Summary
ここでは、角膜上皮の機械的および化学的損傷のためにマウスとウサギに基づく動物モデルを開発し、新しい治療法とそのメカニズムをスクリーニングします。
Abstract
化学火傷や外傷を含む眼表面の角膜損傷は、重度の瘢痕化、シンブレファロン、角膜辺縁系幹細胞の欠乏を引き起こし、大きく持続的な角膜上皮欠損を引き起こす可能性があります。以下の角膜混濁と末梢新生血管を伴う上皮欠損は、不可逆的な視覚障害をもたらし、将来の管理、特に角膜移植術を妨げます。動物モデルは有効な医薬品開発プラットフォームとして利用できるため、マウスの角膜損傷やウサギの角膜上皮へのアルカリ熱傷のモデルをここで開発します。ニュージーランドの白ウサギはアルカリ燃焼モデルで使用されています。異なる濃度の水酸化ナトリウムを、筋肉内麻酔下および局所麻酔下で30秒間角膜の中央円形領域に適用することができる。大量の等張性生理食塩水洗浄後、残留緩い角膜上皮は、この円形領域内のボーマン層まで角膜バリの奥深くまで除去されました。創傷治癒は、コバルトブルー光下でのフルオレセイン染色によって文書化された。C57BL/6マウスをマウス角膜上皮の外傷モデルに用いた。マウス中央角膜は、直径2 mmのスキンパンチを使用してマーキングされ、実体顕微鏡下で0.5 mmのバリを備えた角膜さびリングリムーバーによってデブリードされました。これらのモデルは、角膜上皮再生を促進する可能性のある点眼薬または幹細胞などの混合剤の治療効果を検証するために前向きに使用できます。角膜混濁、末梢新生血管、結膜鬱血を実体顕微鏡やイメージングソフトで観察することで、これらの動物モデルにおける治療効果をモニタリングすることができます。
Introduction
ヒトの角膜は5つの主要な層からなり、眼内組織を保護するための視力と構造的完全性を維持するための眼屈折において極めて重要な役割を果たします1。角膜の最外層は角膜上皮であり、基底細胞から順次分化し、眼表面から脱落するために上方に移動する5〜6層の細胞から構成されている1。ヒトおよびニュージーランドウサギの角膜と比較して、マウス角膜は同様の角膜構造を有するが、上皮および間質の厚さが減少したために中央部よりも周囲が薄い2。眼の光学系におけるその独特の位置のために、機械的損傷、細菌接種、および化学薬品などの多くの外部傷害は、上皮の完全性を容易に危険にさらし、さらに視力を脅かす上皮欠損、感染性角膜炎、角膜融解、さらには角膜穿孔につながる可能性があります。
滑沢剤、抗生物質、抗炎症剤、自動血清製品、羊膜などのさまざまな治療薬がすでに再上皮化を改善し、瘢痕化を減らすために使用されていますが、創傷治癒を可能にし、炎症を軽減し、瘢痕形成を抑制することができる他の潜在的な治療法はまだ開発されており、さまざまなプラットフォームでテストされています。糖尿病マウスにおける角膜さびリング除去剤による角膜上皮除去3、細菌接種用の滅菌25G針によるマウス角膜上皮上の線状引っかき傷4、角膜さびリング除去装置による角膜上皮のトレフィン支援除去5、角膜および辺縁の半分以上の上皮焼灼6など、角膜上皮創傷治癒のための様々な動物モデルが提案されている。、鈍いメス刃7によるトレフィン促進ウサギ角膜擦過傷、液体窒素8での瞬間凍結によるウシ角膜損傷。
角膜上皮への機械的損傷の他に、化学薬品、特に酸性およびアルカリ剤は眼の表面に対する一般的な侮辱でもあります。水酸化ナトリウム(NaOH、30〜60秒間0.1〜1 N)は、角膜化学火傷9,10,11,12,13のマウスおよびウサギモデルで一般的に使用される化学物質の1つです。100%エタノールもラット化学熱傷モデルにおいて角膜に適用され、続いて外科用ブレード14を用いて追加の機械的スクラップが続いた。健康な眼の表面の維持は、まぶた、マイボーム腺、涙系、結膜、角膜などの機能単位に依存するため、in vivo動物モデルは、ex vivo培養角膜上皮細胞または角膜組織よりもいくつかのメリットがあります。本稿では、角膜擦過傷のマウスモデルと、角膜アルカリ熱傷のウサギモデルについて実証する。
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Protocol
動物実験におけるすべての実験手順は、長宮記念病院の研究倫理委員会によって承認され、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に準拠しました。
1. マウス角膜上皮の 生体外 創傷治癒モデル
- マウスの作製
- 塩酸ケタミン(80〜100 mg / kg体重)とキシラジン(5〜10 mg / kg体重)の腹腔内送達により、C57BL / 6マウスに全身麻酔を投与します。.
