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Genetics

मातृ क्रिस्पेंट के साथ प्रारंभिक विकास में मातृ-व्यक्त जीन की भूमिका का निर्धारण

Published: December 21, 2021 doi: 10.3791/63177
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

प्रारंभिक विकास मातृ-विरासत वाले उत्पादों पर निर्भर है, और इनमें से कई उत्पादों की भूमिका वर्तमान में अज्ञात है। यहां, हमने एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जो एक पीढ़ी में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान करने के लिए CRISPR-Cas9 का उपयोग करता है।

Abstract

प्रारंभिक विकास ओजेनेसिस के दौरान परिपक्व अंडाणु में शामिल मातृ कारकों के एक पूल पर निर्भर करता है जो युग्मनज जीनोम सक्रियण तक विकास के लिए आवश्यक सभी सेलुलर कार्य करते हैं। आमतौर पर, इन मातृ कारकों के आनुवंशिक लक्ष्यीकरण के लिए मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान करने के लिए एक अतिरिक्त पीढ़ी की आवश्यकता होती है, जो विकास के दौरान मातृ-व्यक्त जीन की भूमिका निर्धारित करने की क्षमता में बाधा डालती है। CRISPR-Cas9 की द्वि-आयामी संपादन क्षमताओं की खोज ने इंजेक्शन वाले भ्रूण या "क्रिस्पेंट्स" के दैहिक ऊतकों में भ्रूण फेनोटाइप की स्क्रीनिंग की अनुमति दी है, जिससे विकास कार्यक्रमों में युग्मक-व्यक्त जीन की भूमिका की समझ बढ़ जाती है। यह आलेख एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो क्रिस्पेंट विधि का विस्तार है। इस विधि में, रोगाणु कोशिकाओं का द्विगुणी संपादन एक पीढ़ी में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप के अलगाव की अनुमति देता है, या "मातृ क्रिस्पेंट्स" के लिए। मल्टीप्लेक्सिंग गाइड आरएनए को एक लक्ष्य के लिए मातृ क्रिस्पेंट के कुशल उत्पादन को बढ़ावा देता है, जबकि मातृ क्रिस्पेंट अगुणित का अनुक्रम विश्लेषण आनुवंशिक घावों की पुष्टि करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है जो मातृ-प्रभाव फेनोटाइप का उत्पादन करते हैं। मातृ क्रिस्पेंट का उपयोग आवश्यक मातृ-व्यक्त जीन की तेजी से पहचान का समर्थन करता है, इस प्रकार प्रारंभिक विकास की समझ को सुविधाजनक बनाता है।

Introduction

मातृ जमा उत्पादों (जैसे, आरएनए, प्रोटीन और अन्य बायोमोलेक्यूल्स) का एक पूल सभी प्रारंभिक सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है जब तक कि भ्रूण का युग्मनजजीनोम सक्रिय नहीं हो जाता है। अंडाणु से इन उत्पादों की समय से पहले कमी आमतौर पर भ्रूण घातक होती है। विकास में इन जीनों के महत्व के बावजूद, कई मातृ-व्यक्त जीनों की भूमिका वर्तमान में अज्ञात है। जेब्राफिश में जीन-संपादन तकनीक में प्रगति, जैसे कि सीआरआईएसपीआर-कैस 9, मातृ-व्यक्त जीन 2,3,4 के लक्ष्यीकरण को सक्षम बनाता है। हालांकि, एक मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान के लिए एक युग्मनज फेनोटाइप की तुलना में एक अतिरिक्त पीढ़ी की आवश्यकता होती है, इस प्रकार अधिक संसाधनों की आवश्यकता होती है। हाल ही में, CRISPR-Cas9 की द्विस्तरीय संपादन क्षमता का उपयोग इंजेक्शन (F0) भ्रूण के दैहिक ऊतकों में भ्रूण फेनोटाइप ्स के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया है, जिसे "क्रिस्पेंट" 5,6,7,8,9,10 के रूप में जाना जाता है। क्रिस्पेंट तकनीक दैहिक कोशिकाओं में उम्मीदवार जीन की संसाधन-कुशल स्क्रीनिंग की अनुमति देती है, जिससे विकास में विशिष्ट पहलुओं को समझने में सुविधा होती है। इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल एक पीढ़ी11 में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप, या "मातृ क्रिस्पेंट" की पहचान के लिए अनुमति देता है। यह योजना मल्टीप्लेक्सिंग गाइड आरएनए को एक जीन में शामिल करके और जर्मलाइन में द्विवार्षिक संपादन घटनाओं को बढ़ावा देकर प्राप्त की जा सकती है। इन मातृ क्रिस्पेंट भ्रूणों को सकल रूपात्मक फेनोटाइप्स द्वारा पहचाना जा सकता है और प्राथमिक लक्षण वर्णन से गुजरना पड़ता है, जैसे कि सेल सीमाओं के लिए लेबलिंग और डीएनए पैटर्निंग11। प्रेरित आईएनडीईएल के अवलोकन योग्य फेनोटाइप और बुनियादी आणविक लक्षण वर्णन का संयुक्त विश्लेषण प्रारंभिक विकास में लक्षित जीन की भूमिका की भविष्यवाणी के लिए अनुमति देता है।

ज़ेबराफ़िश में, पहले 24 घंटे पोस्ट-फर्टिलाइजेशन (एचपीएफ) के दौरान, कोशिकाओं का एक छोटा समूह आदिम रोगाणु कोशिकाओं में विकसित होता है, जो जर्मलाइन 12,13,14,15 का अग्रदूत है। एफ 0 मादाओं द्वारा रखे गए चंगुल में, बरामद मातृ कुरकुरा भ्रूण का अनुपात इस बात पर निर्भर करता है कि कितनी रोगाणु कोशिकाओं में लक्षित जीन में एक द्विगुण संपादन घटना होती है। सामान्य तौर पर, भ्रूण में जितनी जल्दी संपादन घटना होती है, जर्मलाइन में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 उत्परिवर्तन देखे जाने की संभावना उतनी ही अधिक होती है। ज्यादातर मामलों में, मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण के फेनोटाइप विकासशील अंडाणु में मौजूद दो मातृ एलील में कार्य के नुकसान से आते हैं। जैसे ही अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन को समाप्त करता है, मातृ एलील्स में से एक को ध्रुवीय शरीर के माध्यम से भ्रूण से बाहर निकाला जाता है, जबकि दूसरा एलील मातृ प्रोन्यूक्लियस में शामिल हो जाता है। कई मातृ क्रिस्पेंट अगुणित का अनुक्रमण जर्मलाइन में मौजूद उत्परिवर्तन (सम्मिलन और / या विलोपन (आईएनडीईएल)) के मिश्रण का प्रतिनिधित्व करेगा जो फेनोटाइप11 में योगदान देता है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल मातृ-प्रभाव जीन में CRISPR-Cas9 उत्परिवर्तन बनाने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करता है और मातृ क्रिस्पेंट दृष्टिकोण (चित्रा 1) का उपयोग करके संबंधित फेनोटाइप की पहचान करता है। खंड एक बताएगा कि आरएनए को प्रभावी ढंग से कैसे डिजाइन और बनाया जाए, जबकि खंड दो और तीन में सूक्ष्म इंजेक्शन द्वारा मातृ क्रिस्पेंट बनाने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। CRISPR-Cas9 मिश्रण को इंजेक्ट करने के बाद, पीसीआर (अनुभाग चार) के माध्यम से दैहिक संपादन के लिए इंजेक्शन भ्रूण की जांच की जाती है। एक बार इंजेक्शन वाले एफ 0 भ्रूण विकसित हो जाते हैं और यौन परिपक्वता तक पहुंच जाते हैं, तो एफ 0 मादाओं को जंगली प्रकार के पुरुषों में पार किया जाता है, और उनकी संतानों को मातृ-प्रभाव फेनोटाइप (खंड पांच) के लिए जांच की जाती है। खंड छह में मातृ क्रिस्पेंट अगुणित बनाने के निर्देश शामिल हैं जिन्हें सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9-प्रेरित आईएनडीईएल की पहचान करने के लिए सेंगर अनुक्रमण के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, चर्चा में संशोधन शामिल हैं जो इस विधि की संवेदनशीलता और शक्ति को बढ़ाने के लिए प्रोटोकॉल में किए जा सकते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए अग्रणी अध्ययनों में, सभी ज़ेब्राफिश आवास और प्रयोगों को विस्कॉन्सिन-मैडिसन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी-एम005268-आर 2) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. गाइड आरएनए का संश्लेषण

