Summary
Her utvikles dyremodeller basert på mus og kanin for mekanisk og kjemisk skade på hornhinneepitel for å skjerme nye terapier og den underliggende mekanismen.
Abstract
Hornhinneskade på den okulære overflaten, inkludert kjemisk forbrenning og traumer, kan forårsake alvorlig arrdannelse, symblepharon, hornhinde limbale stamceller mangel, og resultere i en stor, vedvarende hornhinneepiteldefekt. Epiteldefekt med påfølgende hornhinnefortetning og perifer neovaskularisering gir irreversibel synssvekkelse og hindrer fremtidig behandling, spesielt keratoplastikk. Siden dyremodellen kan brukes som en effektiv legemiddelutviklingsplattform, utvikles modeller av hornhinneskade på musen og alkaliforbrenning til kaninhornhinneepitel her. New Zealand hvit kanin brukes i alkalibrenningsmodellen. Forskjellige konsentrasjoner av natriumhydroksid kan påføres det sentrale sirkulære området av hornhinnen i 30 sekunder under intramuskulær og aktuell anestesi. Etter rikelig isoton normal saltvannsirrigasjon ble gjenværende løst hornhinneepitel fjernet med hornhinneborr dypt ned til Bowmans lag innenfor dette sirkulære området. Sårheling ble dokumentert ved fluoresceinfarging under koboltblått lys. C57BL/6-mus ble brukt i den traumatiske modellen av murine hornhinneepitel. Murine sentralhornhinnen ble merket med et hudslag, 2 mm i diameter, og deretter debridert av en hornhinnerustringfjerner med en 0,5 mm burr under et stereomikroskop. Disse modellene kan prospektivt brukes til å validere den terapeutiske effekten av øyedråper eller blandede midler som stamceller, som potensielt letter hornhinneepitelregenerering. Ved å observere hornhindeopasitet, perifer neovaskularisering og konjunktival overbelastning med stereomikroskop og bildebehandlingsprogramvare, kan terapeutiske effekter i disse dyremodellene overvåkes.
Introduction
Den menneskelige hornhinnen består av fem hovedlag og spiller en sentral rolle i okulær brytning for å opprettholde synsstyrke og strukturell integritet for å beskytte intraokulært vev1. Den ytre delen av hornhinnen er hornhinneepitelet, sammensatt av fem til seks lag med celler som sekvensielt skiller seg fra basalcellene og beveger seg oppover for å kaste fra den okulære overflaten1. Sammenlignet med hornhinnen hos mennesker og New Zealand kaniner, har mushornhinnen en lignende hornhinnestruktur, men tynnere periferi enn den sentrale delen på grunn av redusert tykkelse i epitelet og stroma2. På grunn av sin unike posisjon i det okulære optiske systemet, kan mange eksterne fornærmelser som mekanisk skade, bakteriell inokulasjon og kjemiske midler lett true epitelintegritet og videre føre til synstruende epiteldefekt, infeksiøs keratitt, hornhinnesmelting og til og med hornhindeperforering.
Selv om ulike terapeutiske midler, som smøremidler, antibiotika, antiinflammatoriske midler, autoserumprodukter og fostermembran, allerede har blitt brukt til å forbedre reepitelialisering og redusere arrdannelse, utvikles og testes fortsatt andre potensielle behandlingsmodaliteter som kan muliggjøre sårheling, redusere betennelse og undertrykke arrdannelse på forskjellige plattformer. Ulike dyremodeller for sårheling av hornhinneepitel har blitt foreslått, inkludert fjerning av hornhinneepitel med en hornhinnerustringfjerner i diabetisk mus3, lineære riper over hornhinneepitel fra mus med en steril 25 G nål for bakteriell inokulering4, trefinassistert fjerning av hornhinneepitelet ved hjelp av hornhinnen rustringfjerner5, epitelkautery over halvparten av hornhinnen og limbus6 , trefin-tilrettelagt kanin hornhinnen slitasje av en sløv skalpell blad7, og storfe hornhinnen skade ved flash frysing i flytende nitrogen8.
