Summary
O desenvolvimento inicial depende de produtos herdados maternalmente, e o papel de muitos desses produtos é atualmente desconhecido. Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenótipos de efeito materno em uma única geração.
Abstract
O desenvolvimento precoce depende de um conjunto de fatores maternos incorporados ao ovócito maduro durante a oogênese que desempenham todas as funções celulares necessárias para o desenvolvimento até a ativação do genoma zigótico. Normalmente, o direcionamento genético desses fatores maternos requer uma geração adicional para identificar fenótipos de efeito materno, dificultando a capacidade de determinar o papel dos genes expressos maternalmente durante o desenvolvimento. A descoberta das capacidades de edição bialélica da CRISPR-Cas9 permitiu a triagem de fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados ou "crispants", aumentando a compreensão do papel que os genes zigoticamente expressos desempenham nos programas de desenvolvimento. Este artigo descreve um protocolo que é uma extensão do método crispant. Neste método, a edição bialélica de células germinativas permite o isolamento de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, ou "crispants maternos". A multiplexação de RNAs guia para um único alvo promove a produção eficiente de crispants maternos, enquanto a análise de sequência de haploides crispantes maternos fornece um método simples para corroborar lesões genéticas que produzem um fenótipo de efeito materno. O uso de crispants maternos suporta a rápida identificação de genes maternos essenciais expressos, facilitando assim a compreensão do desenvolvimento precoce.
Introduction
Um conjunto de produtos depositados maternalmente (por exemplo, RNAs, proteínas e outras biomoléculas) é necessário para todos os processos celulares iniciais até que o genoma zigótico do embrião seja ativado1. O esgotamento prematuro desses produtos do ovócito é tipicamente letal embrionário. Apesar da importância desses genes no desenvolvimento, o papel de muitos genes expressos maternalmente é atualmente desconhecido. O avanço da tecnologia de edição de genes em peixes-zebra, como o CRISPR-Cas9, possibilita o direcionamento de genes expressos maternalmente 2,3,4. No entanto, a identificação de um fenótipo de efeito materno requer uma geração extra quando comparada a um fenótipo zigótico, necessitando, portanto, de mais recursos. Recentemente, a capacidade de edição bialélica da CRISPR-Cas9 tem sido utilizada para rastrear fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados (F0), conhecidos como "crispants"5,6,7,8,9,10. A técnica crispante permite a triagem eficiente em termos de recursos de genes candidatos em células somáticas, facilitando a compreensão de aspectos específicos no desenvolvimento. O protocolo descrito neste trabalho permite a identificação de fenótipos de efeito materno, ou "crispants maternos", em uma única geração11. Este esquema é alcançável pela multiplexação de RNAs guia para um único gene e promovendo eventos de edição bialélica na linha germinativa. Esses embriões crispantes maternos podem ser identificados por fenótipos morfológicos macroscópicas e submetidos à caracterização primária, como marcação para limites celulares e padronização do DNA11. A análise combinada do fenótipo observável e a caracterização molecular básica dos INDELs induzidos permitem a previsão do papel do gene alvo no desenvolvimento inicial.
No peixe-zebra, durante as primeiras 24 h pós-fertilização (hpf), um pequeno grupo de células se desenvolve nas células germinativas primordiais, precursoras da linha germinativa12,13,14,15. Nas garras colocadas por fêmeas F0, a proporção de embriões crispantes maternos recuperados depende de quantas células germinativas contêm um evento de edição bialélico no gene alvo. Em geral, quanto mais cedo o evento de edição ocorrer no embrião, maior a probabilidade de mutações CRISPR-Cas9 serem observadas na linha germinativa. Na maioria dos casos, os fenótipos de embriões crispantes maternos vêm da perda de função nos dois alelos maternos presentes no ovócito em desenvolvimento. À medida que o ovócito termina a meiose, um dos alelos maternos é extrudado do embrião através do corpo polar, enquanto o outro alelo é incorporado ao pronúcleo materno. O sequenciamento de múltiplos haploides crispantes maternos representará uma mistura das mutações (inserções e/ou deleções (INDELs)) presentes na linha germinativa que contribuem para o fenótipo11.
O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para criar mutações CRISPR-Cas9 em genes de efeito materno e identificar o fenótipo correspondente usando uma abordagem materna crispante (Figura 1). A seção um explicará como efetivamente projetar e criar RNAs guia, enquanto as seções dois e três contêm etapas críticas para a criação de crispants maternos por microinjeção. Após a injeção da mistura CRISPR-Cas9, os embriões injetados são rastreados para edições somáticas via PCR (secção quatro). Uma vez que os embriões F0 injetados se desenvolvem e atingem a maturidade sexual, as fêmeas F0 são cruzadas para machos selvagens e seus descendentes são rastreados para fenótipos de efeito materno (seção cinco). A seção seis inclui instruções sobre como fazer haploides crispantes maternos que podem ser combinados com o sequenciamento de Sanger para identificar os INDELs induzidos por CRISPR-Cas9. Além disso, a Discussão contém modificações que podem ser feitas no protocolo para aumentar a sensibilidade e o poder desse método.
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Protocol
Nos estudos que levaram ao desenvolvimento deste protocolo, todos os alojamentos e experimentos de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).
