Summary
यहां, माउस और खरगोश पर आधारित पशु मॉडल नए चिकित्सीय और अंतर्निहित तंत्र को स्क्रीन करने के लिए कॉर्नियल एपिथेलियम की यांत्रिक और रासायनिक चोट के लिए विकसित किए गए हैं।
Abstract
रासायनिक जलन और आघात सहित ओकुलर सतह पर कॉर्नियल चोट, गंभीर निशान, सिम्बलेफेरॉन, कॉर्नियल लिम्बल स्टेम कोशिकाओं की कमी का कारण बन सकती है, और इसके परिणामस्वरूप एक बड़ा, लगातार कॉर्नियल उपकला दोष हो सकता है। निम्नलिखित कॉर्नियल अस्पष्टता और परिधीय नियोवैस्कुलराइजेशन के साथ उपकला दोष के परिणामस्वरूप अपरिवर्तनीय दृश्य हानि होती है और भविष्य के प्रबंधन में बाधा आती है, विशेष रूप से केराटोप्लास्टी। चूंकि पशु मॉडल को एक प्रभावी दवा विकास मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, माउस को कॉर्नियल चोट और खरगोश कॉर्नियल एपिथेलियम के लिए क्षार जलने के मॉडल यहां विकसित किए गए हैं। न्यूजीलैंड सफेद खरगोश का उपयोग क्षार जलने मॉडल में किया जाता है। सोडियम हाइड्रॉक्साइड की विभिन्न सांद्रता को इंट्रामस्क्युलर और सामयिक संज्ञाहरण के तहत 30 सेकंड के लिए कॉर्निया के केंद्रीय परिपत्र क्षेत्र पर लागू किया जा सकता है। प्रचुर मात्रा में आइसोटोनिक सामान्य खारा सिंचाई के बाद, अवशिष्ट ढीले कॉर्नियल एपिथेलियम को इस गोलाकार क्षेत्र के भीतर बोमन की परत तक कॉर्नियल बर्र के साथ हटा दिया गया था। घाव भरने को कोबाल्ट नीली रोशनी के तहत फ्लोरेसिन धुंधला करके प्रलेखित किया गया था। सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग मुराइन कॉर्नियल एपिथेलियम के दर्दनाक मॉडल में किया गया था। मुराइन सेंट्रल कॉर्निया को 2 मिमी व्यास के त्वचा पंच का उपयोग करके चिह्नित किया गया था, और फिर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत 0.5 मिमी के साथ कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर द्वारा डिब्रिड किया गया था। इन मॉडलों का उपयोग आंखों की बूंदों या स्टेम कोशिकाओं जैसे मिश्रित एजेंटों के चिकित्सीय प्रभाव को मान्य करने के लिए भावी प्रभाव से किया जा सकता है, जो संभावित रूप से कॉर्नियल उपकला पुनर्जनन की सुविधा प्रदान करते हैं। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ कॉर्नियल अस्पष्टता, परिधीय नियोवैस्कुलराइजेशन और नेत्रश्लेष्मला भीड़ का अवलोकन करके, इन पशु मॉडलों में चिकित्सीय प्रभावों की निगरानी की जा सकती है।
Introduction
मानव कॉर्निया में पांच प्रमुख परतें होती हैं और इंट्राओकुलर ऊतकों की रक्षा के लिए दृश्य तीक्ष्णता और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए ओकुलर अपवर्तन में एक महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। कॉर्निया का सबसे बाहरी हिस्सा कॉर्नियल एपिथेलियम है, जो कोशिकाओं की पांच से छह परतों से बना होता है जो क्रमिक रूप से बेसल कोशिकाओं से अलग होते हैं और ओकुलर सतह1 से बहने के लिए ऊपर की ओर बढ़ते हैं। मनुष्यों और न्यूजीलैंड खरगोशों में कॉर्निया की तुलना में, माउस कॉर्निया में एक समान कॉर्नियल संरचना होती है, लेकिन उपकला और स्ट्रोमा2 में कम मोटाई के कारण मध्य भाग की तुलना में पतली परिधि होती है। ओकुलर ऑप्टिक सिस्टम में इसकी अनूठी स्थिति के कारण, यांत्रिक चोट, जीवाणु टीकाकरण और रासायनिक एजेंट जैसे कई बाहरी अपमान आसानी से उपकला अखंडता को खतरे में डाल सकते हैं और आगे दृष्टि-धमकाने वाले उपकला दोष, संक्रामक केराटाइटिस, कॉर्नियल पिघलने और यहां तक कि कॉर्नियल वेध का कारण बन सकते हैं।