नोट: जाइगोटिक क्रिस्पेंट को एकल गाइड आरएनए का उपयोग करके बनाया गया है या एकल लक्ष्य 5,6,7,8,9,9,10 के लिए कई गाइड आरएनए को मल्टीप्लेक्स किया गया है। गाइड आरएनए के मल्टीप्लेक्सिंग से जाइगोटिक क्रिस्पेंट फेनोटाइप10 दिखाने वाले भ्रूण का प्रतिशत बढ़ जाता है। फेनोटाइप का प्रदर्शन करने वाले भ्रूण की इस बढ़ी हुई आवृत्ति के कारण, मातृ क्रिस्पेंट एक जीन के लिए चार गाइड आरएनए को मल्टीप्लेक्स करके बनाए जाते हैं। गाइड आरएनए डिजाइन करने के लिए चॉपचॉप का उपयोग करने पर एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल और जेब्राफिश के लिए गाइड आरएनए को संश्लेषित करने के लिए एक एनीलिंग विधिकहीं और 16,17,18,19,20 पाई जा सकती है।

  1. लक्ष्य करने के लिए मातृ-व्यक्त जीन की पहचान करने के लिए, आरएनए-अनुक्रम डेटाबेस के माध्यम से विकास के दौरान एमआरएनए प्रतिलेख स्तरों का पता लगाएं जो युग्मनज से 5 दिन21 तक प्रतिलेख जानकारी प्रदान करता है। सामान्य तौर पर, मातृ-विशिष्ट जीन प्रारंभिक भ्रूण में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं और युग्मनज जीनोम सक्रिय होने के बाद अवक्रमित होजाते हैं।
  2. एक बार मातृ-व्यक्त लक्ष्य जीन की पहचान हो जाने के बाद, एन्सेम्बल जीनोम ब्राउज़र23 पर उपलब्ध "डोमेन और सुविधाएँ" अनुभाग का उपयोग करके पहले अनुमानित प्रोटीन डोमेन का निर्धारण करें। चार गाइड आरएनए के लिए लक्ष्य क्षेत्र के रूप में इस डोमेन का उपयोग करें।
  3. पहले सक्रिय डोमेन में चार गाइड आरएनए लक्ष्य साइटों की पहचान करने के लिए गाइड आरएनए चयन कार्यक्रम CHOPCHOP का उपयोग करें। जीन-विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स डिजाइन करें, जैसा कि प्रत्येक लक्ष्य साइट के लिए नीचे दिखाया गया है। जीन-विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड में, एन20 खंड चॉपचॉप से पीएएम साइट (एनजीजी) को कम करने वाले लक्ष्य अनुक्रम से मेल खाता है। मानक डेसाल्ट शुद्धिकरण का उपयोग करके इन जीन-विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और निरंतर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का आदेश दें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    जीन-विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड:
    5'TAATACGACTACTA- N20 -GTTTTAGAGCTAGATAGCAAG 3'
  4. प्रत्येक जीन-विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के लिए एक गाइड आरएनए टेम्पलेट बनाने के लिए, इसे निरंतर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड में नष्ट करें और टी 4-डीएनए पोलीमरेज़ के साथ ओवरहैंग्स को भरें जैसा कि पहले वर्णित16 है। चार गाइड आरएनए टेम्प्लेट इकट्ठे होने के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए क्लीन-अप और कंसंट्रेटर किट का उपयोग करके उन्हें एक साथ शुद्ध और केंद्रित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. इन-विट्रो टी 7 ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके पूल किए गए गाइड आरएनए टेम्पलेट से एसजीआरएनए मिश्रण को संश्लेषित करें (सामग्री की तालिका देखें)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार इन-विट्रो ट्रांसक्रिप्शन करें। टी 7 ट्रांसक्रिप्शन किट की आधी प्रतिक्रियाओं का उपयोग करने से प्रति प्रतिक्रिया लागत कम हो सकती है।
  6. आरएनए संश्लेषण के बाद, इथेनॉल / अमोनियम एसीटेट प्रोटोकॉल का उपयोग करके एसजीआरएनए के परिणामी पूल को शुद्ध करें जैसा कि पहले वर्णित 16,20,24 है। आरएनए को अलग करने के बाद, इसे न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 20 μL में पुन: निलंबित करें। यदि टी 7 ट्रांसक्रिप्शन किट की आधी प्रतिक्रियाओं का उपयोग एसजीआरएनए के पूल को स्थानांतरित करने के लिए किया गया था, तो शुद्ध आरएनए को न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 10-15 μL में पुन: निलंबित करें।
  7. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके बनाए गए पूल किए गए एसजीआरएनए की मात्रा निर्धारित करें। न्यूक्लियस-मुक्त पानी में एसजीआरएनए के पूल को 1500 ng/μL ± 500 ng/μL तक पतला करें। आमतौर पर, कार्यशील तनुकरण की अंतिम मात्रा 30-50 μL तक होती है।
  8. एसजीआरएनए के पूल की एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद, 1% अगारोस जेल पर एसजीआरएनए की अखंडता को सत्यापित करें।
    1. 1% agarose/0.5 μg/mL एथिडियम ब्रोमाइड/टीबीई जेल डालें। एक बार जेल जम जाने के बाद, इसे टीबीई रनिंग बफर में रखें।
    2. एसजीआरएनए मिश्रण के 1 μL और RNA जेल लोडिंग बफर के 1 μL मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। इस नमूने को जेल में लोड करें और जेल को 5 मिनट के लिए 100 वोल्ट पर चलाएं।
  9. पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश का उपयोग करके बैंड की कल्पना करें। एसजीआरएनए का पूल एकल बैंड के रूप में दिखाई देना चाहिए। यदि एक धब्बा देखा जाता है, तो आरएनए क्षरण होने की संभावना है।
  10. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में न्यूक्लियस-मुक्त पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों में एकल-उपयोग 1 μL एलिकोट में एसजीआरएनए के पूल को स्टोर करें। एसजीआरएनए मिश्रण (30 μL या अधिक) की बड़ी मात्रा के लिए, मात्रा का आधा हिस्सा न्यूक्लियस-मुक्त पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों में डालें और दूसरे आधे को न्यूक्लियस-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बड़ी मात्रा के रूप में संग्रहीत करें। जरूरत पड़ने पर पिघलाएं और एलिकोट करें।
  11. आरएनए क्षरण को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में नमूने दो से अधिक फ्रीज-पिघलना चक्रों से नहीं गुजरते हैं।

2. माइक्रोइंजेक्शन के लिए अभिकर्मकों और सामग्री तैयार करना

नोट: ज़ेबराफ़िश में, कैस 9 एमआरएनए का इंजेक्शन युग्मनज क्रिस्पेंट बना सकता है। हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि कैस 9 प्रोटीन इंजेक्शन भ्रूण16,25 में आईएनडीईएल बनाने में अधिक कुशल है। यह प्रोटोकॉल मातृ क्रिस्पेंट उत्पन्न करने के लिए कैस 9 प्रोटीन का उपयोग करता है क्योंकि यह प्रोटीन इंजेक्शन कैस 9 एमआरएनए के समान गतिविधि में अंतराल का अनुभव नहीं करता है। सिद्धांत रूप में, इससे विकास की शुरुआत में एक द्विगुणित उत्परिवर्तन की संभावना बढ़ जानी चाहिए जिसके परिणामस्वरूप जर्मलाइन के अधिक व्यापक खंड के प्रभावित होने की संभावना बढ़ जाती है। माइक्रोइंजेक्शन की तैयारी करने के तरीके का विवरण देने वाले अन्य प्रोटोकॉल और संसाधन कहीं और पाए जा सकते हैं 24,26.