1. Síntese de RNAs Guia
NOTA: Os crispants zigóticos foram criados usando um único RNA guia ou multiplexando múltiplos RNAs guia para um único alvo 5,6,7,8,9,10. A multiplexação de RNAs-guia aumenta a porcentagem de embriões que apresentam fenótipo crispante zigótico10. Devido a esse aumento da frequência de embriões que exibem um fenótipo, os crispants maternos são criados pela multiplexação de quatro RNAs guia para um único gene. Um protocolo mais detalhado sobre o uso do CHOPCHOP para o projeto de RNAs guia e um método de recozimento para sintetizar RNAs guia para peixe-zebra podem ser encontrados em outros lugares 16,17,18,19,20.
- Para identificar um gene expresso maternalmente para o alvo, verifique os níveis de transcrito de mRNA durante o desenvolvimento através de um banco de dados de sequência de RNA que fornece informações de transcriptoma do zigoto a 5 dias21. Em geral, os genes materno-específicos são altamente expressos no embrião inicial e são degradados após a ativação do genoma zigótico22.
- Uma vez que um gene alvo expresso maternalmente tenha sido identificado, determine o primeiro domínio proteico previsto usando a seção "domínios e características" disponível no navegador do genoma Ensembl23. Use este domínio como a região de destino para os quatro RNAs guia.
- Use o programa de seleção de RNA guia CHOPCHOP para identificar quatro locais-alvo de RNA guia no primeiro domínio ativo. Projetar oligonucleotídeos específicos de genes, conforme mostrado abaixo para cada local de destino. No oligonucleotídeo específico do gene, a seção N20 corresponde à sequência alvo menos o sítio PAM (NGG) do CHOPCHOP. Ordene estes oligonucleotídeos específicos de genes e o oligonucleótido constante usando purificação de dessal padrão (ver Tabela de Materiais).
Oligonucleotídeo gene-específico:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - Para criar um modelo de RNA guia para cada oligonucleotídeo específico do gene, recozê-lo ao oligonucleotídeo constante e preencher as saliências com T4-DNA polimerase conforme descrito anteriormente16. Depois que os quatro modelos de RNA guia forem montados, purifice-os e concentre-os juntos usando um kit de limpeza e concentrador de DNA de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Sintetize a mistura de sgRNA a partir do modelo de RNA guia agrupado usando um kit de transcrição T7 in vitro (consulte Tabela de Materiais). Realizar a transcrição in vitro de acordo com as instruções do fabricante. O uso de meias-reações do kit de transcrição T7 pode diminuir o custo por reação.
- Após a síntese de RNA, purificar o pool resultante de sgRNAs utilizando um protocolo de etanol/acetato de amônio, conforme descrito anteriormente 16,20,24. Após o RNA ter sido isolado, ressuscite-o em 20 μL de água livre de nuclease. Se meias-reações do kit de transcrição T7 foram usadas para transcrever o pool de sgRNAs, ressuspense o RNA purificado em 10-15 μL de água livre de nuclease.
- Quantifique a quantidade de sgRNAs agrupados que foram criados usando um espectrofotômetro. Diluir o pool de sgRNAs em água livre de nuclease para uma diluição de 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Normalmente, o volume final da diluição de trabalho varia de 30-50 μL.
- Depois de determinar a concentração do pool de sgRNAs, verifique a integridade dos sgRNAs em um gel de agarose a 1%.
- Lançar um gel de brometo de etídio/TBE a 1% de agarose/0,5 μg/mL. Uma vez que o gel tenha se solidificado, coloque-o no buffer de execução TBE.
- Misture 1 μL da mistura de sgRNA e 1 μL de tampão de carregamento de gel de RNA (ver Tabela de Materiais). Carregue esta amostra no gel e passe o gel a 100 V por 5 min.
- Visualize as bandas usando luz ultravioleta (UV). O pool de sgRNAs deve aparecer como uma única banda. Se um esfregaço for observado, a degradação do RNA provavelmente ocorreu.
- Armazenar o conjunto de sgRNAs em alíquotas de 1 μL de uso único em tubos de tira de PCR sem nuclease no congelador de -80 °C. Para grandes volumes de mistura de sgRNAs (30 μL ou mais), alíquota metade do volume nos tubos de tira de PCR livres de nuclease e armazene a outra metade como um volume maior em um tubo de microcentrífuga livre de nuclease. Descongelar e alíquota quando necessário.
- Para evitar a degradação do ARN, certifique-se de que as amostras no tubo de microcentrífuga não sofram mais do que dois ciclos de congelamento-descongelamento.
2. Preparação de reagentes e materiais para microinjeção
NOTA: No peixe-zebra, a injeção de mRNA Cas9 pode criar crispants zigóticos. No entanto, estudos têm demonstrado que a proteína Cas9 é mais eficiente na criação de INDELs em embriões injetados16,25. Este protocolo usa a proteína Cas9 para gerar crispants maternos porque esta proteína não experimenta o mesmo atraso na atividade que o mRNA Cas9 injetado. Em teoria, isso deve aumentar a probabilidade de uma mutação bialélica no início do desenvolvimento, resultando em uma maior chance de uma seção mais extensa da linha germinativa ser afetada. Outros protocolos e recursos detalhando como se preparar para microinjeções podem ser encontrados em outros lugares24,26.
- Compre ou gere proteína Cas9 (consulte Tabela de Materiais). Ressuscite a proteína Cas9 em água isenta de nuclease para produzir uma solução de 2 mg/mL e uma alíquota de 1 μL em tubos de microcentrífuga de polipropileno livres de RNase. Armazene-os como tubos de uso único a -80 °C.