यद्यपि विभिन्न चिकित्सीय एजेंट, जैसे स्नेहक, एंटीबायोटिक्स, विरोधी भड़काऊ एजेंट, ऑटो-सीरम उत्पाद, और एमनियोटिक झिल्ली का उपयोग पहले से ही पुन: उपकलाकरण में सुधार और निशान को कम करने के लिए किया गया है, अन्य संभावित उपचार के तौर-तरीके जो घाव भरने, सूजन को कम करने और निशान गठन को दबाने में सक्षम हो सकते हैं, अभी भी विभिन्न प्लेटफार्मों पर विकसित और परीक्षण किए जा रहे हैं। कॉर्नियल एपिथेलियल घाव भरने के लिए विभिन्न पशु मॉडल प्रस्तावित किए गए हैं, जिनमें डायबिटिक माउस3 में कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर के साथ कॉर्नियल एपिथेलियम हटाने,बैक्टीरियल टीकाकरण के लिए बाँझ 25 जी सुई द्वारा माउस कॉर्नियल एपिथेलियम पर रैखिक खरोंच, कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर5 द्वारा कॉर्नियल एपिथेलियम का ट्रेफिन-असिस्टेड निष्कासन, कॉर्निया के आधे हिस्से से अधिक एपिथेलियल को हटाना और लिम्बस6 शामिल हैं। ट्रेफिन-सुविधा वाले खरगोश कॉर्नियल घर्षण एक सुस्त स्केलपेल ब्लेड7 द्वारा, और गोजातीय कॉर्निया की चोट तरल नाइट्रोजन8 में फ्लैश फ्रीजिंग द्वारा।
कॉर्नियल एपिथेलियम के लिए यांत्रिक चोट के अलावा, रासायनिक एजेंट ओकुलर सतह, विशेष रूप से अम्लीय और क्षार एजेंटों के लिए भी आम अपमान हैं। सोडियम हाइड्रॉक्साइड (30-60 एस के लिए एनएओएच, 0.1-1 एन) कॉर्नियल रासायनिक बर्न 9,10,11,12,13 के मुराइन और खरगोश मॉडल में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले रसायनों में से एक है। चूहे के रासायनिक जलने के मॉडल में कॉर्निया पर 100% इथेनॉल भी लागू किया गया था, इसके बाद सर्जिकल ब्लेड14 का उपयोग करके अतिरिक्त यांत्रिक स्क्रैपिंग की गई थी। चूंकि एक स्वस्थ ओकुलर सतह का रखरखाव कार्यात्मक इकाइयों पर निर्भर करता है, जिसमें पलकें, मेबोमियन ग्रंथियां, लैक्रिमल सिस्टम, नेत्रश्लेष्मला और कॉर्निया शामिल हैं, विवो पशु मॉडल में विवो सुसंस्कृत कॉर्निया उपकला कोशिकाओं या कॉर्नियल ऊतकों पर कुछ गुण हैं। इस लेख में, कॉर्नियल घर्षण घाव का माउस मॉडल, और कॉर्नियल क्षार जलने का खरगोश मॉडल प्रदर्शित किया गया है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
पशु अध्ययन में सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल में अनुसंधान आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एआरवीओ बयान का पालन किया गया था।
1. माउस कॉर्नियल एपिथेलियम के पूर्व विवो घाव भरने मॉडल
- चूहों की तैयारी
- केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (शरीर के वजन का 80-100 मिलीग्राम / किलोग्राम) और ज़ाइलाज़िन (शरीर के वजन का 5-10 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल वितरण द्वारा सी 57बीएल / 6 चूहों को सामान्य संज्ञाहरण का प्रशासन करें।
- सुनिश्चित करें कि सामान्य संज्ञाहरण एक हानिकारक उत्तेजना के आंदोलन के नुकसान और चूहों में राइटिंग रिफ्लेक्स के नुकसान की पुष्टि करके काम कर रहा है।
- चूहों के सिर को हाथ से ठीक करें और 0.5% प्रोपेराकेन हाइड्रोक्लोराइड ऑप्थेल्मिक समाधान (चित्रा 1 ए) की एक बूंद के साथ दोनों आंखों पर सामयिक संज्ञाहरण लागू करें। ओकुलर सतह और ढक्कन को 5% बीटाडीन के साथ तीन बार कीटाणुरहित करें।
- मुराइन कॉर्नियल उपकला घाव मॉडल का निर्माण
नोट: एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत नीचे दी गई प्रक्रियाओं को निष्पादित करें। कॉर्नियल घाव विवो में बनाया गया था, न कि एक्स विवो, आंखों की पुतली को बेहतर ढंग से हेरफेर करने और वास्तविक दुनिया की स्थिति के करीब। यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है; इसलिए, केवल साफ उपकरणों (बाँझ तकनीक नहीं) की आवश्यकता होती है।- घाव के एक अच्छी तरह से सीमित और अच्छी तरह से मापने योग्य क्षेत्र की पुष्टि करने के लिए त्वचा बायोप्सी पंच (व्यास में 2 मिमी) का उपयोग करके माउस के केंद्रीय कॉर्निया को चिह्नित करें।