  1. Cas9 प्रोटीन खरीदें या उत्पन्न करें ( सामग्री की तालिका देखें)। न्यूक्लियस मुक्त पानी में कैस 9 प्रोटीन को 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए पुन: निलंबित करें और आरएनएस-मुक्त पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एलिकोट 1 μL। इन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर एकल-उपयोग ट्यूबों के रूप में स्टोर करें।
  2. इंजेक्शन से पहले दोपहर में, ग्लास केशिका खींचने और इंजेक्शन सुई बनाने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करें। माइक्रोइंजेक्शन की सुबह तक एक संलग्न सुई धारक में अखंड सुई को स्टोर करें।
  3. एक इंजेक्शन प्लेट बनाने के लिए, 100 मिमी X 15 मिमी पेट्री डिश के आधे हिस्से को भरने के लिए 1.5% अगारोस / बाँझ एच 2 ओ का20एमएल डालें और इसे जमने की प्रतीक्षा करें। एक बार जब अगारोस समाधान सेट हो जाता है, तो पेट्री डिश में 1.5% अगारोस / बाँझ एच 2 ओ का20एमएल जोड़ें और प्लास्टिक मोल्ड ( सामग्री की तालिका देखें) को तरल अगारोस में रखें और इसे कठोर होने दें।
  4. अगारोस सख्त होने के बाद, प्लास्टिक के सांचे को हटा दें और इंजेक्शन प्लेट को इंजेक्शन की सुबह तक रेफ्रिजरेटर में उल्टा स्टोर करें। एक एकल प्लेट का उपयोग कई इंजेक्शन के लिए किया जा सकता है जब तक कि कुएं अपनी अखंडता बनाए रखते हैं।

3. मातृ क्रिस्पेंट उत्पन्न करने के लिए एक-सेल ज़ेब्राफिश भ्रूण में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 कॉकटेल का माइक्रोइंजेक्शन

नोट: ज़ेबराफिश भ्रूण में माइक्रोइंजेक्शन के लिए अधिक संसाधनकहीं और पाए जा सकते हैं 24,26,27. सीआरआईएसपीआर-कैस 9 मिश्रण को एक-कोशिका भ्रूण के विकासशील ब्लास्टोडिस्क में इंजेक्ट करने से मातृ क्रिस्पेंट बनाने की संभावना बढ़ सकती है। मिश्रण को 2-सेल चरण तक जर्दी थैली में भी इंजेक्ट किया जा सकता है। हालांकि, जर्दी में इंजेक्ट किए गए मिश्रण ब्लास्टोडिस्क तक पहुंचने के लिए ओप्लाज्मिक स्ट्रीमिंग पर निर्भर करते हैं, इसलिए सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 को जर्दी में इंजेक्ट करने से सीआरआईएसपीआर-सीएएस 928 की काटने की दक्षता कम हो सकती है।

  1. माइक्रोइंजेक्शन से पहले दोपहर, ज़ेबराफिश संभोग बक्से में जंगली प्रकार के क्रॉस सेट करें। नर और मादा दोनों मछलियों को एक ही टैंक में रखें, लेकिन उन्हें संभोग बॉक्स डिवाइडर से अलग करें या मादा को अंडे देने वाले इंसर्ट के अंदर रखें।
  2. प्रयोग की सुबह, कैस 9 प्रोटीन का एक 2 मिलीग्राम / एमएल एलिकोट और एसजीआरएनए के पूल का एक एलिकोट निकालें। RNase-मुक्त पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जिसमें Cas9 प्रोटीन होता है, एक 5 μL इंजेक्शन मिश्रण इकट्ठा करें जिसमें SgRNA का पूल, 0.5% फिनोल लाल घोल का 1 μL और न्यूक्लियस-मुक्त पानी शामिल है। आरनेस-मुक्त पानी में 400 एनजी /1एल सीएएस 9 प्रोटीन और 200 एनजी / 1 एल पूल किए गए एसजीआरएनए की अंतिम एकाग्रता या इंजेक्शन भ्रूण में सीएएस 9 प्रोटीन का एसजीआरएनए के लिए 2: 1 अनुपात का लक्ष्य रखें। इस इंजेक्शन मिश्रण को इंजेक्शन की सुबह बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. रेफ्रिजरेटर से एक इंजेक्शन प्लेट निकालें और इसे कम से कम 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) तक गर्म होने दें।
  4. इंजेक्शन कॉकटेल इकट्ठा होने के बाद, नर और मादा को संभोग करने की अनुमति दें, उदाहरण के लिए, संभोग बॉक्स डिवाइडर को हटाकर या नर को मादा के समान अंडे देने वाले सम्मिलित में रखकर, जैसा कि उपयुक्त हो।
  5. मछली के लेटने के बाद लेकिन भ्रूण एकत्र होने से पहले, एक नए रेजर ब्लेड या बारीक बल का उपयोग करके एक अखंड सुई की नोक को काटें ताकि एक सुई बनाई जा सके जिसमें भ्रूण के नुकसान से बचने के लिए पर्याप्त छोटा बोर हो लेकिन यह इतना चौड़ा हो कि यह इंजेक्शन मिश्रण से भरा न हो। सुई कट जाने के बाद, केशिका के पिछले छोर में डाले गए माइक्रोलोडर पिपेट टिप का उपयोग करके इंजेक्शन मिश्रण के साथ सुई लोड करें ( सामग्री की तालिकाएं देखें)।
  6. सुई भर जाने के बाद, कैस 9-एसजीआरएनए परिसरों को इकट्ठा करने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए सुई को इनक्यूबेट करें।
  7. माइक्रोइंजेक्टर को चालू करें और सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर में डालें। एक माइक्रोमीटर स्लाइड पर खनिज तेल की एक बूंद रखें और इंजेक्शन दबाव को समायोजित करके सुई को कैलिब्रेट करें जब तक कि सुई खनिज तेल में 1 एनएल बोलस को बाहर न निकाल दे।
    नोट: खनिज तेल में इंजेक्ट करते समय, एक 1 एनएल बोलस का व्यास लगभग 0.125 मिमी (या 0.062 मिमी की त्रिज्या) होगा जैसा कि माइक्रोमीटर स्लाइड के साथ मापा जाता है।
  8. भ्रूण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, उन्हें प्लास्टिक की छन्नी का उपयोग करके 10 मिनट के बाद इकट्ठा करें और उन्हें 1x E3 मीडिया (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, और 0.03 M मेथिलीन ब्लू प्रति 1 L 1x E3) का उपयोग करके पेट्री डिश में कुल्ला करें। 10-15 भ्रूण ों को हटा दें और उन्हें एक अलग पेट्री डिश में रखें ताकि उन्हें इंजेक्शन नियंत्रण के रूप में रखा जा सके।
  9. बाकी विकासशील भ्रूणों को इंजेक्शन प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें।
  10. एक-कोशिका भ्रूण के विकासशील ब्लास्टोडिस्क में 1 एनएल समाधान (कुल 400 पीजी कैस 9 प्रोटीन और 200 पीजी एसजीआरएनए) इंजेक्ट करें। यदि सुई की नोक बंद हो जाती है, तो टिप बैक को तोड़ने के लिए बल का उपयोग करें और 1 एनएल बोलस को बाहर निकालने के लिए सुई को फिर से कैलिब्रेट करें। निषेचन के बाद विकास के पहले 40 मिनट के दौरान सभी भ्रूणों को इंजेक्ट करना सुनिश्चित करें।
  11. इंजेक्शन पूरा होने के बाद, इंजेक्शन वाले भ्रूण को एक लेबल पेट्री डिश में वापस करें जिसमें 1x E3 मीडिया होता है और उन्हें पूरे दिन विकसित करने की अनुमति देता है। ज़ेब्राफिश स्टेजिंग श्रृंखला29 के अनुसार किसी भी भ्रूण को हटा दें जो अनफर्टिलाइज्ड हैं या सामान्य रूप से विकसित नहीं हो रहे हैं।