- マウスの有害な刺激に対する動きの喪失と右反射の喪失を確認することにより、全身麻酔が機能していることを確認します。
- マウスを手で固定し、0.5%塩酸プロパラカイン点眼液を1滴垂らして両眼に局所麻酔をかけます(図1A)。眼の表面と蓋を5%ベタジンで3回消毒します。
- マウス角膜上皮創傷モデルの作製
注意: 実体顕微鏡で以下の手順を実行してください。角膜創傷は、眼球をよりよく操作し、現実世界の状況に近いために、ex vivoではなくin vivoで作成されました。これはターミナルプロシージャです。したがって、清潔な器具(滅菌技術ではない)のみが必要です。- 皮膚生検パンチ(直径2 mm)を使用してマウスの中央角膜に印を付け、創傷の十分に外接し、十分に測定可能な領域を確認します。
- パンチを中央の角膜にそっとインデントして、円形のマークを残します(図1B)。バリが0.5 mmのハンドヘルド角膜さびリングリムーバーを使用して、角膜上皮をボーマン層までデブライドし、ボーマン層に損傷を与えないようにします(図1C)。角膜鉗子で創傷縁の内側に残っている緩い組織を取り除きます。
- フルオレセイン染色で創面切除領域を確認します(図1D)。フルオレセイン染色を行うには、フルオレセイン紙に生理食塩水を滴下してフルオレセインを溶解し、次にフルオレセイン含有滴をマウス上皮欠損部に置き、コバルトブルー光下で可視化します。
- マウス角膜擦過傷創傷モデルの生体外培養。
- マウスの眼球を収穫するには、次の手順に従います。
- 誘導チャンバー内で5%イソフルランで麻酔を誘発した後、頸部脱臼によってマウスを屠殺する。マウスの有害な刺激に対する動きの喪失と右反射の喪失を確認することにより、麻酔が機能していることを確認します。
- 上眼窩縁と下眼窩縁を鉗子の先端でそっと押して、眼球を押し出します。閉じた角膜はさみの先端を下眼窩壁に沿って球後腔に導入し、眼球を貫通しないようにします。
- 0.3 mmの角膜鉗子で眼球をしっかりと保持し、角膜ハサミで視神経と眼窩周囲軟部組織を切り取り、眼球を隔離します。
- マウス眼球の 生体外 培養については、以下のように進める。
- ウェル内に溶かしたワックスを入れた48ウェルプレートを用意し、固化するのを待ちます。結膜鉗子の先端で、眼球を収容するための固化したワックスの表面に丸い穴を開けます。
- 採取した眼球を、ワックスで覆われた底部と側壁を備えた48ウェルプレート(図1E)に直接置き、安定化を確立します(図1F)。
- 研究の目的に応じて、抗生物質の有無にかかわらず、5%CO2 の加湿雰囲気中で、1%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で眼球を培養します。
注:このモデルが角膜上皮創傷治癒の研究に使用される場合、感染を防ぐために抗生物質が必要になります。ただし、このモデルを使用して抗生物質または混合薬の有効性を評価する場合、予防的抗生物質は必要ありません。 - 眼球を浮かせることなく、眼の表面に培養液に浸します。
- フルオレセイン染色(ステップ1.2.3)とコバルトブルー光下でデジタルカメラで写真を収集することにより、創傷治癒の過程を文書化します。
注:機械的角膜損傷のマウスモデルを用いた前向き実験では、角膜剥離を受け、治療薬の有効性についてさらに試験されたものは実験群と見なされ、さらなる治療なしで角膜剥離を受けたものは陰性対照群とみなされます。
2. 角膜アルカリ障害の in vivo ウサギモデル
注:このモデルでは、アルカリ熱傷が誘発され、続いて角膜上皮の機械的創面切除が行われ、その後の定量化のために明確に定義された均一な創傷領域が生成されます。使用前にすべての器具を滅菌してください。
- 全身性鎮痛薬および局所点眼薬の筋肉内注射を含む術前鎮痛によるウサギの調製。
- 後肢にキシラジン(5〜10 mg / kg体重)と混合した塩酸ケタミン(体重35〜44 mg / kg)の筋肉内注射により、ニュージーランドの白ウサギに全身麻酔を投与します。.
