효과로부터 구별하는 것을 용이하게 한다.
또한, 모체 크리스펀트를 포함하는 클러치는 일반적으로 모자이크 (즉, 표현형 야생형 및 모체 크리스펀트 배아를 모두 포함)이며, 야생형 배아가 수정시기 및 발달 속도와 같은 변수에 대한 내부 제어 역할을 할 수 있습니다. 평균적으로, F0 암컷으로부터의 클러치는 약 69%의 모체 크리스펀트 배아를 함유할 것이며, 클러치는 최대 100%의 모체 크리스펀트 배아를 함유할 것이다11.
모체 크리스펀트 배아를 확인한 후, 이들은 1차 분자 특성화, 즉 세포 경계에 대한 면역표지 또는 DAPI를 사용한 DNA 염색에 사용될 수 있으며, 이는 영향을 받는 발달 과정의 세포 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다11. 모성 크리스펀트 방법은 가지각색, tmi 및 기운 과 같은 알려진 모성 효과 돌연변이를 표현형화하는 데에도 사용할 수 있습니다(그림 3)11.
모성 파삭 파삭 한 반수체의 시퀀싱 :
모체 크리스펀트 표현형에 기여하는 유전적 병변을 식별하기 위해 UV 처리된 정자와 IVF를 결합하여 모체 크리스펀트 반수체를 만듭니다(그림 4). UV 처리된 정자는 중심소체를 제공하지만 부계 DNA에 기여하지 않으므로 모계 게놈 물질만으로 세포 분열이 발생할 수 있습니다. 반수체의 생성은 모체 대립 유전자의 Sanger 시퀀싱과 모체 크리스펀트 INDEL의 식별을 허용합니다(그림 4). 평균적으로, 모체 크리스펀트 반수체의 클러치 당 2 개의 대립 유전자가 관찰되었다. Sanger 시퀀싱을 통해 식별된 INDEL에는 단일 가이드 사이트의 편집과 여러 가이드 사이트에 걸친 삭제가 모두 포함됩니다(그림 4C, 표 3). 다른 F0 암컷의 모체 크리스펀트 반수체 INDEL에 대한 조사에 따르면 동일한 가이드 부위가 여러 배아에서 편집되고 회복된 돌연변이의 대부분은 조기 정지 코돈입니다(표 3)11.
그림 1: 산모의 크리스펀트 워크플로. 모체 크리스펀트를 만들려면 먼저 유전자의 첫 번째 활성 도메인을 표적으로 하는 4개의 gRNA를 설계합니다. 1) 4개의 gRNA를 단일 반응으로 합성한다. 2) gRNA를 합성하고 정제한 후 CRISPR-Cas9 칵테일을 만들어 단세포 배아의 배반판에 주입한다. 3) 다음으로, PCR 및 겔 전기영동을 이용하여 주입된 배아의 체세포 돌연변이를 스크리닝한다. 주입된 샘플에서 INDEL이 생성되면 야생형 대조군의 단단한 밴드와 달리 주입된 배아에 얼룩이 나타납니다. 4) 주입 된 배아의 형제 자매가 성적 성숙에 도달하기 위해 3-6 개월 동안 자라도록하십시오. 성적 성숙에 도달하면 F0 주사 여성과 야생형 남성을 교차시킵니다. 생성 된 자손은 야생형 및 모체 파삭 파삭 한 배아의 혼합물 일 수있다. 배아가 모성 효과 표현형을 나타내는 F0 주입 여성을 식별합니다. 5) 표현형에 기여하는 병변을 확인하기 위해 UV 처리된 정자를 사용하여 IVF를 수행하여 Sanger 시퀀싱을 위한 모체 크리스펀트 반수체를 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 표적 유전자에서 INDEL의 생성. (A) 가상의 단백질 도메인 (밝은 보라색 및 어두운 보라색 블록), gRNA의 위치 (빨간색 선) 및 PAM 사이트 (빨간색 별)를 보여주는 유전자 구조 다이어그램. gRNA는 제1 활성 도메인을 표적으로 한다. 엑손은 블록으로 표시되고 인트론은 선으로 표시됩니다. (B) 2.5 % 아가 로스 겔의 도말은 주입 된 배아의 체세포에서 INDEL을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 모성 크리스펫은 알려진 모성 효과 돌연변이의 표현형을 요약합니다. 