- Na tarde anterior à injeção, use um extrator de micropipeta para puxar um capilar de vidro e criar uma agulha de injeção. Armazene a agulha ininterrupta em um suporte de agulha fechado até a manhã das microinjeções.
- Para criar uma placa de injeção, despeje 20 mL de agarose/H2O estéril a 1,5% para encher metade de uma placa de Petri de 100 mm X 15 mm e aguarde que ela se solidifique. Uma vez ajustada a solução de agarose, adicione 20 ml de agarose/H2O estéril a 1,5% à placa de Petri e coloque o molde de plástico (ver Tabela de Materiais) na agarose líquida e deixe-a endurecer.
- Depois que a agarose endurecer, remova o molde de plástico e armazene a placa de injeção de cabeça para baixo em uma geladeira até a manhã das injeções. Uma única placa pode ser usada para múltiplas injeções, desde que os poços mantenham sua integridade.
3. Microinjeção de coquetel CRISPR-Cas9 em um embrião de peixe-zebra de uma célula para gerar crispants maternos
NOTA: Mais recursos para microinjeção em embriões de peixe-zebra podem ser encontrados em outros lugares24,26,27. Injetar a mistura CRISPR-Cas9 no blastodisco em desenvolvimento de embriões unicelulares pode aumentar a probabilidade de criar crispants maternos. A mistura também pode ser injetada no saco vitelino até o estágio de 2 células. No entanto, as misturas injetadas na gema dependem do fluxo ooplasmático para atingir o blastodisco, de modo que o CRISPR-Cas9 injetado na gema poderia diminuir a eficiência de corte do CRISPR-Cas928.
- Na tarde anterior às microinjeções, configure cruzamentos do tipo selvagem em caixas de acasalamento de peixe-zebra. Mantenha os peixes machos e fêmeas no mesmo aquário, mas separe-os com um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea dentro de uma inserção de postura de ovos.
- Na manhã do experimento, retirar uma alíquota de 2 mg/mL de proteína Cas9 e uma alíquota do pool de sgRNAs. No tubo de microcentrífuga de polipropileno livre de RNase que contém a proteína Cas9, monte uma mistura de injeção de 5 μL que inclua o pool de sgRNAs, 1 μL de solução vermelha de fenol a 0,5% e água livre de nuclease. Apontar para uma concentração final de 400 ng/μL de proteína Cas9 e 200 ng/μL dos sgRNAs agrupados em água livre de RNase ou uma proporção de 2:1 de proteína Cas9 para sgRNAs no embrião injetado. Esta mistura de injeção pode ser armazenada em gelo durante a manhã da injeção.
- Retire uma placa de injeção do frigorífico e deixe-a aquecer até à temperatura ambiente (RT) durante, pelo menos, 20 minutos.
- Após a montagem do coquetel de injeção, permita que o macho e a fêmea acasalem, por exemplo, removendo o divisor da caixa de acasalamento ou colocando o macho na mesma inserção de postura de ovos que a fêmea, conforme apropriado.
- Depois que o peixe tiver colocado, mas antes que os embriões tenham sido coletados, corte a ponta de uma agulha ininterrupta usando uma nova lâmina de barbear ou pinça fina para criar uma agulha que tenha um furo pequeno o suficiente para evitar danos ao embrião, mas seja larga o suficiente para que não fique entupida com a mistura de injeção. Depois de a agulha ter sido cortada, carregue a agulha com a mistura de injeção utilizando uma ponta de pipeta microcarregadeira inserida na extremidade traseira do capilar (ver Tabelas de Materiais).
- Depois que a agulha estiver cheia, incube a agulha por 5 minutos no RT para montar os complexos de Cas9-sgRNA.
- Ligue o microinjetor e insira a agulha no micromanipulador. Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina de micrômetro e calibre a agulha ajustando a pressão de injeção até que a agulha ejete um bolo de 1 nL no óleo mineral.
NOTA: Ao injetar no óleo mineral, um bolus de 1 nL terá um diâmetro de aproximadamente 0,125 mm (ou raio de 0,062 mm), conforme medido com a lâmina do micrômetro. - Para sincronizar os embriões, colete-os após 10 min usando um filtro de plástico e enxágue-os em uma placa de Petri usando 1x meio E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 e adicione 20 μL de 0,03 M de Azul de Metileno por 1 L de 1x E3). Remova 10-15 embriões e coloque-os em uma placa de Petri separada para serem mantidos como controles não injetados.
- Transfira o resto dos embriões em desenvolvimento para os poços da placa de injeção.
- Injetar 1 nL de solução (um total de 400 pg de proteína Cas9 e 200 pg de sgRNAs) no blastodisco em desenvolvimento de um embrião de uma célula. Se a ponta da agulha ficar entupida, use fórceps para quebrar a ponta para trás e recalibre a agulha para ejetar um bolo de 1 nL. Certifique-se de injetar todos os embriões durante os primeiros 40 minutos de desenvolvimento após a fertilização.
- Após a conclusão da injeção, devolva os embriões injetados em uma placa de Petri marcada que contenha 1x meio E3 e permita que eles se desenvolvam ao longo do dia. Remova quaisquer embriões que não estejam fertilizados ou que não estejam se desenvolvendo normalmente de acordo com a série de estadiamento do peixe-zebra29.
4. Rastreio de INDELs somáticos em embriões injetados F0
NOTA: Outros métodos para identificar INDELs, como o ensaio de endonuclease I T7 ou a análise de fusão de alta resolução, podem ser usados para determinar se os embriões contêm INDELs somáticos 30.