- धीरे से एक गोलाकार निशान छोड़ने के लिए केंद्रीय कॉर्निया पर पंच की पहचान करें (चित्रा 1 बी)। 0.5 मिमी के साथ हाथ से पकड़े गए कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर का उपयोग करते हुए, कॉर्नियल एपिथेलियम को बोमन की परत तक डिब्राइड करें ताकि बाद वाले को नुकसान न पहुंचे (चित्रा 1 सी)। कॉर्नियल फोर्सेस के साथ घाव के मार्जिन के भीतर अवशिष्ट, ढीले ऊतकों को हटा दें।
- फ्लोरेसिन धुंधला होने के साथ डिब्राइडेशन के क्षेत्र की पुष्टि करें (चित्रा 1 डी)। फ्लोरेसिन धुंधला करने के लिए, फ्लोरेसिन को भंग करने के लिए फ्लोरेसिन पेपर पर सामान्य खारा की एक बूंद डालें, और फिर फ्लोरेसिन युक्त बूंद को कोबाल्ट नीली रोशनी के तहत कल्पना करने के लिए मुराइन उपकला दोष पर रखें।
- मुराइन कॉर्नियल घर्षण घाव मॉडल की पूर्व विवो संस्कृति।
- मुराइन नेत्रगोलकों की कटाई के लिए, निम्नानुसार आगे बढ़ें।
- एक प्रेरण कक्ष में 5% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों का बलिदान करें। सुनिश्चित करें कि संज्ञाहरण एक हानिकारक उत्तेजना के आंदोलन के नुकसान और चूहों में राइटिंग रिफ्लेक्स के नुकसान की पुष्टि करके काम कर रहा है।
- नेत्रगोलक को बाहर धकेलने के लिए बेहतर और अवर कक्षीय रिम पर बल की नोक के साथ धीरे से दबाएं। बंद कॉर्नियल कैंची की नोक को अवर कक्षीय दीवार के साथ रेट्रोबुलबार स्पेस में पेश करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि नेत्रगोलक में प्रवेश न हो।
- नेत्रगोलक को 0.3 मिमी कॉर्नियल फोर्सप्स के साथ स्थिर रखें, और फिर नेत्रगोलक को अलग करने के लिए कॉर्नियल कैंची के साथ ऑप्टिक तंत्रिका और पेरिऑर्बिटल नरम ऊतक को काट दें।
- मुराइन नेत्रगोलकों के पूर्व विवो संवर्धन के लिए, निम्नानुसार आगे बढ़ें।
- कुएं के अंदर पिघले हुए मोम के साथ एक 48-वेल प्लेट तैयार करें और जमने की प्रतीक्षा करें। नेत्रश्लेष्मला बल की नोक के साथ, आंखों की पुतलियों को समायोजित करने के लिए ठोस मोम की सतह पर एक गोल छेद बनाएं।
- स्थिरीकरण स्थापित करने के लिए मोम से ढके तल और साइडवॉल के साथ कटी हुई आंखों की पुतलियों को सीधे 48-वेल प्लेट (चित्रा 1 ई) पर रखें (चित्रा 1 एफ)।
- अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ या बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण में 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) युक्त डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के साथ नेत्रगोलक को कल्चर करें।
नोट: यदि मॉडल का उपयोग कॉर्नियल उपकला घाव भरने के अध्ययन के लिए किया जाता है, तो संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता होगी। हालांकि, अगर इस मॉडल का उपयोग एंटीबायोटिक दवाओं या मिश्रित एजेंटों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है, तो रोगनिरोधी एंटीबायोटिक्स आवश्यक नहीं होंगे। - नेत्रगोलक को तैरने के बिना संस्कृति माध्यम के साथ ओकुलर सतह को डुबोएं।
- फ्लोरेसिन स्टेनिंग (चरण 1.2.3) द्वारा घाव भरने के पाठ्यक्रम का दस्तावेजीकरण करें और कोबाल्ट नीली रोशनी के तहत डिजिटल कैमरे के साथ तस्वीरें एकत्र करें।