Annet enn mekanisk skade på hornhinnenepitel, er kjemiske midler også vanlige fornærmelser mot den okulære overflaten, spesielt sure og alkaliske midler. Natriumhydroksid (NaOH, 0,1-1 N for 30-60 s) er en av de vanligste kjemikaliene i murine og kaninmodeller av hornhinnekjemisk brenning 9,10,11,12,13. 100% etanol hadde også blitt påført hornhinnen i rotte kjemisk brenne modell, etterfulgt av ytterligere mekanisk skraping ved hjelp av et kirurgisk blad14. Siden vedlikehold av en sunn okulær overflate er avhengig av funksjonelle enheter, inkludert øyelokkene, Meibomian kjertler, lacrimal system, konjunktivene og hornhinnen, in vivo dyremodeller har noen fordeler over ex vivo dyrkede hornhinneepitelceller eller hornhinnen vev. I denne artikkelen er musemodellen av hornhinnen slitasje sår, og kaninmodellen av hornhinnen alkalibrenning demonstrert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer i dyreforsøk ble godkjent av forskningsetisk komité ved Chang Gung Memorial Hospital og fulgte ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning.
1. Ex vivo sårhelingsmodell av musehornhinneepitelet
- Forberedelse av musene
- Administrer generell anestesi til C57BL / 6 mus ved intraperitoneal tilførsel av ketaminhydroklorid (80-100 mg / kg kroppsvekt) og xylazin (5-10 mg / kg kroppsvekt).
- Sørg for at generell anestesi virker ved å bekrefte tap av bevegelse til en skadelig stimulus og tap av rettende refleks hos mus.
- Fest musene hodet for hånd og påfør aktuell anestesi på begge øynene med en dråpe 0,5% proparakainhydroklorid oftalmisk løsning (figur 1A). Desinfiser den okulære overflaten og lokkene tre ganger med 5% betadin.
- Opprettelse av murine hornhinneepitelial sårmodell
MERK: Utfør prosedyrene nedenfor under et stereomikroskop. Hornhinnen såret ble opprettet in vivo, ikke ex vivo, for å manipulere øyebollet bedre og nær den virkelige situasjonen. Dette er en terminal prosedyre; Derfor er det bare rene instrumenter (ikke steril teknikk) som kreves.- Merk den sentrale hornhinnen på musen ved hjelp av en hudbiopsistans (2 mm i diameter) for å bekrefte et godt omskrevet og godt målbart område av såret.
- Rykk forsiktig inn hullet over den sentrale hornhinnen for å etterlate et sirkulært merke (figur 1B). Ved hjelp av en håndholdt hornhinne rustringfjerner med en 0,5 mm burr, debride hornhinneepitelet ned til Bowmans lag for ikke å skade sistnevnte (figur 1C). Fjern det resterende, løse vevet indre til sårmarginen med hornhinnetang.
- Bekreft debridementområdet med fluoresceinfarging (figur 1D). For å utføre fluoresceinfarging, legg en dråpe vanlig saltvann på et fluoresceinpapir for å oppløse fluorescein, og legg deretter den fluoresceinholdige dråpen på murine epiteldefekt for å visualisere den under koboltblått lys.
- Ex vivo kultur av murine hornhinnen slitasje sår modell.
- For høsting av murine øyebollene, fortsett som følger.
- Ofre musene ved cervikal dislokasjon etter å ha indusert anestesi med 5% isofluran i et induksjonskammer. Sørg for at anestesi fungerer ved å bekrefte tap av bevegelse til en skadelig stimulans og tap av rettende refleks hos mus.
- Trykk forsiktig med tuppen av tang på de øvre og nedre orbitalfelgene for å skyve øyeeplet ut. Innfør spissen av den lukkede hornhinnen saks inn i retrobulbarrommet langs den nedre orbitalveggen, og sørg for ikke å trenge inn i øyebollet.
- Hold øyebollet stødig med 0, 3 mm hornhinnetang, og kutt deretter av optisk nerve og periorbitalt bløtvev med hornhindesaks for å isolere øyebollet.
- For ex vivo dyrking av murine øyeepler, fortsett som følger.
- Forbered en 48-brønnsplate med smeltet voks inne i brønnen og vent på størkning. Med spissen av konjunktiva tang, opprett et rundt hull på overflaten av størknet voks for å imøtekomme øyebollene.