- No dia seguinte após as injeções, remova embriões defeituosos e lisados da placa de Petri e substitua o meio 1x E3 para manter a saúde do embrião.
- Depois de limpar o prato, colete seis embriões saudáveis injetados e dois embriões de controle da placa não injetada. Coloque cada embrião individualmente em um único poço de um tubo de tira de PCR e rotule a parte superior dos tubos.
- Para extrair o DNA genômico de embriões individuais, remova o excesso de meios E3 dos poços do tubo de tira e adicione 100 μL de 50 mM de NaOH por poço.
- Incubar os embriões a 95 °C durante 20 min. Em seguida, arrefecer as amostras até 4 °C, adicionar 10 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vórtice durante 5 a 10 s. Este ADN extraído pode ser armazenado a -20 °C durante, pelo menos, 6 meses sem degradação significativa do ADN.
- Projete iniciadores de triagem exclusivos para cada local de guia para amplificar um fragmento de DNA de 100-110 pb que inclui o local alvo CRISPR-Cas9. Se possível, coloque o local de destino no meio do fragmento amplificado, permitindo a identificação de deleções maiores.
- Para cada um dos quatro locais-alvo de guia, configurar oito reações de PCR de 25 μL usando 5 μL do DNA genômico de embrião único preparado, mistura de PCR e os primers de triagem específicos do guia para identificar mutações somáticas no local alvo (Tabela 1).
- Lançar um gel de brometo de etídio/TBE de 2,5% de agarose/0,5 μg/mL usando pentes que criem poços de aproximadamente 0,625 cm de largura. Este pente largo permite uma melhor resolução ao detectar alterações de tamanho na sequência genômica. Depois que o gel se solidificar, coloque-o em uma câmara de eletroforese que contenha tampão de execução TBE.
- Adicione 5 μL de corante de carga 6x ao produto de PCR e carregue 25 μL desta mistura no gel. Certifique-se de que as amostras injetadas e de controle sejam executadas na mesma linha do gel. Depois de todas as amostras terem sido carregadas, adicionar 5 μL de brometo de etídio por 1 L de tampão de corrida TBE à extremidade positiva da caixa de gel.
- Execute o gel a 120 V até que as bandas de DNA se resolvam ou o DNA se aproxime do final da pista. Se o Cas9 criou INDELs no local de destino, um esfregaço é tipicamente observado em amostras injetadas, mas não nos controles.
- Se os esfregaços forem observados em um mínimo de três dos quatro locais de guia em embriões injetados com quatro RNAs guia, cresça os embriões irmãos injetados.
- Sempre que as amostras injetadas não contiverem esfregaços no número necessário de locais de guia, projete novos RNAs guia para substituir aqueles que não funcionaram e crie um novo pool de RNAs guia que inclua os que funcionaram e os recém-projetados. Injete e teste o novo pool para INDELs somáticos, conforme descrito acima.
5. Identificação de fenótipos de efeito materno em embriões maternos crispantados
NOTA: Uma vez que as fêmeas F0 injetadas tenham atingido a maturidade sexual, suas células germinativas têm o potencial de gerar uma mistura de embriões maternos crispantes e do tipo selvagem. Mesmo que essa mistura permita controles internos para fertilização e tempo de desenvolvimento, ainda é benéfico configurar um cruzamento do tipo selvagem como um controle externo no caso de uma embreagem da fêmea F0 conter apenas embriões maternos crocantes.
- Na tarde anterior ao experimento, configure as fêmeas injetadas F0 contra machos do tipo selvagem e controle cruzamentos do tipo selvagem em caixas de acasalamento padrão de peixe-zebra. Coloque os peixes machos e fêmeas no mesmo aquário, mas separe-os com um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea dentro de uma inserção de postura de ovos.
- Na manhã do experimento, permita que o macho e a fêmea comecem a acasalar, por exemplo, removendo o divisor da caixa de acasalamento ou colocando o macho na mesma inserção de postura de ovos que a fêmea.
- Colete os embriões a cada 10 minutos, movendo a inserção de postura de ovos para um novo fundo de tanque de acasalamento que contenha água fresca do sistema e rotule o tanque com uma etiqueta identificando a fêmea F0 individual. Pegue o velho tanque de acasalamento e despeje a água através de um coador de chá para coletar os embriões de uma embreagem individual de 10 minutos.
- Uma vez que os embriões de uma única embreagem de 10 minutos tenham sido coletados no filtro, transfira-os para uma placa de Petri contendo 1x meio E3. Rotule a placa de Petri com o tempo de coleta e as informações do peixe.
- Sob um microscópio de dissecação com uma fonte de luz transmitida, observe os embriões em desenvolvimento a cada hora durante as primeiras 6-8 h e diariamente durante os próximos 5 dias.
- Identificar potenciais embriões crispantes maternos por alterações morfológicas grosseiras em seu desenvolvimento em comparação com controles do tipo selvagem pareados pelo tempo29.
- Mova os embriões potencialmente crispantados maternos para uma placa de Petri que contenha 1x meio E3 e ensaio para fenótipo morfológico a 24 hpf e viabilidade (por exemplo, inflação da bexiga natatória) em 5 dias após a fertilização.
6. Sequenciamento de alelos em haploides crispantes maternos
NOTA: Os haploides crispantes maternos contêm um único alelo no locus alvo, permitindo a identificação de INDELs no gene alvo através do sequenciamento de Sanger. Embriões de haploides crispantes maternos também podem ser analisados usando ensaios de sequenciamento de próxima geração. Espera-se que embriões que apresentem um fenótipo crispante materno carreguem uma lesão em pelo menos um dos quatro locais-alvo (Ver Discussão).