नोट: यांत्रिक कॉर्नियल चोट के चूहों के मॉडल के साथ संभावित प्रयोगों में, कॉर्नियल घर्षण प्राप्त करने वालों और चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता के लिए आगे परीक्षण किए गए लोगों को एक प्रयोगात्मक समूह के रूप में देखा जाता है, और आगे के उपचार के बिना कॉर्नियल घर्षण प्राप्त करने वालों को नकारात्मक नियंत्रण समूह माना जाता है।
2. कॉर्नियल क्षार चोट के विवो खरगोश मॉडल में
नोट: इस मॉडल में, एक क्षार जलने की चोट को प्रेरित किया जाता है, जिसके बाद बाद में परिमाणीकरण के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित और यहां तक कि घाव क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए कॉर्नियल एपिथेलियम का यांत्रिक विघटन होता है। उपयोग से पहले सभी उपकरणों को निष्फल करें।
- प्री-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के साथ खरगोश की तैयारी, जिसमें प्रणालीगत एनाल्जेसिक और सामयिक आंखों की बूंदों के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन शामिल हैं।
- न्यूजीलैंड के सफेद खरगोशों को केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (शरीर के वजन का 35-44 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा सामान्य संज्ञाहरण का प्रशासन करें, जो पिछले पैर में ज़ाइलज़िन (शरीर के वजन का 5-10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ मिश्रित होता है।
- खरगोश को स्थिति देने और इसे एक तौलिया से ढंकने के बाद, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत 0.5% प्रोपेराकेन हाइड्रोक्लोराइड ऑप्थेल्मिक समाधान (चित्रा 2 ए) की बूंद के साथ दाईं आंख पर सामयिक संज्ञाहरण लागू करें। ओकुलर सतह और ढक्कन को 5% बीटाडीन के साथ तीन बार कीटाणुरहित करें।
- कॉर्निया पर क्षार जलने की चोट को प्रेरित करना
- पेट्री डिश में 8 मिमी के व्यास (8 मिमी पंच का उपयोग करके काटा गया) के साथ गोलाकार फिल्टर पेपर रखें। ड्रॉपर का उपयोग करके, फिल्टर पेपर को भिगोने के लिए पेट्री डिश में 0.5 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) जोड़ें। खरगोश कॉर्निया पर रखने से पहले फिल्टर पेपर से अतिरिक्त एनएओएच समाधान निकालें।
चेतावनी: 0.5 एन एनएओएच मानव ऊतकों को गंभीर इरोसिव चोट का कारण बन सकता है। हैंडलिंग करते समय दस्ताने पहनें। यदि त्वचा या आंखें एनएओएच बूंदों के संपर्क में आती हैं, तो आगे के नुकसान को कम करने के लिए सामान्य खारा और चिकित्सा सहायता की प्रचुर मात्रा के साथ सिंचाई की आवश्यकता होती है। - पलकों को ढक्कन के साथ खोलने और यह पुष्टि करने के बाद कि खरगोश की झिल्ली फ़िल्टर पेपर (चित्रा 2 बी) के सम्मिलन में हस्तक्षेप नहीं कर रही है, 0.5 एन एनएओएच में भिगोए गए गोलाकार फिल्टर पेपर को केंद्रीय कॉर्निया पर 30 सेकंड के लिए रखें, और फिर इसे बल के साथ हटा दें (चित्रा 2 सी)।
- फिल्टर पेपर को हटाने के बाद, क्षार सामग्री को धोने के लिए 10 मिलीलीटर सामान्य खारा के साथ ओकुलर सतह को कुल्ला करें।
- पेट्री डिश में 8 मिमी के व्यास (8 मिमी पंच का उपयोग करके काटा गया) के साथ गोलाकार फिल्टर पेपर रखें। ड्रॉपर का उपयोग करके, फिल्टर पेपर को भिगोने के लिए पेट्री डिश में 0.5 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) जोड़ें। खरगोश कॉर्निया पर रखने से पहले फिल्टर पेपर से अतिरिक्त एनएओएच समाधान निकालें।
- कॉर्नियल उपकला दोष को पूरा करना
- 0.5 मिमी बुर के साथ कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर का उपयोग करके बोमन की झिल्ली तक ओपेसीफाइड क्षेत्र के भीतर कॉर्नियल एपिथेलियम को डिब्राइड करें (चित्रा 2 डी)।