4. एफ 0 इंजेक्शन भ्रूण में दैहिक आईएनडीईएल के लिए स्क्रीनिंग

नोट: आईएनडीईएल की पहचान करने के लिए अन्य तरीकों, जैसे टी 7 एंडोन्यूक्लिज़ आई परख या उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलने विश्लेषण, का उपयोग यह निर्धारित करते समय किया जा सकता है कि भ्रूण में दैहिक आईएनडीईएल 30 है या नहीं।

  1. इंजेक्शन के अगले दिन, पेट्री डिश से दोषपूर्ण और लाइस्ड भ्रूण को हटा दें और भ्रूण के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए 1x E3 मीडिया को बदलें।
  2. पकवान को साफ करने के बाद, बिना इंजेक्शन वाली प्लेट से छह स्वस्थ इंजेक्शन भ्रूण और दो नियंत्रण भ्रूण एकत्र करें। प्रत्येक भ्रूण को व्यक्तिगत रूप से पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब के एक कुएं में रखें और ट्यूबों के शीर्ष को लेबल करें।
  3. अलग-अलग भ्रूण के जीनोमिक डीएनए को निकालने के लिए, स्ट्रिप ट्यूब के कुओं से अतिरिक्त ई 3 मीडिया को हटा दें और प्रति कुएं 50 एमएम एनएओएच के 100 μL जोड़ें।
  4. भ्रूण को 20 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, 1 एम ट्रिस एचसीएल (पीएच 7.5) के 10 μL जोड़ें, और उन्हें 5 से 10 सेकंड के लिए भंवर करें। इस निकाले गए डीएनए को महत्वपूर्ण डीएनए गिरावट के बिना कम से कम 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. 100-110 बीपी डीएनए टुकड़े को बढ़ाने के लिए प्रत्येक गाइड साइट के लिए अद्वितीय स्क्रीनिंग प्राइमर डिज़ाइन करें जिसमें CRISPR-Cas9 लक्ष्य साइट शामिल है। यदि संभव हो, तो लक्ष्य साइट को प्रवर्धित टुकड़े के बीच में रखें, जिससे बड़े विलोपन की पहचान हो सके।
  6. चार गाइड लक्ष्य साइटों में से प्रत्येक के लिए, लक्ष्य साइट में दैहिक उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए तैयार एकल-भ्रूण जीनोमिक डीएनए, पीसीआर मिश्रण और गाइड-विशिष्ट स्क्रीनिंग प्राइमरों के 5 μL का उपयोग करके आठ 25 μL पीसीआर प्रतिक्रियाएं सेट करें (तालिका 1)।
  7. कंघी का उपयोग करके 2.5% अगारोस / 0.5 μg / mL एथिडियम ब्रोमाइड / टीबीई जेल डालें जो लगभग 0.625 सेमी चौड़े कुओं का निर्माण करते हैं। यह विस्तृत कंघी जीनोमिक अनुक्रम में आकार परिवर्तन का पता लगाते समय बेहतर रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देती है। जेल के जम जाने के बाद, इसे वैद्युतकणसंचलन कक्ष में रखें जिसमें टीबीई रनिंग बफर होता है।
  8. पीसीआर उत्पाद में 6x लोडिंग डाई का 5 μL जोड़ें और इस मिश्रण के 25 μL को जेल में लोड करें। सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन और नियंत्रण नमूने जेल की एक ही पंक्ति पर चलाए जाते हैं। सभी नमूने लोड होने के बाद, जेल बॉक्स के सकारात्मक छोर पर टीबीई रनिंग बफर के प्रति 1 एल एथिडियम ब्रोमाइड के 5 μL जोड़ें।
  9. जेल को 120 वी पर चलाएं जब तक कि डीएनए बैंड हल न हो जाए या डीएनए लेन के अंत तक न पहुंच जाए। यदि Cas9 ने लक्ष्य साइट में INDEL बनाए हैं, तो आमतौर पर इंजेक्शन वाले नमूनों में एक स्मीयर देखा जाता है, लेकिन नियंत्रण नहीं।
  10. यदि चार गाइड आरएनए के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूण में चार गाइड साइटों में से कम से कम तीन में स्मीयर देखे जाते हैं, तो भाई-बहन इंजेक्शन भ्रूण को बड़ा करें।
  11. जब भी इंजेक्शन वाले नमूनों में आवश्यक संख्या में गाइड साइटों में स्मीयर नहीं होते हैं, तो उन लोगों को बदलने के लिए नए गाइड आरएनए डिजाइन करें जो काम नहीं करते थे और गाइड आरएनए का एक नया पूल बनाते हैं जिसमें काम करने वाले और नए डिज़ाइन किए गए शामिल होते हैं। ऊपर वर्णित दैहिक आईएनडीईएल के लिए नए पूल को इंजेक्ट और परीक्षण करें।

5. मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान

नोट: एक बार इंजेक्शन एफ 0 मादाएं यौन परिपक्वता तक पहुंच जाती हैं, तो उनकी जर्मलाइन कोशिकाओं में मातृ क्रिस्पेंट और जंगली प्रकार के भ्रूण का मिश्रण उत्पन्न करने की क्षमता होती है। भले ही यह मिश्रण निषेचन और विकास के समय के लिए आंतरिक नियंत्रण की अनुमति देता है, फिर भी एफ 0 मादा के क्लच में केवल मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण होने की स्थिति में बाहरी नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार के इनक्रॉस को स्थापित करना फायदेमंद है।

  1. प्रयोग से पहले दोपहर में, जंगली प्रकार के पुरुषों के खिलाफ एफ 0 इंजेक्शन वाली मादाओं को स्थापित किया गया और मानक ज़ेब्राफिश संभोग बक्से में जंगली-प्रकार के क्रॉस को नियंत्रित किया गया। नर और मादा दोनों मछलियों को एक ही टैंक में रखें, लेकिन उन्हें संभोग बॉक्स डिवाइडर से अलग करें या मादा को अंडे देने वाले डालें।
  2. प्रयोग की सुबह, नर और मादा को संभोग शुरू करने की अनुमति दें, उदाहरण के लिए, संभोग बॉक्स डिवाइडर को हटाकर या नर को मादा के समान अंडे देने वाले सम्मिलित में रखकर।
  3. अंडे देने वाले को एक नए संभोग टैंक के तल में स्थानांतरित करके हर 10 मिनट में भ्रूण एकत्र करें जिसमें ताजा सिस्टम पानी होता है और टैंक को व्यक्तिगत एफ 0 महिला की पहचान करने वाले टैग के साथ लेबल करें। पुराने संभोग टैंक लें और एक व्यक्तिगत 10-मिनट क्लच से भ्रूण एकत्र करने के लिए चाय के छन्नी के माध्यम से पानी डालें।
  4. एक बार जब एकल 10-मिनट क्लच से भ्रूण को छन्नी में एकत्र किया जाता है, तो उन्हें 1x E3 मीडिया वाले पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। पेट्री डिश को संग्रह के समय और मछली की जानकारी के साथ लेबल करें।
  5. एक संचारित प्रकाश स्रोत के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, पहले 6-8 घंटे के लिए हर घंटे और अगले 5 दिनों के लिए दैनिक विकास से गुजरने वाले भ्रूण का निरीक्षण करें।
  6. समय-मिलान वाले जंगली-प्रकार के नियंत्रणों की तुलना में उनके विकास में सकल रूपात्मक परिवर्तनों द्वारा संभावित मातृ क्रिस्पेंट भ्रूणकी पहचान करें।
  7. संभावित मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण को पेट्री डिश में ले जाएं जिसमें निषेचन के बाद 5 दिनों में 24 एचपीएफ पर रूपात्मक फेनोटाइप और व्यवहार्यता (जैसे, तैरने मूत्राशय की मुद्रास्फीति) के लिए 1x E3 मीडिया और परख शामिल है।