- Na tarde anterior ao experimento, montou pares de fêmeas F0 conhecidas por produzir embriões maternos entrelaçados cruzados para machos do tipo selvagem. Mantenha os machos do tipo selvagem fisicamente separados das fêmeas usando um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea na inserção de postura de ovos.
- Na manhã do experimento, remova a partição física ou coloque os machos e as fêmeas dentro da inserção de postura de ovos para iniciar o acasalamento. Ao primeiro sinal de postura de ovos, interrompa a reprodução separando os machos e as fêmeas F0. Mantenha cada fêmea F0 separada em caixas de acasalamento individuais.
- Preparar solução espermática tratada com UV utilizando testículos de um macho selvagem para cada 100 μL de solução de Hank (Tabela 2), suficiente para fertilizar óvulos extrudados de uma fêmea, conforme descrito anteriormente31.
- Extrudar manualmente óvulos maduros das fêmeas F0 pré-selecionadas e realizar fertilização in vitro (FIV ) utilizando o espermatozoide tratado com UV31.
- Após a fertilização in vitro , permita que os embriões haploides se desenvolvam até que o fenótipo crispante materno seja observado e coloque esses embriões em uma placa de Petri diferente.
- Uma vez que os embriões haploides crispantes maternos tenham sido identificados, permita que eles se desenvolvam por pelo menos 6 h após a fertilização.
- Para extrair o DNA genômico de pelo menos dez embriões haploides crispantes maternos, coloque um único embrião haploide em um poço individual de um tubo de tira de PCR, remova o excesso de meios E3 do poço e adicione 50 μL de 50 mM de NaOH.
- Incubar os embriões a 95 °C durante 20 min. Em seguida, arrefecer as amostras até 4 °C, adicionar 5 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vórtice durante 5-10 s. O DNA extraído pode ser armazenado a -20 °C por até 6 meses.
- Para identificar quais locais de guia contêm INDELs, projete iniciadores de sequenciamento para amplificar um fragmento de DNA que inclua todos os quatro locais-alvo CRISPR-Cas9. Esses primers de sequenciamento permitem a identificação de INDELs que abrangem vários locais de guia.
- Configure duas reações de PCR de 25 μL por embrião usando 5 μL do DNA genômico preparado e os primers de sequenciamento.
- Após o término da PCR, purifice e concentre as duas amostras usando um kit de limpeza e concentrador de DNA (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, submeta o fragmento de DNA ao sequenciamento de Sanger usando os primers de sequenciamento para frente e para trás.
- Após o fragmento crispante materno haploide ter sido sequenciado, alinhe-o à sequência do tipo selvagem e identifique INDELs nos locais-alvo usando um programa de alinhamento de sequência.
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Representative Results
A abordagem experimental descrita neste protocolo permite a identificação de fenótipos de efeito materno de forma rápida e eficiente em termos de recursos (Figura 1).
Gerando crispants maternos:
Ao projetar os quatro RNAs guia para atingir um único gene de efeito materno candidato, deve-se considerar especialmente onde os RNAs guia se ligarão ao DNA. Em geral, todos eles devem ser agrupados com regiões mínimas ou nenhuma sobreposição entre os RNAs guia no início do primeiro domínio proteico previsto (Figura 2A). Direcionar os RNAs guia para esse domínio aumenta a chance de que os INDELs in-frame e out-of-frame afetem a função da proteína. Outras variáveis que devem ser consideradas ao projetar RNAs guia são a eficiência de corte e o número de locais fora do alvo no genoma.
Após a injeção da solução de CRISPR-Cas9, a atividade somática de Cas9 pode ser determinada executando um pequeno fragmento de PCR, aproximadamente 100 pb, em um gel de agarose. Se INDELs foram criados no embrião injetado, um esfregaço deve ser observado nas amostras injetadas, mas não no controle não injetado (Figura 2B). Cada local guia deve ser testado independentemente para a atividade de Cas9 em células somáticas. Se os esfregaços forem vistos em pelo menos três locais-guia, os embriões injetados pelos irmãos devem ser crescidos e rastreados para fenótipos crispantes maternos.
Identificação de crispants maternos:
Para determinar se os crispants maternos são criados em cruzamentos naturais, os embriões de uma fêmea de peixe F0 podem ser comparados a controles do tipo selvagem com tempo combinado para observar quaisquer mudanças no desenvolvimento inicial. As embreagens F0 também devem ser pontuadas em 24 hpf e 5 dias após a fertilização para examinar o desenvolvimento do plano básico do corpo e a viabilidade, respectivamente, para identificar fatores maternos que possam regular estágios posteriores do desenvolvimento embrionário. Identificar um fenótipo compartilhado em embreagens de diferentes fêmeas F0 facilita a distinção dos efeitos causados pela perda de função de um gene alvo de efeitos fora do alvo ou inespecíficos.
Além disso, as ninhadas contendo crispants maternos são tipicamente mosaicas (ou seja, incluem embriões fenotípicos do tipo selvagem e crispante materno), permitindo que os embriões do tipo selvagem atuem como um controle interno para variáveis como tempo de fertilização e taxa de desenvolvimento. Em média, as ninhadas de fêmeas F0 conterão aproximadamente 69% de embriões maternos crocantes, com ninhadas contendo até 100% de embriões maternos crispantes observados11.