살아있는 시간 일치 야생형(왼쪽 열), 알려진 모계 돌연변이(중간 열) 및 모체 크리스펀트 배아(오른쪽 열)의 대표적인 비교. (A) 잡다/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) 오라/mid1ipIl 돌연변이/모체 크리스펀트는 초기 배아 분열에서 세포질 분열의 결함을 보여 완전 세포융합 배아(A, B) 또는 부분 무세포 배아(C, 흰색 상자)를 유발합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 모체 크리스펀트 반수체를 사용하여 CRISPR-Cas9 유도 돌연변이 서열 분석. (A) F0 주입 암컷이 야생형 수컷과 교배하면 모체 효과 표현형을 가진 이배체 배아가 생성됩니다. (B) IVF는 UV 처리된 정자를 사용하여 모체 파삭파삭한 반수체를 생성하여 모체 대립유전자에서 유도된 INDEL의 시퀀싱 및 분석을 허용합니다. (C) 가이드 부위 3과 4 사이의 큰 결실을 보여주는 birc5b 모체 크리스펀트 반수체의 대표적인 시퀀싱(박스형). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| PCR 믹스 | ||
| 더하다 | ||
| 멸균 H2O | 171.12 밀리리터 | |
| 마그네슘2 (1 미터) | 0.393 mL | |
| 트리스 - HCl (1 미터, pH 8.4) | 2.618 밀리리터 | |
| 케이클 (1 미터) | 13.092 mL | |
| 20 분 동안 오토 클레이브 한 다음 얼음 위에서 용액을 식힌다. 다음 추가 | ||
| BSA (100 밀리그램 / 밀리리터) | 3.468 mL | |
| dATP (100 mM) | 0.262 mL | |
| dCTP (100 mM) | 0.262 mL | |
| dGTP (100 밀리엠) | 0.262 mL | |
| dTTP (100 mM) | 0.262 mL | |
| 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 분취 | ||
| PCR 레시피 | 샘플당 | |
| PCR 믹스 | 17.9 μL | |
| F + R 프라이머 (10 μM) | 0.2 μL | |
| 노무현2O | 1.8 μL | |
| 탁 DNA 중합효소 | 0.1 μL | |
| 증권 시세 표시기 | 5 μL | |
표 1: PCR 혼합.
| 행크의 솔루션 | |||
| 행크의 프리믹스 | (1) HS #1 10.0mL, (2) HS#2 1.0mL, (3) HS#4 1.0mL, (4) ddH2O 86mL, (5) HS#5 1.0mL 순으로 결합합니다. 모든 HS 용액을 4°C에서 보관 | ||
| 행크의 스톡 솔루션 #1 | 100 mL의ddH2O중 NaCl 8.0 g, KCl 0.4 g | ||
| 행크의 스톡 솔루션 #2 | 0.358 g의Na2HPO4무수; 100 mL의 ddH2O 중 K2H2PO4 0.60 g | ||
| 행크의 스톡 솔루션 #4 | 50 mL의 ddH 2 O 중 0.72 g의 CaCl2 | ||
| 행크의 스톡 솔루션 #5 | 50 mL의ddH20 중 1.23 g의 MgSO4·7H2O | ||
| 행크의 스톡 솔루션 #6 | 10.0 mL의ddH20 중 0.35 g의 NaHCO3; 사용 당일에 신선하게 만드십시오 | ||
| 행크의 최종 작업 솔루션 | 행크 프리믹스 9.9mL와 HS 스톡 #6 0.1mL를 결합합니다. | ||
표 2 : 행크의 솔루션.