6. मातृ क्रिस्पेंट अगुणित में अनुक्रमण एलील्स

नोट: मातृ क्रिस्पेंट अगुणित में लक्षित स्थान में एक एकल एलील होता है, जिससे सेंगर अनुक्रमण के माध्यम से लक्ष्य जीन में आईएनडीईएल की पहचान की अनुमति मिलती है। मातृ क्रिस्पेंट अगुणित भ्रूण का विश्लेषण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण परख का उपयोग करके भी किया जा सकता है। भ्रूण जो मातृ क्रिस्पेंट फेनोटाइप दिखाते हैं, चार लक्ष्य साइटों में से कम से कम एक में घाव ले जाने की उम्मीद है (चर्चा देखें)।

  1. प्रयोग से पहले दोपहर में, एफ 0 मादाओं के संभोग जोड़े स्थापित किए गए, जिन्हें जंगली प्रकार के पुरुषों को पार किए गए मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण का उत्पादन करने के लिए जाना जाता है। जंगली प्रकार के पुरुषों को संभोग बॉक्स डिवाइडर का उपयोग करके मादाओं से शारीरिक रूप से अलग रखें या मादा को अंडे देने वाले सम्मिलित में रखें।
  2. प्रयोग की सुबह, शारीरिक विभाजन को हटा दें या संभोग शुरू करने के लिए अंडे देने वाले सम्मिलित के भीतर नर और मादा दोनों को रखें। अंडे देने के पहले संकेत पर, नर और एफ 0 मादाओं को अलग करके प्रजनन को बाधित करें। प्रत्येक अलग एफ 0 महिला को अलग-अलग संभोग बक्से में रखें।
  3. हांक के समाधान के प्रत्येक 100 μL के लिए एक जंगली प्रकार के पुरुष से वृषण का उपयोग करके यूवी-उपचारित शुक्राणु समाधान तैयार करें (तालिका 2), एक मादा से एक्सट्रूडेड अंडे को निषेचित करने के लिए पर्याप्त है, जैसा कि पहलेवर्णित 31 है।
  4. मैन्युअल रूप से पूर्व-चयनित एफ 0 महिलाओं से परिपक्व अंडे को बाहर निकालें और यूवी-उपचारित शुक्राणु31 का उपयोग करके इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) करें।
  5. इन विट्रो निषेचन के बाद, अगुणित भ्रूण को तब तक विकसित होने दें जब तक कि मातृ क्रिस्पेंट फेनोटाइप नहीं देखा जाता है और उन भ्रूणों को एक अलग पेट्री डिश में रखें।
  6. एक बार मातृ कुरकुरा अगुणित भ्रूण की पहचान हो जाने के बाद, उन्हें निषेचन के बाद कम से कम 6 घंटे के लिए विकसित करने की अनुमति दें।
  7. कम से कम दस मातृ कुरकुरा अगुणित भ्रूण से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, एक एकल अगुणित भ्रूण को पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब के एक व्यक्तिगत कुएं में रखें, कुएं से अतिरिक्त ई 3 मीडिया को हटा दें और 50 एमएम एनएओएच के 50 μL जोड़ें।
  8. भ्रूण को 20 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, 1 एम ट्रिस एचसीएल (पीएच 7.5) के 5 μL जोड़ें, और 5-10 सेकंड के लिए भंवर जोड़ें। निकाले गए डीएनए को 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  9. यह पहचानने के लिए कि किन गाइड साइटों में आईएनडीईएल हैं, डीएनए टुकड़े को बढ़ाने के लिए अनुक्रमण प्राइमर डिजाइन करें जिसमें सभी चार CRISPR-Cas9 लक्ष्य साइटें शामिल हैं। ये अनुक्रमण प्राइमर आईएनडीईएल की पहचान के लिए अनुमति देते हैं जो कई गाइड साइटों को फैलाते हैं।
  10. तैयार जीनोमिक डीएनए और अनुक्रमण प्राइमरों के 5 μL का उपयोग करके प्रति भ्रूण दो 25 μL पीसीआर प्रतिक्रियाएं सेट करें।
  11. पीसीआर समाप्त होने के बाद, डीएनए क्लीन-अप और कंसंट्रेटर किट का उपयोग करके दो नमूनों को शुद्ध और केंद्रित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। फिर आगे और रिवर्स अनुक्रमण प्राइमरों दोनों का उपयोग करके डीएनए टुकड़े को सेंगर अनुक्रमण में जमा करें।
  12. अगुणित मातृ क्रिस्पेंट टुकड़े को अनुक्रमित करने के बाद, इसे जंगली-प्रकार के अनुक्रम में संरेखित करें और अनुक्रम संरेखण कार्यक्रम का उपयोग करके लक्ष्य साइटों में आईएनडीईएल की पहचान करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक तेजी से, संसाधन-कुशल तरीके से मातृ प्रभाव फेनोटाइप की पहचान के लिए अनुमति देता है (चित्रा 1)।

मातृ कुरकुरापन पैदा करना:
एकल उम्मीदवार मातृ-प्रभाव जीन को लक्षित करने के लिए चार गाइड आरएनए को डिजाइन करते समय, इस बात पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए कि गाइड आरएनए डीएनए से कहां बंधेगा। सामान्य तौर पर, उन सभी को पहले अनुमानित प्रोटीन डोमेन (चित्रा 2 ए) की शुरुआत में गाइड आरएनए के बीच न्यूनतम से कोई अतिव्यापी क्षेत्रों के साथ एक साथ समूहित किया जाना चाहिए। इस डोमेन में गाइड आरएनए को लक्षित करने से संभावना बढ़ जाती है कि इन-फ्रेम और आउट-ऑफ-फ्रेम आईएनडीईएल दोनों प्रोटीन के कार्य को प्रभावित करेंगे। गाइड आरएनए डिजाइन करते समय जिन अन्य चर पर विचार किया जाना चाहिए, वे दक्षता में कटौती और जीनोम में ऑफ-टारगेट साइटों की संख्या हैं।

CRISPR-Cas9 समाधान को इंजेक्ट करने के बाद, Cas9 की दैहिक गतिविधि को एक छोटे पीसीआर टुकड़े, लगभग 100 bp, को अगारोस जेल पर चलाकर निर्धारित किया जा सकता है। यदि इंजेक्शन वाले भ्रूण में आईएनडीईएल बनाए गए थे, तो इंजेक्शन वाले नमूनों में एक स्मीयर देखा जाना चाहिए, लेकिन बिना इंजेक्शन वाले नियंत्रण (चित्रा 2 बी) में नहीं। दैहिक कोशिकाओं में कैस 9 गतिविधि के लिए प्रत्येक गाइड साइट को स्वतंत्र रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि कम से कम तीन गाइड साइटों में स्मीयर देखे जाते हैं, तो भाई-बहन इंजेक्शन वाले भ्रूण को बड़ा किया जाना चाहिए और मातृ क्रिस्पेंट फेनोटाइप के लिए जांच की जानी चाहिए।