- Plasser de høstede øyeeplene direkte på 48-brønnsplaten (figur 1E) med voksbelagte bunner og sidevegger for å etablere stabilisering (figur 1F).
- Dyrk øyeeplene med Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) som inneholder 1% føtal bovint serum (FBS) i en fuktet atmosfære på 5% CO2 ved 37 ° C med eller uten antibiotika, avhengig av formålet med studien.
MERK: Hvis modellen brukes til å studere hornhinneepitelial sårheling, vil antibiotika være nødvendig for å forhindre infeksjon. Imidlertid, hvis denne modellen brukes til å evaluere effekten av antibiotika eller blandede midler, vil profylaktiske antibiotika ikke være nødvendig. - Fordyp den okulære overflaten med kulturmediet uten å få øyebollet til å flyte.
- Dokumenter forløpet av sårheling ved fluoresceinfarging (trinn 1.2.3) og innsamling av fotografier med digitalkamera under koboltblått lys.
MERK: I prospektive eksperimenter med musmodeller av mekanisk hornhinneskade, blir de som mottar hornhinneslitasje og testet videre for effekten av terapeutiske midler, sett på som en eksperimentell gruppe, og de som mottar hornhinneslitasje uten ytterligere behandling, betraktes som en negativ kontrollgruppe.
2. In vivo kaninmodell av korneal alkaliskade
MERK: I denne modellen induseres en alkaliforbrenningsskade etterfulgt av mekanisk debridement av hornhinneepitelet for å generere et veldefinert og jevnt sårområde for etterfølgende kvantifisering. Steriliser alle instrumenter før bruk.
- Fremstilling av kaninen med preoperativ analgesi, inkludert intramuskulær injeksjon av systemiske analgetika og aktuelle øyedråper.
- Gi generell anestesi til New Zealand hvite kaniner ved intramuskulær injeksjon av ketaminhydroklorid (35-44 mg / kg kroppsvekt), blandet med xylazin (5-10 mg / kg kroppsvekt) på bakbenet.
- Etter å ha plassert kaninen og dekket den med et håndkle, bruk aktuell anestesi over høyre øye med en dråpe på 0,5% proparakainhydroklorid oftalmisk løsning (figur 2A) under et stereomikroskop. Desinfiser den okulære overflaten og lokkene tre ganger med 5% betadin.
- Indusere alkaliforbrenningsskade over hornhinnen
- Legg sirkulære filterpapir med en diameter på 8 mm (kuttet med 8 mm slag) i en petriskål. Bruk en dråpeteller, tilsett 0,5 N natriumhydroksid (NaOH) i petriskålen for å suge filterpapirene. Tøm overflødig NaOH-løsning fra filterpapirene før du legger dem på kaninhornhinnen.
FORSIKTIG: 0,5 N NaOH kan forårsake alvorlig erosiv skade på menneskelig vev. Bruk hansker ved håndtering. Hvis huden eller øynene kommer i kontakt med NaOH-dråper, er det nødvendig med irrigasjon med store mengder vanlig saltvann og medisinsk hjelp for å redusere ytterligere skade. - Etter å ha åpnet øyelokkene med et lokkspekulum og bekreftet at kaninens niktiterende membran ikke forstyrrer innsetting av filterpapir (figur 2B), plasser det sirkulære filterpapiret dynket i 0,5 N NaOH på den sentrale hornhinnen i 30 s, og fjern det deretter med tang (figur 2C).
- Etter å ha fjernet filterpapiret, skyll den okulære overflaten med 10 ml vanlig saltvann for å vaske ut alkalimateriale.
- Legg sirkulære filterpapir med en diameter på 8 mm (kuttet med 8 mm slag) i en petriskål. Bruk en dråpeteller, tilsett 0,5 N natriumhydroksid (NaOH) i petriskålen for å suge filterpapirene. Tøm overflødig NaOH-løsning fra filterpapirene før du legger dem på kaninhornhinnen.
- Fullføring av hornhinneepiteldefekt
- Debrid hornhinneepitelet i det opacifiserte området ned til Bowmans membran ved hjelp av en hornhinne rustringfjerner med en 0,5 mm burr (figur 2D).
- Bekreft debridementområdet med fluoresceinfarging under koboltblått lys og fjern gjenværende hornhinneepitel ved hjelp av hornhinnetang (figur 2E).