| 비르크5b #1 | 버크5b #2 | BIRC5b #3 | prc1l #1 | prc1l #2 | ||
| 시퀀싱된 배아의 총 수 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| INDEL이있는 배아의 총 수 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| 한 사이트의 돌연변이 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 여러 사이트의 돌연변이 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| 인델의 위치 | ||||||
| 가이드 사이트 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 가이드 사이트 2 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | |
| 가이드 사이트 3 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| 가이드 사이트 4 | 3 | 9 | 12 | 0 | 10 | |
| 인델의 종류 | ||||||
| 인프레임 변형 | 1 | 2 | 2 | 7 | 10 | |
| 프레임 시프트 변형 | 4 | 7 | 10 | 9 | 10 | |
표 3 : 두 가지 다른 모체 크리스펀트 반수체 세트에서 발견되는 INDEL의 위치와 유형 : birc5b 및 prc1l.
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Discussion
이 원고에 제시된 프로토콜은 정방향 및 역방향 유전 기술 모두에 필요한 여러 세대 대신 단일 세대에서 모성 효과 표현형의 식별 및 1 차 분자 특성화를 허용합니다. 현재, 많은 모계 발현 유전자의 역할은 알려져 있지 않다. 이러한 지식 부족은 부분적으로 모성 효과 유전자를 식별 할 때 표현형을 시각화하는 데 필요한 추가 세대 때문입니다. 과거에, 제브라피쉬에서 모성 효과 유전자의 신속한 동정은 배양된 난모세포(32)에 번역-차단 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 주입함으로써 달성될 수 있었다. 이 방법은 알려진 여러 모성 효과 유전자를 표현하여 성공적으로 입증되었지만 미성숙 난 모세포를 조작하는 것은 섬세하고 시간이 많이 걸리는 실험 일 수 있습니다. 모체 RNA는 또한 CRISPR-RfxCas13d 복합체를 사용하여 분해를 위해 표적화될 수 있지만, 이들 복합체를 단세포 배아에 주입하는 것은 모계가 제공한 단백질33을 표적화할 수 없다. 보다 최근에는 CRISPR-Cas9가 생식계열에서 이대립유전자 돌연변이를 유도하여 단일 세대에서 새로운 모성 효과 유전자를 신속하게 식별할 수 있다는 것이 발견되었습니다.11.
이 프로토콜에는 모체 크리스펀트 배아의 회복에 기여하는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 이론적으로 생식 세포는 초기 배아 발달에 명시되어 있기 때문에 표적 유전자에서 DNA 병변이 일찍 생성될수록 돌연변이를 포함하는 세포가 생식계열의 일부가 될 확률이 높아집니다. 이 방법은 단일 세포 배아의 발달 중인 배반판에 주입된 Cas9 단백질을 사용하여 생식계열의 편집 가능성을 높입니다. 회수된 모체 크리스펀트 배아의 비율에 영향을 미치는 또 다른 중요한 요소는 표적 부위에서 유전자 편집을 생성하는 가이드 RNA의 효율성입니다. 이 절차에는 PCR에 의해 24 hpf에서 체세포 INDEL을 생성하는 가이드 RNA의 능력을 결정하는 섹션이 포함되어 있습니다. 가이드 RNA가 체세포 편집에 실패하면 모체 크리스펀트를 생성하기에 충분히 높은 속도로 생식계열에서 편집을 생성할 가능성이 낮습니다. 이 프로토콜은 사용자에게 세 개 이상의 가이드 사이트에서 볼 수 있어야 하는 체세포 편집을 테스트하도록 지시합니다.
