Summary
Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.
Abstract
A lesão da córnea na superfície ocular, incluindo queimadura química e trauma, pode causar cicatrizes graves, simbléfaro, deficiência de células-tronco límbicas da córnea e resultar em um grande defeito epitelial corneano persistente. O defeito epitelial com opacidade corneana e neovascularização periférica resulta em comprometimento visual irreversível e dificulta o manejo futuro, especialmente a ceratoplastia. Uma vez que o modelo animal pode ser usado como uma plataforma eficaz de desenvolvimento de fármacos, modelos de lesão corneana em camundongos e queimadura alcalina em epitélio corneano de coelho são desenvolvidos aqui. O coelho branco da Nova Zelândia é usado no modelo de queimadura alcalina. Diferentes concentrações de hidróxido de sódio podem ser aplicadas na área circular central da córnea por 30 s sob anestesia intramuscular e tópica. Após abundante irrigação salina isotônica normal, o epitélio corneano solto residual foi removido com broca corneana profundamente até a camada de Bowman dentro desta área circular. A cicatrização foi documentada pela coloração com fluoresceína sob luz azul de cobalto. Camundongos C57BL/6 foram utilizados no modelo traumático de epitélio corneano murino. A córnea central murina foi marcada com punch cutâneo de 2 mm de diâmetro e, em seguida, desbridada por removedor de anel de ferrugem corneana com broca de 0,5mm em estereomicroscópio. Esses modelos podem ser usados prospectivamente para validar o efeito terapêutico de colírios ou agentes mistos, como células-tronco, que potencialmente facilitam a regeneração epitelial corneana. Observando-se opacidade corneana, neovascularização periférica e congestão conjuntival com estereomicroscópio e software de imagem, os efeitos terapêuticos nesses modelos animais podem ser monitorados.
Introduction
A córnea humana é constituída por cinco camadas principais e desempenha um papel fundamental na refração ocular para manter a acuidade visual e a integridade estrutural para proteger os tecidos intraoculares1. A parte mais externa da córnea é o epitélio corneano, composto por cinco a seis camadas de células que se diferenciam sequencialmente das células basais e se movem para cima para se desprender da superfícieocular1. Comparada à córnea em humanos e coelhos da raça Nova Zelândia, a córnea de camundongos tem uma estrutura corneana semelhante, mas periferia mais fina do que a parte central devido a uma espessura reduzida no epitélio e no estroma2. Devido à sua posição única no sistema óptico ocular, muitos insultos externos, como lesão mecânica, inoculação bacteriana e agentes químicos, podem facilmente colocar em risco a integridade epitelial e levar a um defeito epitelial que ameace a visão, ceratite infecciosa, derretimento da córnea e até perfuração da córnea.
Embora vários agentes terapêuticos, como lubrificantes, antibióticos, anti-inflamatórios, produtos auto-sorológicos e membrana amniótica já tenham sido usados para melhorar a reepitelização e reduzir a cicatrização, outras potenciais modalidades de tratamento que podem permitir a cicatrização de feridas, reduzir a inflamação e suprimir a formação de cicatrizes ainda estão sendo desenvolvidas e testadas em diferentes plataformas. Vários modelos animais para cicatrização de feridas epiteliais corneanas têm sido propostos, incluindo remoção do epitélio corneano com removedor de anel de ferrugem corneana em camundongos diabéticos3, arranhões lineares sobre o epitélio corneano de camundongos por agulha estéril 25 G para inoculação bacteriana4, remoção assistida por trefina do epitélio corneano por removedor de anel de ferrugem corneana5, cautério epitelial sobre metade da córnea e limbo6 , abrasão da córnea de coelho facilitada pela trefina por lâmina de bisturi embotada7 e lesão da córnea bovina por congelamento instantâneo em nitrogênio líquido8.