Após a identificação de embriões crisantes maternos, eles podem ser utilizados para caracterização molecular primária, ou seja, imunomarcação para limites celulares ou coloração de DNA com DAPI, o que pode fornecer informações sobre a natureza celular do processo de desenvolvimento afetado11. O método crispante materno também pode ser utilizado para fenocopiar mutações conhecidas de efeito materno, como heterogêneas, tmi e aura (Figura 3)11.
Sequenciamento de haploides crispantes maternos:
Para identificar a(s) lesão(ões) genética(s) que contribuem para o fenótipo crispante materno, espermatozoides tratados com UV e FIV são combinados para criar haploides crispantes maternos (Figura 4). O esperma tratado com UV fornece um centríolo, mas não contribui com DNA paterno, permitindo assim que a divisão celular ocorra apenas com material genômico materno. A criação de um haploide permite o sequenciamento de Sanger do alelo materno e a identificação de INDELs maternas crisantes (Figura 4). Em média, foram observados dois alelos por embreagem de haploide crispante materno. Os INDELs identificados por meio do sequenciamento de Sanger incluem edições em sites de guia únicos e exclusões que abrangem vários locais de guia (Figura 4C, Tabela 3). Um levantamento de INDELs haploides crispantes maternos de diferentes fêmeas F0 mostra que os mesmos locais guia são editados em múltiplos embriões, e a maioria das mutações recuperadas são códons de parada prematura (Tabela 3)11.
Figura 1: Fluxo de trabalho crispante materno. Para criar uma crispante materna, comece projetando quatro gRNAs que visam o primeiro domínio ativo do gene. 1) Em seguida, sintetize os quatro gRNAs em uma única reação. 2) Depois de sintetizar e purificar os gRNAs, crie um coquetel CRISPR-Cas9 e injete-o no blastodisco de um embrião unicelular. 3) Em seguida, faça a triagem dos embriões injetados para mutações somáticas usando PCR e eletroforese em gel. Se os INDELs fossem criados em amostras injetadas, um esfregaço apareceria nos embriões injetados, em contraste com a faixa apertada do controle do tipo selvagem. 4) Permita que os irmãos dos embriões injetados cresçam por 3-6 meses para atingir a maturidade sexual. Depois que a maturidade sexual for atingida, cruze uma fêmea injetada F0 contra um macho do tipo selvagem. A progênie resultante pode ser uma mistura de embriões crispantes do tipo selvagem e maternos. Identifique uma fêmea injetada F0 cujos embriões apresentem o fenótipo de efeito materno. 5) Para identificar as lesões que contribuem para o fenótipo, a FIV é realizada usando espermatozoides tratados com UV para criar haploides crispantes maternos para sequenciamento de Sanger. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de INDELs em genes-alvo. (A) Diagrama de estrutura gênica mostrando domínios hipotéticos de proteínas (blocos roxos claros e escuros), localização de gRNAs (linhas vermelhas) e locais de PAM (estrelas vermelhas). Os gRNAs são direcionados para o primeiro domínio ativo. Os éxons são mostrados como blocos, e os íntrons são mostrados como linhas. (B) Esfregaços em gel de agarose a 2,5% são indicativos de INDELs em células somáticas em embriões injetados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os crispants maternos recapitulam o fenótipo das mutações de efeito materno conhecidas. Comparação representativa de embriões vivos, do tipo selvagem pareado no tempo (coluna da esquerda), mutantes maternos conhecidos (coluna do meio) e crispante maternos (coluna da direita). (A) heterogêneo/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura/mutantes mid1ipIl/crispants maternos apresentam defeitos na citocinese em divisões embrionárias iniciais, levando a blástulas totalmente sinciciais (A, B) ou embriões parcialmente acelulares (C, caixa branca). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Usando haploides crispantes maternos para sequenciar mutações induzidas por CRISPR-Cas9 . (A) Uma fêmea injetada F0 cruzada contra um macho do tipo selvagem resulta em um embrião diploide com um fenótipo de efeito materno. (B) A VITRO é realizada usando espermatozoides tratados com UV para criar haploides maternos crocantes, permitindo o sequenciamento e a análise de INDELs induzidos no alelo materno. (C) Sequenciamento representativo do haploide crispante materno birc5b mostrando uma grande deleção entre os locais guia 3 e 4 (encaixotados). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mistura de PCR | ||
| Adicionar | ||
| estéril H2O | 171,12 mL | |
| MgCl2 (1 M) | 0,393 mL | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8,4) | 2,618 mL | |
| KCl (1 M) | 13,092 mL | |
| Autoclave por 20 min, em seguida, resfrie a solução no gelo. Próximo adicionar | ||
| BSA (100 mg/mL) | 3,468 mL | |
| dATP (100 mM) | 0,262 mL | |
| dCTP (100 mM) | 0,262 mL | |
| dGTP (100 mM) | 0,262 mL | |
| dTTP (100 mM) | 0,262 mL | |
| Alíquota em tubos de microcentrífuga estéreis | ||
| Receita de PCR | por amostra | |
| Mistura de PCR | 17,9 μL | |
| Primer F + R (10 μM) | 0,2 μL | |
| ROH2O | 1,8 μL | |
| Taq DNA Polimerase | 0,1 μL | |
| ADN | 5 μL | |
Tabela 1: Mistura de PCR.