- Sikker sårtilstand med tarsorrafi
- Bekreft at niktiteringsmembranen jevnt dekker den okulære overflaten og hornhinneepiteldefekten på nesesiden. Sørg for at niktiteringsmembranen ikke brettes eller forvrenges for mye for å forstyrre prosessen med sårheling og eksperimentet.
- Utfør en midlertidig tarsorrhaphy med eller uten aktuelle midler ved hjelp av en 6-0 sutur for å beskytte den okulære overflaten og forhindre kaninen i å klø den (figur 2F). Sørg for at suturen for tarsorrhaphy er på 3-4 mm fra øvre og nedre lokkmarginer med 4-5 bånd og lengre knuter for å forhindre at kaninen bryter suturene.
MERK: Hvis eksperimentet ikke er involvert i en antibiotikastudie, kan aktuelle midler med antibiotika vurderes. - I denne kaninmodellen ble de som fikk alkaliforbrenning og fjerning av hornhinneepitel ansett som kontrollgruppen.
MERK: I prospektive eksperimenter blir kaninene som får alkaliforbrenning hornhinneskade og videre behandlet med terapeutiske midler, sett på som en eksperimentell gruppe. Kaninene som kun får alkaliforbrenningsbehandling, uten videre behandling, betraktes som en negativ kontrollgruppe.
- Postoperativ analgesi og smertekontroll
- Vurder den fysiologiske tilstanden og USDA smertenivåer i 7 dager etter inngrepet, ved å overvåke smerte og nød hos dyrene. Vurder bruk av tobramycin salve og en dråpe 0,5% proparakainhydroklorid oftalmisk løsning i henhold til resultatet av vurderingen. Administrer buprenorfin HCl (0,03 mg/kg) hver 6-8 time i 3 dager.
MERK: For daglig måling av defektområde og observasjon etter operasjon, tilhører prosedyren USDA kategori D.
- Vurder den fysiologiske tilstanden og USDA smertenivåer i 7 dager etter inngrepet, ved å overvåke smerte og nød hos dyrene. Vurder bruk av tobramycin salve og en dråpe 0,5% proparakainhydroklorid oftalmisk løsning i henhold til resultatet av vurderingen. Administrer buprenorfin HCl (0,03 mg/kg) hver 6-8 time i 3 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo sårhelingsmodell av hornhinneepitelet på mus:
Etter in vivo debridement av hornhinneepitel fra mus med håndholdt hornhinnerustringfjerner, kan et mildt deprimert sentralt hornhinneområde med positiv fluoresceinflekk finnes i det sentrale 2 mm-området (figur 3A-B). Etter høsting av musens øyeboll ble den lett festet på en voksbelagt 48-brønns kulturplate uten betydelig rotasjon. Etter protokollen kan ex vivo-dyrkning av murine eyeballs undersøkes og dokumenteres daglig i en 48-brønns kulturplate under et stereomikroskop (figur 3C). En dag etter debriding av murine hornhinneepitelet, kan en sirkulær fluoresceinfarget epiteldefekt målt 2 mm i diameter avsløres i digitale fotografier oppnådd under koboltblått lys (figur 3D). Innledende uregelmessig farget sårmargin eller negativ fluoresceinfarging betyr ufullstendig eller mislykket fjerning av hornhinneepitelet. I den normale prosessen med sårheling vil hornhinneepiteldefekten helbrede med redusert fluoresceinfarget område om 2-3 dager.
In vivo kaninmodell av korneal alkaliskade:
Før noen prosedyre kan intakt kaninhornhinneepitel ikke farges med fluoresceinfarging. Etter å ha skapt alkaliskade på hornhinneepitelet hos kaninen, kan positiv fluoresceinfarging observeres med eller uten koboltblått lys over den sentrale hornhinnen med en klar og fullstendig sirkulær margin (figur 4A-B og figur 5B). Ufullstendig flekk med ufylt område representerer gjenværende hornhinneepitelvev eller mislykket farging. Under regelmessig oppfølging epiteliserer hornhinneepitelet på nytt med innvekst av pannus fra limbus, etterfulgt av redusert farget område (figur 5C). Epiteldefekten leges innen 3-4 uker. Hvis sår på hornhinnen, dellen, stor epiteldefekt eller massiv hvitaktig eller slimete utflod utvikler seg brått, bør usikker tarsorrhaphy, eksponerte suturer, en feilplassert niktiterende membran eller et fremmedlegeme i palpebral conjunctiva vurderes.