Além da lesão mecânica do epitélio corneano, agentes químicos também são insultos comuns à superfície ocular, especialmente agentes ácidos e alcalinos. O hidróxido de sódio (NaOH, 0,1-1 N por 30-60 s) é um dos produtos químicos comumente utilizados em modelos murinos e coelhos de queimadura química de córnea 9,10,11,12,13. Etanol a 100% também foi aplicado na córnea no modelo de queimadura química de ratos, seguido de raspagem mecânica adicional com lâmina cirúrgica14. Uma vez que a manutenção de uma superfície ocular saudável depende de unidades funcionais, incluindo as pálpebras, as glândulas meibomianas, o sistema lacrimal, a conjuntiva e a córnea, os modelos animais in vivo têm alguns méritos sobre células epiteliais da córnea cultivadas ex vivo ou tecidos corneanos. Neste artigo, o modelo de ferida por abrasão corneana em camundongo e o modelo de coelho de queimadura alcalina corneana são demonstrados.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais em estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Chang Gung Memorial Hospital e aderiram à declaração ARVO para uso de animais em pesquisas oftalmológicas e da visão.
1. Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano de camundongos
- Preparação dos ratos
- Administrar anestesia geral a camundongos C57BL/6 por administração intraperitoneal de cloridrato de cetamina (80-100 mg/kg de peso corporal) e xilazina (5-10 mg/kg de peso corporal).
- Certifique-se de que a anestesia geral esteja funcionando, confirmando a perda de movimento para um estímulo nocivo e a perda do reflexo de retificação em camundongos.
- Fixar a cabeça dos camundongos com a mão e aplicar anestesia tópica em ambos os olhos com uma gota de solução oftálmica de cloridrato de proparacaína a 0,5% (Figura 1A). Desinfetar a superfície ocular e as pálpebras três vezes com betadina a 5%.
- Criação de modelo de ferida epitelial corneana murina
NOTA: Execute os procedimentos abaixo sob um estereomicroscópio. A ferida corneana foi criada in vivo, não ex vivo, para manipular melhor o globo ocular e se aproximar da situação do mundo real. Este é um procedimento terminal; portanto, apenas instrumentos limpos (não técnica estéril) são necessários.- Marque a córnea central do camundongo usando um punch de biópsia de pele (2 mm de diâmetro) para confirmar uma área bem circunscrita e bem mensurável da ferida.
- Recue suavemente o punção sobre a córnea central para deixar uma marca circular (Figura 1B). Utilizando um removedor manual de anel de ferrugem corneana com uma broca de 0,5 mm, desbridar o epitélio corneano até a camada de Bowman, garantindo que não danifique esta última (Figura 1C). Remova os tecidos residuais e soltos internos à margem da ferida com pinças corneanas.
- Confirmar a área de desbridamento com coloração de fluoresceína (Figura 1D). Para realizar a coloração de fluoresceína, coloque uma gota de soro fisiológico em um papel fluoresceína para dissolver a fluoresceína e, em seguida, coloque a gota contendo fluoresceína no defeito epitelial murino para visualizá-la sob luz azul de Cobalto.
- Cultura ex vivo do modelo de ferida por abrasão corneana murina.
- Para colher os globos oculares murinos, proceda da seguinte forma.
- Sacrificar os camundongos por deslocamento cervical após indução anestésica com isoflurano a 5% em câmara de indução. Certifique-se de que a anestesia está funcionando, confirmando a perda de movimento para um estímulo nocivo e perda do reflexo de retificação em camundongos.
- Pressione suavemente com a ponta da pinça nas bordas orbitais superior e inferior para empurrar o globo ocular para fora. Introduzir a ponta da tesoura corneana fechada no espaço retrobulbar ao longo da parede orbitária inferior, garantindo que não penetre no globo ocular.
- Mantenha o globo ocular firme com pinça corneana de 0,3 mm e, em seguida, corte o nervo óptico e o tecido mole periorbital com tesoura corneana para isolar o globo ocular.
- Para a cultura ex vivo de globos oculares murinos, proceda da seguinte forma.
- Prepare uma placa de 48 poços com cera derretida dentro do poço e aguarde a solidificação. Com a ponta da pinça da conjuntiva, crie um orifício redondo na superfície de cera solidificada para acomodar os globos oculares.
- Coloque os globos oculares colhidos diretamente sobre a placa de 48 poços (Figura 1E) com fundo coberto de cera e paredes laterais para estabelecer a estabilização (Figura 1F).