- ウサギを配置してタオルで覆った後、実体顕微鏡下で0.5%塩酸プロパラカイン点眼液(図2A)を滴下して右眼に局所麻酔をかけます。眼の表面と蓋を5%ベタジンで3回消毒します。
- 角膜にアルカリ熱傷を誘発する
- 直径8 mmの円形ろ紙(8 mmパンチを使用してカット)をペトリ皿に入れます。スポイトを使用して、0.5 N水酸化ナトリウム(NaOH)をペトリ皿に加え、ろ紙を浸します。ウサギの角膜に置く前に、ろ紙から余分なNaOH溶液を排出します。
注意: 0.5 N NaOHは、人間の組織に重度の侵食性損傷を引き起こす可能性があります。取り扱うときは手袋を着用してください。皮膚や目がNaOH液滴に接触した場合は、さらなる損傷を減らすために、大量の生理食塩水と医療援助による灌漑が必要です。 - 蓋検鏡でまぶたを開き、ウサギの硝化膜がろ紙の挿入を妨げていないことを確認した後(図2B)、0.5N NaOHに浸した円形のろ紙を角膜中央に30秒間置き、鉗子で取り除きます(図2C)。
- ろ紙をはがした後、眼の表面を10mLの生理食塩水ですすぎ、アルカリ物質を洗い流します。
- 直径8 mmの円形ろ紙(8 mmパンチを使用してカット)をペトリ皿に入れます。スポイトを使用して、0.5 N水酸化ナトリウム(NaOH)をペトリ皿に加え、ろ紙を浸します。ウサギの角膜に置く前に、ろ紙から余分なNaOH溶液を排出します。
- 角膜上皮欠損の完了
- 0.5 mmのバリを備えた角膜サビリングリムーバーを使用して、不透明領域内の角膜上皮をボーマン膜までデブライドします(図2D)。
- コバルトブルー光下でフルオレセイン染色で創面切除領域を確認し、角膜鉗子を使用して残留角膜上皮を除去します(図2E)。
- 足根骨で創傷状態を確保
- 硝子化膜が眼表面と鼻側の角膜上皮欠損を滑らかに覆っていることを確認します。窒化膜が折りたたまれたり歪んだりして、創傷治癒や実験のプロセスを妨げないようにしてください。
- 6-0縫合糸を使用して局所剤の有無にかかわらず一時的な足根治療を行い、眼の表面を保護し、ウサギがそれを引っ掻くのを防ぎます(図2F)。ウサギが縫合糸を壊さないように、足根骨の縫合糸が上下のまぶたの縁から3〜4 mmにあり、4〜5本のネクタイと長い結び目があることを確認してください。
注:実験が抗生物質研究に関与していない場合は、抗生物質を含む局所薬剤を検討することができます。 - このウサギモデルでは、アルカリ熱傷および角膜上皮の除去を受けたものを対照群とみなした。
注:前向き実験では、アルカリ熱傷角膜損傷を受け、さらに治療薬で治療されたウサギは実験群と見なされます。アルカリ熱傷治療のみを受け、それ以上の治療を受けていないウサギは、陰性対照群とみなされる。
- 術後鎮痛と疼痛管理
- 動物の痛みと苦痛を監視することにより、手順後7日間の生理学的状態とUSDAの痛みのレベルを評価します。評価の結果に応じて、トブラマイシン軟膏と1滴の0.5%塩酸プロパラカイン点眼液の使用を検討してください。ブプレノルフィンHCl(0.03 mg / kg)を6〜8時間ごとに3日間投与します。.
注:欠陥領域の毎日の測定と手術後の観察のために、手順はUSDAカテゴリーDに属します。
- 動物の痛みと苦痛を監視することにより、手順後7日間の生理学的状態とUSDAの痛みのレベルを評価します。評価の結果に応じて、トブラマイシン軟膏と1滴の0.5%塩酸プロパラカイン点眼液の使用を検討してください。ブプレノルフィンHCl(0.03 mg / kg)を6〜8時間ごとに3日間投与します。.