Figur 1: Prosedyrer for å sette opp en musemodell av hornhinnen mekanisk skade . (A) Aktuell anestesi påføres før prosedyren. (B) Lett fordypning gjøres over den sentrale hornhinnen med en 2 mm hudbiopsi trefin. (C) Korneal rustringfjerner brukes til å fjerne det sentrale hornhinneepitelet. (D) En epiteldefekt er farget med fluorescein for å bekrefte defektområdet og sammenligne det med regionen merket i B. (E,F) Musens øyeboll høstes og overføres til en 48-brønnsplate dekket med voks på forhånd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinn for å bygge opp en kaninmodell av alkalisk hornhinneskade . (A) Aktuell anestesi påføres den okulære overflaten. (B) Et lokkspekulum brukes til å åpne øvre og nedre øyelokk, uten å brette eller klemme niktiteringsmembranen. (C) Et NaOH-gjennomvåt trephined filterpapir (8 mm i diameter) plasseres på den sentrale hornhinnen. (D) Fjerning av rustring i hornhinnen brukes til å debridere det 8 mm sentrale epitelet ned til Bowmans lag. (E) Epiteldefekten er farget med fluorescein. (F) Etter prosedyren utføres tarsorrhaphy for å beskytte såret mot riper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Positive og negative resultater i en musemodell av hornhinnemekanisk skade . (A) Intakt hornhinneepitel uten farging før prosedyren. (B) In vivo positiv farging med fluorescein på murine hornhinnesåret uten koboltblått lys. (C) Ex vivo kultur av musens øyeeple uten å legge til fluoresceinflekk før tilsetning av kulturmedium. (D) Positiv farging med fluorescein på hornhinneepiteldefekt i ex vivo musemodell. Epiteldefekten på 2 mm leges vanligvis innen 2-3 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Resultater av fluoresceinfarging i en kaninmodell av korneal alkaliskade. (A) Positiv fluoresceinfarging under koboltblått lys. Bildet er tatt like etter den mekaniske hornhinneskaden. (B) Positiv farging med fluoresceinfargestoff kan også observeres på kaninens okulære overflate uten koboltblått lys. (C) Negativ farging på den helbredede okulære overflaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Tidsforløp for sårheling og utseende av reepitelisering i en kaninmodell av hornhinnealkaliskade. (A) Reepitelialisering i muse- og kaninmodeller tar henholdsvis 2-3 dager og 3-4 uker. (B) En 8 mm epiteldefekt farget med fluorescein etter alkaliforbrenning i en kaninmodell. Koboltblått lys ble brukt som lyskilde. Bildet er tatt like etter alkaliskaden. (C) En helbredet epiteldefekt i kaninøyet 3 uker etter alkaliskade, som viser redusert flekkområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muse- og kaninmodeller av hornhinneskade gir en nyttig ex vivo og in vivo-plattform for overvåking av sårheling, testing av nye terapier og studier av underliggende mekanismer for sårheling og behandlingsveier. Ulike dyremodeller kan brukes til et kortsiktig eller langsiktig eksperiment, avhengig av formålet med forskningen. For eksempel, etter å ha opprettet en epiteldefekt på musehornhinnen in vivo, kan en begrenset epiteldefekt brukes til å overvåke flytende terapeutiske midler i et lite volum. Samtidig kan omkringliggende funksjonelle enheter, som øyelokk, lacrimal system og konjunktiv, evalueres under in vivo-forhold, i motsetning til cellekultur eller ex vivo kulturforhold. Tarsorrhaphy kan fortsatt være nødvendig i denne situasjonen hvis musbevegelser kan påvirke eksperimentell tilstand. Det er lettere å observere og kvantifisere et sirkulært sår enn et enkelt lineært ripesår4. Imidlertid bør hudstans for å skape en avgrensningslinje på hornhinnen gjøres forsiktig uten å kutte gjennom Bowmans membran, som ellers vil etterlate en dyp hornhinneskade eller et gjennomtrengende sår. Det mekaniske hornhinnesåret kunne også lages av en 8 mm hornhinne-trefin og et skalpellblad i en kaninmodell15, hvor et dypere sår ned til fremre stroma i stedet for hornhinneepitelet ble presentert.