- कोबाल्ट नीली रोशनी के तहत फ्लोरेसिन धुंधला होने के साथ विघटन के क्षेत्र की पुष्टि करें और कॉर्नियल फोर्सेस का उपयोग करके अवशिष्ट कॉर्नियल एपिथेलियम को हटा दें (चित्रा 2 ई)।
- टार्सोरफी के साथ सुरक्षित घाव की स्थिति
- पुष्टि करें कि निकोटिटिंग झिल्ली नाक की तरफ ओकुलर सतह और कॉर्नियल उपकला दोष को आसानी से कवर करती है। सुनिश्चित करें कि घाव भरने और प्रयोग की प्रक्रिया में हस्तक्षेप करने के लिए निकोटिटिंग झिल्ली को बहुत अधिक मोड़ा या विकृत नहीं किया गया है।
- ओकुलर सतह की रक्षा करने और खरगोश को इसे खरोंचने से रोकने के लिए 6-0 सीवन का उपयोग करके सामयिक एजेंटों के साथ या बिना एक अस्थायी टार्सोरफी करें (चित्रा 2 एफ)। सुनिश्चित करें कि खरगोश को सीवन को तोड़ने से रोकने के लिए 4-5 टाई और लंबी गांठों के साथ ऊपरी और निचले ढक्कन मार्जिन से टारसोरफी के लिए सीवन 3-4 मिमी पर है।
नोट: यदि प्रयोग एंटीबायोटिक दवाओं के अध्ययन में शामिल नहीं है, तो एंटीबायोटिक दवाओं के साथ सामयिक एजेंटों पर विचार किया जा सकता है। - इस खरगोश मॉडल में, क्षार जलने और कॉर्नियल एपिथेलियम को हटाने वाले लोगों को नियंत्रण समूह के रूप में माना जाता था।
नोट: संभावित प्रयोगों में, क्षार जलने वाली कॉर्नियल चोट प्राप्त करने वाले खरगोशों को आगे चिकित्सीय एजेंटों के साथ इलाज किया जाता है, जिसे एक प्रयोगात्मक समूह के रूप में देखा जाता है। केवल क्षार जलने का उपचार प्राप्त करने वाले खरगोशों को, आगे के उपचार के बिना, एक नकारात्मक नियंत्रण समूह माना जाता है।
- पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया और दर्द नियंत्रण
- जानवरों में दर्द और संकट की निगरानी करके, प्रक्रिया के बाद 7 दिनों के लिए शारीरिक स्थिति और यूएसडीए दर्द के स्तर का आकलन करें। मूल्यांकन के परिणाम के अनुसार टोब्रामाइसिन मलहम और 0.5% प्रोपेराकेन हाइड्रोक्लोराइड ऑप्थेल्मिक समाधान की एक बूंद के उपयोग पर विचार करें। 3 दिनों के लिए हर 6-8 घंटे में ब्यूप्रेनोर्फिन एचसीएल (0.03 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रबंधन करें।
नोट: सर्जरी के बाद दोष क्षेत्र और अवलोकन के दैनिक माप के लिए, प्रक्रिया यूएसडीए श्रेणी डी से संबंधित है।
- जानवरों में दर्द और संकट की निगरानी करके, प्रक्रिया के बाद 7 दिनों के लिए शारीरिक स्थिति और यूएसडीए दर्द के स्तर का आकलन करें। मूल्यांकन के परिणाम के अनुसार टोब्रामाइसिन मलहम और 0.5% प्रोपेराकेन हाइड्रोक्लोराइड ऑप्थेल्मिक समाधान की एक बूंद के उपयोग पर विचार करें। 3 दिनों के लिए हर 6-8 घंटे में ब्यूप्रेनोर्फिन एचसीएल (0.03 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रबंधन करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
माउस कॉर्नियल एपिथेलियम के पूर्व विवो घाव उपचार मॉडल:
हाथ से पकड़े जाने वाले कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर के साथ माउस कॉर्नियल एपिथेलियम के विवो डिब्राइडेशन के बाद, केंद्रीय 2 मिमी क्षेत्र (चित्रा 3 ए-बी) में सकारात्मक फ्लोरेसिन दाग के साथ एक हल्का उदास केंद्रीय कॉर्नियल क्षेत्र पाया जा सकता है। माउस नेत्रगोलक की कटाई के बाद, इसे आसानी से मोम-लेपित 48-वेल कल्चर प्लेट पर महत्वपूर्ण घूर्णन के बिना तय किया गया था। प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 3 सी) के तहत 48-वेल कल्चर प्लेट के भीतर मुराइन नेत्रगोलकियों की पूर्व विवो संस्कृति की जांच और दस्तावेज किया जा सकता है। मुराइन कॉर्नियल एपिथेलियम को हटाने के एक दिन बाद, कोबाल्ट ब्लू लाइट (चित्रा 3 डी) के तहत प्राप्त डिजिटल तस्वीरों में 2 मिमी व्यास मापा गया एक गोलाकार फ्लोरेसिन-सना उपकला दोष प्रकट किया जा सकता है। प्रारंभिक अनियमित रूप से दाग वाले घाव मार्जिन या नकारात्मक फ्लोरेसिन धुंधला होने का मतलब है कॉर्नियल एपिथेलियम का अधूरा या असफल निष्कासन। घाव भरने की सामान्य प्रक्रिया में, कॉर्नियल उपकला दोष 2-3 दिनों में कम फ्लोरेसिन-दाग वाले क्षेत्र के साथ ठीक हो जाएगा।