모체 크리스펀트 배아의 표현형을 관찰한 후, 표현형에 기여하는 유전적 병변은 UV 처리된 정자를 사용한 IVF를 통해 서열 수준에서 분석할 수 있습니다. PCR을 위한 충분한 출발 물질을 얻기 위해, 모체 크리스펀트 반수체 배아는 적어도 6-8시간 동안 발달하여 여러 주기의 DNA 복제가 일어날 수 있도록 해야 합니다. 게놈 DNA는 또한 DNA를 농축하기 위해 50mM NaOH의 50μL에서 추출되어야 합니다. 모체 크리스펀트 반수체 배아가 6-8 시간 동안 생존 할 수없는 경우 더 이른 시점에서 배아를 수집하십시오. 더 적은 DNA 복제 주기를 거치는 배아를 설명하려면 NaOH 및 Tris-HCL의 동일한 비율을 유지하면서 더 작은 부피의 50mM NaOH에서 DNA를 추출합니다. 또 다른 옵션은 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 추출된 DNA를 농축하는 것입니다. DNA가 추출된 후 시퀀싱에 사용되는 PCR 단편에는 가능한 경우 4개의 표적 부위가 모두 포함되어야 합니다. 이 단편은 모체 크리스펀트 배아의 여러 가이드 부위에 걸쳐 있는 큰 결실을 식별할 수 있게 해줍니다.
Sanger 시퀀싱을 위해 모체 크리스펀트 반수체를 수집할 때 표현형을 보여주는 모든 반수체를 수집하고 최소 10개의 고유한 반수체 배아 샘플을 Sanger 시퀀싱으로 보냅니다. 클러치 당 여러 반수체 배아의 시퀀싱은 생식계열에서 발견되는 여러 INDEL의 식별을 가능하게 합니다. 모체 크리스펀트 반수체의 과거 시퀀싱 데이터는 다수의 대립유전자가 모체 크리스펀트 반수체 세트에서 확인될 수 있음을 보여주었다(11). 그러나, 이들 대립유전자는 예상된 1:1 비율(11)에서 회복되지 않는다. 다중 배아의 시퀀싱은 또한 표현형이 표적 유전자의 CRISPR-Cas9 INDEL에 의해 유발된다는 생각을 뒷받침하는 데 도움이 될 것입니다. 특정 표현형을 나타내는 서열화된 반수체 배아에서 관찰되는 임의의 야생형 서열은 표현형이 표적화된 유전자와 연관되지 않음을 시사한다. 이전에 특성화되지 않은 유전자를 표적화함으로써 확인된 임의의 새로운 모성-효과 표현형은 또한 형제 F0 수컷11을 사용하여 안정한 계통을 확립함으로써 확인되어야 한다.
어떤 경우에는 확인된 모체 파산제 표현형이 특정 표현형 특성을 갖는 반수체 분석을 통해 INDEL을 식별하는 것이 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 분열 단계에서 수정되지 않거나 용해되는 것으로 보이는 모체 크리스펀트 반수체 배아는 선택이 불가능할 수 있습니다. 반수체 증후군에 대응하는 것과 유사한 축 확장 결함을 갖는 모체 크리스펀트 배아는 또한 모체 반수체를 생성할 때 분석을 위해 구별되지 않을 수 있다(34). 이러한 경우 연구원은 유전자 표현형 확인을 위해 안정한 라인을 사용하여 직접 분석을 수행하는 것이 좋습니다.