- Cultura dos globos oculares com meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 1% de soro fetal bovino (SFB) em atmosfera umidificada de 5% CO2 a 37 °C com ou sem antibióticos, dependendo do objetivo do estudo.
NOTA: Se o modelo for usado para estudar a cicatrização de feridas epiteliais da córnea, antibióticos seriam necessários para prevenir a infecção. No entanto, se esse modelo for usado para avaliar a eficácia de antibióticos ou agentes mistos, antibióticos profiláticos não seriam necessários. - Imergir a superfície ocular com o meio de cultura sem causar flutuação do globo ocular.
- Documentar o curso da cicatrização de feridas pela coloração com fluoresceína (passo 1.2.3) e coletar fotografias com uma câmera digital sob luz azul de cobalto.
NOTA: Em experimentos prospectivos com modelos de camundongos de lesão mecânica da córnea, aqueles que recebem abrasão da córnea e testados posteriormente quanto à eficácia dos agentes terapêuticos são vistos como um grupo experimental, e aqueles que recebem abrasão da córnea sem tratamento adicional são considerados como um grupo controle negativo.
2. Modelo in vivo de lesão alcalina corneana em coelhos
OBS: Neste modelo, uma lesão por queimadura alcalina é induzida seguida de desbridamento mecânico do epitélio corneano para gerar uma área bem definida e uniforme da ferida para posterior quantificação. Esterilizar todos os instrumentos antes do uso.
- Preparo do coelho com analgesia pré-operatória, incluindo injeção intramuscular de analgésicos sistêmicos e colírios tópicos.
- Administrar anestesia geral a coelhos brancos da Nova Zelândia por injeção intramuscular de cloridrato de cetamina (35-44 mg/kg de peso corporal), misturado com xilazina (5-10 mg/kg de peso corporal) na pata traseira.
- Após posicionar o coelho e cobri-lo com uma toalha, aplicar anestesia tópica sobre o olho direito com uma gota de solução oftálmica de cloridrato de proparacaína a 0,5% (Figura 2A) sob um estereomicroscópio. Desinfetar a superfície ocular e as pálpebras três vezes com betadina a 5%.
- Induzindo lesão por queimadura alcalina sobre a córnea
- Coloque papéis de filtro circulares com um diâmetro de 8 mm (cortados com um punch de 8 mm) em uma placa de Petri. Usando um conta-gotas, adicione 0,5 N de hidróxido de sódio (NaOH) na placa de Petri para molhar os papéis de filtro. Escorra o excesso de solução de NaOH dos papéis de filtro antes de colocá-los na córnea do coelho.
CUIDADO: 0,5 N NaOH pode causar lesão erosiva grave em tecidos humanos. Use luvas ao manusear. Se a pele ou os olhos entrarem em contato com gotículas de NaOH, irrigação com quantidades abundantes de soro fisiológico normal e ajuda médica são necessárias para reduzir mais danos. - Após a abertura das pálpebras com um espéculo palpebral e a confirmação de que a membrana nictitante do coelho não está interferindo na inserção do papel de filtro (Figura 2B), colocar o papel de filtro circular embebido em NaOH 0,5 N na córnea central por 30 s e, em seguida, retirá-lo com pinça (Figura 2C).
- Após a remoção do papel de filtro, enxaguar a superfície ocular com 10 mL de soro fisiológico para lavar o material alcalino.
- Coloque papéis de filtro circulares com um diâmetro de 8 mm (cortados com um punch de 8 mm) em uma placa de Petri. Usando um conta-gotas, adicione 0,5 N de hidróxido de sódio (NaOH) na placa de Petri para molhar os papéis de filtro. Escorra o excesso de solução de NaOH dos papéis de filtro antes de colocá-los na córnea do coelho.
- Defeito epitelial corneano completo
- Desbridar o epitélio corneano dentro da área opacificada até a membrana de Bowman usando um removedor de anel de ferrugem corneana com uma broca de 0,5 mm (Figura 2D).
- Confirmar a área de desbridamento com coloração de fluoresceína sob a luz azul de Cobalto e remover o epitélio corneano residual com pinça corneana (Figura 2E).