मातृ क्रिस्पेंट की पहचान:
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्राकृतिक क्रॉस में मातृ क्रिस्पेंट बनाए जाते हैं, एफ 0 मादा मछली के भ्रूण की तुलना प्रारंभिक विकास में किसी भी बदलाव का निरीक्षण करने के लिए समय-मिलान वाले जंगली-प्रकार के नियंत्रणों से की जा सकती है। भ्रूण के विकास के बाद के चरणों को विनियमित करने वाले मातृ कारकों की पहचान करने के लिए, मूल शरीर योजना और व्यवहार्यता के विकास की जांच करने के लिए क्रमशः एफ 0 चंगुल को 24 एचपीएफ और 5 दिनों के बाद निषेचन पर स्कोर किया जाना चाहिए। विभिन्न एफ 0 महिलाओं से चंगुल में एक साझा फेनोटाइप की पहचान करना ऑफ-टारगेट या गैर-विशिष्ट प्रभावों से लक्ष्य जीन के कार्य के नुकसान के कारण होने वाले विशिष्ट प्रभावों की सुविधा प्रदान करता है।

इसके अतिरिक्त, मातृ क्रिस्पेंट युक्त चंगुल आम तौर पर मोज़ेक होते हैं (यानी, उनमें फेनोटाइपिक वाइल्ड-टाइप और मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण दोनों शामिल होते हैं), जिससे जंगली-प्रकार के भ्रूण निषेचन समय और विकास दर जैसे चर के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य कर सकते हैं। औसतन, एफ 0 मादाओं के चंगुल में लगभग 69% मातृ कुरकुरा भ्रूण होंगे, जिसमें 100% तक मातृ कुरकुरा भ्रूणहोंगे।

मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण की पहचान करने के बाद, उनका उपयोग प्राथमिक आणविक लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है, यानी, सेल सीमाओं के लिए इम्यूनोलेबलिंग या डीएपीआई के साथ डीएनए का धुंधला होना, जो प्रभावित विकास प्रक्रिया की सेलुलर प्रकृति में अंतर्दृष्टि प्रदान करसकता है। मातृ क्रिस्पेंट विधि का उपयोग ज्ञात मातृ-प्रभाव उत्परिवर्तन, जैसे मोटली, टीएमआई और ऑरा (चित्रा 3)11) को फेनोकॉपी करने के लिए भी किया जा सकता है।

मातृ क्रिस्पेंट अगुणित का अनुक्रमण:
मातृ क्रिस्पेंट फेनोटाइप में योगदान करने वाले आनुवंशिक घावों की पहचान करने के लिए, यूवी-उपचारित शुक्राणु और आईवीएफ को मातृ क्रिस्पेंट अगुणित बनाने के लिए जोड़ा जाता है (चित्रा 4)। यूवी-उपचारित शुक्राणु एक सेंट्रीओल प्रदान करता है लेकिन पैतृक डीएनए में योगदान नहीं करता है, इस प्रकार सेलुलर विभाजन को केवल मातृ जीनोमिक सामग्री के साथ होने की अनुमति देता है। एक अगुणित का निर्माण मातृ एलील के सेंगर अनुक्रमण और मातृ क्रिस्पेंट आईएनडीईएल की पहचान की अनुमति देता है (चित्रा 4)। औसतन, मातृ क्रिस्पेंट अगुणित के प्रति क्लच दो एलील देखे गए थे। सेंगर अनुक्रमण के माध्यम से पहचाने गए आईएनडीईएल में एकल गाइड साइटों में संपादन और कई गाइड साइटों (चित्रा 4 सी, तालिका 3) में फैले विलोपन शामिल हैं। विभिन्न एफ 0 महिलाओं से मातृ क्रिस्पेंट अगुणित आईएनडीईएल के एक सर्वेक्षण से पता चलता है कि एक ही गाइड साइटों को कई भ्रूणों में संपादित किया जाता है, और बरामद किए गए अधिकांश उत्परिवर्तन समय से पहले स्टॉप कोडन हैं (तालिका 3)11)।

Figure 1
चित्र 1: मातृ क्रिस्पेंट वर्कफ़्लो। मातृ क्रिस्पेंट बनाने के लिए, चार जीआरएनए डिजाइन करके शुरू करें जो जीन के पहले सक्रिय डोमेन को लक्षित करते हैं। 1) फिर एक ही प्रतिक्रिया में चार जीआरएनए को संश्लेषित करें। 2) जीआरएनए को संश्लेषित और शुद्ध करने के बाद, एक सीआरआईएसपीआर-कैस 9 कॉकटेल बनाएं और इसे एकल-कोशिका भ्रूण के ब्लास्टोडिस्क में इंजेक्ट करें। 3) इसके बाद, पीसीआर और जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके दैहिक उत्परिवर्तन के लिए इंजेक्शन भ्रूण की जांच करें। यदि इंजेक्शन वाले नमूनों में आईएनडीईएल बनाए गए थे, तो जंगली-प्रकार के नियंत्रण के तंग बैंड के विपरीत, इंजेक्शन वाले भ्रूण में एक धब्बा दिखाई देगा। 4) इंजेक्शन वाले भ्रूण के भाई-बहनों को यौन परिपक्वता तक पहुंचने के लिए 3-6 महीने तक बढ़ने दें। यौन परिपक्वता तक पहुंचने के बाद, जंगली प्रकार के नर के खिलाफ एफ 0 इंजेक्शन वाली मादा को पार करें। परिणामस्वरूप संतान जंगली प्रकार और मातृ कुरकुरा भ्रूण का मिश्रण हो सकती है। एक एफ 0 इंजेक्शन वाली मादा की पहचान करें जिसके भ्रूण मातृ-प्रभाव फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं। 5) फेनोटाइप में योगदान करने वाले घावों की पहचान करने के लिए, आईवीएफ को सेंगर अनुक्रमण के लिए मातृ क्रिस्पेंट अगुणित बनाने के लिए यूवी-उपचारित शुक्राणु का उपयोग करके किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: लक्षित जीन में आईएनडीईएल की पीढ़ी। (ए) जीन संरचना आरेख काल्पनिक प्रोटीन डोमेन (हल्के और गहरे बैंगनी ब्लॉक), जीआरएनए (लाल रेखाओं) का स्थान, और पीएएम साइटों (लाल सितारों) को दर्शाता है। जीआरएनए को पहले सक्रिय डोमेन पर लक्षित किया जाता है। एक्सॉन को ब्लॉक के रूप में दिखाया गया है, और इंट्रोन्स को लाइनों के रूप में दिखाया गया है। (बी) 2.5% अगारोस जेल में स्मीयर इंजेक्शन भ्रूण में दैहिक कोशिकाओं में आईएनडीईएल का संकेत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मातृ क्रिस्पेंट ज्ञात मातृ-प्रभाव उत्परिवर्तन के फेनोटाइप को पुन: परिभाषित करते हैं। जीवित, समय-मिलान वाले जंगली-प्रकार (बाएं कॉलम), ज्ञात मातृ उत्परिवर्ती (मध्य स्तंभ), और मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण (दाएं कॉलम) की प्रतिनिधि तुलना। (ए) मोटली/बिर्क5बी, (बी) टीएमआई/पीआरसी1एल, (सी) ऑरा/मिड1िपिल म्यूटेंट/मातृ क्रिस्पेंट प्रारंभिक भ्रूण विभाजनों में साइटोकिनेसिस में दोष दिखाते हैं, जिससे पूरी तरह से सिंसाइटियल ब्लास्टुला (ए, बी), या आंशिक रूप से एककोशिकीय भ्रूण (सी, व्हाइट बॉक्स) होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: CRISPR-Cas9-प्रेरित उत्परिवर्तनों को अनुक्रमित करने के लिए मातृ क्रिस्पेंट अगुणित का उपयोग करना। (A) जंगली-प्रकार के पुरुष के खिलाफ एक F0 इंजेक्शन वाली मादा के परिणामस्वरूप मातृ प्रभाव फेनोटाइप के साथ द्विगुणित भ्रूण होता है। (बी) आईवीएफ मातृ क्रिस्पेंट अगुणित बनाने के लिए यूवी-उपचारित शुक्राणु का उपयोग करके किया जाता है, जिससे मातृ एलील में प्रेरित आईएनडीईएल के अनुक्रमण और विश्लेषण की अनुमति मिलती है। (सी) बीआरसी 5 बी मातृ क्रिस्पेंट अगुणित का प्रतिनिधि अनुक्रमण गाइड साइट 3 और 4 (बॉक्स्ड) के बीच एक बड़ा विलोपन दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीसीआर मिक्स
जोड़ना
बाँझ H2O 171.12 mL
MgCl2 (1 M) 0.393 एमएल
ट्रिस-एचसीएल (1 एम, पीएच 8.4) 2.618 एमएल
KCl (1 M) 13.092 एमएल
20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें, फिर घोल को बर्फ पर ठंडा करें। अगला जोड़ें
बीएसए (100 मिलीग्राम / 3.468 एमएल
डीएटीपी (100 mM) 0.262 एमएल
dCTP (100 mM) 0.262 एमएल
डीजीटीपी (100 mM) 0.262 एमएल
dTTP (100 mM) 0.262 एमएल
बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एलिकोट
पीसीआर रेसिपी प्रति नमूना
पीसीआर मिक्स 17.9 μL
F + R प्राइमर (10 μM) 0.2 μL
ROH2O 1.8 μL
टैक डीएनए पोलीमरेज़ 0.1 μL
डीएनए 5 μL