कॉर्नियल क्षार की चोट के विवो खरगोश मॉडल में:
किसी भी प्रक्रिया से पहले, बरकरार खरगोश कॉर्नियल एपिथेलियम को फ्लोरेसिन धुंधला होने से दाग नहीं दिया जा सकता है। खरगोश कॉर्नियल एपिथेलियम में क्षार की चोट बनाने के बाद, एक स्पष्ट और पूर्ण परिपत्र मार्जिन के साथ केंद्रीय कॉर्निया पर कोबाल्ट नीली रोशनी के साथ या उसके बिना सकारात्मक फ्लोरेसिन धुंधलापन देखा जा सकता है (चित्रा 4 ए-बी और चित्रा 5 बी)। भरे हुए क्षेत्र के साथ अधूरा दाग अवशिष्ट कॉर्नियल उपकला ऊतकों या असफल धुंधलापन का प्रतिनिधित्व करता है। नियमित अनुवर्ती कार्रवाई के दौरान, कॉर्नियल उपकला घाव लिम्बस से पन्नू के विकास के साथ फिर से उपकलाकृत हो जाता है, इसके बाद कम दाग वाले क्षेत्र (चित्रा 5 सी) होते हैं। उपकला दोष 3-4 सप्ताह के भीतर ठीक हो जाता है। यदि कॉर्नियल अल्सर, डेलेन, बड़े उपकला दोष, या बड़े पैमाने पर सफेद या श्लेष्म निर्वहन अचानक विकसित होता है, तो असुरक्षित टार्सोरफी, उजागर सीवन, एक गलत स्थिति वाली निकोटिटिंग झिल्ली, या पैल्पेब्रल नेत्रश्लेष्मला के भीतर एक विदेशी शरीर पर विचार किया जाना चाहिए।
चित्र 1: कॉर्नियल यांत्रिक चोट के माउस मॉडल को स्थापित करने की प्रक्रियाएं। (A) प्रक्रिया से पहले सामयिक संज्ञाहरण लागू किया जाता है। (बी) 2 मिमी त्वचा बायोप्सी ट्रेफिन के साथ केंद्रीय कॉर्निया पर कोमल इंडेंटेशन किया जाता है। (सी) केंद्रीय कॉर्नियल एपिथेलियम को हटाने के लिए कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर का उपयोग किया जाता है। (डी) दोष क्षेत्र की पुष्टि करने और बी में चिह्नित क्षेत्र के साथ तुलना करने के लिए एक उपकला दोष को फ्लोरेसिन से दाग दिया जाता है। (E, F) माउस नेत्रगोलक को काटा जाता है और पहले से मोम से ढकी 48-वेल प्लेट पर स्थानांतरित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: क्षार कॉर्नियल चोट के खरगोश मॉडल का निर्माण करने के लिए कदम। (A) सामयिक संज्ञाहरण ओकुलर सतह पर लागू किया जाता है। (बी) एक ढक्कन स्पेकुलम का उपयोग ऊपरी और निचली पलकों को खोलने के लिए किया जाता है, बिना निकोटिटिंग झिल्ली को मोड़ने या निचोड़ने के। (सी) केंद्रीय कॉर्निया पर एक एनएओएच-भिगोया हुआ ट्रेफाइड फिल्टर पेपर (व्यास में 8 मिमी) रखा जाता है। (डी) कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर का उपयोग 8 मिमी केंद्रीय उपकला को बोमन की परत तक डिब्राइड करने के लिए किया जाता है। (ई) एपिथेलियम दोष फ्लोरेसिन से सना हुआ है। (एफ) प्रक्रिया के बाद, घाव को खरोंच से बचाने के लिए टार्सोर्फी किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: कॉर्नियल यांत्रिक चोट के माउस मॉडल में सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम। (ए) प्रक्रिया से पहले किसी भी धुंधलापन के बिना बरकरार माउस कॉर्नियल एपिथेलियम। (बी) कोबाल्ट नीली रोशनी के बिना मुराइन कॉर्नियल घाव पर फ्लोरेसिन के साथ विवो पॉजिटिव धुंधलापन। (सी) कल्चर माध्यम जोड़ने से पहले फ्लोरेसिन दाग को जोड़े बिना माउस आईबॉल की पूर्व विवो संस्कृति। (डी) एक्स विवो माउस मॉडल में कॉर्नियल एपिथेलियल दोष पर फ्लोरेसिन के साथ सकारात्मक धुंधलापन। 