- Condição segura da ferida com tarsorrafia
- Confirme se a membrana nictitante cobre suavemente a superfície ocular e o defeito epitelial corneano no lado nasal. Certifique-se de que a membrana nictitante não esteja dobrada ou distorcida demais para interferir no processo de cicatrização de feridas e no experimento.
- Realizar tarsorrafia temporária, com ou sem agentes tópicos, com sutura 6-0 para proteger a superfície ocular e evitar que o coelho a coce (Figura 2F). Certifique-se de que a sutura para tarsorrafia esteja a 3-4 mm das margens superior e inferior da pálpebra, com 4-5 laços e nós mais longos para evitar que o coelho quebre as suturas.
NOTA: Se o experimento não estiver envolvido em um estudo de antibióticos, agentes tópicos com antibióticos podem ser considerados. - Neste modelo de coelho, aqueles que receberam queimadura alcalina e remoção do epitélio corneano foram considerados como grupo controle.
NOTA: Em experimentos prospectivos, os coelhos que recebem lesão de córnea por queimadura alcalina e posteriormente tratados com agentes terapêuticos são vistos como um grupo experimental. Os coelhos que recebem apenas tratamento para queimaduras alcalinas, sem tratamento adicional, são considerados como um grupo de controle negativo.
- Analgesia pós-operatória e controle da dor
- Avaliar a condição fisiológica e os níveis de dor do USDA por 7 dias após o procedimento, monitorando a dor e o sofrimento nos animais. Considerar o uso de pomada de tobramicina e uma gota de solução oftálmica de cloridrato de proparacaína a 0,5% de acordo com o resultado da avaliação. Administrar Buprenorfina HCl (0,03 mg/kg) a cada 6-8 horas por 3 dias.
NOTA: Para medição diária da área do defeito e observação após a cirurgia, o procedimento pertence à categoria D do USDA.
- Avaliar a condição fisiológica e os níveis de dor do USDA por 7 dias após o procedimento, monitorando a dor e o sofrimento nos animais. Considerar o uso de pomada de tobramicina e uma gota de solução oftálmica de cloridrato de proparacaína a 0,5% de acordo com o resultado da avaliação. Administrar Buprenorfina HCl (0,03 mg/kg) a cada 6-8 horas por 3 dias.
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Representative Results
Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano de camundongos:
Após desbridamento in vivo do epitélio corneano de camundongos com removedor manual de anel de ferrugem corneana, uma área corneana central levemente deprimida com coloração fluoresceína positiva pode ser encontrada na área central de 2 mm (Figura 3A-B). Após a colheita do globo ocular do camundongo, ele foi facilmente fixado em uma placa de cultura de 48 poços revestida com cera, sem rotação significativa. Seguindo o protocolo, a cultura ex vivo dos globos oculares murinos pode ser examinada e documentada diariamente em uma placa de cultura de 48 poços sob um estereomicroscópio (Figura 3C). Um dia após a debridação do epitélio corneano murino, um defeito epitelial circular corado com fluoresceína, medindo 2 mm de diâmetro, pode ser revelado em fotografias digitais obtidas sob luz azul de Cobalto (Figura 3D). A margem inicial da ferida corada irregularmente ou a coloração negativa com fluoresceína significam remoção incompleta ou sem falha do epitélio corneano. No processo normal de cicatrização de feridas, o defeito epitelial da córnea cicatrizará com área corada com fluoresceína reduzida em 2-3 dias.
Modelo in vivo de lesão alcalina corneana em coelhos:
Antes de qualquer procedimento, o epitélio corneano intacto de coelho não pode ser corado com coloração de fluoresceína. Após a criação de lesão alcalina no epitélio corneano de coelhos, pode-se observar coloração positiva com ou sem azul de cobalto sobre a córnea central com margem circular clara e completa (Figura 4A-B e Figura 5B). A coloração incompleta com área não preenchida representa tecido epitelial corneano residual ou falha na coloração. Durante o seguimento regular, a ferida epitelial corneana reepiteliza com crescimento do pannus do limbo, seguido de redução da área corada (Figura 5C). O defeito epitelial cicatriza dentro de 3-4 semanas. Se úlcera de córnea, dellen, grande defeito epitelial ou descarga maciça esbranquiçada ou mucosa se desenvolver abruptamente, tarsorrafia insegura, suturas expostas, uma membrana nictitante mal posicionada ou um corpo estranho dentro da conjuntiva palpebral devem ser considerados.