| Solução de Hank | |||
| Premix de Hank | Combine o seguinte na ordem: (1) 10,0 mL de HS #1, (2) 1,0 mL de HS#2, (3) 1,0 mL de HS#4, (4) 86 mL de ddH2O, (5) 1,0 mL de HS#5. Armazene todas as soluções HS a 4 °C | ||
| Solução de Estoque de Hank #1 | 8,0 g de NaCl, 0,4 g de KCl em 100 mL de ddH2O | ||
| Solução de Estoque de Hank #2 | 0,358 g de Na2HPO4 anidro; 0,60 g de K 2 H 2 PO4 em 100 mL de ddH2O | ||
| Solução de Estoque de Hank #4 | 0,72 g de CaCl 2 em 50 mL de ddH2O | ||
| Solução de Estoque de Hank #5 | 1,23 g de MgSO4·7H 2 O em 50 mL de ddH20 | ||
| Solução de Estoque de Hank #6 | 0,35 g de NaHCO3 em 10,0 mL de ddH20; fazer fresco no dia de uso | ||
| Solução de trabalho final de Hank | Combine 9,9 mL de Hank's Premix com 0,1 mL de HS Stock #6 | ||
Tabela 2: Solução de Hank.
| birc5b #1 | birc5b #2 | birc5b #3 | prc1l #1 | prc1l #2 | ||
| Número total de embriões sequenciados | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Número total de embriões com INDELs | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Mutação em um local | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Mutações em vários locais | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Localização dos INDELs | ||||||
| Site do guia 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Site do guia 2 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | |
| Site de guia 3 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Site do guia 4 | 3 | 9 | 12 | 0 | 10 | |
| Tipos de INDELs | ||||||
| Mutação no quadro | 1 | 2 | 2 | 7 | 10 | |
| Mutação de deslocamento de quadro | 4 | 7 | 10 | 9 | 10 | |
Tabela 3: Localização e tipo de INDELs encontrados em dois conjuntos diferentes de haploides crispantes maternos: birc5b e prc1l.
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Discussion
O protocolo apresentado neste manuscrito permite a identificação e caracterização molecular primária de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, em vez das múltiplas gerações necessárias para técnicas genéticas avançadas e reversas. Atualmente, o papel de muitos genes expressos maternalmente é desconhecido. Essa falta de conhecimento se deve, em parte, à geração extra necessária para visualizar um fenótipo ao identificar genes de efeito materno. No passado, a rápida identificação de genes de efeito materno em peixes-zebra poderia ser alcançada injetando oligonucleotídeos morfolinográficos bloqueadores de translação em ovócitos cultivados32. Este método provou ser bem sucedido pela fenocópia de múltiplos genes de efeito materno conhecidos, mas manipular um ovócito imaturo pode ser um experimento delicado e demorado. Os RNAs maternos também podem ser direcionados para degradação usando complexos CRISPR-RfxCas13d, mas a injeção desses complexos no embrião de uma célula não pode ter como alvo a proteína33 fornecida pela mãe. Mais recentemente, descobriu-se que a CRISPR-Cas9 pode induzir mutações bialélicas na linha germinativa, permitindo a rápida identificação de novos genes de efeito materno em uma única geração11.
Este protocolo inclui várias etapas críticas que contribuem para a recuperação de embriões maternos crocantes. Em teoria, como as células germinativas são especificadas no início do desenvolvimento embrionário, quanto mais cedo uma lesão de DNA é criada em um gene alvo, maior a probabilidade de que uma célula contendo mutações se torne parte da linha germinativa. Este método usa a proteína Cas9 injetada no blastodisco em desenvolvimento de um embrião de uma célula para aumentar a probabilidade de edições na linha germinativa. Outro fator crítico que afeta a porcentagem de embriões crispantes maternos recuperados é a eficiência dos RNAs guia na criação de edições genéticas em locais-alvo. Este procedimento inclui uma seção sobre a determinação da capacidade dos RNAs guia de criar INDELs somáticos a 24 hpf por PCR. Se um RNA guia não consegue fazer edições somáticas, ele tem uma baixa probabilidade de produzir edições na linha germinativa a uma taxa alta o suficiente para gerar uma crispante materna. Esse protocolo direciona o usuário a testar edições somáticas, que devem ser visíveis em três ou mais sites de guia.
Após a observação do fenótipo dos embriões crisantes maternos, a(s) lesão(ões) genética(s) que contribuem para o fenótipo podem ser analisadas ao nível da sequência através da FIV com espermatozoides tratados com UV. Para adquirir material de partida suficiente para a PCR, os embriões haploides crispantes maternos devem se desenvolver por pelo menos seis a oito horas, permitindo que ocorram vários ciclos de replicação do DNA. O DNA genômico também deve ser extraído em 50 μL de 50mM de NaOH para concentrar o DNA. Se os embriões haploides crispantes maternos não puderem sobreviver por 6-8 h, colete os embriões em um ponto de tempo anterior. Para explicar o embrião submetido a menos ciclos de replicação do DNA, extraia o DNA em um volume menor de 50 mM de NaOH, mantendo a mesma proporção de NaOH e Tris-HCL. Outra opção é concentrar o DNA extraído usando um kit de limpeza e concentrador de DNA. Após a extração do ADN, o fragmento de PCR utilizado para a sequenciação deve incluir todos os quatro locais-alvo, se possível. Este fragmento permitirá a identificação de grandes deleções que abrangem vários locais de guia em embriões maternos crispantes.