Fjerning av hornhinnerustring er et annet sentralt problem som er verdt å nevne. Siden musens øyeboll er liten, kan overfjerning eller underfjerning av hornhinnenepitel forekomme og dermed påvirke nøyaktigheten av forskningen. Merking av hornhinnen med hudbiopsistans og fluoresceinstyrt drift vil bidra til å redusere disse feilene. Selv om cautery og skalpellblad har blitt foreslått som verktøy for å fjerne hornhinneepitel i dyremodeller6,7, kan skaden over den okulære overflaten ikke lett kontrolleres og reproduseres på samme måte, noe som potensielt fører til inkonsekvente resultater i ytterligere eksperimenter.
Sammenlignet med in vivo-tilstanden er ex vivo-dyrkede museøyeboller i 48-brønnsplater lettere å manipulere på grunn av større arbeidsrom på platene og kan brukes til å teste komplekse midler i forskjellige kulturmedier samtidig, for eksempel stoffeluerende kontaktlinser og celleterapier. Når mus øyeboller blir høstet og overført til en 48-brønnplate, er det viktig å beskytte hornhinnen for å unngå ytterligere kunstig skade på den okulære overflaten og brudd på øyebollene. For den følgende studien kan øyebollet festes i den parafinbelagte brønnen med hornhinnen vendt oppover og nedsenket i et kulturmedium. Flytende eller roterende øyeboller eller dehydrert hornhinne vil hindre resultatene. Siden denne ex vivo musemodellen fokuserer på endringer over den okulære overflaten, diskuteres ikke andre funksjonelle enheter, som lacrimal kjertel og øyelokk, i denne ex vivo-modellen. Ex vivo musemodell reduserer også kostnadene ved avl og oppbevaring av mus og sparer eksperimentell plass, sammenlignet med in vivo dyremodell. Denne modellen er egnet for en kortsiktig studie, snarere enn en langsiktig en siden potensiell vevsinfeksjon og organsvikt kan utvikle seg i det lange løp.
Selv om musemodellen koster mindre og kan skaleres opp i laboratoriet, begrenser et lite overflateareal potensielt observasjonen av detaljerte endringer i hornhinnen som lipidavsetning og neovaskularisering ved stereomikroskoper. I stedet kan en kaninmodell av hornhinneskade med større diameter av øyebollet generelt kompensere for denne ulempen. Ved å justere konsentrasjonen av NaOH og bløtleggingstiden, kan forskjellige grader av alvorlighetsgraden av hornhinnen alkaliforbrenning opprettes. I kjemiske forbrenningsmodeller fra rotter ble 1 N NaOH brukt til å suge hornhinnen med 3 mm filterpapir for 40 s og 4 mm filterpapir i 20 s, noe som gir et lignende, men mindre område for observasjon16,17. For å holde alkaliforbrenningen konsistent i størrelse og konsentrasjon, foreslås en helt ny og skarp stans ved tilberedning av 8 mm filterpapir for å unngå fiber eller ufylt hjørne ved papirmargen. Tilstrekkelig vanning for å vaske ut kjemiske midler fra den okulære overflaten og konjunktivalsekken er nødvendig for å redusere kontinuerlig skade utenfor såret. Siden kaninniktiterende membran kan forstyrre eksperimentell prosedyre og indusere smerte når den korroderes av alkalimidler, må den beskyttes nøye og settes tilbake til fysiologisk posisjon etter prosedyren for å redusere ytterligere betennelse over den okulære overflaten. Etter prosedyren med alkaliforbrenning kan kaninhornhinnen sår beskyttes av tarsorrhaphy eller annet materiale som kontaktlinser for å sikre kvalitet og konsistens av eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Studien ble finansiert av Atomic Energy Council of Taiwan (Grant No. A-IE-01-03-02-02), Ministry of Science and Technology (Grant No. NMRPG3E6202-3), og Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3H1281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z.
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