2 मिमी उपकला दोष आम तौर पर 2-3 दिनों के भीतर ठीक हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: कॉर्नियल क्षार की चोट के खरगोश मॉडल में फ्लोरेसिन धुंधला होने के परिणाम। (ए) कोबाल्ट नीली रोशनी के तहत सकारात्मक फ्लोरेसिन धुंधला होना। यह तस्वीर मैकेनिकल कॉर्नियल चोट के ठीक बाद ली गई थी। (बी) कोबाल्ट नीली रोशनी के बिना खरगोश ओकुलर सतह पर फ्लोरेसिन डाई के साथ सकारात्मक धुंधलापन भी देखा जा सकता है। (सी) ठीक हो चुकी ओकुलर सतह पर नकारात्मक धुंधलापन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: कॉर्नियल क्षार की चोट के खरगोश मॉडल में घाव भरने और पुन: उपकलाकरण की उपस्थिति का समय पाठ्यक्रम। (A) माउस और खरगोश मॉडल में पुन: उपकलाकरण में क्रमशः 2-3 दिन और 3-4 सप्ताह लगते हैं। (बी) खरगोश मॉडल में क्षार जलने के बाद फ्लोरेसिन के साथ सना हुआ 8 मिमी उपकला दोष। कोबाल्ट ब्लू लाइट का उपयोग प्रकाश स्रोत के रूप में किया गया था। यह तस्वीर क्षार की चोट के ठीक बाद ली गई थी। (सी) क्षार की चोट के 3 सप्ताह बाद खरगोश की आंख में एक ठीक उपकला दोष, कम दाग क्षेत्र दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
कॉर्नियल चोट के माउस और खरगोश मॉडल घाव भरने की निगरानी, नए चिकित्सीय परीक्षण और घाव भरने और उपचार मार्गों के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी पूर्व विवो और विवो प्लेटफॉर्म प्रदान करते हैं। अनुसंधान के उद्देश्य के आधार पर, अल्पकालिक या दीर्घकालिक प्रयोग के लिए विभिन्न पशु मॉडल का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विवो में माउस कॉर्निया पर उपकला दोष बनाने के बाद, एक सीमित उपकला दोष का उपयोग छोटी मात्रा में तरल चिकित्सीय एजेंटों की निगरानी के लिए किया जा सकता है। इसी समय, आसपास की कार्यात्मक इकाइयों, जैसे पलकें, लैक्रिमल सिस्टम और नेत्रश्लेष्मला, का मूल्यांकन सेल संस्कृति या पूर्व विवो संस्कृति स्थितियों के विपरीत, आईएन विवो स्थितियों के तहत किया जा सकता है। इस स्थिति में टार्सोरफी की अभी भी आवश्यकता हो सकती है यदि चूहों के आंदोलन प्रयोगात्मक स्थिति को प्रभावित कर सकते हैं। एक साधारण रैखिक खरोंच घाव4 की तुलना में एक गोलाकार घाव का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करना आसान है। हालांकि, कॉर्निया पर एक सीमांकन रेखा बनाने के लिए त्वचा पंच बोमन की झिल्ली को काटे बिना सावधानी से किया जाना चाहिए, जो अन्यथा एक गहरी कॉर्नियल चोट या एक मर्मज्ञ घाव छोड़ देगा। यांत्रिक कॉर्नियल घाव को खरगोश मॉडल15 में 8 मिमी कॉर्नियल ट्रेफिन और एक स्केलपेल ब्लेड द्वारा भी बनाया जा सकता है, जिसमें कॉर्नियल एपिथेलियम के बजाय पूर्ववर्ती स्ट्रोमा तक एक गहरा घाव प्रस्तुत किया गया था।
कॉर्नियल जंग अंगूठी हटाना एक और महत्वपूर्ण मुद्दा है जो उल्लेख करने योग्य है। चूंकि माउस नेत्रगोलक छोटा है, इसलिए कॉर्नियल एपिथेलियम का ओवर-रिमूवल या अंडर-रिमूवल हो सकता है, इस प्रकार अनुसंधान की सटीकता प्रभावित हो सकती है। त्वचा बायोप्सी पंच और फ्लोरेसिन-निर्देशित ऑपरेशन के साथ कॉर्निया को चिह्नित करने से इन गलतियों को कम करने में मदद मिलेगी। यद्यपि पशु मॉडल 6,7 में कॉर्नियल एपिथेलियम को हटाने के लिए उपकरण के रूप में कॉट्री और स्केलपेल ब्लेड प्रस्तावित किए गए हैं, ओकुलर सतह पर क्षति को आसानी से नियंत्रित और पुन: पेश नहीं किया जा सकता है, जो संभावित रूप से आगे के प्रयोगों में असंगत परिणामों की ओर जाता है।