तालिका 1: पीसीआर मिश्रण।

हांक का समाधान
हांक का प्रीमिक्स निम्नलिखित को क्रम में संयोजित करें: (1) एचएस # 1 का 10.0 एमएल, (2) एचएस # 2 का 1.0 एमएल, (3) एचएस # 4 का 1.0 एमएल, (4) डीडीएच 2 ओ का 86 एमएल, (5) एचएस # 5 का 1.0 एमएल। सभी एचएस समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
हांक के स्टॉक समाधान # 1 NaCl का 8.0 ग्राम, ddH2O के 100 mL में KCl का 0.4 g
हांक का स्टॉक समाधान # 2 0.358 ग्राम Na2HPO4 निर्जल; 0.60 ग्राम K2H2PO4 में ddH2O के 100 mL में
हांक के स्टॉक समाधान # 4 50 एमएल ddH 2 O में CaCl2 का 0.72 ग्राम
हांक के स्टॉक समाधान # 5 1.23 ग्राम MgSO4.7H 2O में 50 mL ddH20
हांक के स्टॉक समाधान # 6 10.0 एमएल डीडीएच20 में एनएएचसीओ 3 का0.35 ग्राम; उपयोग के दिन ताजा बनाएं
हांक का अंतिम कार्य समाधान हैंक के प्रीमिक्स के 9.9 एमएल को 0.1 एमएल एचएस स्टॉक # 6 के साथ मिलाएं

तालिका 2: हांक का समाधान।

birc5b #1 birc5b #2 birc5b #3 prc1l #1 prc1l #2
अनुक्रमित भ्रूणों की कुल संख्या 3 9 12 8 10
आईएनडीईएल के साथ भ्रूण की कुल संख्या 3 9 12 8 10
एक साइट में उत्परिवर्तन 0 0 0 0 0
कई साइटों में उत्परिवर्तन 3 9 12 8 10
INDELs का स्थान
गाइड साइट 1 0 0 0 0 0
गाइड साइट 2 0 0 0 8 10
गाइड साइट 3 3 9 12 8 10
गाइड साइट 4 3 9 12 0 10
INDEL के प्रकार
इन-फ्रेम म्यूटेशन 1 2 2 7 10
फ़्रेम शिफ्ट म्यूटेशन 4 7 10 9 10

तालिका 3: मातृ क्रिस्पेंट अगुणित के दो अलग-अलग सेटों में पाए जाने वाले आईएनडीईएल का स्थान और प्रकार: birc5b और prc1l।

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Discussion

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल आगे और रिवर्स आनुवंशिक तकनीकों दोनों के लिए आवश्यक कई पीढ़ियों के बजाय एक पीढ़ी में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान और प्राथमिक आणविक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। वर्तमान में, कई मातृ रूप से व्यक्त जीनों की भूमिका अज्ञात है। ज्ञान की यह कमी आंशिक रूप से मातृ-प्रभाव जीन की पहचान करते समय फेनोटाइप की कल्पना करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त पीढ़ी के कारण है। अतीत में, ज़ेबराफिश में मातृ-प्रभाव जीन की तेजी से पहचान सुसंस्कृत अंडाणुओं में अनुवाद-अवरुद्ध मोर्फोलिनो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को इंजेक्ट करके प्राप्त की जासकती है। यह विधि कई ज्ञात मातृ-प्रभाव जीनों की नकल करके सफल साबित हुई थी, लेकिन अपरिपक्व अंडाणु में हेरफेर करना एक नाजुक, समय लेने वाला प्रयोग हो सकता है। मातृ आरएनए को सीआरआईएसपीआर-आरएफएक्ससीएएएस 13 डी कॉम्प्लेक्स का उपयोग करके गिरावट के लिए भी लक्षित किया जा सकता है, लेकिन एक-सेल भ्रूण में इन परिसरों का इंजेक्शन मातृ रूप से प्रदान किए गए प्रोटीन33 को लक्षित नहीं कर सकता है। हाल ही में, यह पता चला है कि CRISPR-Cas9 जर्मलाइन में द्विगुणित उत्परिवर्तन को प्रेरित कर सकता है, जिससे एकल पीढ़ी11 में नए मातृ-प्रभाव जीन की तेजी से पहचान हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जो मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण की वसूली में योगदान करते हैं। सिद्धांत रूप में, क्योंकि रोगाणु कोशिकाओं को प्रारंभिक भ्रूण के विकास में निर्दिष्ट किया जाता है, जितनी जल्दी एक लक्ष्य जीन में एक डीएनए घाव बनाया जाता है, उतनी ही अधिक संभावना है कि उत्परिवर्तन युक्त कोशिका रोगाणु का हिस्सा बन जाएगी। यह विधि रोगाणु में संपादन की संभावना बढ़ाने के लिए एक-कोशिका भ्रूण के विकासशील ब्लास्टोडिस्क में इंजेक्ट किए गए कैस 9 प्रोटीन का उपयोग करती है। एक और महत्वपूर्ण कारक जो बरामद मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण के प्रतिशत को प्रभावित करता है, वह लक्ष्य साइटों में आनुवंशिक संपादन बनाने में गाइड आरएनए की दक्षता है। इस प्रक्रिया में पीसीआर द्वारा 24 एचपीएफ पर दैहिक आईएनडीईएल बनाने के लिए गाइड आरएनए की क्षमता का निर्धारण करने पर एक खंड शामिल है। यदि एक गाइड आरएनए दैहिक संपादन करने में विफल रहता है, तो मातृ क्रिस्पेंट उत्पन्न करने के लिए उच्च दर पर जर्मलाइन में संपादन का उत्पादन करने की संभावना कम होती है। यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को दैहिक संपादन का परीक्षण करने के लिए निर्देशित करता है, जो तीन या अधिक गाइड साइटों में दिखाई देना चाहिए।

मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण के फेनोटाइप का अवलोकन करने के बाद, फेनोटाइप में योगदान करने वाले आनुवंशिक घावों का विश्लेषण यूवी-उपचारित शुक्राणु के साथ आईवीएफ के माध्यम से अनुक्रम स्तर पर किया जा सकता है। पीसीआर के लिए पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री प्राप्त करने के लिए, मातृ क्रिस्पेंट अगुणित भ्रूण को कम से कम छह से आठ घंटे तक विकसित करना चाहिए, जिससे डीएनए प्रतिकृति के कई चक्र हो सकते हैं। डीएनए को केंद्रित करने के लिए जीनोमिक डीएनए को 50 mM NaOH के 50 μL में भी निकाला जाना चाहिए। यदि मातृ क्रिस्पेंट अगुणित भ्रूण 6-8 घंटे तक जीवित नहीं रह सकते हैं, तो भ्रूण को पहले समय बिंदु पर एकत्र करें। डीएनए प्रतिकृति के कम चक्रों से गुजरने वाले भ्रूण के लिए, एनएओएच और ट्रिस-एचसीएल के समान अनुपात को बनाए रखते हुए 50 एमएम एनएओएच की छोटी मात्रा में डीएनए निकालें। एक अन्य विकल्प डीएनए क्लीन-अप और कंसंट्रेटर किट का उपयोग करके निकाले गए डीएनए को केंद्रित करना है। डीएनए निकाले जाने के बाद, अनुक्रमण के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर टुकड़े में यदि संभव हो तो सभी चार लक्ष्य साइटों को शामिल किया जाना चाहिए। यह टुकड़ा बड़े विलोपन की पहचान करने की अनुमति देगा जो मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण में कई गाइड साइटों को फैलाता है।

सेंगर अनुक्रमण के लिए मातृ क्रिस्पेंट अगुणित एकत्र करते समय, फेनोटाइप दिखाने वाले सभी अगुणित को इकट्ठा करें और सेंगर अनुक्रमण के लिए न्यूनतम 10 अद्वितीय अगुणित भ्रूण के नमूने भेजें। प्रति क्लच कई अगुणित भ्रूणों के अनुक्रमण से जर्मलाइन में पाए जाने वाले कई आईएनडीईएल की पहचान करने की अनुमति मिलेगी। मातृ क्रिस्पेंट अगुणित के पिछले अनुक्रमण डेटा से पता चला है कि मातृ क्रिस्पेंट अगुणित11 के एक सेट में कई एलील्स की पहचान की जा सकती है। हालांकि, इन एलील्स को अपेक्षित 1 से 1 अनुपात 11 में पुनर्प्राप्त नहीं किया जाताहै। कई भ्रूणों के अनुक्रमण से इस विचार का समर्थन करने में भी मदद मिलेगी कि फेनोटाइप लक्ष्य जीन में CRISPR-Cas9 INDEL के कारण होता है। अनुक्रमित अगुणित भ्रूण में देखा गया कोई भी जंगली-प्रकार का अनुक्रम जो एक विशिष्ट फेनोटाइप दिखाता है, यह सुझाव देगा कि फेनोटाइप लक्षित जीन से जुड़ा नहीं है। पहले से अज्ञात जीनों को लक्षित करने के माध्यम से पहचाने गए किसी भी नए मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पुष्टि भाई-बहन एफ 0पुरुषों 11 का उपयोग करके एक स्थिर रेखा स्थापित करके भी की जानी चाहिए।

कुछ मामलों में, अगुणित विश्लेषण के माध्यम से आईएनडीईएल की पहचान करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है जहां पहचाने गए मातृ क्रिस्पेंट फेनोटाइप में एक निश्चित फेनोटाइपिक विशेषता होती है। उदाहरण के लिए, मातृ क्रिस्पेंट अगुणित भ्रूण जो दरार चरण के दौरान अनफर्टिलाइज्ड या लाइसिस प्रतीत होते हैं, उनका चयन करना असंभव हो सकता है। अगुणित सिंड्रोम के अनुरूप अक्ष विस्तार दोषों वाले मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण भी मातृ अगुणित34 उत्पन्न करते समय विश्लेषण के लिए अलग-अलग नहीं हो सकते हैं। ऐसे मामलों में, शोधकर्ता को जीन-फेनोटाइप पुष्टि के लिए स्थिर लाइनों का उपयोग करके सीधे विश्लेषण करने की सलाह दी जाती है।

वर्तमान मातृ क्रिस्पेंट प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह केवल सकल रूपात्मक दोषों द्वारा मातृ-प्रभाव जीन की पहचान करता है। विधि की संवेदनशीलता को बढ़ाने और प्रारंभिक विकास के कुछ पहलुओं के लिए इसे और अधिक विशिष्ट बनाने के लिए, ट्रांसजेनिक संवाददाताओं का उपयोग विशिष्ट संरचनाओं या सेल प्रकारों को उजागर करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि अन्य स्क्रीन 9,10,35 के लिए किया गया है। उदाहरण के लिए, CRISPR-Cas9 मिश्रण को गैर-घातक जीन की पहचान करने के लिए Buc-GFP ट्रांसजेनिक लाइन में इंजेक्ट किया जा सकता है जो आदिम रोगाणु कोशिकाओं के गठन और विकास को नियंत्रित करतेहैं। मातृ क्रिस्पेंट प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि, हालांकि प्रारंभिक विकास के दौरान केवल व्यक्त जीन के लिए उपयोगी है, यह मातृ और युग्मनज दोनों कार्य वाले जीन के लिए प्रभावी नहीं हो सकता है क्योंकि जीन का सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 लक्ष्यीकरण विकासशील भ्रूण के लिए घातक हो सकता है। पूरे विकास में व्यक्त जीन के मातृ कार्य का अध्ययन करने के लिए, कैस 9 गतिविधि को जर्मलाइन37 पर लक्षित किया जा सकता है, इस प्रकार, जीन के दैहिक कार्य को अप्रभावित छोड़ दिया जाता है और वयस्कता तक एफ 0 महिलाओं के अस्तित्व की अनुमति मिलती है।

मातृ क्रिस्पेंट प्रारंभिक विकास के लिए आवश्यक नए मातृ-प्रभाव जीन की पहचान करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। मल्टीप्लेक्सिंग गाइड आरएनए को एक लक्ष्य और कैस 9 की द्विस्तरीय संपादन क्षमता का संयोजन मातृ-प्रभाव फेनोटाइप को एक पीढ़ी में देखने की अनुमति देता है, जो आमतौर पर लक्षित जीन संपादन करते समय आवश्यक बहु-पीढ़ी प्रजनन योजनाओं से बचता है। कई पीढ़ियों को दरकिनार करने से मातृ-प्रभाव जीन की पहचान करने के लिए आवश्यक स्थान और संसाधनों की मात्रा कम हो जाती है।

नए मातृ-प्रभाव जीन की पहचान करने के अलावा, यह प्रोटोकॉल किसी भी ज़ेब्राफिश प्रयोगशाला को स्थिर लाइनों को स्थापित करने और बनाए रखने के बिना किसी भी ज्ञात मातृ-प्रभाव उत्परिवर्ती का अध्ययन करने और अध्ययन करने की अनुमति देता है, जिससे आनुवंशिक मार्गों का विस्तृत विश्लेषण होता है। सिद्धांत रूप में, यह मातृ क्रिस्पेंट दृष्टिकोण गैर-आनुवंशिक मॉडल प्रजातियों में मातृ उत्पादों के कार्य को भी निर्धारित कर सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम जलीय सुविधा की देखभाल के लिए पिछले और वर्तमान पेलेगरी प्रयोगशाला पशुपालन कर्मचारियों के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम रयान ट्रेवेना और डायने हैनसन द्वारा पांडुलिपि पर टिप्पणियों और अंतर्दृष्टि के लिए भी आभारी हैं। एफ.पी. (जीएम065303) को एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

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References

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जेनेटिक्स अंक 178 प्रारंभिक विकास CRISPR-Cas9 मातृ-प्रभाव ज़ेबराफ़िश जीनोम संपादन रिवर्स जेनेटिक्स
मातृ क्रिस्पेंट के साथ प्रारंभिक विकास में मातृ-व्यक्त जीन की भूमिका का निर्धारण
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Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

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