Figura 1: Procedimentos para montagem de um modelo de lesão mecânica corneana em camundongos . (A) A anestesia tópica é aplicada antes do procedimento. (B) Suave indentação é feita sobre a córnea central com uma trefina de biópsia de pele de 2 mm. (C) O removedor do anel de ferrugem da córnea é usado para remover o epitélio corneano central. (D) Um defeito epitelial é corado com fluoresceína para confirmar a área do defeito e compará-la com a região marcada em B. (E,F) O globo ocular do rato é colhido e transferido para uma placa de 48 poços coberta com cera de antemão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Passos para a construção de um modelo de lesão alcalina da córnea em coelhos . (A) A anestesia tópica é aplicada na superfície ocular. (B) Um espéculo palpebral é usado para abrir as pálpebras superiores e inferiores, sem dobrar ou apertar a membrana nictitante. (C) Um papel de filtro trefinado embebido em NaOH (8 mm de diâmetro) é colocado sobre a córnea central. (D) O removedor do anel de ferrugem da córnea é usado para desbridar o epitélio central de 8 mm até a camada de Bowman. (E) O defeito do epitélio é corado com fluoresceína. (F) Após o procedimento, é realizada tarsorrafia para proteger a ferida de arranhões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados positivos e negativos em um modelo de lesão mecânica corneana em camundongos . (A) Epitélio corneano de camundongo intacto sem qualquer coloração antes do procedimento. (B) Coloração positiva in vivo com fluoresceína na ferida corneana murina sem luz azul de Cobalto. (C) Cultura ex vivo do globo ocular de camundongos sem adição de coloração de fluoresceína antes da adição de meio de cultura. (D) Coloração positiva com fluoresceína no defeito epitelial corneano em modelo ex vivo de camundongo. O defeito epitelial de 2 mm geralmente cicatriza dentro de 2-3 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados da coloração com fluoresceína em modelo de lesão de álcalis corneanos em coelhos . (A) Coloração positiva com fluoresceína sob luz azul de cobalto. A fotografia foi tirada logo após a lesão mecânica da córnea. (B) Coloração positiva com corante fluoresceína também pôde ser observada na superfície ocular de coelhos sem luz azul de Cobalto. (C) Coloração negativa na superfície ocular cicatrizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Tempo de evolução da cicatrização e aparecimento da reepitelização em modelo de coelho de lesão alcalina corneana . (A) A reepitelização em modelos de camundongos e coelhos leva 2-3 dias e 3-4 semanas, respectivamente. (B) Defeito epitelial de 8 mm corado com fluoresceína após queimadura alcalina em coelho modelo. A luz azul de cobalto foi utilizada como fonte de luz. A fotografia foi tirada logo após a lesão alcalina. (C) Um defeito epitelial cicatrizado no olho do coelho 3 semanas após a lesão alcalina, mostrando redução da área de mancha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modelos de lesão corneana em camundongos e coelhos fornecem uma plataforma útil ex vivo e in vivo para monitorar a cicatrização de feridas, testar novas terapêuticas e estudar mecanismos subjacentes de cicatrização de feridas e vias de tratamento. Diferentes modelos animais podem ser usados para um experimento de curto ou longo prazo, dependendo do objetivo da pesquisa. Por exemplo, depois de criar um defeito epitelial na córnea de camundongos in vivo, um defeito epitelial confinado poderia ser usado para monitorar agentes terapêuticos líquidos em um pequeno volume. Ao mesmo tempo, as unidades funcionais circundantes, como as pálpebras, o sistema lacrimal e a conjuntiva, podem ser avaliadas em condições in vivo, em oposição às condições de cultura celular ou cultura ex vivo . A tarsorrafia ainda pode ser necessária nesta situação se os movimentos dos camundongos puderem afetar a condição experimental. É mais fácil observar e quantificar uma ferida circular do que uma simples ferida linear4. No entanto, o punção da pele para criar uma linha de demarcação na córnea deve ser feito com cuidado, sem cortar a membrana de Bowman, o que deixará uma lesão profunda na córnea ou uma ferida penetrante. A ferida corneana mecânica também poderia ser criada por uma trefina corneana de 8 mm e uma lâmina de bisturi em um coelho modelo15, em que uma ferida mais profunda até o estroma anterior ao invés do epitélio corneano foi apresentada.