विवो स्थिति की तुलना में, 48-वेल प्लेटों में एक्स विवो सुसंस्कृत माउस आईबॉल प्लेटों पर एक बड़े काम करने की जगह के कारण हेरफेर करना आसान है और इसका उपयोग एक ही समय में विभिन्न संस्कृति माध्यमों में जटिल एजेंटों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि ड्रग-एल्यूटिंग संपर्क लेंस और सेल थेरेपी। जब माउस नेत्रगोलक को काटा जा रहा है और 48-वेल प्लेट पर स्थानांतरित किया जा रहा है, तो ओकुलर सतह को अतिरिक्त कृत्रिम क्षति और आंखों की पुतलियों के टूटने से बचने के लिए कॉर्निया की सावधानीपूर्वक सुरक्षा महत्वपूर्ण है। निम्नलिखित अध्ययन के लिए, नेत्रगोलक को पैराफिन-लेपित अच्छी तरह से तय किया जा सकता है जिसमें कॉर्निया ऊपर की ओर होता है और एक संस्कृति माध्यम के भीतर डूबा होता है। तैरते या घूमने वाली आंखों की पुतलियां या निर्जलित कॉर्निया परिणामों में बाधा डालेंगे। चूंकि यह पूर्व विवो माउस मॉडल ओकुलर सतह पर परिवर्तन पर केंद्रित है, इसलिए अन्य कार्यात्मक इकाइयों, जैसे लैक्रिमल ग्रंथि और पलकें, इस पूर्व विवो मॉडल में चर्चा नहीं की जाती हैं। एक्स विवो माउस मॉडल भी चूहों के प्रजनन और आवास की लागत को कम करता है और विवो पशु मॉडल की तुलना में प्रयोगात्मक स्थान बचाता है। यह मॉडल दीर्घकालिक के बजाय अल्पकालिक अध्ययन के लिए उपयुक्त है क्योंकि संभावित ऊतक संक्रमण और अंग विफलता लंबे समय में विकसित हो सकती है।
यद्यपि माउस मॉडल की लागत कम होती है और इसे प्रयोगशाला में बढ़ाया जा सकता है, एक छोटा सतह क्षेत्र संभावित रूप से कॉर्निया के विस्तृत परिवर्तनों जैसे लिपिड जमाव और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप द्वारा नियोवैस्कुलराइजेशन के अवलोकन को सीमित करता है। इसके बजाय, नेत्रगोलक के बड़े व्यास के साथ कॉर्नियल चोट का एक खरगोश मॉडल आम तौर पर इस नुकसान की भरपाई कर सकता है। एनएओएच की एकाग्रता और भिगोने के समय को समायोजित करके, कॉर्नियल क्षार जलने की गंभीरता के विभिन्न विस्तार बनाए जा सकते हैं। चूहे के रासायनिक जलने के मॉडल में, 1 एन एनएओएच का उपयोग कॉर्निया को 40 सेकंड के लिए 3 मिमी फिल्टर पेपर और 20 सेकंड के लिए 4 मिमी फिल्टर पेपर के साथ भिगोने के लिए किया गया था, जो अवलोकन16,17 के लिए एक समान लेकिन छोटा क्षेत्र प्रदान करता है। क्षार जलने को आकार और एकाग्रता में सुसंगत रखने के लिए, पेपर मार्जिन पर किसी भी फाइबर या भरे हुए कोने से बचने के लिए 8 मिमी फिल्टर पेपर की तैयारी में एक नया और तेज पंच सुझाया जाता है। घाव के बाहर निरंतर क्षति को कम करने के लिए ओकुलर सतह और नेत्रश्लेष्मला थैली से रासायनिक एजेंटों को धोने के लिए पर्याप्त सिंचाई की आवश्यकता होती है। चूंकि खरगोश की झिल्ली प्रयोगात्मक प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकती है और क्षार एजेंटों द्वारा खराब होने पर दर्द को प्रेरित कर सकती है, इसलिए इसे सावधानीपूर्वक संरक्षित किया जाना चाहिए और ओकुलर सतह पर अतिरिक्त सूजन को कम करने के लिए प्रक्रिया के बाद शारीरिक स्थिति में वापस रखा जाना चाहिए। क्षार जलने की प्रक्रिया के बाद, खरगोश कॉर्नियल घाव को प्रयोगों की गुणवत्ता और संयोजन को सुरक्षित करने के लिए टार्सोरफी या अन्य सामग्री जैसे संपर्क लेंस द्वारा संरक्षित किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।
Acknowledgments
अध्ययन को ताइवान की परमाणु ऊर्जा परिषद (अनुदान संख्या ए-आईई-01-03-02-02-02), विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (अनुदान संख्या एनएमआरपीजी 3 ई 6202-3), और चांग गुंग मेडिकल रिसर्च प्रोजेक्ट (अनुदान संख्या सीएमआरपीजी 3 एच 1281) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z.
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