Ao coletar haploides crispantes maternos para sequenciamento de Sanger, colete todos os haploides que mostram o fenótipo e envie um mínimo de 10 amostras únicas de embriões haploides para o sequenciamento de Sanger. O sequenciamento de múltiplos embriões haploides por embreagem permitirá a identificação de múltiplos INDELs encontrados na linha germinativa. Dados de sequenciamento prévio de haploides crispantes maternos mostraram que múltiplos alelos podem ser identificados em um conjunto de haploides crispantes maternos11. No entanto, esses alelos não são recuperados na proporção esperada de 1 para 111. O sequenciamento de múltiplos embriões também ajudará a apoiar a ideia de que o fenótipo é causado por um INDEL CRISPR-Cas9 no gene alvo. Qualquer sequência de tipo selvagem observada em embriões haploides sequenciados que mostrem um fenótipo específico sugerirá que o fenótipo não está associado ao gene alvo. Quaisquer novos fenótipos de efeito materno identificados através da segmentação de genes previamente descaracterizados também devem ser confirmados pelo estabelecimento de uma linha estável usando o irmão F0 machos11.
Em alguns casos, pode ser um desafio identificar INDELs através de análise haploide, onde o fenótipo crispante materno identificado tem uma certa característica fenotípica. Por exemplo, embriões haploides crispantes maternos que parecem não ser fertilizados ou lise durante o estágio de clivagem podem ser impossíveis de selecionar. Embriões crispantes maternos com defeitos de extensão do eixo semelhantes aos correspondentes à síndrome haploide também podem não ser distinguíveis para análise ao gerar haploides maternos34. Nesses casos, o pesquisador é aconselhado a realizar a análise diretamente usando linhas estáveis para confirmação do fenótipo genético.
Uma limitação do atual protocolo crispante materno é que ele só identifica genes de efeito materno por defeitos morfológicos grosseiros. Para aumentar a sensibilidade do método e torná-lo mais específico para certos aspectos do desenvolvimento precoce, repórteres transgênicos poderiam ser usados para destacar estruturas ou tipos de células específicas, como tem sido feito para outras telas 9,10,35. Por exemplo, a mistura CRISPR-Cas9 poderia ser injetada na linha transgênica Buc-GFP para identificar genes não letais que regulam a formação e o desenvolvimento de células germinativas primordiais36. Outra limitação do protocolo crispante materno é que, embora útil para genes expressos apenas durante o desenvolvimento inicial, pode não ser eficaz para genes com função materna e zigótica, uma vez que o direcionamento CRISPR-Cas9 do gene pode ser letal para o embrião em desenvolvimento. Para estudar a função materna dos genes expressos ao longo do desenvolvimento, a atividade da Cas9 poderia ser direcionada para a linha germinativa37, deixando assim a função somática do gene não afetada e permitindo a sobrevivência das fêmeas F0 até a idade adulta.
Os crispants maternos são uma ferramenta eficaz para identificar novos genes de efeito materno necessários para o desenvolvimento precoce. A combinação de RNAs guia de multiplexação para um único alvo e a capacidade de edição bialélica de Cas9 permite que o fenótipo de efeito materno seja observado em uma única geração, evitando esquemas de reprodução de várias gerações tipicamente necessários ao realizar a edição de genes direcionados. O desvio de várias gerações diminui a quantidade de espaço e recursos necessários para identificar genes de efeito materno.
Além de identificar novos genes de efeito materno, este protocolo permite que qualquer laboratório de peixe-zebra fenocopie e estude qualquer mutante de efeito materno conhecido sem estabelecer e manter linhas estáveis, facilitando a análise detalhada das vias genéticas. Em princípio, essa abordagem materna crispante também pode determinar a função dos produtos maternos em espécies modelo não genéticas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos antigos e atuais membros da equipe de criação de animais de laboratório da Pelegri por seu cuidado com a instalação aquática. Também somos gratos pelos comentários e insights sobre o manuscrito de Ryan Trevena e Diane Hanson. O financiamento foi fornecido pela subvenção do NIH à F.P. (GM065303)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
| 100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
| 70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
| Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
| Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
| Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
| Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
| Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
| Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
| General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Gloves | Any Maker | ||
| Ice Bucket | Any Maker | ||
| Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Female zebrafish | |||
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
| Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
| MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
| Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
| Micropipeters | Any Maker | ||
| Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
| Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
| Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
| Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
| nuclease-free water | Any Maker | ||
| Paper Towel | Any Maker | ||
| Pastro Pipettes | Any Maker | ||
| PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
| Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
| Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
| Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
| Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatula | Any Maker | ||
| Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
| Tape | Any Maker | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
| Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
| UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
| Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
| 1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse free ethanol | any maker | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
| Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agarose | any maker | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | any maker | ||
| Dissecting Forcepts | any maker | ||
| Dissecting Microscope | any maker | ||
| Dissecting Scissors | any maker | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
| Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fish Net | any maker | fine mesh | |
| Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
| Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
| Gel Electropheresis System | any maker | ||
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
| Glass Dishes | any maker | ||
| Gloves | any maker | ||
| Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ice Bucket | any maker | ||
| Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
| In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Male and Female zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Microinjector | |||
| Microneedle Slide | |||
| Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
| Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
| Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
| Microplastic slide | |||
| Microwave | any maker | ||
| MiliQ Water | any maker | ||
| mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Narrow Spatula | any maker | ||
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Paper Towel | any maker | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
| PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
| Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
| Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software for sanger sequencing Analysis | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterlie H2O | any brand | ||
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Tape | any brand | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
| UV lamp | UVP | ||
| UV safety glasses | any maker | ||
| Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
| Zebrafish mating boxes | any maker | ||
| PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |
References
- Pelegri, F.
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
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