A remoção do anel de ferrugem da córnea é outra questão crucial que vale a pena mencionar. Como o globo ocular de camundongo é pequeno, pode ocorrer remoção excessiva ou sub-remoção do epitélio corneano, afetando a precisão da pesquisa. A marcação da córnea com um punch de biópsia de pele e operação guiada por fluoresceína ajudará a reduzir esses erros. Embora o cautério e as lâminas de bisturi tenham sido propostos como ferramentas para remoção do epitélio corneano em modelosanimais6,7, o dano sobre a superfície ocular pode não ser facilmente controlado e reproduzido da mesma forma, o que potencialmente leva a resultados inconsistentes em experimentos posteriores.
Em comparação com a condição in vivo, globos oculares de camundongos cultivados ex vivo em placas de 48 poços são mais fáceis de manipular devido a um maior espaço de trabalho nas placas e podem ser usados para testar agentes complexos em vários meios de cultura ao mesmo tempo, como lentes de contato farmacológicas e terapias celulares. Quando os globos oculares de camundongos estão sendo colhidos e transferidos para uma placa de 48 poços, a proteção meticulosa da córnea é importante para evitar danos artificiais adicionais à superfície ocular e ruptura dos globos oculares. Para o estudo seguinte, o globo ocular pode ser fixado dentro do poço revestido de parafina com a córnea voltada para cima e imersa em um meio de cultura. Globos oculares flutuantes ou giratórios ou córnea desidratada atrapalham os resultados. Como este modelo de camundongo ex vivo enfoca as alterações sobre a superfície ocular, outras unidades funcionais, como glândula lacrimal e pálpebras, não são discutidas neste modelo ex vivo . O modelo de camundongo ex vivo também reduz o custo de criação e alojamento de camundongos e economiza espaço experimental, em comparação com o modelo animal in vivo . Este modelo é adequado para um estudo de curto prazo, em vez de um estudo de longo prazo, uma vez que a infecção tecidual potencial e falência de órgãos podem se desenvolver a longo prazo.
Embora o modelo em camundongo custe menos e possa ser ampliado em laboratório, uma pequena área de superfície potencialmente limita a observação de alterações detalhadas da córnea, como deposição lipídica e neovascularização por estereomicroscópios. Em vez disso, um modelo de coelho de lesão na córnea com um diâmetro maior do globo ocular geralmente pode compensar essa desvantagem. Ao ajustar a concentração de NaOH e o tempo de embebição, diferentes extensões da severidade da queimadura de álcalis corneanos podem ser criadas. Em modelos de queimadura química de ratos, NaOH 1 N foi usado para embeber a córnea com papel de filtro de 3 mm por 40 s e papel de filtro de 4 mm por 20 s, proporcionando uma área semelhante, porém menor, para observação16,17. Para manter a queima alcalina consistente em tamanho e concentração, um punção novo e afiado é sugerido na preparação de papel de filtro de 8 mm para evitar qualquer fibra ou canto não preenchido na margem do papel. A irrigação suficiente para lavar os agentes químicos da superfície ocular e do saco conjuntival é necessária para reduzir os danos contínuos fora da ferida. Uma vez que a membrana nictitante de coelho pode interferir com o procedimento experimental e induzir dor quando corroída por agentes alcalinos, ela deve ser cuidadosamente protegida e recolocada em posição fisiológica após o procedimento para reduzir a inflamação adicional sobre a superfície ocular. Após o procedimento de queimadura alcalina, a ferida corneana do coelho pode ser protegida por tarsorrafia ou outro material, como lente de contato, para garantir a qualidade e consistência dos experimentos.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O estudo foi financiado pelo Conselho de Energia Atômica de Taiwan (Grant No. A-IE-01-03-02-02), Ministério da Ciência e Tecnologia (Processo nº. NMRPG3E6202-3) e Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3H1281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
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