현재 모성 크리스펀트 프로토콜의 한 가지 한계는 총 형태학적 결함에 의해서만 모성 효과 유전자를 식별한다는 것입니다. 상기 방법의 민감도를 증가시키고 초기 발달의 특정 측면에 대해 더 구체적으로 만들기 위해, 트랜스제닉 리포터는 다른 스크린(9,10,35)에 대해 행해진 것처럼 특정 구조 또는 세포 유형을 강조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR-Cas9 혼합물을 Buc-GFP 형질전환 라인에 주입하여 원시 생식 세포(36)의 형성 및 발달을 조절하는 비치명적 유전자를 확인할 수 있다. 모체 크리스펀트 프로토콜의 또 다른 한계는 초기 발달 동안에만 발현되는 유전자에는 유용하지만 유전자의 CRISPR-Cas9 표적화가 발달 중인 배아에 치명적일 수 있기 때문에 모체 및 접합 기능을 모두 가진 유전자에는 효과적이지 않을 수 있다는 것입니다. 발달 전반에 걸쳐 발현되는 유전자의 모체 기능을 연구하기 위해 Cas9 활성은 생식계열37을 표적으로 할 수 있으므로 유전자의 체세포 기능은 영향을 받지 않고 F0 암컷이 성인이 될 때까지 생존할 수 있습니다.
모성 크리스펀트는 초기 발달에 필요한 새로운 모성 효과 유전자를 식별하는 효과적인 도구입니다. 단일 표적에 대한 가이드 RNA의 멀티플렉싱과 Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력의 조합은 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 관찰 할 수있게하여 표적 유전자 편집을 수행 할 때 일반적으로 필요한 다중 세대 육종 계획을 피할 수 있습니다. 여러 세대를 우회하면 모성 효과 유전자를 식별하는 데 필요한 공간과 자원의 양이 줄어 듭니다.
새로운 모성 효과 유전자를 식별하는 것 외에도 이 프로토콜은 모든 제브라피쉬 실험실에서 안정적인 계통을 설정 및 유지하지 않고도 알려진 모성 효과 돌연변이를 표현형으로 복사하고 연구할 수 있도록 하여 유전 경로에 대한 자세한 분석을 용이하게 합니다. 원칙적으로,이 모성 크리스펀트 접근법은 또한 비 유전 모델 종에서 모체 제품의 기능을 결정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
수생 시설을 돌봐 주신 전현직 Pelegri 실험실 축산 직원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 Ryan Trevena와 Diane Hanson의 원고에 대한 의견과 통찰력에 감사드립니다. 자금은 FP에 대한 NIH 보조금으로 제공되었습니다 (GM065303).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
| 100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
| 70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
| Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
| Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
| Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
| Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
| Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
| Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
| General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Gloves | Any Maker | ||
| Ice Bucket | Any Maker | ||
| Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Female zebrafish | |||
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
| Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
| MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
| Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
| Micropipeters | Any Maker | ||
| Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
| Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
| Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
| Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
| nuclease-free water | Any Maker | ||
| Paper Towel | Any Maker | ||
| Pastro Pipettes | Any Maker | ||
| PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
| Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
| Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
| Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
| Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatula | Any Maker | ||
| Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
| Tape | Any Maker | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
| Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
| UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
| Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
| 1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse free ethanol | any maker | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
| Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agarose | any maker | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | any maker | ||
| Dissecting Forcepts | any maker | ||
| Dissecting Microscope | any maker | ||
| Dissecting Scissors | any maker | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
| Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fish Net | any maker | fine mesh | |
| Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
| Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
| Gel Electropheresis System | any maker | ||
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
| Glass Dishes | any maker | ||
| Gloves | any maker | ||
| Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ice Bucket | any maker | ||
| Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
| In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Male and Female zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Microinjector | |||
| Microneedle Slide | |||
| Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
| Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
| Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
| Microplastic slide | |||
| Microwave | any maker | ||
| MiliQ Water | any maker | ||
| mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Narrow Spatula | any maker | ||
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Paper Towel | any maker | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
| PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
| Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
| Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software for sanger sequencing Analysis | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterlie H2O | any brand | ||
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Tape | any brand | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
| UV lamp | UVP | ||
| UV safety glasses | any maker | ||
| Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
| Zebrafish mating boxes | any maker | ||
| PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |
References
- Pelegri, F.
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
- He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
- Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
- Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
- Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
- Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
- Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
- Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
- Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
- Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
- White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
- Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
- Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
- Xu, Q.
- Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
- Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