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Representative Results
マウス角膜上皮の生体外創傷治癒モデル:
ハンドヘルド角膜さびリングリムーバーによるマウス角膜上皮のin vivoデブリードマン後、フルオレセイン染色陽性の軽度の角膜中央領域が中央2 mm領域に見られます(図3A-B)。マウス眼球を採取した後、大きく回転することなくワックスコート48穴培養プレート上に容易に固定した。プロトコルに従って、マウス眼球のex vivo培養は、実体顕微鏡下で48ウェル培養プレート内で毎日検査および文書化できます(図3C)。マウス角膜上皮をデブライディングした翌日、コバルトブルー光下で得られたデジタル写真では、直径2 mmの円形のフルオレセイン染色された上皮欠損が1つ明らかになります(図3D)。初期の不規則に染色された創傷縁または陰性のフルオレセイン染色は、角膜上皮の不完全または失敗した除去を意味する。創傷治癒の通常のプロセスでは、角膜上皮欠損は2〜3日でフルオレセイン染色面積が減少して治癒します。
角膜アルカリ損傷のin vivoウサギモデル:
手技の前に、無傷のウサギ角膜上皮をフルオレセイン染色で染色することはできません。ウサギの角膜上皮にアルカリ損傷を引き起こした後、中央の角膜上のコバルトブルー光の有無にかかわらず、正のフルオレセイン染色を明確かつ完全な円形マージンで観察できます(図4A-Bおよび図5B)。未充填領域を有する不完全な染色は、残存角膜上皮組織または染色の失敗を表す。定期的なフォローアップ中に、角膜上皮創傷は、辺縁部からのパンヌスの内方成長とともに再上皮化し、続いて染色面積が減少した(図5C)。上皮欠損は3〜4週間以内に治癒します。角膜潰瘍、デレン、大きな上皮欠損、または大量の白っぽいまたは粘液分泌物が突然発生する場合は、不安定な足根、露出した縫合糸、位置の誤ったニチタイト膜、または眼瞼結膜内の異物を考慮する必要があります。.
図1:角膜の機械的損傷のマウスモデルを設定する手順 。 (A)局所麻酔は、手順の前に適用されます。(B)2mmの皮膚生検トレフィンで角膜中央部に穏やかなくぼみを行います。(C)角膜錆リング除去剤は、中心角膜上皮を除去するために使用される。(D)上皮欠損部をフルオレセインで染色して欠損領域を確認し、 Bでマークした領域と比較する。(E,F)マウス眼球を採取し、予めワックスで覆われた48ウェルプレートに移す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アルカリ性角膜損傷のウサギモデルを構築する手順 。 (A)局所麻酔を眼の表面に塗布する。(B)蓋鏡は、窒化膜を折りたたんだり絞ったりすることなく、上まぶたと下まぶたを開くために使用されます。(C)NaOHを染み込ませたトレフィン濾紙(直径8mm)を角膜中央に配置する。(D)角膜錆リング除去剤は、8mmの中心上皮をボーマン層までデブライドするために使用されます。(E)上皮欠損部をフルオレセインで染色する。(F)処置後、創傷を引っかき傷から保護するために歯根治療が行われる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:角膜の機械的損傷のマウスモデルにおける陽性および陰性の結果 。 (A)処置前に染色することなく無傷のマウス角膜上皮。(B)コバルトブルー光のないマウス角膜創傷上のフルオレセインによる in vivo 陽性染色。(C)培養液を添加する前にフルオレセイン染色剤を添加しないマウス眼球の 生体外 培養。(D) ex vivo マウスモデルにおける角膜上皮欠損に対するフルオレセインによる陽性染色。2 mmの上皮欠損は通常2〜3日以内に治癒します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:角膜アルカリ障害のウサギモデルにおけるフルオレセイン染色の結果 。 (A)コバルトブルー光下での陽性フルオレセイン染色。写真は機械的角膜損傷の直後に撮影されました。(B)フルオレセイン色素による陽性染色は、コバルトブルー光なしでウサギの眼表面でも観察できました。(C)治癒した眼表面の陰性染色。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:角膜アルカリ損傷のウサギモデルにおける創傷治癒の経時変化と再上皮化の出現 。 (A)マウスモデルとウサギモデルでの再上皮化には、それぞれ2〜3日と3〜4週間かかります。(B)ウサギモデルにおけるアルカリ熱傷後にフルオレセインで染色された8 mmの上皮欠損。光源としてコバルトブルー光を用いた。写真はアルカリ損傷の直後に撮影されました。(C)アルカリ損傷後3週間でウサギ眼の上皮欠損が治癒し、染色面積の減少が認められた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
角膜損傷のマウスおよびウサギモデルは、創傷治癒のモニタリング、新しい治療法の試験、創傷治癒および治療経路の根底にあるメカニズムの研究のための有用なex vivoおよびin vivoプラットフォームを提供します。研究の目的に応じて、短期または長期の実験にさまざまな動物モデルを使用できます。例えば、in vivoでマウス角膜に上皮欠損を作成した後、閉じ込められた上皮欠損を使用して、少量の液体治療薬をモニタリングすることができます。同時に、まぶた、涙系、結膜などの周囲の機能単位は、細胞培養またはex vivo培養条件とは対照的に、invivo条件下で評価することができる。マウスの動きが実験条件に影響を与える可能性がある場合、この状況では足根骨炎が依然として必要になる可能性があります。単純な線状の引っかき傷4よりも円形の傷を観察して定量化する方が簡単です。ただし、角膜に境界線を作成するためのスキンパンチは、ボーマンの膜を切断せずに慎重に行う必要があります。機械的角膜創傷は、ウサギモデル15の8mm角膜トレフィンとメスの刃によっても作成でき、角膜上皮ではなく前間質までのより深い創傷が提示されました。
角膜の錆輪の除去は、言及する価値のあるもう一つの重要な問題です。マウスの眼球は小さいため、角膜上皮の過剰除去または除去不足が発生し、研究の精度に影響を与える可能性があります。皮膚生検パンチとフルオレセインガイド下手術で角膜をマーキングすると、これらの間違いを減らすのに役立ちます。動物モデルでは角膜上皮を除去するためのツールとして焼灼およびメスの刃が提案されているが6,7、眼表面の損傷は、同じ方法で容易に制御および再現できない可能性があり、さらなる実験で一貫性のない結果につながる可能性があります。
in vivo条件と比較して、48ウェルプレートのex vivo培養マウス眼球は、プレート上の作業スペースが大きいため操作が容易であり、薬物溶出コンタクトレンズや細胞療法など、さまざまな培地中の複雑な薬剤を同時に試験するために使用できます。マウスの眼球を採取して48ウェルプレートに移す場合、眼の表面への追加の人工的な損傷や眼球の破裂を避けるために、角膜を綿密に保護することが重要です。以下の研究では、眼球を角膜を上に向けてパラフィンコーティングウェル内に固定し、培養培地に浸すことができます。浮遊または回転する眼球または脱水角膜は結果を妨げます。このex vivoマウスモデルは眼の表面上の変化に焦点を当てているため、涙腺やまぶたなどの他の機能単位については、このex vivoモデルでは議論されていません。Ex vivoマウスモデルはまた、in vivo動物モデルと比較して、マウスの繁殖と収容のコストを削減し、実験スペースを節約します。このモデルは、潜在的な組織感染や臓器不全が長期的に発症する可能性があるため、長期的な研究ではなく、短期的な研究に適しています。
マウスモデルはコストが低く、実験室でスケールアップできますが、表面積が小さいと、脂質沈着や実体顕微鏡による血管新生などの角膜の詳細な変化の観察が制限される可能性があります。代わりに、眼球の直径が大きい角膜損傷のウサギモデルは、一般にこの欠点を補うことができます。NaOHの濃度と浸漬時間を調整することにより、角膜アルカリ熱傷の重症度を異なる程度にすることができます。ラット化学火傷モデルでは、1 N NaOHを使用して角膜を3 mmのろ紙で40秒間、4 mmのろ紙で20秒間浸し、観察のための同様の、しかしより小さな領域を提供しました16,17。アルカリ燃焼のサイズと濃度を一定に保つために、紙の余白に繊維や塗りつぶされていない角を避けるために、8mmのろ紙の準備にまったく新しい鋭いパンチをお勧めします。創傷の外側の継続的な損傷を減らすには、眼の表面と結膜嚢から化学薬品を洗い流すのに十分な灌漑が必要です。ウサギの硝化膜は、アルカリ剤によって腐食すると実験手順を妨げ、痛みを引き起こす可能性があるため、眼の表面上の追加の炎症を軽減するために、慎重に保護し、手順後に生理学的位置に戻す必要があります。アルカリ熱傷の手順の後、ウサギの角膜創傷は、実験の質と一貫性を確保するために、足根またはコンタクトレンズなどの他の材料で保護することができます。
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Disclosures
著者は競合する金銭的利益を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、台湾原子力評議会(助成金番号A-IE-01-03-02-02)、科学技術省(助成金番号NMRPG3E6202-3)、および長宮医学研究プロジェクト(助成金番号CMRPG3H1281)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
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